Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Undersøgelse af arvelig immunitet i en Caenorhabditis elegans model af microsporidia infektion

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63636
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

Summary

Infektionen af Caenorhabditis elegans af den mikrosporidiske parasit Nematocida parisii gør det muligt for ormene at producere afkom, der er stærkt resistente over for det samme patogen. Dette er et eksempel på arvelig immunitet, et dårligt forstået epigenetisk fænomen. Den foreliggende protokol beskriver undersøgelsen af arvelig immunitet i en genetisk trækbar ormmodel.

Abstract

Arvelig immunitet beskriver, hvordan nogle dyr kan videregive "hukommelsen" af en tidligere infektion til deres afkom. Dette kan øge patogenresistensen i deres afkom og fremme overlevelse. Mens arvelig immunitet er blevet rapporteret hos mange hvirvelløse dyr, er mekanismerne bag dette epigenetiske fænomen stort set ukendte. Infektionen af Caenorhabditis elegans med det naturlige mikrosporidiske patogen Nematocida parisii resulterer i, at ormene producerer afkom, der er robust resistente over for mikrosporidier. Den foreliggende protokol beskriver undersøgelsen af intergenerationel immunitet i den enkle og genetisk trækbare N. parisii -C. elegans infektionsmodel . Den nuværende artikel beskriver metoder til at inficere C. elegans og generere immun-primed afkom. Der gives også metoder til analyse af resistens over for mikrosporidier ved farvning for mikrosporidier og visualisering af infektion ved mikroskopi. Især forhindrer arvelig immunitet værtscelleinvasion af mikrosporidier, og fluorescens in situ-hybridisering (FISH) kan bruges til at kvantificere invasionshændelser. Den relative mængde mikrosporidiasporer, der produceres i det immunprimede afkom, kan kvantificeres ved at farve sporerne med et chitinbindende farvestof. Hidtil har disse metoder kastet lys over kinetikken og patogens specificiteten af arvelig immunitet såvel som de molekylære mekanismer, der ligger til grund for den. Disse teknikker, sammen med de omfattende værktøjer, der er tilgængelige for C. elegans forskning, vil muliggøre vigtige opdagelser inden for arvelig immunitet.

Introduction

Arvelig immunitet er et epigenetisk fænomen, hvor forældrenes eksponering for patogener kan muliggøre produktion af infektionsresistente afkom. Denne type immunhukommelse er blevet vist hos mange hvirvelløse dyr, der mangler adaptive immunsystemer og kan beskytte mod virale, bakterielle og svampesygdomme1. Mens arvelig immunitet har vigtige konsekvenser for forståelsen af både sundhed og evolution, er de molekylære mekanismer, der ligger til grund for denne beskyttelse, stort set ukendte. Det skyldes blandt andet, at mange af de dyr, hvor arvelig immunitet er beskrevet, ikke er etablerede modelorganismer til forskning. I modsætning hertil drager undersøgelser af den gennemsigtige nematode Caenorhabditis elegans fordel af et omfattende genetisk og biokemisk værktøjssæt 2,3, et stærkt kommenteret genom 4,5 og en kort generationstid. Faktisk har forskning i C. elegans muliggjort grundlæggende fremskridt inden for epigenetik og medfødt immunitet 6,7, og det er nu en etableret model til undersøgelse af immunhukommelse 8,9.

Microsporidia er svampepatogener, der inficerer næsten alle dyr og forårsager dødelige infektioner hos immunkompromitterede mennesker10. Infektion begynder, når en microsporidia spore injicerer eller "fyrer" sit cellulære indhold (sporoplasma) i en værtscelle ved hjælp af en struktur kaldet et polært rør. Intracellulær replikation af parasitten resulterer i dannelsen af meronter, som i sidste ende differentierer sig til modne sporer, der kan forlade cellen11,12. Selvom disse parasitter er skadelige for både menneskers sundhed og fødevaresikkerheden, er der stadig meget at lære om deres infektionsbiologi12. Nematocida parisii er en naturlig mikrosporidisk parasit, der udelukkende replikerer i ormens tarmceller, hvilket resulterer i reduceret fecundity og i sidste ende død. N. parisii-C. elegans-infektionsmodellen er blevet brugt til at vise: (1) autofagiets rolle i patogenclearance13, (2) hvordan mikrosporidier kan forlade inficerede celler ikke-lytisk14, (3) hvordan patogener kan sprede sig fra celle til celle ved at danne syncytia15, (4) proteinerne N. parisii bruger til at kommunikere med sin vært16 og (5) reguleringen af transkriptionelt intracellulært patogenrespons (IPR)17, 18.

Protokoller for infektion af C. elegans er beskrevet i det aktuelle arbejde og kan bruges til at afsløre den unikke microsporidia biologi og dissekere værtens reaktion på infektion. Mikroskopien af faste orme farvet med det chitinbindende farvestof Direct Yellow 96 (DY96) viser infektionsspredningen af chitinholdige mikrosporidisporer i hele tarmen. DY96-farvning muliggør også visualisering af chitinholdige ormbryoner til samtidig vurdering af orm graviditet (evne til at producere embryoner) som en aflæsning af værtsfitness.

