Summary
Et højhastigheds- og åbent ultraviolet fotoakustisk mikroskop, der kan give histologiske billeder intraoperativt til kirurgisk marginanalyse, demonstreres, herunder systemkonfiguration, optisk justering, prøveforberedelse og eksperimentelle procedurer.
Abstract
Kirurgisk marginanalyse (SMA), en vigtig procedure for at bekræfte fuldstændig udskæring af kræftvæv i tumorresektionskirurgi, kræver intraoperative diagnostiske værktøjer for at undgå gentagne operationer på grund af en positiv kirurgisk margen. For nylig, ved at drage fordel af den høje iboende optiske absorption af DNA / RNA ved 266 nm bølgelængde, er ultraviolet fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) blevet udviklet til at give histologiske billeder i høj opløsning uden mærkning, hvilket viser stort løfte som et intraoperativt værktøj til SMA. For at muliggøre udviklingen af UV-PAM til SMA præsenteres her et højhastigheds- og åbent UV-PAM-system, som kan betjenes på samme måde som konventionelle optiske mikroskopier. UV-PAM-systemet giver en høj lateral opløsning på 1,2 μm og en høj billedhastighed på 55 kHz A-linjehastighed med enakset galvanometer spejlscanning. For at sikre, at UV-PAM-billeder let kan fortolkes af patologer uden yderligere træning, er de originale gråtoner UV-PAM-billeder praktisk talt farvet af en dyb læringsalgoritme for at efterligne de standard hæmatoxylin- og eosinfarvede billeder, hvilket muliggør træningsfri histologisk analyse. Billeddannelse af musehjerneskiver udføres for at demonstrere den høje ydeevne af det åbne UV-PAM-system, hvilket illustrerer dets store potentiale for SMA-applikationer.
Introduction
Kirurgisk marginanalyse (SMA), som kræver en undersøgelse af vævsprøver under et mikroskop, er en væsentlig procedure for at afgøre, om alle kræftceller fjernes fra en patients krop i en resektionsoperation1. Derfor er et mikroskop, der hurtigt kan give histologiske billeder, af afgørende betydning for SMA for at undgå gentagne operationer forårsaget af ufuldstændig fjernelse af kræftceller. I henhold til den nuværende guldstandardmetode baseret på lysfeltoptisk mikroskopi skal det udskårne væv imidlertid fastgøres i formalin, indlejret i paraffin, snittet i tynde skiver (4-7 μm) og derefter farves af hæmatoxylin og eosin (H & E) inden billeddannelse, hvilket er tidskrævende (3-7 dage) og besværligt 2,3 . En frossen sektion er et hurtigt alternativ til SMA ved hurtigt at fryse, skære og farve vævet, hvilket kan give histologiske billeder på 20-30 min4. Imidlertid er de histologiske træk ofte forvrænget og krævet dygtig træning, hvilket forhindrer teknikkens anvendelighed på flere typer organer5.
Optiske mikroskopiteknikker, der kan give cellulære billeder uden eller med et par trin i vævsbehandling, er udviklet til SMA. Men hver af dem lider af forskellige problemer. For eksempel lider optisk kohærenstomografi6 og konfokal reflektionsmikroskopi7 af lav specificitet på grund af deres lave iboende spredningskontrast. Selvom mikroskopi med ultraviolet overflade excitation8 og lysarkmikroskopi9 kan give billeder i høj opløsning og høj kontrast til SMA, kan den giftige og flygtige farvningsprocedure normalt ikke udføres i en operationsstue, hvilket forlænger behandlingstiden. Multi-fotonmikroskopi10 og stimuleret Raman mikroskopi11 kan give rig information til SMA. Alligevel forhindrer de høje omkostninger ved de krævede ultrahurtige lasere, der bruges til at generere ikke-lineære effekter, deres brede anvendelighed.
