Summary
Первичные культуры глии Мюллера, полученные из сетчатки мышей, представляют собой очень прочный и надежный инструмент для изучения глиального превращения в клетки-предшественники сетчатки после лечения микроРНК. Отдельные молекулы или комбинации могут быть протестированы перед их последующим применением подходов in vivo .
Abstract
Мюллеровская глия (MG) является преобладающей глией в нервной сетчатке и может функционировать как регенеративный источник для нейронов сетчатки. У низших позвоночных, таких как рыбы, регенерация, вызванная MG, происходит естественным образом; у млекопитающих, однако, требуется стимуляция определенными факторами или генетические/эпигенетические манипуляции. Поскольку МГ составляют только 5% популяции клеток сетчатки, существует необходимость в модельных системах, которые позволяют изучать исключительно эту клеточную популяцию. Одной из этих модельных систем являются первичные культуры MG, которые воспроизводимы и могут использоваться для различных применений, включая скрининг и идентификацию молекул / факторов, тестирование соединений или факторов, мониторинг клеток и / или функциональные тесты. Эта модель используется для изучения потенциала мышиного МГ для преобразования в нейроны сетчатки после добавления или ингибирования микроРНК (миРНК) путем трансфекции искусственных микроРНК или их ингибиторов. Использование MG-специфических репортерных мышей в сочетании с иммунофлуоресцентной маркировкой и секвенированием одноклеточной РНК (scRNA-seq) подтвердило, что 80%-90% клеток, обнаруженных в этих культурах, являются MG. Используя эту модель, было обнаружено, что миРНК могут перепрограммировать MG в клетки-предшественники сетчатки (RPC), которые впоследствии дифференцируются в нейроноподобные клетки. Преимущества этого метода заключаются в том, что кандидаты на миРНК могут быть проверены на их эффективность и результат перед их использованием в приложениях in vivo .
Introduction
Мюллеровская глия (MG) является преобладающей глией в нервной сетчатке. Они имеют аналогичные функции по сравнению с другими глиями в других частях центральной нервной системы, таких как поддержание водного и ионного гомеостаза, питание нейронов и защита тканей. У MG есть еще одна увлекательная особенность: хотя они являются зрелыми глиями, они все еще экспрессируют многие гены, экспрессируемые в клетках-предшественниках сетчатки (RPC) во время позднего развития 1,2. Предполагается, что это сходство является причиной естественной регенерации нейронов на основе MG в сетчатке рыб после повреждения сетчатки 3,4. Во время этого процесса MG повторно входят в клеточный цикл и дедифференцируются в RPC, которые затем дифференцируются во все шесть типов нейронов сетчатки. Хотя это явление встречается естественным образом у рыб, МГ млекопитающих не превращаются в нейроны 5,6. Однако они могут быть перепрограммированы. Было показано, что различные факторы перепрограммируют MG в RPC/ нейроны; среди этих факторов — основной фактор транскрипции спираль-петля-спираль (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1), который участвует в регенерации рыб 7,8. У мышей Ascl1 экспрессируется только в RPC во время ретиногенеза, но отсутствует в зрелых MG или нейронах сетчатки9.
Перепрограммирование клеток непосредственно in vivo является не только методологически сложной задачей, но и требует одобрения институционального комитета по уходу за животными и их использованию. Для получения одобрения требуются предварительные данные об используемом или измененном факторе (факторах), концентрациях, нецелевых эффектах, основных механизмах, токсичности и эффективности. Системы клеточных культур позволяют тестировать эти критерии перед использованием в моделях in vivo. Более того, поскольку МГ составляют только около 5% всей популяции клеток сетчатки10, культуры МГ позволяют изучать их функцию11, а также их поведение, включая миграцию12,13, пролиферацию14, стрессовую реакцию на травму / повреждение15,16, их взаимодействие с другими типами клеток, такими как микроглия17 или ганглиозные клетки сетчатки (RGC)18, или их нейрогенный потенциал 19,20,21. Многие исследователи используют увековеченные клеточные линии для своих исследований, поскольку они имеют неограниченный пролиферативный потенциал и могут легко поддерживаться и трансфицироваться. Первичные клетки, однако, предпочтительнее для биологически значимых анализов, чем увековеченные клетки, поскольку они имеют истинные клеточные характеристики (экспрессия генов и белков) и, что более важно, они представляют собой определенную стадию развития и, следовательно, имеют «возраст». Возраст животного (и, следовательно, клеток, полученных от животного) является особенно важным фактором в клеточном перепрограммировании, поскольку пластичность клеток уменьшается с прогрессирующей стадией развития22.
Этот протокол подробно описывает, как перепрограммировать первичный МГ с миРНК в качестве текущего метода in vitro для изучения регенерации. Эта модель первичной культуры MG была создана в 2012 году для оценки характеристик пролиферации клеток MG у нокаутирующих мышей P53 (trp53-/- мышей)23. Было показано, что культивируемые МГ сохраняют свои глиальные свойства (т.е. экспрессию белков S100β, Pax6 и Sox2, оцененных с помощью иммунофлуоресцентной маркировки), и что они напоминают in vivo MG (микрочип ОЧИЩЕННОГО FACS MG)23. Вскоре после этого глиальная мРНК и экспрессия белка были проверены и подтверждены в другом подходе с использованием вирусных векторов20. Несколько лет спустя было подтверждено, что подавляющее большинство клеток, обнаруженных в этих культурах, являются MG с помощью MG-специфической Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl репортерной мыши24. Кроме того, количественная оценка набора миРНК как в FACS-очищенных МГ, так и в культивируемых первичных МГ показала, что уровни МГ миРНК (mGLiomiRs) не сильно различаются в культивируемых МГ во время фазы роста. Однако удлиненные периоды культивирования вызывают изменения в уровнях миРНК и, следовательно, в уровнях мРНК и экспрессии белка, поскольку миРНК являются трансляционными регуляторами25.
В 2013 году эта модель культуры MG была использована для тестирования различных факторов транскрипции в отношении их способности перепрограммировать MG в нейроны сетчатки20. Ascl1 оказался очень надежным и надежным фактором перепрограммирования. Сверхэкспрессия Ascl1 через вирусные векторы индуцировала морфологические изменения, экспрессию нейронных маркеров и приобретение нейрональных электрофизиологических свойств. Что еще более важно, идеи и результаты, полученные в результате этих первых экспериментов in vitro, были успешно перенесены в приложения in vivo 22,26, демонстрируя, что первичные культуры MG представляют собой надежный и надежный инструмент для скрининга начальных факторов и оценки глиальных признаков до реализации in vivo.