Nylige resultater har afsløret, at C. elegans inficeret med N. parisii producerer afkom, der er robust resistente over for den samme infektion19. Denne arvelige immunitet varer en enkelt generation og er dosisafhængig, da afkom fra mere stærkt inficerede forældre er mere resistente over for mikrosporidier. Interessant nok er N. parisii-primede afkom også mere resistente over for det bakterielle tarmpatogen Pseudomonas aeruginosa, selvom de ikke er beskyttet mod det naturlige patogen Orsay-virus19. Det foreliggende arbejde viser også, at immunprimede afkom begrænser værtscelleinvasion af mikrosporidier. Metoden beskriver også indsamlingen af immunprimede afkom, og hvordan FISH kan bruges til at detektere N. parisii RNA i tarmceller til at analysere værtscelleinvasion og sporeaffyring20.

Sammen giver disse protokoller et solidt fundament for at studere mikrosporidier og arvelig immunitet i C. elegans. Det er håbet, at fremtidigt arbejde i dette modelsystem vil muliggøre vigtige opdagelser inden for det spirende felt af arvelig immunitet. Disse teknikker vil sandsynligvis også være udgangspunkter for undersøgelse af mikrosporidiinduceret arvelig immunitet hos andre værtsorganismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den foreliggende undersøgelse bruger vildtype C. elegans Bristol stamme N2 dyrket ved 21 ° C.

1. Forberedelse af medier

  1. Forbered M9-medier i henhold til tidligere rapport21,22.
  2. Forbered nematode vækstmedium (NGM) i henhold til tidligere rapport21,22. Hæld 12 ml NGM pr. 6 cm plade eller 30 ml pr. 10 cm plade.
  3. Forbered Escherichia coli stamme OP50-1 i henhold til en tidligere rapport23.
  4. Forbered OP50-1-frøede NGM-plader ved at følge nedenstående trin.
    1. Resuspend 10x koncentreret OP50-1 ved hvirvel.
    2. Brug en repeaterpipette til at så pladerne i midten. For 6 cm og 10 cm plader, frø med et volumen på henholdsvis 200 μL eller 500 μL.
    3. For 10 cm plader skal du bruge en glasspreder til at sprede OP50-1 og skabe en græsplæne af bakterier. Spred ikke bakterierne helt ud til kanten af pladen.
      BEMÆRK: Ethanol dypper og flammer sprederen hver femte plade for at sikre sterilitet. Lad sprederen køle af i et par sekunder, før den spredes for at forhindre at dræbe bakterier.
    4. Lad pladerne stå ved stuetemperatur i 2 dage for at tørre og for at sikre væksten af bakterieplænen.
      BEMÆRK: Frøede plader kan opbevares ved stuetemperatur i 2-3 uger eller ved 4 °C i op til 1 måned.

2. Vedligeholdelse af C. elegans

  1. Oprethold orme på en konstant bakteriel fødekilde på OP50-1-frøede NGM-plader.
    BEMÆRK: Sult kan resultere i fænotyper mellem generationerne, hvilket kan påvirke resultaterne. En 10 cm OP50-1-frøet plade understøtter 2.500 L1'er (det tidligste larvestadium af C. elegans) i op til 72 timer.
  2. Hvis ormene sulter, skal du vokse i tre generationer på OP50-1, før du bruger ormene til forsøg.

3. Synkronisering af C. elegans populationer ved hjælp af natriumhypochlorit (blegning)

BEMÆRK: Dette trin er meget tidsfølsomt, så sørg for, at centrifugen er tilgængelig, før du begynder. Alternative, mindre hurtige blegeprotokoller er tilgængelige i litteraturen og kan anvendes, hvis det foretrækkes. For at forhindre, at 6% natriumhypochlorit mister aktivitet over tid, skal reagenset opbevares i mørke ved 4 °C og opbevares i op til 1 år.