For nylig, ved at drage fordel af iboende optisk absorption, er etiketfri ultraviolet fotoakustisk mikroskopi (UV-PAM) blevet udviklet til at give histologiske billeder i høj opløsning12. I UV-PAM absorberes fotonenergien af excitations-UV-lyset (f.eks. 266 nm) først af DNA/RNA i cellekerner13 og omdannes derefter til varme, hvilket inducerer akustisk bølgeemission gennem termisk-elastisk ekspansion14. Ved at detektere de genererede akustiske bølger kan todimensionelle (2D) UV-PAM-billeder af cellekerner opnås via maksimal amplitudeprojektion af de akustiske signaler, hvilket giver histologisk information til SMA. For at muliggøre de kliniske anvendelser af UV-PAM er der udviklet højhastigheds-UV-PAM baseret på galvanometer spejlscanning for at give histologiske billeder til en hjernebiopsiprøve (5 mm x 5 mm) inden for 18 minutter, hvilket viser stort potentiale i tidsfølsomme applikationer15. For yderligere at validere muligheden for UV-PAM til billeddannelse af tykt væv blev der foreslået et refleksionstilstand UV-PAM-system med en vandtæt enakset mikroelektromekanisk systemscanner, der med succes demonstrerede intraoperativ histopatologisk undersøgelse af humant tyktarms- og levervæv16. Da det originale UV-PAM-billede er i gråtoner, mens det guldstandard H&E-farvede billede er i lyserøde og lilla farver, er det svært for patologer at fortolke UV-PAM-billeder direkte. For at løse dette problem blev der foreslået en dyb læringsalgoritme til at overføre gråtoner UV-PAM-billeder til virtuelle H &E-farvede billeder i næsten realtid, så patologer kan forstå billederne uden yderligere træning17.
Dette arbejde rapporterer et højhastigheds- og åbent UV-PAM-system, der kan betjenes på samme måde som konventionelle optiske mikroskopier, hvilket giver både originale gråtone histologiske billeder og næsten farvede billeder assisteret af en dyb læringsalgoritme. Uv-PAM-systemet afbilder UV-PAM-systemet ligheden mellem vores praktisk talt farvede UV-PAM- og standard H&E-farvede billeder og viser dets potentiale for SMA-applikationer.
Protocol
Alle dyreforsøg, der udføres i dette arbejde, er godkendt af Animal Ethics Committee ved Hong Kong University of Science and Technology.
1. Åbent UV-PAM-system (figur 1)
- Optisk belysning
- Brug en Q-switch diodepumpet solid state-laser (266 nm bølgelængde) som en excitationskilde.
- Brug to konvekse linser til at udvide laserstrålen og placere et pinhole tæt på brændpunktet for den første konvekse linse for at udføre rumlig filtrering.
- Reflekter laserstrålen opad ved hjælp af et 1D galvanometerspejl (1D GM).
- Brug en objektiv linse til at fokusere laserstrålen og passere gennem midten af en ringformet ultralydstransducer (UT), før du er tæt fokuseret på en prøve.
- Ultralyd detektion
- Brug en ringformet fokuseret UT til at detektere ultralydbølger. De indre og ydre diametre i det aktive UT-område er henholdsvis 3 mm og 6 mm. Brændvidde: 6,3 mm; centerfrekvens: 40 MHz; -6 dB båndbredde: 84%.
- Fastgør UT i en laboratoriefremstillet vandtank med et optisk gennemsigtigt vindue i bunden, dækket af et tyndt kvartsdækslips for at lade UV-lys passere igennem. Sørg for, at det aktive område af UT vender opad. Fastgør vandtanken til et toakset manuelt trin til styring af UT's laterale position.
- Tænd UV-laseren, juster UT'ens position, så laserstrålen kan passere igennem fra midten af UT. Sluk for UV-laseren. Fyld derefter vandtanken med deioniseret vand for at nedsænke UT fuldt ud.
- Tilslut UT'ens udgang til to forstærkere (total forstærkning = 56 dB), og tilslut udgangen fra den anden forstærker til et dataindsamlingskort (DAQ).
- Fastgør en prøveholder til et z-akse manuelt trin, der er forbundet med xy-motoriserede trin. Prøveholderen har et tomt hul, der gør det muligt for UV-lys at passere igennem. Fastgør fire stykker dobbeltsidet tape, der omgiver hullet.