Несколько лет назад было показано, что обогащенная мозгом миРНК miR-124, которая также высоко экспрессируется в нейронах сетчатки, может индуцировать экспрессию Ascl1 в культивируемом MG21. Экспрессия Ascl1 в живых клетках визуализировалась с помощью репортерской мыши Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Мышь-репортер — это генетически модифицированная мышь, в ДНК которой вставлен ген репортера. Этот ген-репортер кодирует репортерный белок, который находится в этом исследовании tdTomato, красный флуоресцентный белок. Этот белок-репортер сообщает о экспрессии интересующего гена, в данном случае Ascl1. Другими словами, клетки, которые экспрессируют Ascl1 , станут красными. Поскольку Ascl1 экспрессируется только в RPC9, эта мышь Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl позволяет отслеживать преобразование MG в Ascl1 , экспрессирующие RPC, что означает, что преобразующие клетки будут экспрессировать красный флуоресцентный tdTomato репортерный белок. Это необратимая маркировка, так как ДНК этих клеток изменяется. Следовательно, любая последующая дифференцировка нейронов будет визуализирована, потому что метка tdTomato остается в дифференцирующих клетках. Если Ascl1 , экспрессирующие RPC, полученные из MG (с меткой tdTomato), дифференцируются в нейроны, эти нейроны все равно будут иметь свою красную метку. Таким образом, эта мышь позволяет не только маркировать RPC, полученные из MG, для визуализации живых клеток, но также позволяет картировать судьбу и отслеживать родословную этих MG-производных (красных) RPC. Совсем недавно был идентифицирован набор миРНК в RPC и MG культуры Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-репортерных мышей были использованы для скрининга и тестирования влияния этих микроРНК на способность перепрограммирования и эффективность27. Было обнаружено, что один из кандидатов, RPC-miRNA miR-25, способен перепрограммировать культивируемый MG в клетки, экспрессирующие Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Эти перепрограммированные клетки со временем принимают нейронные особенности, включая морфологию нейронов (малые соматы и короткие или длинные тонкие процессы), экспрессию нейронных транскриптов, измеренных с помощью scRNA-Seq, а также экспрессию нейронных белков, подтвержденных с помощью иммунофлуоресцентной маркировки27.
Здесь протокол подробно описывает, как выращивать и трансфектировать MG от мышей P12, адаптированных из предыдущей работы 21,24,27. Для этого протокола выбрана вышеупомянутая miRNA miR-25, миРНК, высоко экспрессируемая в RPC, с низкими уровнями экспрессии в MG или нейронах сетчатки. Для сверхэкспрессии miR-25 используется мышиная имитация miR-25, т.е. искусственные молекулы миРНК. В качестве контроля выбраны имитации миРНК из Caenorhabditis elegans, которые не имеют функции в клетках млекопитающих. Визуализация преобразования MG в RPC осуществлялась с помощью RPC-репортерной мыши (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), мыши со смешанным фоном (штаммы C57BL/6, S129 и ICR). Эта культура, однако, может быть выполнена со всеми штаммами мышей, включая штаммы дикого типа. В последние несколько лет оригинальный протокол был изменен для сокращения продолжительности фазы роста и общего периода культивирования и обеспечения более надежного статуса клеток глии и минимизации степени клеточной дегенерации, которая происходит в длительные периоды культивирования. Обычное временное окно трансфекции также было продлено с 3 ч до 2 дней. Как упоминалось ранее, хотя текущий протокол описывает культуры MG как инструмент для исследований регенерации, метод не только полезен для тестирования факторов перепрограммирования, но также может быть адаптирован для других применений, включая исследования о миграционном или пролиферативном поведении MG, парадигмах, связанных с повреждением травм / клеток, и / или идентификации основных механизмов и путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Процедуры, связанные с животными, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Колледже оптометрии SUNY.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол культивирования состоит из трех фаз: роста, трансфекции и фазы преобразования. Краткое изложение общего протокола с временной шкалой приведено на рисунке 1.
1. Подготовка сред и всех необходимых реагентов
ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы должны выполняться в шкафу биобезопасности A2 или B2 (BSC). Во время фазы роста используется среда роста с высоким содержанием сыворотки, которая состоит из базальной нейрональной среды, дополненной эпидермальным фактором роста (EGF). Для фазы конверсии используется нейрофизиологическая базальная среда с низким содержанием сыворотки, дополненная нейронными добавками, для обеспечения дифференцировки и выживания нейронов.
- Подготовьте питательную среду (используемую во время фазы роста), добавив 200 мл базальной нейрональной среды 20 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS, 10%), 1 мл 200 мМ L-глутамина (0,5%), 2 мл пенициллина / стрептомицина (1%) и 2 мл добавки N2 (1%). Выполните стерильную фильтрацию (фильтрующие блоки с размером пор 0,22 мкм). Перед использованием предварительно нагрейте среду в металлической бисерной ванне при температуре 37 °C.
- Получают нейронную среду (используемую во время фазы конверсии) в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов), добавляя 100 мл нейрофизиологической базальной среды без сыворотки 2 мл нейрональной добавки B27 (2%), 1 мл добавки N2 (1%), 20 мкл 100 нг /мл нейротрофического фактора мозга (BDNF, восстановленный в 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) в фосфатном буферном физиологическом растворе (PBS, конечная концентрация 20 нг/мл), 20 мкл 100 нг/мл, полученный из клеток глии нейротрофический фактор (GDNF, восстановленный в стерильном растворе сбалансированной соли Хэнкса [HBSS], конечная концентрация 20 нг/мл), 500 мкл 100 мг/мл Дибутирил-цАМФ (восстановленный в ДМСО), 70 мкл 50 нг/мл аскорбиновой кислоты (восстановленный в стерильном PBS) и 1,5 мл пенициллина/стрептомицина. Выполните стерильную фильтрацию (фильтрующие блоки с размером пор 0,22 мкм). Перед использованием прогрейте среду в металлической бисерной ванне при температуре 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти носители могут храниться при температуре 4 °C в течение 1 месяца. - Восстанавливают папаин, ДНКазу I и овомукуоидные реагенты, необходимые для диссоциации сетчатки в соответствии с протоколом производителя. Аликвот 750 мкл папаина в стерильных пробирках 1,5 мл, 75 мкл ДНКазы I в стерильных пробирках по 0,6 мл и 750 мкл ингибитора овомукуоидной протеазы в пробирках по 2 мл. Заморозьте папаин и ДНКазу I аликвоты при -20 °C и держите овомукуоидные аликвоты при 4 °C, чтобы избежать деградации реагентов. Разморозить при комнатной температуре непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Папаин, ДНКаза I и овомукуоид находятся в наборе под названием Papain Dissociation System (см. Таблицу материалов). - Восстановление поли-L-орнитина (Poly-O) и ламинина для покрытия крышки, если иммунофлуоресцентная маркировка выполняется в соответствии с инструкциями в техническом описании (Poly-O: 0,1 мг/мл в стерильной воде; Ламинин: развести 1,2 мг/мл при 1:50 в ДМЭМ). Аликвот Поли-О и Ламинин (2,5 мл) и замораживание аликвот при -20 °C. Разморозить при комнатной температуре непосредственно перед использованием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Шаг 1.4. требуется только при проведении иммунофлуоресцентной маркировки и лазерно-сканирующей микроскопии.
2. Удаление мышей и тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих исследований перепрограммирования мышь Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl была создана путем скрещивания мыши Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) с мышью tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Эта мышь имеет смешанный фон (C57BL/6, S129 и штамм ICR). Генотип этой мыши показан на рисунке 1А. Для этого протокола могут использоваться все штаммы.
- Наденьте перчатки и продезинфицируйте рабочее пространство, включая рассеченный микроскоп и все тонкие инструменты (тонкие щипцы Dumont #5 и Dumont #7, тонкие ножницы и ножницы Vannas) с 70% этанолом. Продезинфицируйте 10-сантиметровую черную форму для рассечения с силиконовым покрытием, подвергая ее воздействию ультрафиолетового излучения в течение 20 минут.
- Приготовление блюд и тарелок для удаления тканей
- Подготовьте 24-луночную пластину для сбора и разделения образцов (два глаза на мышь в одной лунке, помеченной идентификаторами мыши) с ~ 1 мл холодного HBSS (4 °C) на лунку. Поместите плиту из 24 скважин на лед.
- Наполните стерильную 10 см чашку Петри (для мытья) и дезинфицированную силиконовую форму для рассечения несколькими мл холодного HBSS (4 ° C), чтобы убедиться, что ткань полностью покрыта HBSS.
- Приготовьте стерильную пробирку объемом 1,5 мл с 1 мл 70% этанола.