  1. Der fremstilles 2 ml blegemiddelopløsning for hver prøve ved at blande 400 μL 1 M NaOH, 250 μL 6 % natriumhypochlorit (se materialetabellen) og 1350 μL destilleret vand.
  2. Vask voksne orme (~ 72 timer efter luge) af pladerne i et mikrocentrifugerør ved hjælp af 1 ml M9-medier.
    BEMÆRK: Hvis der er mange orme tilbage på pladerne, skal du pelletere ormene ved centrifugering ved 1.400 x g i 30 s ved stuetemperatur, fjerne supernatanten ved hjælp af en 1 ml pipettespids og udføre yderligere pladevask.
  3. Centrifugering ved 1.400 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere ormene, vask derefter 2x med 1 ml M9-medier for at fjerne bakterier.
  4. Fjern supernatanten, tilsæt 1 ml af den tilberedte blegemiddelopløsning (trin 3.1.), og indstil en timer i 1 min. Inverter rørene 3-4x.
    BEMÆRK: Under et lysmikroskop kan ormene ses at stoppe med at slå.
  5. Efter 1 min centrifugeres ved 3.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere ormene, fjern derefter supernatanten og tilsæt 1 ml frisk blegemiddelopløsning.
  6. Overvåg røret (e) nøje under et lysmikroskop for at visualisere ormekroppene, der splitter op og frigiver embryoner. Gå straks videre til næste trin, når ~50%-80% af slagtekroppene er splittet op, og mange embryoner er blevet frigivet.
    BEMÆRK: Afhængigt af antallet af dyr og ormstammen kan dette trin tage 15 s til 4 minutter. Af ukendte årsager tager N. parisii-inficerede orme ofte længere tid at blege end uinficerede dyr.
  7. Centrifuge ved 3.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere embryonerne og derefter vaske 3x i 1 ml M9-medier.
    BEMÆRK: Vasker fortynder den resterende hypochloritopløsning fra rørene og skal udføres hurtigt for at sikre, at blegemiddelopløsningen ikke beskadiger embryonerne.
  8. Tilsæt 1 ml M9-medier til den endelige pellet og overfør til et 15 ml konisk rør indeholdende 4 ml M9-medier. Suspender embryonerne i et endeligt volumen på 5 ml.
  9. Rør på en mekanisk rotor (se materialetabel) ved 21 °C i 18-24 timer for at udklække embryonerne i L1'er.
    BEMÆRK: Da N. parisii inficerer ormetarmen og ikke invaderer kimlinjen, overfører inficerede forældre ikke infektionen til deres afkom ved lodret transmission19. Blegning af inficerede voksne synkroniserer F1-dyr og ødelægger N. parisii-sporer , hvilket sikrer, at F1-afkom ikke inficeres af sporer, der overføres fra forældrene.
  10. Centrifuger rørene i 1 min ved 1.800 x g ved stuetemperatur for at pelletere L1'erne og kassere alle undtagen 1 ml supernatanten.
  11. Pipette 1-5 μL L1-blanding på en ikke-sået NGM-plade, og tæl straks antallet af L1'er i dråben ved at visualisere under et lysmikroskop. Gentag 3x og gennemsnit tællingerne for at bestemme koncentrationen og det samlede antal L1'er.
    BEMÆRK: Størstedelen af embryonerne skal udklækkes, og L1'erne skal bevæge sig hurtigt i væskedråben. Hvis en stor del af uudklækkede embryoner og sløve (langsomt bevægende) L1'er forbliver, indikerer dette blegning for længe.

4. Fremstilling af N. parisii sporer

  1. Forbered N. parisii sporer efter tidligere offentliggjorte referencer19,24.

5. Infektion af C. elegans med N. parisii for at give immun-primet afkom

  1. En dag før planlagte infektioner skal du flytte det krævede antal 10 cm ikke-såede NGM-plader fra 4 ° C til stuetemperatur.
  2. Umiddelbart før infektion, centrifuge ~ 2.500 synkroniserede L1 orme ved 1.400 x g i 30 s ved stuetemperatur i et mikrocentrifugerør for at pelletere ormene. Fjern supernatant med en pipettespids for at efterlade orme i ~ 50 μL M9-medier.
  3. Tilsæt 1 ml 10x OP50-1 til L1'erne og N. parisii-sporerne til den ønskede koncentration (typisk ~ 2,5 millioner sporer). Som en uinficerede kontrol fremstilles et ækvivalent rør af L1'er og OP50-1 med et volumen M9-medier svarende til det anvendte volumen sporepræparat.
    BEMÆRK: For at opnå immunprimet afkom skal du bruge en sporedosis, der er høj nok, så >90% af dyrene inficeres med 72 timer (målt ved DY96-farvning, trin 7), men lav nok til, at >80% af dyrene stadig er gravide. Dette sikrer, at de fleste afkom kommer fra inficerede forældre, og at blegning af forældrene giver tilstrækkelige embryoner til F1-test. Selvom sporepræparater varierer i koncentration og smitsomhed, er en passende forældredosis typisk mellem 5-15 μL sporepræparat (~ 2,5 millioner sporer) pr. 10 cm plade.
  4. Vortex kort for at blande og plade ovennævnte 1 ml orme på en 10 cm useedet NGM-plade. Hvirvl for at sikre, at væsken spredes over hele pladen.
  5. Tør pladerne i et rent skab med lågene af i 10-20 minutter eller indtil de er helt tørre, inden de inkuberes ved 21 °C i 72 timer.
  6. Ved 72 timer efter infektion (hpi) vaskes ormene af pladerne i et mikrocentrifugerør ved hjælp af 1 ml M9-medier. Hvis der er mange orme tilbage på pladerne, pelleteres ormene ved centrifugering ved 1.400 x g i 30 s, fjern supernatanten og udfør yderligere pladevask.
  7. Centrifugering ved 1.400 x g i 30 s ved stuetemperatur til pelletsorme, vask 2x med 1 ml M9-medier, eller indtil supernatanten er klar. Resuspend i et endeligt volumen på 1 ml M9-medier.
  8. Pipette op og ned for at blande, og overfør derefter 100 μL af de suspenderede orme til et nyt rør.
    BEMÆRK: Denne prøve på ~ 250 voksne kan senere fikseres og farves for at bestemme forældrenes ormkondition og infektionsstatus, som beskrevet i trin 7 og begyndelsen af trin 3.
  9. For at bryde de voksne orme op og frigive F1-embryoner til testning bleges de resterende 900 μL suspenderede orme som beskrevet i trin 3.
    BEMÆRK: Dette trin ødelægger også eventuelle N. parisii-sporer før efterfølgende infektionsanalyser.