- Systemjustering
- Fastgør sort tape til en glasrutsjebane, og anbring glasrutsjebanen for at dække prøveholderens hul med den sorte tape nedad. Tryk på glasglideren for at sikre, at den er fastgjort på prøveholderen. Sænk derefter prøveholderen for at nedsænke glasglideren i vandet.
- Frakobl den ringformede UT og forstærkere, tilslut UT til pulseren / modtageren, og tilslut pulserens / modtagerens udgang til et oscilloskop. Betjen pulseren/modtageren i Tilstanden Pulse-Echo. Indstil pulsamplituden og forstærkningen af pulseren/modtageren til henholdsvis 6 og 20 dB.
- Aktivér pulseren / modtageren, og juster z-positionen for prøveholderen for at finde placeringen af det akustiske brændplan, hvor ultralydssignalerne er maksimale.
- Skift pulseren/modtageren til transmissionstilstand, og indstil forstærkningen til 60 dB. Aktivér laserudgangen. Juster objektivobjektivets z-position for at maksimere de PA-signaler, der måles med oscilloskopet.
- Juster den laterale position af den ringformede UT for at gøre det genererede PA-signal symmetrisk og maksimalt, hvilket repræsenterer, at de optiske og akustiske foci er samlet i sideplanet. Juster derefter prøveholderens z-position for at maksimere PA-signalerne.
- Gentag trin 1.4.3 og 1.4.4 for at optimere både symmetrien og amplituden af PA-signalerne. Registrer tidsforsinkelsen (dvs. den tid, det tager for PA-bølgerne at nå UT) på oscilloskopet, når PA-signalerne optimeres.
- Flyt prøveholderen for at afbilde forskellige positioner af den sorte tape. Juster prøveholderens fladhed, således at DE PA-signaler, der genereres fra hver position af det sorte bånd, har samme tidsforsinkelse som den, der måles i trin 1.4.5.
- Sluk for laseren, og tilslut UT til de to forstærkere.
2. Prøveforberedelse
- FFPE mus hjerne skive
- Ofre en mus med en overdosis anæstesi. Høst derefter musehjernen efter protokollen beskrevet i reference18.
- Fastgør den høstede hjerne i 10% neutral bufferet formalin i 24 timer.
- Behandl den faste hjerne ved dehydrering med gradueret alkohol, rydning med xylen og indlejring med paraffin som beskrevet i reference19.
BEMÆRK: Behandl prøven i en stinkhætte. - Skær den indlejrede hjerne i tynde skiver (5 μm i tykkelse) ved hjælp af et mikrotome. Læg prøveskiverne på kvartsglass. Tør rutsjebanerne i en ovn ved 60 °C i 1 time.
- Deparaffiniser sektionerne ved hjælp af et clearingmiddel (se Table of Materials), som fjerner paraffinen for at undgå høje baggrundssignaler, da paraffin er stærkt absorberende med UV-excitation.
BEMÆRK: Behandl prøven i en stinkhætte.
- Frisk musehjerne skive
- Ofre en mus med en overdosis anæstesi. Høst derefter musehjernen efter den protokol, der er angivet i reference18.
- Vask musehjernen med fosfatbufret saltvand (PBS) for at fjerne blodet.
- Skær et stykke af hjerneprøven (~ 5 mm tyk) i hånden, og vask derefter prøven med PBS for at fjerne blodet på tværsnittet.
3. Eksperimentelle procedurer
- Placering af prøve
- Forbered en laboratoriefremstillet prøvetank med en UV-gennemsigtig membran (polyethylen, ∼10 μm i tykkelse). Tilsæt en dråbe vand til membranen, og læg derefter den biologiske prøve på prøvetanken for at dække vandet. I tilfælde af FFPE-skiveprøven skal du bruge tape til at fastgøre glasglideren på membranen.
- Anbring den prøveholdige prøvetank på prøveholderen, så det sikres, at prøveholderens tomme hul dækkes.