- Подготовьте 12-луночную культуральную пластину, пометив ее номером культуры, датой, штаммом и всей необходимой информацией.
- Усыпление мышей P12 любым одобренным методом.
- Удаление глаз
- Осторожно держите головку мыши большим и указательным пальцами вокруг глаза.
- Используя изогнутые щипцы Дюмона No7, осторожно зайдите за глазное яблоко и обрежьте зрительный нерв. Осторожно выньте глаз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются взрослые мыши, не используйте изогнутые щипцы и не тяните глаз. Вместо этого аккуратно разрезайте вокруг глазного шара тонкими ножницами; перерезать зрительный нерв, но не резать сам глаз. Используйте щипцы, чтобы аккуратно удалить глазное яблоко.
- Чистка глазных яблок
- Окуните глазное яблоко ненадолго в трубку, содержащую этанол, чтобы избежать переноса бактерий от животного.
- Кратковременно промойте глазное яблоко в чашке Петри размером 10 см, прежде чем поместить его в 24-луночную тарелку на льду.
- Повторите шаги 2.4 и 2.5 для других глаз. Держите плиту скважины на льду во время процесса. Поместите два глаза одного животного в тарелку для рассечения, помещенную под рассеченный микроскоп с источником света.
- Извлечение сетчатки
- Зафиксируйте одно глазное яблоко, захватив зрительный нерв и окружающую соединительную ткань вокруг склеры тонкими щипцами Дюмона No 5 и осторожно прижав его к тарелке для рассечения (роговица вверх).
- Сделайте отверстие в центре роговицы, используя иглу 30 G, чтобы облегчить доступ ножницам Vannas.
- Рассекните роговицу вокруг цилиарного тела с помощью ножниц Vannas и осторожно удалите роговицу, хрусталик, радужную оболочку и стекловидное тело с помощью тонких щипцов Дюмона No 5. На рисунке 2А показана глазная чашка с сетчаткой внутри.
- Рассекайте склеру ножницами Vannas до тех пор, пока зрительный нерв не будет достигнут. Обрежьте зрительный нерв и осторожно извлеките сетчатку с помощью тонких щипцов Дюмона No5.
- Используйте вторую пару тонких щипцов Дюмона No 5, чтобы надавить на сетчатку и обеспечить полное удаление стекловидного тела. На рисунке 2B показаны две извлеченные сетчатки.
- Перенос и стирка
- Отрежьте около 2,5 см кончика стерильной передаточной пипетки, чтобы увеличить диаметр. Используя этот наконечник, подберите (всасывайте) целые сетчатки, не повреждая ткани.
- Переложите сетчатку в новую стерильную чашку Петри с холодным HBSS (4 °C) и качайте чашку (вперед и назад, влево и вправо).
- Используя наконечник переносной пипетки, осторожно толкайте сетчатку, чтобы смыть пигментные эпителиальные клетки сетчатки (RPE).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, вся сетчатка с хрусталиком и стекловидное тело могут быть удалены из глазной чашки. Затем хрусталик и стекловидное тело могут быть удалены из извлеченной сетчатки. Если сетчатка разорвана, обязательно соберите все кусочки для диссоциации; в противном случае будет недостаточно количества ткани для роста сливающихся клеточных слоев.
- Немедленно поместите изолированную сетчатку в новый, чистый колодец из 24-луночной пластины, заполненной 1 мл HBSS. Держите 24-луночную пластину на льду во время процесса рассечения.
- Повторите шаги 2.7-2.9, чтобы изолировать вторую сетчатку.
3. Диссоциация сетчатки
ПРИМЕЧАНИЕ: Все последующие шаги (до сбора клеток) должны быть выполнены в шкафу биобезопасности A2 или B2 (BSC).
- Приготовьте диссоциационную смесь Папаин/ДнКаза I следующим образом.
- Для шести сетчаток добавляют 75 мкл ДНКазы I в пробирку, содержащую 750 мкл папаина (со стадии 1.3), и тщательно перемешивают (диссоциационная смесь).
- Для индивидуальной пробоподготовки, которая требуется для этого протокола, разделите общий объем 825 мкл на три аликвоты: 275 мкл смеси в одной пробирке объемом 1,5 мл на мышь (две сетчатки). Рассчитайте необходимые количества ДНК I и Папаина соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: До шести сетчаток могут быть диссоциированы в одной пробирке смеси Папаин/ДнКаза I. Тем не менее, индивидуальная пробоподготовка приводит к меньшему количеству сгустков и лучшему росту клеток, чем в комбинированных образцах.
- Переведите две сетчатки в диссоциационную смесь Папаин/ДНКаза I. Используйте переносную пипетку с увеличенным диаметром кончика (шаг 2.8.1), поднимите сетчатку, подождите, пока сетчатка осядет в нижней части кончика, а затем выпустите сетчатку без чрезмерного HBSS в трубку, содержащую смесь Папаин / ДНКаза I.
- Поместите на питатель и инкубируйте его в течение 10 мин в инкубаторе клеточной культуры (37 °C, 5% CO2).
- Диссоциируйте клетки, тщательно пипетируя вверх и вниз (около 20-30 раз) пипеткой 1 мл. После диссоциации клеток (т.е. в результате получения однородного раствора без кусков) добавляют 275 мкл ингибитора овомукуоидной протеазы из набора диссоциации папаина для нейтрализации папаина. Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если шесть сетчаток были диссоциированы в смеси 825 мкл папаина/ДНКазы I, требуется 825 мкл овомукуоида. - Центрифугировать смесь при 300 х г в течение 10 мин при 4 °С.
- Добавьте эпидермальный фактор роста (EGF, 1 мкл на 1 мл питательной среды, восстановленный при 200 мкг/мл в PBS) к расчетному объему питательной среды (1 мл на мышь), предварительно нагретой при 37 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от экспериментальной конструкции маркер пролиферации 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU), а также 4-гидрокситамоксифен (4-OHT) или другие необходимые факторы могут быть добавлены в начале периода культивирования. - Осторожно извлеките трубки из центрифуги. Не прикасайтесь к грануле в нижней части трубки.
- Удалите супернатант осторожно и полностью. Повторно суспендируйте клеточную гранулу 500 мкл питательной среды, дополненной EGF.
- Переложите клеточную суспензию в одну лунку из меченой 12-луночной пластины (рисунок 2С). Промыть трубку еще 500 мкл питательной среды, дополненной EGF, и добавить ее в скважину (общий объем 1 мл на скважину).
- Повторите шаги 3.8 и 3.9 со всеми остальными примерами.
- Трижды осторожно покачайте плиту колодца (взад и вперед; влево и вправо). Поместите пластину в инкубатор (37 °C, CO2).
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются трансгенные мыши, выполните генотипирование для каждого животного (рисунок 2D). Идентифицируйте cre рекомбиназу положительных и отрицательных мышей и маркируйте пластину соответствующим образом. Для этого протокола для следующих шагов использовались только клетки мышей с положительным результатом Cre recombinase. Клетки отрицательных образцов Cre замораживаются и используются для других применений.
4. Фаза роста
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза роста имеет продолжительность около 4-5 дней (рисунок 1B). Для добавления жидкостей в колодцы, содержащие ячейки, пипетка должна указывать на стенку скважины, а жидкость должна высвобождаться медленно, чтобы избежать отслоения клеток. Не пипетку непосредственно поверх клеток.
- Через сутки после диссоциации удалите среду и добавьте 1 мл свежей питательной среды, дополненной EGF.
- На 3-й день удалите среду и добавьте 1 мл HBSS (комнатной температуры) для удаления остатков клеток. Качайтесь осторожно взад и вперед слева направо. Удалите HBSS, повторите этап промывки и добавьте 1 мл предварительно подогретой питательной среды, дополненной EGF.