6. Test af arvelig immunitet over for N. parisii i C. elegans

  1. Udfør infektioner som beskrevet i trin 5.1.-5.6., med ændringer som nævnt nedenfor.
    BEMÆRK: Infektionsassays på F1'er kan skaleres ned og udføres på 6 cm NGM-plader ved hjælp af ~ 1.000 L1 orme og 400 μL 10x OP50-1. En "høj" dosis sporer skal også anvendes, således at ~ 100% af naive F1'er (dvs. orme fra uinficerede forældre) inficeres, og kun ~ 10% af naive F1'er er gravide. Selvom sporepræparater varierer i koncentration og smitsomhed, er en passende dosis typisk mellem 5-15 μL (~ 2,5 millioner sporer) pr. 6 cm plade.
  2. Ved 72 hpi, fix og plet for at bestemme ormens kondition og infektionsstatus, som beskrevet i trin 7.

7. DY96 farvning af C. elegans for at visualisere embryoner og microsporidia sporer

BEMÆRK: DY96 er et grønt fluorescerende chitinbindende farvestof, der pletter ormbryoner og microsporidia spore vægge 19,15,25. Dette muliggør samtidig overvågning af ormenes kondition og infektionsstatus.

  1. Vask ormene af pladerne i et mikrocentrifugerør ved hjælp af 1 ml M9-medier indeholdende 0,1% Tween-20. Hvis der er mange orme tilbage på pladerne, pelleteres ormene ved centrifugering ved 1.400 x g i 30 s ved stuetemperatur, fjern supernatanten ved hjælp af en pipettespids og udfør yderligere pladevask.
  2. Centrifugering ved 1.400 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere ormene og vask 2x med 1 ml M9-medier indeholdende 0,1% Tween-20, eller indtil supernatanten er klar.
  3. Fjern supernatanten, tilsæt 700 μL acetone og lad ormene fiksere ved stuetemperatur i 10 minutter.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan ormene opbevares ved -20 °C til forarbejdning op til flere måneder senere, hvis det ønskes.
  4. Centrifuge ved 10.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere de faste orme og vaske 2x med 1 ml PBS indeholdende 0,1% Tween-20 (PBST).
  5. 50 ml DY96-arbejdsløsning til klargøring: PBST, 0,1 % (v/v) natriumdodecylsulfat (SDS) og 20 μg/ml DY96 (fra en 5 mg/ml stamopløsning i destilleret vand) (se materialetabel). Pak røret ind i folie og opbevar det i en skuffe for at forhindre udsættelse for lys.
    BEMÆRK: DY96 lager- og arbejdsløsninger kan opbevares i >1 år ved stuetemperatur, hvis de opbevares i mørke.
  6. Centrifuge ved 10.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere ormene og fjerne supernatant. Tilsæt 500 μL DY96-arbejdsløsning til pillen og drej i 30 minutter ved stuetemperatur.
  7. Centrifuge ved 10.000 x g i 30 s ved stuetemperatur for at pelletere ormene. Fjern supernatanten, og tilsæt 15 μL af monteringsmediet med/uden DAPI (se Materialetabellen).
  8. Pipette 10 μL af opløsningen indeholdende farvede orme på et mikroskop glider og placere et dækslip over toppen.
    BEMÆRK: Dias og yderligere prøver kan opbevares ved 4 °C i mørke til langtidsopbevaring.