- Indstil UV-laseren til den eksterne udløsertilstand. Brug vores laboratoriebyggede LabVIEW-program (se Table of Materials) til at indstille scanningsparametrene som følger.
- Indstil lasergentagelseshastigheden til 55 kHz; indstil GM-driverens signaltypee til trekantet og kørespændingsområdet til 0,018 V (repræsenterer ±0,018 V; skalafaktor: 1 V/°). Indstil GMnum til 22 og dy til 2, så GM efter hver 22 laserudløsere afslutter en fjerdedel af scanningsperioden, og y-aksemotoren bevæger sig en trinstørrelse på 0,3125 μm. Indstil dx til 192, så når y-aksemotoren når den forudindstillede position (f.eks. 5 mm), bevæger x-aksemotoren en trinstørrelse på 30 μm.
BEMÆRK: Den mindste trinvise trinstørrelse er indstillet til at være 0,15625 μm for både x- og y-aksemotorerne. Derfor, når dy = 2, er trinstørrelse lig med 0,15625 x 2 = 0,3125 μm, og når dx = 192, er trinstørrelse lig med 0,15625 x 192 = 30 μm. For at scanne hele arealet på 5 x 5 mm2 vil x-aksemotoren bevæge sig 5000 μm /30 μm = 167 gange, hvilket betyder, at 167 underbilleder ville blive syet for at opnå et helt billede. Se figur 2 for UV-PAM-systemets scanningsbane.
- Indstil lasergentagelseshastigheden til 55 kHz; indstil GM-driverens signaltypee til trekantet og kørespændingsområdet til 0,018 V (repræsenterer ±0,018 V; skalafaktor: 1 V/°). Indstil GMnum til 22 og dy til 2, så GM efter hver 22 laserudløsere afslutter en fjerdedel af scanningsperioden, og y-aksemotoren bevæger sig en trinstørrelse på 0,3125 μm. Indstil dx til 192, så når y-aksemotoren når den forudindstillede position (f.eks. 5 mm), bevæger x-aksemotoren en trinstørrelse på 30 μm.
- Start prøvescanning på et lille område ved at indstille antallet af bevægelige trin i x- og y-aksemotorerne (xn = 10 og yn = 1000). Juster z-aksens manuelle trin for at placere prøven på brændplanet for at opnå maksimale PA-signaler.
- Flyt både x- og y-aksemotorer til det ønskede startpunkt, indstil scanningsområdet ved at indstille xn - og yn-værdierne , og start derefter billedoptagelsesprogrammet (se Tabel over materialer).
- Efter billedoptagelsen skal du slukke for laseren, fjerne prøveholderen og opbevare de biologiske prøver.
- For friske biologiske væv opbevares prøverne i 10% neutralt bufret formalin.
- For FFPE-musehjerneskiverne, plet med H & E efter protokollen angivet i reference20 for at opnå de tilsvarende H & E-farvede billeder.
- Brug de indsamlede PA-signaler til at rekonstruere det maksimale amplitudeprojektionsbillede ved hjælp af en laboratoriebygget billedbehandlingsalgoritme (se Tabel over materialer).
Representative Results
Figur 1 viser skemaet for højhastigheds-UV-PAM-systemet. I denne opsætning er de optiske excitations- og ultralydsdetekteringsstier på samme side og under prøven, der danner en reflekterende tilstand og åbent system. Således er det brugervenligt og velegnet til billeddannelse af tykke prøver.
Figur 2 viser UV-PAM-systemets scanningsbane under billeddannelse. Underbillede af hver sektion (f.eks. areal på 5 mm x 30 μm) genereres først ved hjælp af en spredt interpolationsalgoritme, og derefter opnås et helt billede (f.eks. Areal på 5 mm x 5 mm) ved at sy alle underbillederne ved hjælp af brugerdefineret billedbehandlingsalgoritme (se Tabel over materialer).
Figur 3A og figur 3B viser henholdsvis UV-PAM- og H&E-billederne af en FFPE-musehjerneskive, som begge har et synsfelt på 5 x 5 mm2. Billedbehandlingsalgoritmen kan tilgås fra Github via linket i materialetabellen. Billedoptagelsestiden var mindre end 18 min. Figur 3C-F viser de zoomede billeder af de markerede områder i figur 3A, hvor de enkelte cellekerner tydeligt kan løses. Endnu vigtigere er, at de tilsvarende cellekerner kan findes i standard H & E-farvede billeder (figur 3G-J), der viser den høje nøjagtighed af det nuværende system til cellulær billeddannelse. For at overføre gråtonen UV-PAM-billede til et virtuelt H&E-farvet billede blev der anvendt en dyb læringsalgoritme17 (se Tabel over materialer), som ville tage mindre end 30 s for et billede med 8000 x 8000 pixels. De tilsvarende zoomede billeder er vist i figur 3K-N. De næsten farvede UV-PAM-billeder giver næsten de samme strukturelle oplysninger som de H&E-farvede billeder, hvilket viser løfte om klinisk oversættelse af det nuværende UV-PAM-system.
Figur 1: Skemaet for det hurtige og åbne UV-PAM-system. (A) Systemopsætningen. B) Fotografi af prøveholderen og en vandtank, der er fastgjort til et toakset manuelt trin. (C) Fotografi af den ringformede ultralydstransducer fastgjort i vandtanken og prøvetanken, der dækker hullet i prøveholderen. D) Fotografi af prøvetanken med membranen og prøven, der ville blive anbragt på prøveholderen. UV: Ultraviolet; DAQ: Dataindsamlingskort; GM: Galvanometer spejl. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: UV-PAM-systemets scanningsbane under billeddannelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Eksperimentelle resultater af UV-PAM-billeddannelse med dyb læringsbaseret virtuel farvning. (A) UV-PAM-billede af en FFPE-musehjerneskive. (B) Standard H&E-farvet billede af den samme skive. Skalabjælker: 1 mm. (C-F) Zoomede billeder ind af de markerede områder i A. (G-J) Tilsvarende H&E-farvede billeder af de markerede områder i B. (K-N) Tilsvarende næsten farvede billeder ved hjælp af en dyb læringsalgoritme. Skalabjælker: 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Sammenfattende er der påvist et højhastigheds- og åbent UV-PAM-system til histologisk billeddannelse. De detaljerede instruktioner om systemkonfiguration, optisk justering, prøveforberedelse og eksperimentelle procedurer præsenteres. Billedoptagelsesprogrammet kan tilgås fra Github via linket i materialetabellen. Den laterale opløsning af det nuværende system er ~1,2 μm, som er blevet eksperimentelt målt i en nylig publikation21. En musehjerneskive blev afbildet for at demonstrere, at det nuværende system kan opnå et histologisk billede inden for 18 minutter for et område på 5 x 5 mm2, hvilket er en typisk størrelse af hjernebiopsi22. Selvom det originale billede er i gråtoner, kan det nuværende system ved hjælp af et digitalt virtuelt farvningsværktøj aktiveret af en dyb læringsalgoritme yderligere levere næsten farvede billeder i næsten realtid, hvilket sikrer nem tilpasning for patologer til at fortolke billederne. Som en etiketfri billedteknik kan det nuværende UV-PAM-system også levere histologiske billeder til uforarbejdede friske vævsprøver. Flere eksempler (herunder frosne sektioner og friske vævsprøver) er blevet påvist i en tidligere publikation17. De eksperimentelle resultater viser det store potentiale i det nuværende deep-learning-assisterede UV-PAM-system i SMA-applikationer.
En af fordelene ved UV-PAM-systemet er, at systemet implementeres i refleksionstilstand, hvilket muliggør billeddannelse af tykt væv. Desuden gør det open-top UV-PAM-system det muligt at placere prøven på scanningsvinduet (prøvetankens membran), som har en lignende funktion som traditionelle optiske mikroskopier. Derfor er dette system mere brugervenligt end andre systemer, der kræver, at prøver skal klemmes af to membraner11,14. Ved at bruge en 1D GM med en UV-laser med høj gentagelseshastighed kan det nuværende UV-PAM-system desuden opnå høj billedhastighed med højere omkostningseffektivitet sammenlignet med systemet ved hjælp af multifokal excitation23.
I øjeblikket er billedhastigheden hovedsageligt begrænset af gentagelseshastigheden for laser- og fotonbudgettet. Med en laser, der har en høj gentagelseshastighed og høj pulsenergi, kan billedbehandlingstiden forkortes yderligere. En anden begrænsning af systemet er, at prøven kun groft kan justeres til objektivobjektivets brændplan ved at finde de maksimale PA-signaler i stedet for at vise et realtidsbillede, så brugerne kan visualisere, om prøven er i fokus. For at vise et billede i næsten realtid kan 2D GM anvendes.
Der er to kritiske trin i protokollen: (a) det konfokale krav til de optiske og akustiske foci bør optimeres for at opnå en høj detektionsfølsomhed; b) scanningsområdet for GM'en på x-aksen skal være mindre end det akustiske brændpunkt for den ringformede UT for at opretholde en tilsvarende høj detektionsfølsomhed (i den aktuelle opsætning er scanningsområdet ~30 μm ±15 μm). Ellers ville åbenlyse vignetteringseffekter omkring kanterne forekomme, når flere underbilleder sys sammen for at opnå et helt billede.
Disclosures
T. T. W. W. og V. T. C. T. har en økonomisk interesse i PhoMedics Limited, som dog ikke støttede dette arbejde. Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne anerkende den finansielle støtte fra Hong Kong Innovation and Technology Commission (ITS/036/19).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Sigma Aldrich | PHR1373 | Sample dehydration |
| Amplifier | Mini Circuit | ZFL-500LN-BNC+ | Ultrasonic signal amplification |
| Controller | National Instruments | NI myRIO | System controller |
| Data acquisition card | Alazar Technologies | ATS9350 | Ultrasonic signal collection |
| Deep-learning algorithm | For transfering the grayscale UV-PAM image to a virtual H&E-stained image; https://github.com/TABLAB-HKUST/Deep-PAM | ||
| Formalin | Sigma Aldrich | R04586 | Sample fixation |
| H&E staining kit | Abcam | ab245880 | Sample staining |
| Histo-Clear II | National Diagnostics | HS-202 | Sample deparaffinization |
| Image acquisition program | National Instruments | LabVIEW | Lab-built program using LabVIEW; https://github.com/TABLAB-HKUST/LabVIEW-program-for-UV-PAM |
| Image processing algorithm | Mathworks | MATLAB | Lab-built algorithm using MATLAB; https://github.com/TABLAB-HKUST/ImageRec_GM-UVPAM |
| Kinematic platform mounts | Thorlabs | KM200B | Adjust the sample to be flat |
| Membrane | Glad | Cling wrap | Sandwiched in sample tank |
| Microscope objective lens | Thorlabs | LMU- 5X-NUV | Objective lens |
| Motorized stages | Physik Instrumente | L-509.10SD00 | Scanning stages |
| One-dimensional galvanometer mirror | Thorlabs | GVS411 | Fast scanning mirror |
| Oscilloscope | RIGOL Technologies | DS1102E | Ultrasonic signal readout |
| Phosphate-buffered saline | Sigma Aldrich | P3813 | Sample washing |
| Pinhole | Edmund Optics | #59–257 | Spatial filtering |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4600-UV | Focusing lens |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA-4663-UV | Collimating lens |
| Pulser/receiver | Imaginant | DPR300 | Pulse echo amplifier |
| Q-switch diode-pumped solid-state laser | Bright Solutions | WEDGE HF 266 nm | 266-nm laser |
| Ring-shaped ultrasonic transducer | University of Southern California | Ultrasonic signal detection | |
| Sample holder | Lab-made | Hold the sample tank | |
| Sample tank | Lab-made | Hold biological samples | |
| Single-axis Z-translational stage | Thorlabs | PT1 | Manual stage |
| Two-axis manual stage | Thorlabs | LX20 | Manual stage |
| Water tank | Lab-made | Ultrasonic signal transmission | |
| Xylene | Sigma Aldrich | XX0060 | Sample clearing |
References
- Kunos, C., et al. Breast conservation surgery achieving ≥ 2 mm tumor-free margins results in decreased local-regional recurrence rates. The Breast Journal. 12, 28-36 (2006).