- Контролируйте клетки каждый день и оценивайте их статус роста, пока клетки не достигнут 90%-100% конфлюзии. На рисунке 3 показан пример хорошего роста MG с течением времени. Проверьте возможное загрязнение или гибель клеток (дополнительный рисунок 1). Выбрасывайте загрязненные культуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для мониторинга и записи состояния клеток делайте снимки с различными увеличениями с помощью светового микроскопа с прикрепленной камерой и 4x, 10x или 20x объективов. В этом исследовании используется флуоресцентный микроскоп.
5. Приготовление покровов с поли-L-орнитиновым (Poly-O) и ламининовым покрытием
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим только в том случае, если выполняется иммунофлуоресцентная маркировка и конфокальная лазерно-сканирующая микроскопия. Для правильной визуализации требуются круглые стеклянные крышки (диаметром 12 мм). Протокол покрытия также можно найти в техническом описании нейронной среды (см. Таблицу материалов).
- Аккуратно поместите стерильные крышки в центр каждой лунки плиты из 24 лунок, используя стерильные щипцы Дюмона #2AP.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите крышки в центре колодца. Размещение крышек близко к стенке колодца вызовет проблемы с поверхностным натяжением для следующих этапов. - Разморозьте аликвоту Poly-O объемом 2,5 мл при комнатной температуре и поместите 100 мкл ее в центр каждого крышки.
- Инкубируйте плиту скважины в течение 30 мин в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Удалите Poly-O и трижды промойте колодец крышкой ~ 1 мл стерильной воды.
- Дайте плите колодца высохнуть в течение ночи в BSC. Разморозьте 2,5 мл ламинина при 4 °C в течение ночи.
- На следующее утро добавьте 100 мкл ламинина в центр каждого покровного листа и высиживайте в течение 4 ч в инкубаторе с температурой 37 °C.
- Удалите ламинин осторожно и полностью.
- Держите пластину при температуре 4 °C, если пассаж не может быть выполнен немедленно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Покрытые крышки в подготовленных пластинах можно хранить в течение нескольких дней при температуре 4 °C.
6. Прохождение клеток для удаления выживших нейронов
ПРИМЕЧАНИЕ: Прохождение клеток требуется для удаления нейрональных клеток, а не для увеличения клеточной популяции. Глия делится всего несколько раз и не будет расти дальше после прохождения. Не разбавляйте клеточные суспензии. Ячейки одного сливающегося колодца 12-луночной плиты могут быть распределены по одной скважине 12-луночной плиты или двум скважинам из 24-луночной плиты. При использовании покрытых чехлов покрывается только около одной трети чехлового листа. Таким образом, шесть облицовок, сидящих в 24-луночной пластине, со сливающимися ячейками (~80%-90%) могут быть получены из одного колодца сливающихся ячеек 12-луночной пластины. Другие соотношения также могут быть выбраны для увеличения или уменьшения плотности клеток. Для этого протокола используется одна мышь-репортер Cre+ [один эксперимент, две обработки: miR-25 или контроль-miR; технические реплики n = 3 (три обшивка на обработку), биологическая репликация n = 1]. Количество технических и биологических реплик может быть определено по-разному в зависимости от экспериментальной конструкции.
- Проверьте, являются ли ячейки 90%-100% сливающимися (также на краю скважины); Рисунок 3E,F).
- Удалите среду и добавьте 1 мл HBSS (комнатной температуры) для стирки. Аккуратно раскачивайте пластину (вперед и назад, влево и вправо). Полностью удалите HBSS.
- Добавьте 500 мкл предварительно нагретого трипсинсодержащего раствора (предварительно нагретого при 37 °C в металлической шариковой ванне), чтобы отделить клетки от колодца. Осторожно качайте (взад и вперед, слева направо) и высиживайте в течение 2 мин в инкубаторе при температуре 37 °C.
- Переместите пластину из инкубатора в BSC. Во время наклона аспирируйте трипсинсодержащий раствор и осторожно и медленно рассеивайте его по лунке несколько раз, пока клетки полностью не отсоединятся. Держите пластину против света и убедитесь, что внизу не осталось ячеек.
- Переложите эту клеточную суспензию в стерильную трубку объемом 1,5 мл. Центрифуга при 300 х г в течение 8 мин при 4 °C.
- Удалите надосадочный материал и осторожно повторно суспендируйте клеточную гранулу, добавив 600 мкл (100 мкл на лунку для 6 лунок/покровов) предварительно нагретой питательной среды (дополненной EGF; 1:1000). и пипетка вверх и вниз ~30-40 раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть заморожены в это время при -80 °C или в жидком азоте и разморожены в соответствии со стандартными протоколами для размораживания клеточных линий. Если клетки заморожены, они не будут повторно суспендированы в среде, дополненной EGF (питательной среде). Они будут повторно суспендированы в основной среде (без EGF) и замороженном растворе (соотношение 1/1). На этапах 6.1.1-6.6.2 описываются этапы замораживания клеток. Если клетки не заморожены, перейдите к шагу 6.7.- Готовят замороженный раствор путем смешивания 100 мкл ДМСО и 400 мкл FBS (общий объем 500 мкл на скважину/образец).
- Повторно суспендировать клеточную гранулу в 500 мкл предварительно нагретой питательной среды. Добавьте клеточную суспензию к 500 мкл замороженного раствора DMSO/FBS (общий объем 1 мл). Держите трубки на льду до тех пор, пока все образцы не будут обработаны. Заморозить клетки при -20 °C в течение 1 ч, а затем хранить при -80 °C.
- Семенные клетки путем размещения 100 мкл 600 мкл клеточной/средовой суспензии (стадия 6.6) в центр шести покрытых крышками (см. этап 5) 24-луночной пластины. Аккуратно поместите тарелку в инкубатор и дайте клеткам осесть.
ПРИМЕЧАНИЕ: 100 мкл клеточной суспензии 600 мкл (собранной из одной скважины 12-луночной пластины) приведет к 90%-100% клеточной конфюрентности, которая необходима для трансфекции. - Проверьте ячейки через 3 часа, чтобы увидеть, осели ли они на крышке. Добавьте 400 мкл питательной среды, дополненной EGF.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки обычно готовы к трансфекции на следующий день (рисунок 3G). Если не сливаются (90%-100%), оставьте их на другой день. Если все еще не сливаются, не используйте их для трансфекции. Если проводятся другие последующие применения, такие как профилирование миРНК, RNA-Seq, RT-qPCR или западное пятно, клетки должны быть переданы в 12-луночные пластины (соотношение 1: 1; обработка пластин не требуется) и собраны для экстракции РНК / белка.
7. Трансфекция
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза трансфекции состоит из 3-часовой фазы только в трансфекционной среде (процедуры трансфекции описаны в руководстве по трансфекции, поставляемой с трансфекционным реагентом) и удлиненной фазы, в которой все еще присутствуют трансфекционный реагент и миРНК, но добавляется нейронная среда с необходимыми добавками (общая продолжительность составляет 2 дня; Рисунок 1B). В этом протоколе будут трансфектированы шесть скважин: три скважины получат перепрограммируемую миРНК miR-25 и три скважины получат контрольную миРНК.
- Проверьте, достигли ли клетки 90% конфюляции и запишите / изобразите клетки перед трансфекцией.
- Удалите питательную среду и добавьте 500 мкл HBSS (комнатной температуры) для промывки клеток.
- Удалите HBSS и добавьте 400 мкл восстановленной сывороточной среды, используемой для трансфекции. Поместите пластину обратно в инкубатор при температуре 37 °C.