8. Billeddannelse og analyse af DY96-farvede orme til vurdering af ormens egnethed og infektionsstatus

  1. For at analysere de DY96-farvede orme (monteret på dias, som i trin 7.8.), Udfør billeddannelse ved hjælp af GFP-kanalen i et fluorescensmikroskop.
  2. For at bestemme ormpopulationernes egnethed skal du bruge et 5x eller 10x mål til at analysere graviditeten af >100 orme pr. Tilstand.
    BEMÆRK: Orme, der bærer ≥1 embryo, betragtes som gravide. Mekaniske celletællere kan bidrage til at minimere menneskelige fejl ved optælling. Ormbryoner er mindre farvede (mindre fluorescerende) end microsporidia sporer19. Embryoner er ovoide, ~ 50 μm x ~ 30 μm, og findes i mellemkroppen af raske C. elegans voksne. Sunde, uinficerede voksne bærer 10-20 embryoner organiseret i rækker langs deres kropslængde26.
  3. For at afsløre mere subtile forskelle i fitness, udfør embryotællinger. Til dette tæller manuelt antallet af embryoner i 20-30 individuelle orme pr. Tilstand.
  4. For at bestemme, hvor inficerede ormpopulationerne er, skal du bruge et 5x-40x mål til at vurdere infektionsstatus for > 100 orme pr. Tilstand. Orme, der omfatter et vilkårligt antal intracellulære tarmsporer, betragtes som inficerede.
    BEMÆRK: Microsporidia sporer er lysere end ormembryoner. De bønneformede sporer af N. parisii er ~ 2,2 μm x ~ 0,8 μm og produceres i ormens tarmceller fra ~ 48 hpi15. Orme, hvor sporer udelukkende ses i tarmens lumen og ikke langs tarmvæggene, betragtes ikke som inficerede19. Dette skyldes, at disse sporer sandsynligvis repræsenterer nyligt indgivne sporer, der ikke skyldes infektion af individet.
  5. Ved hjælp af billedanalysesoftware (se tabel over materialer) kvantificeres parasitbyrde og ormestørrelse ved at følge nedenstående trin.
    1. Billede 20-30 orme monteret på mikroskop dias ved hjælp af et fluorescerende opretstående stereoskop for hver prøve. Tag billeder i Brightfield-, DAPI- og GFP-kanaler. Vælg en passende eksponering i GFP-kanalen, således at fluorescensen i de mest inficerede prøver ikke er mættet.
      BEMÆRK: Infektionen kan stadig visualiseres i de mindst inficerede prøver. Billeder tages typisk ved hjælp af et 5x mål.
    2. Åbn filer i FIJI/ImageJ. Afhængigt af filtypen kan Bio-Formats Importer-pluginet være nødvendigt for at åbne billeder i ImageJ.
    3. Skitser 20-30 individuelle orme i billeder ved hjælp af brightfield- eller DAPI-billeder og Polygon-markeringsværktøjet i værktøjslinjen. Gem hver disposition med Analyze > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager i rullemenuen ved at klikke på Tilføj [t]. Skitser dyr, der er fuldt synlige i rammen.
      BEMÆRK: Ormkonturer kan genbesøges senere ved at gemme filen med konturer som en Tiff.
    4. Klik på Fravælg i ROI-manageren for at fjerne alle konturer fra billedet, og klik på Billede > duplikat i rullemenuen. Indtast det nummer, der svarer til den kanal, der er af interesse, i feltet "Kanaler" for at duplikere GFP-kanalen for parasitbyrde (f.eks. 2).
    5. Tærskel denne kanal ved hjælp af Image > Juster > tærskel til et niveau, hvor den lyse parasitbyrde fanges, men lysdæmperfluorescensen fra ormbryostre ikke er, og klik derefter på Anvend. Vær opmærksom på de anvendte tærskelværdier, og brug dem konsekvent til alle billeder af det samme eksperiment.
      BEMÆRK: Kontroller, at tærsklen er en passende værdi for både de mindste og mest inficerede prøver, før du analyserer alle billederne.
    6. Vælg Analysér > Angiv målinger, og marker afkrydsningsfeltet for Arealfraktion. Vælg enkelte ormkonturer igen fra ROI-manageren, og klik på funktionen Analysér > måling . Et resultatvindue giver mulighed for måling for %Areal (dvs. % parasitbyrde).
      BEMÆRK: Hvis fluorescensen fra embryonerne er så lys, at den krydser tærsklen, kan penselværktøjet i sort på værktøjslinjen bruges til manuelt at slette disse områder, inden der måles %Areal.
    7. For at bestemme ormens størrelse som en aflæsning af egnethed skal du skitsere orme som beskrevet i trin 8.3. Vælg Analysér > Angiv målinger, og markér afkrydsningsfeltet for Areal. Vælg enkelte ormkonturer igen fra ROI-manageren , og klik på funktionen Analysér > måling . Et resultatvindue giver målingen for %Areal.

9. FISH-assay til vurdering af invasion af C. elegans ved mikrosporidier og sporeaffyring

BEMÆRK: MicroB FISH-sonden genkender en konserveret region af microsporidian 18s rRNA og kan bruges til at mærke intracellulære sporoplasmer (dvs. invaderede værtsceller) og det genetiske materiale i sporer.

  1. Inficere 6.000 blegemiddelsynkronerede L1-orme med 4 millioner sporer af N. parisii og 10 μL af 10x OP50-1 i et endeligt volumen på 400 μL, der består af M9-medier.
  2. Plade blandingen på en 6 cm ikke-sået NGM-plade, tør i et rent skab i 10-20 minutter og anbring ved 21 °C.
  3. Efter 30 minutter vaskes dyrene af pladerne med 1 ml M9-medier indeholdende 0,1% Tween-20.
  4. Pellet ormene ved centrifugering ved 1.400 x g i 1 min ved stuetemperatur.
  5. Fjern supernatanten ved hjælp af en pipettespids, tilsæt 700 μL acetone, og lad den sidde i 10 minutter ved stuetemperatur.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt kan ormene opbevares ved -20 °C til forarbejdning på et senere tidspunkt.
  6. Udfør FISH-assay natten over ved hjælp af MicroB-sonden efter tidligere offentliggjorte rapporter27,19.
    BEMÆRK: For at vurdere sporeaffyringen suppleres den endelige vaskebuffer på 500 μL med 20 μg/ml DY96 til prøverne og roteres i 30 minutter ved 21 °C, inden protokollen fortsættes som normalt.
  7. Opbevar lysbillederne i en glideboks ved 4 °C. Ved langtidsopbevaring (dvs. flere måneder) opbevares yderligere prøver i mikrocentrifugerør ved 4 °C i mørke.
  8. For at vurdere invasion i FISH-farvede orme skal du se på ormene ved hjælp af den røde kanal i et fluorescensmikroskop. Visualiser infektionshændelser ved høj forstørrelse (63x mål), da L1-dyr er små, og sporoplasmer vil være i de tidlige stadier af replikation. For at vurdere sporeaffyring skal du bruge et 63x objektiv og både røde og grønne fluorescenskanaler.
    BEMÆRK: Sporer, hvor GFP og mCherry-signal colokaliseres, betragtes som ubrændte; tomme GFP-sporesager betragtes som fyrede.
  9. For at analysere invasion eller spore fyring skal du manuelt tælle antallet af sporoplasmer (mCherry foci i tarmcellerne) eller procentdelen af sporer fyret i 20-30 orme pr. Tilstand. Juster fokus i z-planet for at fange alle infektionshændelser og sporer, som ofte findes i forskellige planer.
    BEMÆRK: Sporoplasmer findes udelukkende i tarmcellerne. Den højeste koncentration af sporoplasmer findes typisk umiddelbart efter svælget. Hvis prøver også er farvet med DY96, skal du kigge efter tilstedeværelsen af sporoplasmer, der ikke colokaliserer med sporen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I den foreliggende undersøgelse blev forældrepopulationer af C. elegans (P0) inficeret på L1-stadiet med en lav dosis N. parisii-sporer . Disse infektionsbetingelser bruges typisk til at opnå et stort antal mikrosporidieresistente F1-afkom gennem blegning af forældrene. Inficerede forældrepopulationer og uinficerede kontroller blev fastsat til 72 hpi og farvet med DY96 for at visualisere ormbryoner og microsporidia-sporer (figur 1A). Inficerede dyr er små, indeholder mange mikrosporidiasporer og producerer færre embryoner end sunde uinficerede kontroller. Vurdering af orm graviditet viste, at ~ 95% af uinficerede dyr producerede afkom sammenlignet med mindre end 80% af de inficerede dyr (figur 1B). Kvantificeringer afslørede, at ~ 90% af den mikrosporidia-behandlede befolkning var inficeret, som bestemt af antallet af orme indeholdende DY96-farvede sporer (figur 1C). For at opnå immunprimet F1-afkom er det vigtigt at bruge en dosis mikrosporidier, der er høj nok til at sikre, at de fleste forældre er inficeret, men lav nok til at sikre, at befolkningen stadig kan producere afkom. Der findes en tabel over de mikrosporidiedoser, der er anvendt til at opnå dataene i denne undersøgelse (tabel 1).