- Rosai, J. Why microscopy will remain a cornerstone of surgical pathology. Laboratory Investigation. 87 (5), 403-408 (2007).
- Yang, J., Caprioli, R. M. Matrix sublimation/recrystallization for imaging proteins by mass spectrometry at high spatial resolution. Analytical Chemistry. 83 (14), 5728-5734 (2011).
- Jaafar, H. Intra-operative frozen section consultation: concepts, applications and limitations. The Malaysian Journal of Medical Sciences: MJMS. 13 (1), 4 (2006).
- Rastogi, V., et al. Artefacts: a diagnostic dilemma - a review. Journal of Clinical and Diagnostic Research. 7 (10), 2408-2413 (2013).
- Carrasco-Zevallos, O. M., et al. Review of intraoperative optical coherence tomography: technology and applications [Invited]. Biomedical Optics Express. 8 (3), 1607 (2017).
- Gareau, D. S., Jeon, H., Nehal, K. S., Rajadhyaksha, M. Rapid screening of cancer margins in tissue with multimodal confocal microscopy. Journal of Surgical Research. 178 (2), 533-538 (2012).
- Fereidouni, F., et al. Microscopy with ultraviolet surface excitation for rapid slide-free histology. Nature Biomedical Engineering. 1 (12), 957-966 (2017).
- Tanaka, N., et al. Whole-tissue biopsy phenotyping of three-dimensional tumours reveals patterns of cancer heterogeneity. Nature Biomedical Engineering. 1 (10), 796-806 (2017).
- Jain, M., et al. Multiphoton microscopy: A potential intraoperative tool for the detection of carcinoma in situ in human bladder. Archives of Pathology and Laboratory Medicine. 139 (6), 796-804 (2015).
- Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1 (2), 0027 (2017).
- Wong, T. T. W., et al. Fast label-free multilayered histology-like imaging of human breast cancer by photoacoustic microscopy. Science Advances. 3 (5), 1602168 (2017).
- Shen, C. -H. Detection and analysis of nucleic acids. Diagnostic Molecular Biology. , 167-185 (2019).
- Yao, J., Wang, L. V.
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Optics Letters. 45 (19), 5401 (2020).
- Baik, J. W., et al. Intraoperative label-free photoacoustic histopathology of clinical specimens. Laser & Photonics Reviews. 15 (10), 2100124 (2021).
- Kang, L., Li, X., Zhang, Y., Wong, T. T. W. Deep learning enables ultraviolet photoacoustic microscopy based histological imaging with near real-time virtual staining. Photoacoustics. 25, 100308 (2022).
- Sterile Tissue Harvest | Protocol. , Available from: https://www.jove.com/science-education/10298/sterile-tissue-harvest (2022).
- Steps to Tissue Processing for Histopathology. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/an-introduction-to-specimen-processing/ (2022).
- An Intro to H&E Staining: Protocol, Best Practices, Steps & More. , Available from: https://www.liecabiosystems.com/knowledge-pathway/he-staining-overview-a-guide-to-best-practices/ (2022).
- Li, X., et al. Ultraviolet photoacoustic microscopy with tissue clearing for high-contrast histological imaging. Photoacoustics. 25, 100313 (2022).
- Leinonen, V., et al. Assessment of β-amyloid in a frontal cortical brain biopsy specimen and by positron emission tomography with carbon 11-labeled pittsburgh compound B. Archives of Neurology. 65 (10), 1304-1309 (2008).
- Imai, T., et al. High-throughput ultraviolet photoacoustic microscopy with multifocal excitation. Journal of Biomedical Optics. 23 (03), (2018).