- Приготовьте трансфекционную смесь, следуя инструкциям протокола трансфекционного реагента производителя. Сделайте две смеси: смесь трансфекционных реагентов и смесь миРНК (см. Рисунок 1B для иллюстрации).
- Приготовьте смесь трансфекционных реагентов: Для 24-луночной пластины требуется 49 мкл восстановленной сывороточной среды и 1 мкл трансфекционного реагента для одной скважины (всего 50 мкл). Для шести скважин 294 мкл восстановленной сывороточной среды и 6 мкл трансфекционного реагента объединяют и хорошо перемешивают путем осторожного пипетирования вверх и вниз.
- Приготовьте мимическую смесь миРНК: для 24-луночной пластины для одной лунки требуется общий объем 50 мкл мимической смеси. Три скважины получат контрольную миРНК, а остальные три скважины будут обработаны miR-25. Для этого протокола используется конечная концентрация 200 нМ.
- Для лечения miR-25 (три лунки) 150 мкл восстановленной сывороточной среды и 3 мкл имитации miR-25 (100 мкМ запасной раствор) объединяют и хорошо перемешивают путем осторожного пипетирования вверх и вниз. Инкубировать в течение 5 мин.
Для контрольной имитации обработки (три лунки) 150 мкл восстановленной сывороточной среды и 3 мкл контрольно-миРНК-мимки (100 мкМ запасной раствор) объединяют и хорошо перемешивают путем осторожной пипетки вверх и вниз. Инкубировать в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем имитации миРНК зависит от коэффициента разбавления и необходимой концентрации (20-500 нМ). Ингибиторы миРНК (антагомиры) или другие молекулы, включая плазмиды, также могут быть использованы. Кроме того, комбинации молекул могут быть трансфектированы.
- Для лечения miR-25 (три лунки) 150 мкл восстановленной сывороточной среды и 3 мкл имитации miR-25 (100 мкМ запасной раствор) объединяют и хорошо перемешивают путем осторожного пипетирования вверх и вниз. Инкубировать в течение 5 мин.
- Комбинируйте мимическую смесь миРНК и смесь трансфекционных реагентов. Тщательно перемешайте, медленно и тщательно пипетируя, осторожно пипетируя вверх и вниз. Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре (по инструкции производителя).
- Добавьте вышеупомянутую трансфекционную смесь по каплям и медленно поверх ячеек, близко к поверхности среды в лунке, используя пипетку 20 мкл. Осторожно покачайте пластину (вперед и назад, слева направо).
- Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 3 ч.
- Через 3 ч добавляют в лунки нейронную среду (500 мкл на лунку), дополненную 4-гидрокситамоксифеном (5 мМ запас, восстановленный с 2,58 мл этанола, конечная концентрация 250 нМ), чтобы активировать рекомбиназу Cre и 5-этинил-2'-дезоксиуридин (EdU, 10 мМ раствор запаса, восстановленный с 2 мл ДМСО, 1 мкМ конечной концентрации) для отслеживания пролиферации клеток.
ВНИМАНИЕ: 4-гидрокситамоксифен и EdU, как известно, являются канцерогенами, тератогенами и мутагенами человека. Прочитайте паспорт безопасности материала перед использованием и наденьте перчатки, защитные очки и лабораторное покрытие. Восстановите оба реагента в соответствии с рекомендациями производителя. Не вдыхайте вещество/смесь. Плотно закрыть после использования. Отходы должны быть утилизированы в соответствии с национальными и местными правилами. Мойте руки и лицо после работы с веществом. - Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 2 дней (рисунок 1B).
8. Преобразование ячеек
ПРИМЕЧАНИЕ: Фаза преобразования клеток имеет продолжительность около 5-6 дней (рисунок 1B), но возможны и более длительные периоды.
- Ежедневно проверяйте клетки на успешную индукцию экспрессии tdTomato, потенциальную гибель клеток и / или загрязнение. Плотность клеток не изменяется (рисунок 4). Первые слабые красные флуоресцентно-меченые клетки могут наблюдаться через 1 день после лечения 4-гидрокситамоксифеном. Флуоресцентный микроскоп необходим для мониторинга и визуализации клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании флуоресцентный микроскоп используется для визуализации в реальном времени. Изображения делаются с 4-кратными, 10-кратными или 20-кратными целями. - Через два дня после трансфекции удаляют среду и добавляют 500 мкл предварительно нагретой нейрональной среды, дополненной 4-гидрокситамоксифеном и EdU в каждую лунку.
- Заменяйте среду свежей средой через день, пока клетки не будут собраны.
- Сделайте живые снимки для оценки и оценки количества красных флуоресцентных (экспрессирующих Ascl1) клеток и их морфологических изменений (рисунок 4 и рисунок 5A-C).
9. Сбор клеток: фиксация для иммунофлуоресцентной маркировки
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть собраны для других последующих применений, включая объемный или scRNA-Seq, RT-qPCR или вестерн-блоттинг.
- Удалите среду и добавьте 500 мкл холодного HBSS (4 °C) на лунку и аккуратно покачайте пластину (вперед и назад, слева направо). Удалите HBSS.
- Зафиксируйте клетки, добавив 500 мкл 2% параформальдегида (PFA) и инкубируйте в течение 20 минут при комнатной температуре.
- Выполняют иммунофлуоресцентную маркировку в соответствии с установленными протоколами.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает, как вырастить MG из сетчатки мыши P12 и как перепрограммировать эти клетки с miR-25 в нейроны сетчатки с помощью мыши-репортера Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC. Этот метод был использован в предыдущей работе, в которой подробно сообщалось о других подходящих микроРНК (мимиках или ингибиторах, в виде отдельных молекул или в комбинации) для перепрограммирования MG в RPC, которые затем принимают характеристики нейрональных клеток27. Этот метод был модифицирован для более быстрого выращивания культур и, таким образом, минимизации клеточных изменений, вызванных искусственной средой с течением времени 24,28,29.
Диссоциация сетчатки и фаза роста первичных культур МГ
Первый МГ можно обнаружить уже в первый день in vitro с помощью светового микроскопа. МГ имеют трубчатую, вытянутую форму и светло-серые тела клеток (рисунок 3A-D, красные наконечники стрелок). Большинство из них, однако, покрыты клеточным мусором на этих ранних стадиях. МГ из двух сетчаток одной мыши, выращенных в одной лунке из 12-луночной пластины, достигают 90%-95% слияния в течение 4-5 дней (рисунок 3E,F). Со временем все нейронные обломки будут очищены, и будет присутствовать плотный клеточный слой. Клетки не готовы к прохождению, если дно скважины не полностью сливается. Тем не менее, прохождение не должно быть сделано позже, чем через 6 дней in vitro, так как глия со временем теряет свои глиальные черты в культуре. Перед трансфекцией или любым другим лечением клетки должны быть проверены на плотность и жизнеспособность. Трансфекция должна выполняться только на 90%-95% сливающихся клетках (рисунок 3G). Для иммунофлуоресцентной маркировки и конфокального микроскопического анализа клетки должны быть посеяны на покрытых крышками.
Ранняя и поздняя фаза периода конверсии клеток
Уже через 15 ч после трансфекции и лечения 4-гидрокситамоксифеном первые клетки начинают экспрессировать слабую красную флуоресценцию, то есть красный флуоресцентный репортерный белок tdTomato, приводимый в действие (активированным) промотором Ascl1. Клетки, экспрессирующие Ascl1, теперь далее называются клетками Ascl1-Tom+. Более устойчивая экспрессия Ascl1-Tom может наблюдаться через 2 дня после трансфекции с увеличением красной флуоресценции с течением времени (рисунок 4). Эффект перепрограммирования становится видимым примерно через 2 дня в культуре со многими клетками Ascl1-Tom+ на поле, обнаруженным при перепрограммировании лечения микроРНК: показано здесь для контрольного miR и miR-25 (рисунок 4B-B''' и рисунок 4C-C''', соответственно). В обоих методах лечения клетки Ascl1-Tom+ по-прежнему довольно круглые и относительно большие, с более морфологией глии / клеток-предшественников. Более того, индукция красного флуоресцентного репортера не влияет на плотность клеток культуры (все еще 90%-95% сливающихся).
Через три-пять дней после трансфекции (Рисунок 4A и Рисунок 5A) увеличение числа клеток Ascl1-Tom+ становится более очевидным в обработанных miR-25 скважинах (Рисунок 5B-D), показывая четырехкратное увеличение числа после лечения miR-25 по сравнению с контрольной группой. Более того, становятся видны первые морфологические изменения. Эти изменения включают уменьшение размера клеточной сомы и развитие тонких процессов. В то время как в контрольных условиях подавляющее большинство клеток являются большими и плоскими (глиальные / предшественникоподобные, рисунок - 5B-B''), многие клетки с маленькими ядрами и несколькими мелкими отростками, напоминающими нейроны сетчатки, появляются в лечении miR-25 (рисунок - 5C-C''). Эти нейроноподобные клетки составляют примерно 70% от общей популяции Ascl1-Tom (15% в контрольном лечении; Рисунок 5Е). Ячейки менее плотные из-за преобразования клеток (меньшие ячейки требуют меньше места). Интересно, что эти нейроноподобные клетки даже, по-видимому, образуют крошечные сети (рисунок 5C''). В это время клетки могут быть собраны для иммунофлуоресцентной маркировки для подтверждения идентичности нейронов.
Подтверждение идентичности нейронов
Клетки мечеются антителами против микротрубочек-ассоциированного белка 2 (Map2), маркера для нейрон-специфических цитоскелетных белков30,31, и против Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) для проверки нейронной идентичности32,33. Оба маркера также использовались в предыдущих исследованиях перепрограммирования21,27. Otx2 является транскрипционным фактором, обнаруженным в RPC 34,35,36, зрелых биполярных клетках 34,35,37,38,39 и фоторецепторах 35,36,37,38,40 . Ядерная маркировка DAPI используется для противодействия культурам. Иммунофлуоресцентная маркировка показывает незначительную или отсутствующую экспрессию Map2 или Otx2 в контрольных условиях (рисунок 6A-A''',C). Однако образцы, обработанные miR-25, имеют много клеток Map2+ и Otx2+ (рисунок 6B-B'''). Количественная оценка конфокальных изображений показывает, что после сверхэкспрессии miR-25 присутствует около 40 нейрональных клеток на поле по сравнению с пятью нейрональными клетками на поле в контрольной группе (рисунок 6C, размер поля: 630 мкм x 630 мкм). Снимки были сделаны с 20-кратным объективом. Эти нейрональные клетки составляют около 70% от общей популяции клеток Ascl1-Tom+ обработанных miR-25 образцов (контроль ~ 20%, рисунок 6D). Все нейроноподобные клетки Ascl1-Tom+ были Map2+ и Otx2+, подтверждая нейронную идентичность. Кроме того, абсолютное количество клеток Otx2+ и Map2+ было выше после лечения miR-25 по сравнению с лечением контрольной миРНК (miR-25: 60 клеток на поле; контроль-miR: 10 клеток на поле; Рисунок 6Е).
Взятые вместе, результаты показывают, что культуры MG могут быть выращены и перепрограммированы с помощью миРНК. Добавка miR-25 индуцирует экспрессию Ascl1-Tom в первичном МГ. Многие MG превращаются в RPC, которые принимают морфологию нейронов и экспрессируют нейронные маркеры Map2 и Otx2 через несколько дней.
Рисунок 1: Экспериментальное проектирование и временной ход первичной культуры глии Мюллера. (A) Схема мыши Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl, репортерной мыши-предшественника сетчатки, используемой для отслеживания преобразования глии Мюллера (MG) в клетки-предшественники сетчатки (RPC). (B) Временной ход периодов культивирования, состоящий из фазы роста (синий, 0-4/5 дней in vitro, div), фазы трансфекции (фиолетовый, 5/6-7/8 div) и фазы превращения MG (желтый, начинается 7/8 div). Фаза роста: диссоциированные сетчатки (две сетчатки одной мыши) выращиваются в одном колодце 12-луночной пластины в питательной среде. Примерно на 4/6 день клетки проходят в 24-луночную пластину, которая содержит покрытые крышками. Фаза трансфекции: 5-7 div (1 день после прохождения) клетки трансфектируются миРНК в течение 2 дней в трансфекционной среде. Cre рекомбиназа активируется 4-гидрокситамоксифеном (4-OHT). Пролиферация клеток отслеживается с помощью EdU. Фаза превращения МГ начинается через 1 день после трансфекции. Клетки теперь выращиваются в нейронной среде до сбора урожая (6-7 дней после трансфекции, dpTF). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Диссоциация и генотипирование сетчатки. (А) Глазная чашка с удаленной роговицей, хрусталиком, радужной оболочкой и стекловидным телом. B) изолированные сетчатки; пигментные эпителиальные клетки сетчатки удаляются после тщательной промывки. (C) 12-луночная пластинка с диссоциированными сетчатками (две сетчатки на лунку). (D) Вырезание примера изображения генотипирующего геля. Генотипирование необходимо для идентификации мышей, у которых экспрессия Cre-рекомбиназы, управляемой Ascl1, и будет использоваться для отслеживания конверсии клеток. Шкала: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Первичная глия Мюллера во время фазы роста. (А) Временной ход периодов культивирования во время фазы роста (0-4/5 дней in vitro (div)) выделен синим цветом. (Б-Г) Живые изображения (фаза) глии Мюллера (MG) во время фазы роста после 1 div (B), 2 div после изменения среды (C), 3 div (D), 4 div до прохождения (E,F) и 5 div, через 1 день после прохождения и до трансфекции (G). Тела клеток MG обозначены красными наконечниками стрелок. После 3 div культуры на 60%-80% сливаются (D), после 4-5 div культуры на 90%-100% сливаются и готовы к прохождению (E-F). После прохождения на покровах клеточные культуры должны быть на 80%-90% сливающимися для последующей трансфекции (G). Шкала стержней: 50 мкм (A-D), 100 мкм (E), 200 мкм (F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Ранние стадии в фазе превращения глии Мюллера. (A) Временной ход периодов культивирования во время фазы конверсии выделен желтым цветом (начинается с 7/8 дней in vitro (div)). Временная точка анализа, показанная на этом рисунке, обозначена красной звездой: 7 дел, 2 дня после трансфекции (dpTF). (B-C''') Живые изображения культур мюллеровской глии (МГ) в фазовой и красной флуоресценции, комбинированной или одиночной красной флуоресценции. Красная флуоресценция визуализирует Ascl1, экспрессирующую MG (tdTomato+, сокращенно Ascl1-Tom), через 2 дня после трансфекции либо контрольной имитацией миРНК (контроль-miR, B-B'''), либо имитацией miR-25 (C-C'''). Области в B/B' и C/C' показаны в более высоком увеличении в B''/B''', C''/C'''. Шкала 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Конечные стадии в фазе превращения глии Мюллера. (A) Временной ход периодов культивирования во время фазы конверсии выделен желтым цветом (начинается с 7/8 дней in vitro (div)). Временная точка анализа, показанная на этом рисунке, обозначена красной звездой: 10 дел, 5 дней после трансфекции (dpTF). (Б-С'') Живые изображения культур мюллеровской глии (МГ) в фазовой и красной флуоресценции, комбинированной или одиночной красной флуоресценции. Красная флуоресценция визуализирует Ascl1, экспрессирующую MG (tdTomato+, сокращенно Ascl1-Tom), через 5 дней после трансфекции (pTF) с имитацией контрольной микроРНК (контроль-miR, B-B''), либо с имитацией miR-25 (C-C''). Вставки в B'/C' показаны в более высоком увеличении в B''/C'', соответственно. (D) Абсолютное количество клеток Ascl1-Tomato+ на поле (10x; 1440 мкм x 1080 мкм) после контрольной обработки миРНК или miR-25, через 2 и 5 дней после трансфекции (dpTF; n = 1, подсчитывается пять изображений на лунку; среднее ± S.D.). (E) Процент нейроноподобных клеток Ascl1-Tomato+ от общего количества клеток Ascl1-Tomato+ на поле (10x; 1440 мкм x 1080 мкм) после контрольной миРНК или miR-25 обработки, через 5 дней после трансфекции (5dpTF, n = 1, среднее ± S.D.). Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Подтверждение нейронной идентичности перепрограммированных клеток. (A-A'''; B-B''') Иммунофлуоресцентная маркировка первичных культур глии Мюллера мыши (MG) через 5 дней после трансфекции, обработанных контрольной имитацией миРНК (контроль-miR, A-A''') или мимикой miR-25 (B-B'''). Клетки фиксировали 2% параформальдегидом (PFA) и инкубировали с антителами против RFP для маркировки tdTomato, Map2 и Otx2 для маркировки нейронов. Ядерная маркировка DAPI (синий) использовалась для окрашивания всех клеточных ядер. (С-Е) Количественная оценка (n = 1; пять изображений на обложку подсчитывается; среднее ± S.D.) абсолютного числа ячеек Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ на поле (C), процент ячеек Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ от общего числа ячеек Ascl1-Tom+ (D) и абсолютное число ячеек Otx2+Map2+ на поле (E). Результаты показывают более высокое количество нейронов в лечении miR-25 по сравнению с контрольной группой. Размер поля: 630 мкм x 630 мкм. Шкала: 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок 1: Гибель клеток и бактериальное загрязнение. (А-А'') Живые изображения культур мюллеровской глии (MG) 3 div, загрязненных бактериями. Вставка 1 в A показана в более высоком увеличении в A' и отображает атрофическую, мертвую глию. Вставка 2 в A показана в A'' с живой глией. Шкала: 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол описывает, как вырастить MG из диссоциированных сетчаток мыши для исследований перепрограммирования с использованием миРНК. Как показано и подтверждено в различных предыдущих исследованиях, подавляющее большинство (80%-90%) клеток, обнаруженных в этих культурах, составляют MG 20,23,24. Этот метод является очень надежным и надежным методом, и результаты могут быть легко воспроизведены, если протокол соблюдается правильно21,27. Однако успешный рост и эффективность перепрограммирования культуры зависят от множества факторов.
Во-первых, возраст мыши играет важную роль в успешном росте клеток. Поэтому, если культуры MG выращиваются из мышей дикого типа или трансгенных мышей, которые напоминают дикие типы, такие как мыши-репортеры, последний возраст для выращивания сливающихся монослоев MG составляет P12. При P12 все нейроны сетчатки и MG дифференцированы, и в сетчатке больше нет RPC. MG экспрессируют зрелые маркеры MG, такие как глутаминситетаза или транспортер аспартата глутамата (GLAST)20,23,41,42. Культивируемый P12 MG все еще может повторно входить в клеточный цикл при воздействии EGF, но количество циклов ограничено, хотя и достаточно, чтобы сформировать сливающиеся клеточные слои in vitro. Тем не менее, может случиться так, что даже P12 MG плохо растут, потому что EGF или компоненты в среде могут деградировать. Неполная диссоциация (куски) также может привести к меньшему или задержке роста МГ. Основной причиной неполной диссоциации является инактивация ДНКазы I, используемой для диссоциации сетчатки путем жесткого обращения с ферментом (быстрое пипетирование, вихрь и т. Д.). Даже если клетки хорошо растут до прохождения, клетки могут быть менее сливающимися после прохождения. Причинами этого могут быть жесткое обращение во время процесса прохождения, которое приводит к увеличению гибели клеток или потому, что клетки были засеяны слишком редко. Поскольку глия не сильно растет, клетки должны быть покрыты в том же соотношении, что и выращенные, а не разбавленными (в отличие от процедур пропускания увековеченных клеточных линий). Следует отметить, что, поскольку культуры MG растут от центра до периферии колодца, более высокие плотности клеток всегда будут найдены в центре. Поэтому крайне важно проверить поля каждого колодца перед прохождением, чтобы убедиться, что весь колодец покрыт клетками. Измерения концентрации клеток должны быть выполнены для обеспечения обработки достаточного количества клеток.
Кроме того, первичные культуры, полученные от мышей с P6 или моложе, не будут содержать MG, поскольку MG вот-вот созреют в этот момент времени. Это было показано с помощью одноклеточного анализа РНК-seq43. Иммунофлуоресцентная маркировка зрелыми маркерами MG в этом возрасте также подтвердит это. Однако доля RPC значительна на уровне P6. Поэтому результаты следует интерпретировать осторожно. Кроме того, такие маркеры, как промежуточные нитевые маркеры виментин и нестин, не подходят для идентификации первичного МГ, поскольку эти маркеры также экспрессируются в астроцитах 44,45,46, микроглии47,48, эндотелиальных клетках и перицитах 49,50,51,52 , и не являются специфичными для MG. GFAP, экспрессируемый в астроцитах сетчатки, но не в MG неповрежденных сетчаток, не является хорошим маркером для культивируемого MG. Хотя он повышается в диссоциированных МГ из-за механического повреждения во время диссоциации, он понижается через 3 дня в культуре28.
Поскольку MG имеет много общих маркеров RPC, самой безопасной процедурой для обеспечения надежной культуры MG является использование мышей на P12 или более старых мышах. Хотя этот протокол описывает культуры, полученные из P12 мыши MG, взрослые мыши MG могут быть культивированы и перепрограммированы27. Тем не менее, больше ткани на лунку должно быть покрыто (от четырех до шести сетчаток). Это связано с тем, что взрослые глии не делятся сильно, даже если подвергаются воздействию EGF и 10% сыворотки. Уменьшение клеточных контактов приведет к гибели клеток и дегенерации клеток (растянутые клетки, увеличенные клетки). Взрослая глия является отличным инструментом для парадигм кокультуры18 , и плотность клеток может не иметь большого значения в этих приложениях. Однако для последующих применений, таких как трансфекция или трансдукция, сливающиеся клеточные слои являются обязательным требованием.
Помимо нарушения роста, может произойти гибель клеток. Если гибель клеток происходит без каких-либо явных признаков, следует учитывать загрязнение микоплазмой (размер микоплазмы 0,1-0,3 мкм) и использовать набор для обнаружения микоплазмы. Хранение каждого образца отдельно (не объединение образцов) также может снизить риск перекрестного загрязнения. Тем не менее, более крупные бактерии также могут быть перенесены от животного и могут вызвать загрязнение, даже если вся работа выполняется в чистой, стерильной среде. Перед рассечением глаза рекомендуется ненадолго окунуть глазное яблоко в 70% этанол и тщательно промыть в дополнительной чашке Петри 10 см. Для достижения успешной культуры крайне важно работать в стерильных условиях, так как загрязнение может произойти быстро. Как только бактерии, дрожжи или плесень / грибок обнаруживаются в тарелке, даже если не все колодцы поражены, культура теряется. Загрязнения вызовут гибель клеток (дополнительный рисунок 1) и повлияют на клетки, что приведет к нерепрезентативным данным.
Гибель клеток также может быть вызвана реагентами, необходимыми для последующих применений, таких как Poly-O (или Poly-D-Lysine), используемых для покрытия покровных пластин. Эти вещества токсичны, и перед использованием Ламинина требуется тщательная промывка. Чехлы должны прилипать ко дну колодца, а не плавать внутри колодца. Пузырьков воздуха нужно избегать. Кроме того, полное покрытие Ламинином имеет решающее значение для обеспечения адгезии клеток к крышке. Недостаток ламинина также приведет к меньшей плотности клеток и / или гибели клеток.
Для идентификации истинно перепрограммированной глии следует использовать репортерных мышей и маркеры пролиферации клеток, которые позволяют отслеживать клетки, такие как EdU или BrdU. Поскольку целые сетчатки покрыты, выжившие нейроны присутствуют во всех культурах. Они, однако, почти полностью удаляются после прохождения в большинстве случаев. Тем не менее, маркировка EdU (или BrdU) должна быть выполнена для подтверждения того, что нейроны возникли из пролиферирующих MG / RPC и не являются выжившими нейронами (постмитотическими). Небольшое количество нейронов, обнаруженных в контроле, используемом здесь, являются выжившими нейронами.
Интересно, что несколько клеток Ascl1-Tom+ также присутствуют в контрольном лечении с немного увеличивающимся числом с течением времени. Эти клетки могут быть довольно незрелыми MG экспрессами Ascl1 при выделении и культивировании. Однако доля этой клеточной популяции Ascl1-Tom+ невелика. Более того, большинство из этих клеток Ascl1-Tom+, обнаруженных в контрольном лечении, не экспрессируют Otx2 и / или Map2 и сохраняют довольно плоскую форму клеток. Дифференцировка нейронов, по-видимому, не происходит в контролируемых условиях. Очень тонкие нейроноподобные клетки, которые, по-видимому, образуют сети, обнаруживаются только после лечения miR-25.
Протокол, описанный здесь, использовался в предыдущих исследованиях для тестирования микроРНК на перепрограммирование МГ21,27 и был немного изменен в последние годы в отношении пластин скважин для выращивания глии. Теперь они выращиваются в 12-луночных плитах, а не в 6-луночных плитах. Сливающиеся монослои могут быть получены в 12-луночных пластинах через 4/5 дня (против 6/8 дней с 6-луночными пластинами) и, следовательно, общий период культивирования, который приводит к изменению/дегенерации клеток, сокращается. Временное окно трансфекции также удлинено. Обычные протоколы трансфекции имеют продолжительность трансфекции 3 часа, после чего необходимо выполнить полное изменение среды, чтобы обеспечить выживание клеток. Все молекулы удаляются после этого изменения среды. В текущем протоколе временное окно было расширено, и более длительное воздействие миРНК было разрешено путем добавления 50% нейронной среды (дополненной факторами, необходимыми для индукции Cre и отслеживания пролиферации клеток) в среду трансфектного реагента. Клетки были здоровыми, и никаких проблем с этой модификацией не возникало. Похоже, что результаты трансфекции лучше с удлиненным временем трансфекции, но для подтверждения этого наблюдения требуется больше данных.
Кроме того, здесь описаны все этапы, необходимые для иммунофлуоресцентной маркировки для выполнения конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Следовательно, MG должен проходить на стеклянных крышках. Поскольку покровные листы меньше, чем площадь пластины из 24 скважин, только около одной трети ячеек, которые покрывали бы полный колодец пластины из 24 лунок, помещаются на покрытом крышке. Для других применений, таких как qPCR, RNA-Seq или западные пятна, клетки проходят в соотношении 1:1, обрабатывают и собирают в желаемый момент времени.
Как упоминалось ранее, эта система культивирования может также использоваться для других применений, например, для изучения глиального поведения, включая нейропротекторные механизмы, глиоз и/ или для профилирования мРНК, миРНК или белков культивируемой глии, аналогично исследованиям, в которых использовались несколько иные парадигмы культуры или виды 11,28,29,54 . Эти приложения не потребуют ни нейронной среды для обеспечения выживания нейронов после перепрограммирования, ни добавления EdU для визуализации пролиферации клеток. Вместо этого следует использовать среду с низким содержанием сыворотки без нейронных добавок.
Хотя этот метод является надежным и надежным, как и все первичные системы культивирования, он имеет ограничения; Это ограниченная продолжительность жизни клеток, прогрессирующая дегенерация клеток с течением времени28 и тот факт, что это 2-мерная система искусственной культуры, которая не может имитировать физиологический контекст в отношении как других типов клеток сетчатки, так и внеклеточного матрикса. Поэтому после выявления лучших кандидатов и их наиболее эффективных концентраций в первичных культурах МГ следует выполнить эксплантные культуры сетчатки, 3-мерную культуральную систему, напоминающую ткань сетчатки. Эксплантные культуры также имеют ограниченные периоды культивирования, а клетки эксплантов также дегенерируют с течением времени. Тем не менее, они позволяют изучать МГ в их естественной 3-мерной среде и могут быть выполнены в различном возрасте, отражающем стадию развития животного 23,32,55,56.
Взятые вместе, это исследование сообщает о культурах MG, используемых для мониторинга потенциала RPC miRNA miR-25 для перепрограммирования MG в нейроноподобные клетки, подтвержденные иммунофлуоресцентной маркировкой. Этот протокол использовался в предыдущих работах 21,24,27 и является текущим методом in vitro для изучения регенеративного потенциала МГ. В целом, первичные культуры МГ являются надежным методом и позволяют воспроизводить результаты 20,21. Хотя сверхэкспрессия миРНК для перепрограммирования MG описана здесь исключительно, другие факторы, такие как малые молекулы, ДНК (либо плазмиды, либо упакованные в вирусные векторы), антитела для ингибирования белка32 или специфические соединения могут быть использованы / протестированы в первичных культурах MG. Существует также широкий спектр последующих применений, включая профилирование миРНК24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 или западные пятна20. Кроме того, первичные культуры MG позволяют ежедневно наблюдать и наблюдать за клетками. Это может быть существенным преимуществом для определения временных точек, например, для начала, продолжительности и/или окончания определенной реакции или клеточного ответа. Мигрирующее или пролиферативное поведение, а также парадигмы, связанные с повреждением/повреждением клеток (например, глобальная делеция миРНК в культурах МГ)32 могут быть изучены и проанализированы в первичных культурах МГ для выявления основных механизмов и путей. Таким образом, культуры MG являются очень мощным инструментом для изучения MG на молекулярном и клеточном уровнях перед внедрением в системы in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Патент, включающий некоторые выводы в этом отчете, был подан Вашингтонским университетом с изобретателями Николасом Йорстадом, Стефани Г. Воль и Томасом А. Рехом. Патент называется «Способы и композиции для стимуляции регенерации сетчатки.
Acknowledgments
Авторы благодарят доктора Энн Битон и всех членов лаборатории за их вклад в рукопись. Особая благодарность докторам Тому Реху, Джулии Поллак и Рассу Тейлору за внедрение первичных культур MG в качестве инструмента скрининга для S.G.W. во время постдокторантуры в Вашингтонском университете в Сиэтле. Исследование финансировалось грантом Имперской инновационной программы (EIP) для S.G.W. и стартовыми фондами от SUNY Optometry до S.G.W., а также премией R01EY032532 от Национального института глаз (NEI) для S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