Uinficerede og inficerede forældrepopulationer (figur 1) blev behandlet med natriumhypochlorit ved 72 hpi for at opnå naive og immunprimede F1-afkom. F1-dyr blev udsat for en høj dosis N. parisii-sporer på L1-stadiet for at teste for arvelig immunitet over for mikrosporidier. Ved 72 hpi blev F1-dyr fikseret og farvet med DY96 for at vurdere mikrosporidieresistens (figur 2A). Kvantificeringer af disse faste dyr afslørede, at de grundede orme indeholdt betydeligt flere embryoner end deres naive modstykker, hvilket indikerer større egnethed i lyset af infektion (figur 2B). FIJI/ImageJ blev brugt til at bestemme parasitbyrden for individuelle naive og immunprimede orme (dvs. procentdel af kroppen fyldt med fluorescerende N. parisii-sporer ) (figur 2C). Kvantificeringer afslørede en dramatisk reduktion i parasitbyrden af orme, der kom fra inficerede forældre (figur 2D). Endvidere viste beregninger af individuel ormstørrelse, at primede orme havde en betydelig vækstfordel i forhold til naive dyr i lyset af N. parisii-infektion (figur 2E). Disse data viser, at N. parisii-inficerede forældre producerer afkom med høje niveauer af mikrosporidiaresistens.

Tidligere arbejde har afsløret, at arvelig immunitet over for microsporidia reducerer invasion af tarmceller med N. parisii19. For at visualisere forskelle i værtscelleinvasion blev naive og immunprimede dyr (opnået fra uinficerede eller inficerede forældre, som ovenfor) udsat for en maksimal dosis N. parisii på L1-stadiet. Ved 30 dpi blev ormene fikseret og co-farvet ved hjælp af en FISH-sonde til at detektere N. parisii RNA og DY96 til påvisning af N. parisii sporevægge. Billeddannelse afslørede, at mens naive dyr typisk indeholdt flere sporer og flere inficerede celler (sporoplasmer), havde de grundede dyr langt færre (eller ingen) sporer og typisk ingen sporoplasmer (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Direkte gul 96 (DY96) farvning af uinficerede og N. parisii-inficerede C. elegans afslører orm graviditet og infektionsstatus. (A-C) N2 C. elegans var ikke inficeret eller inficeret med en lav dosis N. parisii på L1-stadiet. Ved 72 hpi blev ormene fikseret, farvet med DY96 og afbildet for at vurdere orm graviditet og infektionsstatus. (A) Repræsentative billeder vises. DY96 muliggør visualisering af ormeembryoner og microsporidia sporer (chitin). Et indsætningsbillede af en inficeret orm vises på højre side. Embryoner er mærket »E«; N. parisii infektion i tarmen er mærket 'Np'. Skalabjælke til venstre og midterste billeder = 500 μm. Skalabjælke for det rigtige billede = 100 μm. (B) Orme, der bærer et eller flere embryoner, blev scoret som gravid og graferet. (C) Orme med et vilkårligt antal N. parisii-sporer i tarmcellerne blev scoret som inficerede og graferede. (B-C) Data samlet fra 5 uafhængige eksperimenter ved hjælp af n = 100 orme pr. Tilstand pr. Eksperiment. Gennemsnitlig ± SEM vises. P-værdierne blev bestemt af den uparrede tohalede elevs t-test. Betydning blev defineret som: *p < 0,05; p < 0.001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Direkte gul 96 (DY96) farvning af naive og immunprimede C. elegans for at bestemme embryoner pr. Orm, mikrosporidia byrde og ormstørrelse. (A) N2 C. elegans var inficeret eller ikke inficeret med en lav dosis N. parisii på L1-stadiet. Ved 72 hpi blev ormene behandlet med natriumhypochlorit for at frigive embryoner. De resulterende naive og immunprimede afkom blev inficeret med en høj dosis N. parisii på L1-stadiet. Ved 72 hpi blev ormene fikseret, farvet med DY96 og afbildet for at visualisere ormbryoner og parasitbyrde. Repræsentative billeder vises. Skalabjælke = 200 μm.(B) Antallet af embryoner pr. orm blev talt og graferet fra (A). (C) Et skærmbillede fra FIJI/ImageJ viser naive orme fra panel A , der er blevet tærskeltet for at visualisere parasitbyrden (vist med hvidt) ved hjælp af vinduet Tærskelværdi nederst til højre. Her blev individuelle orme skitseret ved hjælp af værktøjet "Polygonvalg" fremhævet med rødt og defineret som "Region of interest" (ROI) ved hjælp af ROI-vinduet øverst til højre. Funktionen Analysér > measure > Area blev brugt til at kvantificere parasitbyrden for to eksempelorme, der viste sig at være 25,02% og 13,49%. (D) Parasitbyrden pr. orm blev bestemt og graferet ud fra (A). (E) Ud fra ovenstående billeder blev individuel ormstørrelse beregnet ud fra dyr, der er skitseret som i panel C , ved hjælp af funktionen Analysér > mål > område . (B, D og E) Gennemsnitlig ± SEM vises. P-værdierne blev bestemt af uparret tohalet studerendes t-test. Betydning blev defineret som: *p < 0,05. **p < 0,01, ***p < 0,001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fluorescens in situ hybridisering (FISH) mod N. parisii 18S rRNA afslører parasitinvasion af C. elegans tarmceller hos naive, men ikke primede dyr. N2 C. elegans var inficeret eller ikke inficeret med en lav dosis N. parisii på L1-stadiet. Ved 72 hpi blev ormene behandlet med natriumhypochlorit for at frigive embryoner. De resulterende naive og immunprimede afkom blev inficeret med en maksimal dosis N. parisii på L1-stadiet. Ved 30 mpi blev ormene fikseret, udsat for FISH for at detektere sporoplasmer, farvet med DY96 for at detektere microsporidia sporevægge og afbildet. Repræsentative billeder vises. Indbyggede billeder til den naive orm viser sporoplasmer (rød, stjerner), fyrede sporer (grøn, pilespidser) og en ubrændt spore (gul, pil). Den naive inficerede orm vist viser 4 sporoplasmer. Skalabjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.

N. parisii dosis Pladekoncentration (sporer/cm2) Millioner af sporer pr. 6 cm plade Millioner af sporer pr. 10 cm plade
Lav 35,400 - 2.7
Høj 88,400 2.5 -
Maksimal 2,12,000 6 -

Tabel 1: N. parisii doser anvendt i undersøgelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den nuværende protokol beskriver undersøgelsen af mikrosporidier og arvelig immunitet i en simpel og genetisk trækbar N. parisii -C. elegans infektionsmodel .

Sporeforberedelse er en intensiv protokol, der typisk giver nok sporer til 6 måneders eksperimenter, afhængigt af produktivitet24. Det er vigtigt, at smitsomheden skal bestemmes for hver ny spore "lot", før den bruges til eksperimenterne. På grund af variabiliteten i infektivitet mellem sporepræparater skal et enkelt parti anvendes konsekvent til alle gentagelser af et forsøg. Individuelle alikvoter bør ikke optøes og genfryses, da optøning kan få sporer til at brænde og reducere smitsomheden. Sporer må derfor kun fjernes fra -80 °C-fryseren umiddelbart før infektion og opbevares på is, mens de er på bænken.

I trin 5-6 blev infektionsanalyserne skitseret. Det er vigtigt under infektionsanalyser at undgå forurening eller sult af dyrene, da dette kan resultere i yderligere intergenerationelle virkninger, der forvirrer immuniteten i F1'er. En vigtig begrænsning af det arvelige immunitetsassay er, at flere inficerede forældre producerer færre F1-afkom. Derfor er det vigtigt at finde en omhyggelig balance mellem, at forældregenerationen er tilstrækkeligt smittet til at videregive immunitet, samtidig med at den er sund nok til at producere afkom til test. Selvom den nuværende protokol beskrev infektionsassays for L1-dyr, kan protokollen ændres for at teste virkningen af mikrosporidiainfektion på forskelligt iscenesatte forældre og vedvarende immunitet hos ældre afkom. Metoderne kan også ændres for at teste virkningerne af flere eller forskellige belastninger (f.eks. Osmotisk stress, tungmetalstress, coinfektion med et andet patogen) på arvelig immunitet. Mens arvelig immunitet over for N. parisii i C. elegans er intergenerationel (dvs. varer en enkelt generation)19, kan protokollen tilpasses til at studere yderligere generationer for at teste transgenerationelle virkninger. Mens de angivne protokoller er specifikke for N. parisii-infektion, findes der mange andre nematodeinficerende arter af microsporidia28. Protokollerne kan tilpasses til at studere arvelig immunitet over for andre tarminficerende (f.eks. Nematocida ausubeli) og epidermal- og muskelinficerende (f.eks. Nematocida displodere) mikrosporidier29,30. C. elegans er også inficeret af mange andre naturlige og humane patogener (bakterielle, svampe og virale). De her beskrevne metoder kan bruges til at teste arvelig immunitet over for andre patogener i C. elegans og patogen-specificiteten af det arvelige immunrespons på N. parisii. C. elegans er en veletableret modelorganisme. Andre medlemmer af Caenorhabditis-slægten, herunder de hermafroditiske arter C. tropicalis og C. briggsae og den mandlige-kvindelige art C. kamaaina, er imidlertid også inficeret i varierende grad med N. parisii31. Ved at foretage små ændringer af de leverede protokoller kan arvelig immunitet også testes hos disse dyr.

I trin 8 blev der givet hurtige og enkle metoder til bestemmelse af forskelle i mikrosporidiafølsomhed i DY96-farvede orme (dvs. % dyr inficeret, % dyr gravid). Men nogle gange er disse metoder ikke følsomme nok til at opdage små ændringer i immunitet og fitness. Dette skyldes, at en orm med et embryo og mange inficerede celler ville blive behandlet på samme måde som en orm med 10 embryoner og en inficeret celle. Som sådan er der også tilvejebragt metoder med finere opløsning til bestemmelse af infektionsresultater hos disse dyr (dvs. % parasitbyrde, antal embryoner, ormstørrelse). Mens begge metoder kan anvendes, er fænotypiske forskelle typisk mere udtalte med sidstnævnte, hvilket gør det lettere at opdage betydelige forskelle. Fremtidige tilpasninger af denne metode kan omfatte brug af maskinel indlæring til at automatisere analysen.

I trin 9 blev der tilvejebragt teknikker til analyse af værtscelleinvasion ved mikrosporidier og sporeaffyring ved hjælp af FISH. Mens DY96 markerer microsporidia med et stærkt fluorescerende grønt signal, kan andre farvestoffer, herunder den lipofile plet Nile Red og den chitinbindende Calcofluor White, også bruges til at plette N. parisii 30,32,33. Den nuværende protokol beskriver fiksering ved hjælp af acetone og fungerer godt til påvisning af mikrosporidier med DY96 og FISH-farvning. Fiksering med 4% paraformaldehyd kan dog hjælpe med at bevare vævsmorfologi og forbedre signalet i nogle billeddannelsesprotokoller.

Microsporidia er et underundersøgt patogen, og meget af infektionens cellebiologi forbliver ukendt. C. elegans er en simpel modelorganisme, og disse protokoller kan tjene som en platform til at forstå de vigtigste processer, der er involveret i infektion og værtsforsvar mod denne parasit. Arvelig immunitet er et voksende felt, og mange spørgsmål forbliver udestående1. Hvordan overfører inficerede forældre immunitet over for afkom (moderens forsyning eller ændret transkriptionel regulering i afkom)? Hvad medierer immunitet hos afkom (antimikrobielle peptider eller andre immunproteiner)? Hvor patogenspecifikke er arvelige immunresponser, og hvor bevaret er arvelig immunitet mellem arter? I betragtning af de omfattende værktøjer, der er tilgængelige med C. elegans, er undersøgelser, der bygger på den protokol, der er beskrevet her, godt klar til at besvare disse grundlæggende spørgsmål om arvelig immunitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Winnie Zhao og Yin Chen Wan for at give nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.0 mm zirconia beads Biospec Products Inc. 11079124ZX
10 mL syringe Fisher Scientific 1482613
5 μm filter Millipore Sigma SLSV025LS
Axio Imager 2 Zeiss - Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope Zeiss - For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench Baker -
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V Global Industrial T9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers Fisher Scientific DRM600
Direct Yellow 96 Sigma-Aldrich S472409-1G
EverBrite Mounting Medium with DAPI Biotium 23001
EverBrite Mounting Medium without DAPI Biotium 23002
Fiji/ImageJ software ImageJ https://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanical rotor Thermo Sceintific 415110 / 1834090806873 Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching
MicroB FISH probe Biosearch Technologies Inc. - Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2 Wild-type, Bristol strain Default strain Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771-100G
Sodium hydroxide solution (5 N) Fisher Chemical FLSS256500
Sodium hypochlorite solution (6%) Fisher Chemical SS290-1
Stemi 508 Stereo Microscope Zeiss - For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups
Tween-20 Sigma-Aldrich P1379-100ML
Vectashield + A16 Biolynx VECTH1500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Tags

Immunologi og infektion udgave 182 Caenorhabditis elegans hvirvelløse dyr nematode infektion patogen parasit mikrosporidier arvelig immunitet immunhukommelse epigenetisk arv mikroskopi intergenerationel
Undersøgelse af arvelig immunitet i en <em>Caenorhabditis elegans</em> model af microsporidia infektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., … More

Willis, A. R., Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. Studying Inherited Immunity in a Caenorhabditis elegans Model of Microsporidia Infection. J. Vis. Exp. (182), e63636, doi:10.3791/63636 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter