Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN

Published: March 28, 2022 doi: 10.3791/63651
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

Summary

Les cultures primaires de glie de Müller obtenues à partir de rétines de souris représentent un outil très robuste et fiable pour étudier la conversion gliale en cellules progénitrices rétiniennes après un traitement par microARN. Des molécules uniques ou des combinaisons peuvent être testées avant leur application ultérieure d’approches in vivo .

Abstract

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale et peut fonctionner comme une source régénératrice pour les neurones rétiniens. Chez les vertébrés inférieurs tels que les poissons, la régénération entraînée par MG se produit naturellement; chez les mammifères, cependant, une stimulation avec certains facteurs ou une manipulation génétique / épigénétique est nécessaire. Étant donné que les MG ne représentent que 5% de la population cellulaire rétinienne, il existe un besoin de systèmes modèles permettant l’étude exclusive de cette population cellulaire. L’un de ces systèmes modèles est constitué de cultures MG primaires qui sont reproductibles et peuvent être utilisées pour une variété d’applications, y compris le criblage et l’identification de molécules / facteurs, le test de composés ou de facteurs, la surveillance cellulaire et / ou des tests fonctionnels. Ce modèle est utilisé pour étudier le potentiel de la MG murine à se convertir en neurones rétiniens après supplémentation ou inhibition des microARN (miARN) par transfection de miARN artificiels ou de leurs inhibiteurs. L’utilisation de souris rapporteures spécifiques à MG en combinaison avec le marquage immunofluorescent et le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) a confirmé que 80% à 90% des cellules trouvées dans ces cultures sont MG. En utilisant ce modèle, il a été découvert que les miARN peuvent reprogrammer MG en cellules progénitrices rétiniennes (RPC), qui se différencient ensuite en cellules neuronales. Les avantages de cette technique sont que les candidats miARN peuvent être testés pour leur efficacité et leurs résultats avant leur utilisation dans des applications in vivo .

Introduction

La glie de Müller (MG) est la glie prédominante dans la rétine neurale. Ils ont des fonctions similaires à celles d’autres glies dans d’autres parties du système nerveux central, telles que le maintien de l’homéostasie de l’eau et des ions, la nutrition des neurones et la protection des tissus. Les MG ont une autre caractéristique fascinante : bien qu’ils soient des glie matures, ils expriment encore de nombreux gènes exprimés dans les cellules progénitrices rétiniennes (RPC) à la fin du développement 1,2. Cette ressemblance est supposée être la raison de la régénération neuronale naturelle à base de MG dans la rétine du poisson après une lésion rétinienne 3,4. Au cours de ce processus, MG rentre dans le cycle cellulaire et se différencie en RPC qui se différencient ensuite en six types de neurones rétiniens. Bien que ce phénomène se produise naturellement chez les poissons, les MG de mammifères ne se convertissent pas en neurones 5,6. Ils peuvent toutefois être reprogrammés. Il a été démontré qu’une variété de facteurs reprogramment mg en RPC / neurones; parmi ces facteurs figure le facteur de transcription de base hélice-boucle-hélice (bHLH) homologue achaete-scute 1 (Ascl1) qui est impliqué dans la régénération des poissons 7,8. Chez la souris, Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC pendant la rétinogenèse mais est absent dans les neurones MG matures ou rétiniens9.

La reprogrammation des cellules directement in vivo est non seulement difficile sur le plan méthodologique, mais nécessite également l’approbation d’un comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Pour recevoir l’approbation, des données préliminaires sur le ou les facteurs utilisés ou modifiés, les concentrations, les effets hors cible, les mécanismes sous-jacents, la toxicité et l’efficacité sont requises. Les systèmes de culture cellulaire permettent de tester ces critères avant utilisation dans des modèles in vivo. De plus, comme les MG ne représentent qu’environ 5% de l’ensemble de la population de cellules rétiniennes10, les cultures MG permettent d’étudier leur fonction11 ainsi que leur comportement, y compris la migration 12,13, la prolifération14, la réaction au stress aux blessures / dommages15,16, leur interaction avec d’autres types de cellules telles que la microglie17 ou les cellules ganglionnaires rétiniennes (CGR)18, ou leur potentiel neurogène 19,20,21. De nombreux chercheurs utilisent des lignées cellulaires immortalisées pour leurs études car elles ont un potentiel prolifératif illimité et peuvent être facilement maintenues et transfectées. Les cellules primaires, cependant, sont préférables pour les essais biologiquement pertinents que les cellules immortalisées car elles ont de vraies caractéristiques cellulaires (expression des gènes et des protéines) et, plus important encore, elles représentent un certain stade de développement et ont donc un « âge ». L’âge d’un animal (et par conséquent des cellules obtenues à partir d’un animal) est un facteur particulièrement crucial dans la reprogrammation cellulaire puisque la plasticité cellulaire diminue avec le stade de développement avancé22.

Ce protocole décrit en détail comment reprogrammer la MG primaire avec des miARN comme méthode in vitro actuelle pour étudier la régénération. Ce modèle de culture primaire MG a été établi en 2012 pour évaluer les caractéristiques de prolifération cellulaire de MG chez les souris knock-out P53 (souris trp53-/-)23. Il a été démontré que les MG cultivés conservent leurs caractéristiques gliales (c’est-à-dire l’expression des protéines S100β, Pax6 et Sox2 évaluées par marquage immunofluorescent), et qu’ils ressemblent à des MG in vivo (microréseau de MG purifié par FACS)23. Peu de temps après, l’expression de l’ARNm glial et des protéines a été validée et confirmée dans une approche différente utilisant des vecteurs viraux20. Quelques années plus tard, il a été confirmé que la grande majorité des cellules trouvées dans ces cultures sont MG en utilisant la souris rapporteur Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl spécifique à MG 24. De plus, la quantification de l’ensemble des miARN dans le MG purifié par FACS et le MG primaire cultivé a montré que les niveaux de mg miARN (mGLiomiRs) ne varient pas beaucoup dans le MG cultivé pendant la phase de croissance. Les périodes de culture allongées, cependant, provoquent des changements dans les niveaux de miARN et, par conséquent, dans les niveaux d’ARNm et l’expression des protéines, car les miARN sont des régulateurs translationnels25.

En 2013, ce modèle de culture MG a été utilisé pour tester une variété de facteurs de transcription en ce qui concerne leur capacité à reprogrammer MG dans les neurones rétiniens20. Ascl1 s’est avéré être un facteur de reprogrammation très robuste et fiable. La surexpression d’Ascl1 via des vecteurs viraux a induit des changements morphologiques, l’expression de marqueurs neuronaux et l’acquisition de propriétés électrophysiologiques neuronales. Plus important encore, les connaissances et les résultats obtenus à partir de ces premières expériences in vitro ont été transférés avec succès à des applications in vivo 22,26, démontrant que les cultures MG primaires représentent un outil solide et fiable pour les criblages factoriels initiaux et l’évaluation des caractéristiques gliales avant la mise en œuvre in vivo.

Il y a quelques années, il a été démontré que le miARN miR-124 enrichi par le cerveau, qui est également fortement exprimé dans les neurones rétiniens, peut induire l’expression d’Ascl1 dans MG21 cultivé. L’expression d’Ascl1 dans les cellules vivantes a été visualisée via une souris rapporteure Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Une souris rapporteure est une souris génétiquement modifiée qui a un gène rapporteur inséré dans son ADN. Ce gène rapporteur code pour une protéine rapporteure, qui est dans cette étude tdTomato, une protéine fluorescente rouge. Cette protéine rapporteure rapporte l’expression d’un gène d’intérêt, en l’occurrence Ascl1. En d’autres termes, les cellules qui expriment Ascl1 deviendront rouges. Étant donné qu’Ascl1 n’est exprimé que dans les RPC9, cette souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl permet de suivre la conversion DE MG en RPC exprimant Ascl1 , ce qui signifie que la conversion des cellules exprimera la protéine rapporteure tdTomato fluorescente rouge. Il s’agit d’un marquage irréversible puisque l’ADN de ces cellules est altéré. Par conséquent, toute différenciation neuronale ultérieure sera visualisée car l’étiquette tdTomato reste dans les cellules différenciantes. Si Ascl1 exprimant des RPC dérivés de MG (avec étiquette tdTomato) se différencient en neurones, ces neurones auront toujours leur étiquette rouge. Cette souris permet donc non seulement l’étiquetage des RPC dérivés de MG pour l’imagerie de cellules vivantes, mais permet également la cartographie du destin et le traçage de la lignée de ces RPC dérivés de MG (rouges). Plus récemment, l’ensemble des miARN dans les RPC a été identifié et des cultures MG de souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter ont été utilisées pour dépister et tester l’effet de ces miARN sur la capacité et l’efficacité de reprogrammation27. Un candidat, le RPC-miRNA miR-25, s’est avéré capable de reprogrammer la MG cultivée dans des cellules exprimant Ascl1 (Ascl1-Tomato+). Ces cellules reprogrammées adoptent des caractéristiques neuronales au fil du temps, y compris la morphologie neuronale (petits somata et processus fins courts ou longs), l’expression des transcriptions neuronales mesurées via scRNA-Seq, ainsi que l’expression de protéines neuronales validées par marquage immunofluorescent27.

Ici, le protocole détaille comment cultiver et transfecter MG à partir de souris P12 adaptées des travauxprécédents 21,24,27. Choisi pour ce protocole est le miARN miR-25 susmentionné, un miARN fortement exprimé dans les RPC, avec de faibles niveaux d’expression dans les neurones MG ou rétiniens. Afin de surexprimer miR-25, des mimiques murines miR-25, c’est-à-dire des molécules artificielles de miARN sont utilisées. Comme contrôle, on choisit des imitations d’un miARN de Caenorhabditis elegans, qui n’ont aucune fonction dans les cellules de mammifères. La visualisation de la conversion de MG en RPC a été réalisée via la souris rapporteur RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), une souris avec un fond mixte (souches C57BL/6, S129 et ICR). Cette culture peut toutefois être réalisée avec toutes les souches de souris, y compris les souches de type sauvage. Au cours des dernières années, le protocole original a été modifié pour réduire la durée de la phase de croissance et la période de culture globale et assurer un statut de cellule gliale plus robuste et minimiser le degré de dégénérescence cellulaire, qui se produit pendant les périodes de culture prolongées. La fenêtre de temps de transfection régulière a également été prolongée de 3 h à 2 jours. Comme mentionné précédemment, bien que le protocole actuel décrive les cultures MG comme un outil pour les études de régénération, la méthode est non seulement utile pour tester les facteurs de reprogrammation, mais peut également être adaptée à d’autres applications, y compris des études sur le comportement migratoire ou prolifératif MG, les paradigmes liés aux blessures / dommages cellulaires, et / ou l’identification des mécanismes et des voies sous-jacents.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du SUNY College of Optometry.

REMARQUE: Ce protocole de culture se compose de trois phases: la croissance, la transfection et la phase de conversion. Un résumé du protocole global avec la chronologie est donné à la figure 1.

1. Préparation des milieux et de tous les réactifs requis

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité (BSC) A2 ou B2. Pendant la phase de croissance, un milieu de croissance sérique élevé est utilisé qui consiste en un milieu neuronal basal complété par un facteur de croissance épidermique (EGF). Pour la phase de conversion, un milieu basal neurophysiologique à faible sérum complété par des suppléments neuronaux est utilisé pour assurer la différenciation neuronale et la survie.

  1. Préparer le milieu de croissance (utilisé pendant la phase de croissance) en complétant 200 mL de milieu neuronal basal avec 20 mL de sérum bovin fœtal (FBS, 10%), 1 mL de 200 mM de L-glutamine (0,5%), 2 mL de pénicilline/streptomycine (1%) et 2 mL de supplément de N2 (1%). Effectuer une filtration stérile (unités de filtration avec une taille de pore de 0,22 μm). Préchauffer le milieu dans un bain de billes métalliques à 37 °C avant utilisation.
  2. Préparer le milieu neuronal (utilisé pendant la phase de conversion) en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux) en complétant 100 mL de milieu basal neurophysiologique sans sérum par 2 mL de supplément neuronal B27 (2 %), 1 mL de supplément de N2 (1 %), 20 μL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau de 100 ng/mL (BDNF, reconstitué dans 0,1 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, concentration finale 20 ng/mL), 20 μL de 100 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé des cellules gliales (GDNF, reconstitué dans une solution saline équilibrée stérile de Hanks [HBSS], concentration finale 20 ng/mL), 500 μL de 100 mg/mL de Dibutyryl-cAMP (reconstitué dans le DMSO), 70 μL d’acide ascorbique de 50 ng/mL (reconstitué dans le PBS stérile) et 1,5 mL de pénicilline/streptomycine. Effectuer une filtration stérile (unités de filtration avec une taille de pore de 0,22 μm). Milieu préchauffant dans un bain de billes métalliques à 37 °C avant utilisation.
    REMARQUE: Ces supports peuvent être conservés à 4 °C, pendant 1 mois.
  3. Reconstituer la papaïne, la DNase I et les réactifs ovomucoïdes nécessaires à la dissociation rétinienne selon le protocole du fabricant. Aliquote 750 μL de papaïne dans des tubes stériles de 1,5 mL, 75 μL de DNase I dans des tubes stériles de 0,6 mL et 750 μL d’inhibiteur de la protéase ovomucoïde dans des tubes de 2 mL. Congeler les aliquotes de papaïne et de DNase I à -20 °C et conserver les aliquotes ovomucoïdes à 4 °C pour éviter la dégradation des réactifs. Décongeler à température ambiante juste avant utilisation.
    REMARQUE: La papaïne, la DNase I et l’ovomucoïde se trouvent dans un kit appelé Système de dissociation de la papaïne (voir tableau des matériaux).
  4. Reconstituer la poly-L-ornithine (Poly-O) et la laminine pour le revêtement de couverture si le marquage immunofluorescent est effectué en suivant les instructions de la fiche technique (Poly-O: 0,1 mg/mL dans de l’eau stérile; Laminine : diluer 1,2 mg/mL à 1:50 dans le DMEM). Aliquote Poly-O et Laminine (2,5 mL) et congeler les aliquotes à -20 °C. Décongeler à température ambiante juste avant utilisation.
    REMARQUE: Étape 1.4. n’est nécessaire que si un marquage immunofluorescent et une microscopie à balayage laser sont effectués.

2. Extraction de souris et de tissus

REMARQUE: Pour ces études de reprogrammation, la souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl a été créée en croisant une souris Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) avec une souris tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Cette souris a un fond mixte (souche C57BL/6, S129 et ICR). Le génotype de cette souris est illustré à la figure 1A. Toutes les souches peuvent être utilisées pour ce protocole.

  1. Portez des gants et désinfectez l’espace de travail, y compris le microscope à dissection et tous les outils fins (pinces courbes Dumont #5 et Dumont #7, ciseaux fins et ciseaux Vannas) avec 70% d’éthanol. Désinfectez un plat de dissection noir enduit de silicone de 10 cm en l’exposant à la lumière UV pendant 20 min.
  2. Préparation de plats et d’assiettes pour l’extraction des tissus
    1. Préparer une plaque de 24 puits pour la collecte des yeux et la séparation des échantillons (deux yeux par souris dans un puits, étiquetés avec des ID de souris) avec ~ 1 mL de HBSS froid (4 °C) par puits. Placez la plaque de 24 puits sur de la glace.
    2. Remplissez une boîte de Petri stérile de 10 cm (pour le lavage) et la boîte de dissection désinfectée recouverte de silicone avec plusieurs mL de HBSS froid (4 °C) pour vous assurer que le tissu est entièrement recouvert de HBSS.
    3. Préparer un tube stérile de 1,5 mL avec 1 mL d’éthanol à 70 %.
    4. Préparez une plaque de culture de 12 puits en étiquetant la plaque avec le numéro de culture, la date, la souche et toutes les informations requises.
  3. Euthanasier les souris P12 en utilisant n’importe quelle méthode approuvée.
  4. Enlèvement des yeux
    1. Tenez doucement la tête de la souris avec le pouce et l’index autour de l’œil.
    2. À l’aide de pinces incurvées Dumont #7, allez doucement derrière le globe oculaire et coupez le nerf optique. Retirez soigneusement l’œil.
      REMARQUE: Si des souris adultes sont utilisées, n’utilisez pas de pince incurvée et ne tirez pas l’œil. Au lieu de cela, coupez soigneusement autour du globe oculaire à l’aide de ciseaux fins; couper le nerf optique mais ne pas couper l’œil lui-même. Utilisez une pince pour retirer soigneusement le globe oculaire.
  5. Nettoyage des globes oculaires
    1. Trempez brièvement le globe oculaire dans un tube contenant de l’éthanol pour éviter le transfert de bactéries de l’animal.
    2. Lavez brièvement le globe oculaire dans la boîte de Petri de 10 cm avant de le placer dans la plaque de 24 puits sur de la glace.
  6. Répétez les étapes 2.4 et 2.5 pour les autres yeux. Gardez la plaque de puits sur la glace pendant le processus. Placez deux yeux d’un animal dans la boîte de dissection placée sous un microscope à dissection avec une source de lumière.
  7. Extraction de la rétine
    1. Fixez un globe oculaire en saisissant le nerf optique et le tissu conjonctif environnant autour de la sclérotique avec une pince fine Dumont #5 et appuyez-le soigneusement contre la boîte de dissection (cornée vers le haut).
    2. Faites un trou au centre de la cornée à l’aide d’une aiguille de 30 G pour permettre un accès plus facile aux ciseaux Vannas.
    3. Disséquez la cornée autour du corps ciliaire à l’aide de ciseaux Vannas et retirez soigneusement la cornée, le cristallin, l’iris et le corps vitré avec une pince fine Dumont #5. La figure 2A illustre une coupe oculaire avec la rétine à l’intérieur.
    4. Disséquez la sclérotique avec des ciseaux Vannas jusqu’à ce que le nerf optique soit atteint. Coupez le nerf optique et extrayez soigneusement la rétine à l’aide de pinces fines Dumont #5.
    5. Utilisez une deuxième paire de pinces fines Dumont #5 pour pousser contre la rétine et permettre l’ablation complète du corps vitré. La figure 2B illustre deux rétines extraites.
  8. Transfert et lavage
    1. Couper environ 2,5 cm de l’extrémité d’une pipette de transfert stérile pour agrandir le diamètre. À l’aide de cette pointe, ramassez (aspirez) des rétines entières sans endommager les tissus.
    2. Transférer les rétines dans une nouvelle boîte de Petri stérile avec du HBSS froid (4 °C) et bercer la boîte (d’avant en arrière, à gauche et à droite).
    3. À l’aide de la pointe de la pipette de transfert, poussez soigneusement les rétines pour laver les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR).
      REMARQUE: Alternativement, toute la rétine avec le cristallin et le corps vitré peut être retirée de la coupe oculaire. Ensuite, le cristallin et le corps vitré peuvent être retirés de la rétine extraite. Si la rétine est déchirée, assurez-vous de ramasser tous les morceaux pour la dissociation; sinon, il n’y aura pas suffisamment de tissus pour développer des couches cellulaires confluentes.
  9. Placez immédiatement la rétine isolée dans un nouveau puits propre de la plaque de 24 puits remplie de 1 mL de HBSS. Gardez la plaque de 24 puits sur la glace pendant le processus de dissection.
  10. Répétez les étapes 2.7-2.9 pour isoler la deuxième rétine.

3. Dissociation de la rétine

REMARQUE: Toutes les étapes suivantes (jusqu’à la récolte des cellules) doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité (BSC) A2 ou B2.

  1. Préparer le mélange de dissociation Papaïne/DNase I comme suit.
    1. Pour six rétines, ajouter 75 μL de DNase I dans le tube contenant 750 μL de papaïne (à partir de l’étape 1.3) et mélanger soigneusement (mélange de dissociation).
    2. Pour la préparation individuelle de l’échantillon requise pour ce protocole, diviser le volume total de 825 μL en trois aliquotes : 275 μL du mélange dans un tube de 1,5 mL par souris (deux rétines). Calculez les quantités requises de DNase I et de Papaïne en conséquence.
      REMARQUE: Jusqu’à six rétines peuvent être dissociées dans un tube de mélange papaïne / DNase I. Cependant, la préparation individuelle des échantillons entraîne moins d’amas et une meilleure croissance cellulaire que dans les échantillons combinés.
  2. Transférer deux rétines dans le mélange de dissociation Papaïne/DNase I. Utilisez une pipette de transfert avec un diamètre de pointe élargi (étape 2.8.1), ramassez les rétines, attendez que les rétines se déposent au bas de la pointe, puis relâchez les rétines sans HBSS excessif dans le tube contenant le mélange Papaïne/DNase I.
  3. Placer sur un nutator et l’incuber pendant 10 min dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5% de CO2).
  4. Dissocier les cellules en pipetant soigneusement de haut en bas (environ 20-30 fois) avec une pipette de 1 mL. Une fois les cellules dissociées (c.-à-d. résultant en une solution homogène sans morceaux), ajoutez 275 μL d’inhibiteur de la protéase ovomucoïde du kit de dissociation de la papaïne pour neutraliser la papaïne. Mélanger doucement en pipetant de haut en bas.
    REMARQUE: Si six rétines ont été dissociées dans 825 μL de mélange papaïne/DNase I, 825 μL d’ovomucoïde sont nécessaires.
  5. Centrifuger le mélange à 300 x g pendant 10 min à 4 °C.
  6. Ajouter le facteur de croissance épidermique (EGF, 1 μL pour 1 mL du milieu de croissance, reconstitué à 200 μg/mL dans le PBS) au volume calculé du milieu de croissance (1 mL par souris) préchauffé à 37 °C.
    REMARQUE: Selon la conception expérimentale, le marqueur de prolifération 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine (EdU), ainsi que le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT) ou d’autres facteurs requis peuvent être ajoutés au début de la période de culture.
  7. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse. Ne touchez pas la pastille au fond du tube.
  8. Retirez le surnageant soigneusement et entièrement. Remettre en suspension la pastille cellulaire avec 500 μL de milieu de croissance supplémenté en EGF.
  9. Transférer la suspension de la cellule dans un puits de la plaque étiquetée à 12 puits (Figure 2C). Rincez le tube avec 500 μL supplémentaires du milieu de croissance supplémenté en EGF et ajoutez-le au puits (volume total de 1 mL par puits).
  10. Répétez les étapes 3.8 et 3.9 avec tous les autres échantillons.
  11. Bercez la plaque du puits trois fois avec précaution (d’avant en arrière; à gauche et à droite). Placer la plaque dans l’incubateur (37 °C, CO2).
    REMARQUE: Si des souris transgéniques sont utilisées, effectuez un génotypage pour chaque animal (Figure 2D). Identifiez les souris positives et négatives à la Cre recombinase et étiquetez la plaque en conséquence. Pour ce protocole, seules des cellules de souris rapporteures positives à la Cre recombinase ont été utilisées pour les étapes suivantes. Les cellules des spécimens de Cre négatif sont congelées et utilisées pour d’autres applications.

4. Phase de croissance

REMARQUE: La phase de croissance a une durée d’environ 4-5 jours (Figure 1B). Pour ajouter des liquides aux puits contenant des cellules, la pipette doit pointer vers la paroi du puits et le liquide doit être libéré lentement pour éviter le détachement cellulaire. Ne pas pipeter directement sur les cellules.

  1. Un jour après la dissociation, retirez le milieu et ajoutez 1 mL de milieu de croissance frais supplémenté en EGF.
  2. Le jour 3, retirez le milieu et ajoutez 1 mL de HBSS (température ambiante) pour éliminer les débris cellulaires. Basculez doucement d’avant en arrière de gauche à droite. Retirez le HBSS, répétez l’étape de lavage et ajoutez 1 mL de milieu de croissance préchauffé supplémenté en EGF.
  3. Surveillez les cellules tous les jours et évaluez leur état de croissance jusqu’à ce que les cellules atteignent une confluence de 90% à 100%. La figure 3 montre un exemple de bonne croissance de MG au fil du temps. Vérifiez s’il y a une éventuelle contamination ou la mort cellulaire (figure supplémentaire 1). Jeter les cultures contaminées.
    REMARQUE: Pour surveiller et enregistrer l’état de la cellule, prenez des images à différents grossissements à l’aide d’un microscope optique avec une caméra attachée et des objectifs 4x, 10x ou 20x. Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé.

5. Préparation des couvertures avec de la poly-L-ornithine (Poly-O) et une couche de laminine

REMARQUE: Cette étape n’est nécessaire que si le marquage immunofluorescent et la microscopie confocale à balayage laser sont effectués. Des couvercles ronds en verre (12 mm de diamètre) sont nécessaires pour une imagerie correcte. Le protocole de revêtement se trouve également dans la fiche technique du milieu neuronal (voir Tableau des matériaux).

  1. Placez soigneusement les couvercles stériles au centre de chaque puits d’une plaque de 24 puits à l’aide de pinces à #2AP Dumont stériles.
    REMARQUE: Placez des couvertures au centre du puits. Placer des couvercles près de la paroi d’un puits entraînera des problèmes de tension superficielle pour les étapes suivantes.
  2. Décongeler une aliquote Poly-O de 2,5 mL à température ambiante et en placer 100 μL au centre de chaque couvercle.
  3. Incuber la plaque du puits pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
  4. Retirez le Poly-O et lavez le puits avec le couvercle trois fois avec ~ 1 mL d’eau stérile.
  5. Laissez sécher la plaque de puits pendant la nuit dans le BSC. Décongeler 2,5 mL de laminine à 4 °C pendant la nuit.
  6. Le lendemain matin, ajouter 100 μL de Laminine au centre de chaque couvercle et incuber pendant 4 h dans un incubateur à 37 °C.
  7. Retirez la laminine soigneusement et entièrement.
  8. Maintenir la plaque à 4 °C si le passage ne peut pas être effectué immédiatement.
    REMARQUE: Les couvercles enduits dans des plaques préparées peuvent être conservés pendant quelques jours à 4 ° C.

6. Passage cellulaire pour éliminer les survivants neuronaux

REMARQUE: Le passage cellulaire est nécessaire pour éliminer les cellules neuronales, pas pour augmenter la population cellulaire. Glia ne se divise que quelques fois et ne grandira pas plus après le passage. Ne pas diluer les suspensions cellulaires. Les cellules d’un puits confluent d’une plaque de 12 puits peuvent être réparties sur un puits d’une plaque de 12 puits ou sur deux puits d’une plaque de 24 puits. Lorsque des couvercles enduits sont utilisés, seulement environ un tiers du couvercle est revêtu. Par conséquent, six couvercles assis dans une plaque de 24 puits, avec des cellules confluentes (~ 80% -90%) peuvent être obtenus à partir d’un puits de cellules confluentes d’une plaque de 12 puits. D’autres rapports peuvent également être choisis pour augmenter ou diminuer la densité cellulaire. Pour ce protocole, une souris rapporteur Cre+ est utilisée [une expérience, deux traitements : miR-25 ou control-miR ; réplique technique n = 3 (trois couvercles par traitement), réplication biologique n = 1]. Le nombre de répliques techniques et biologiques peut être défini différemment selon la conception expérimentale.

  1. Vérifiez si les cellules sont confluentes à 90% à 100% (également à la marge du puits; Figure 3E,F).
  2. Retirer le milieu et ajouter 1 mL de HBSS (température ambiante) pour laver. Bercez doucement la plaque (d’avant en arrière, à gauche et à droite). Retirez complètement HBSS.
  3. Ajouter 500 μL d’une solution préchauffée contenant de la trypsine (préchauffée à 37 °C dans un bain de billes métalliques) pour détacher les cellules du puits. Basculez doucement (d’avant en arrière, de gauche à droite) et incubez pendant 2 min dans un incubateur à 37 °C.
  4. Déplacez la plaque de l’incubateur vers BSC. Pendant l’inclinaison, aspirez la solution contenant de la trypsine et dispersez-la soigneusement et lentement sur le puits plusieurs fois jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement. Tenez la plaque contre la lumière et assurez-vous qu’aucune cellule n’est laissée en bas.
  5. Transférer cette suspension cellulaire dans un tube stérile de 1,5 mL. Centrifuger à 300 x g pendant 8 min à 4 °C.
  6. Retirez le surnageant et remettez soigneusement en suspension la pastille cellulaire en ajoutant 600 μL (100 μL par puits pour 6 puits/couvercles) de milieu de croissance préchauffé (complété par de l’EGF; 1:1000). et pipeter de haut en bas ~ 30-40 fois.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être congelées à ce moment à -80 ° C ou dans de l’azote liquide et décongelées selon les protocoles standard pour la décongélation des lignées cellulaires. Si les cellules sont congelées, elles ne seront pas remises en suspension dans un milieu supplémenté en EGF (milieu de croissance). Ils seront remis en suspension en milieu de base (sans EGF) et en solution de congélation (rapport 1/1). Les étapes 6.1.1 à 6.6.2 décrivent les étapes de congélation des cellules. Si aucune cellule n’est gelée, passez à l’étape 6.7.
    1. Préparer la solution de congélation en mélangeant 100 μL de DMSO et 400 μL de FBS (volume total de 500 μL par puits/échantillon).
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 500 μL de milieu de croissance préchauffé. Ajouter la suspension cellulaire à 500 μL de solution de congélation DMSO/FBS (volume total de 1 mL). Conservez les tubes sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons soient traités. Congeler les cellules à -20 °C pendant 1 h, puis les conserver à -80 °C.
  7. Ensemencer des cellules en plaçant 100 μL de la suspension cellulaire/média de 600 μL (étape 6.6) au centre de six couvercles enduits (voir étape 5) de la plaque de 24 puits. Placez soigneusement la plaque dans l’incubateur et laissez les cellules se déposer.
    REMARQUE: 100 μL de la suspension cellulaire de 600 μL (récoltée dans un puits d’une plaque de 12 puits) entraînera une confluence cellulaire de 90% à 100%, ce qui est nécessaire pour la transfection.
  8. Vérifiez les cellules après 3 h pour voir si elles se sont installées sur le couvercle. Ajouter 400 μL de milieu de croissance complété par du FEM.
    REMARQUE : Les cellules sont généralement prêtes à être transfectionnées le lendemain (Figure 3G). S’ils ne sont pas confluents (90%-100%), laissez-les pour un autre jour. S’ils ne sont toujours pas confluents, ne les utilisez pas pour la transfection. Si d’autres applications en aval sont menées, telles que le profilage des miARN, l’ARN-Seq, la RT-qPCR ou le transfert western, les cellules doivent être acheminées dans des plaques à 12 puits (rapport 1:1; aucun traitement de plaque requis) et récoltées pour l’extraction de l’ARN / protéine.

7. Transfection

REMARQUE: La phase de transfection se compose d’une phase de 3 h dans le milieu de transfection uniquement (les procédures de transfection sont décrites dans le manuel de transfection fourni avec le réactif de transfection) et d’une phase allongée dans laquelle le réactif de transfection et les miARN sont toujours présents, mais un milieu neuronal avec les suppléments requis est ajouté (la durée totale est de 2 jours; Figure 1B). Dans ce protocole, six puits seront transfectés : trois puits recevront le miARN de reprogrammation miR-25 et trois puits recevront le miARN de contrôle.

  1. Vérifiez si les cellules ont atteint 90% de confluence et enregistrez/imagez les cellules avant la transfection.
  2. Retirer le milieu de croissance et ajouter 500 μL de HBSS (température ambiante) pour laver les cellules.
  3. Retirer HBSS et ajouter 400 μL de milieu sérique réduit utilisé pour les transfections. Replacez la plaque dans un incubateur à 37 °C.
  4. Préparez le mélange de transfection en suivant les instructions du protocole de réactif de transfection du fabricant. Faire deux mélanges : mélange de réactif de transfection et mélange de miARN (voir la figure 1B pour l’illustration).
    1. Préparer le mélange de réactif de transfection : Pour une plaque de 24 puits, 49 μL de milieu sérique réduit et 1 μL de réactif de transfection sont nécessaires pour un puits (50 μL au total). Pour six puits, 294 μL de milieu sérique réduit et 6 μL de réactif de transfection sont combinés et bien mélangés en pipetant doucement de haut en bas.
    2. Préparer un mélange mimique de miARN : Pour une plaque de 24 puits, un volume total de 50 μL du mélange mimétique est nécessaire pour un puits. Trois puits recevront le miARN témoin et les trois autres puits seront traités avec du miR-25. Pour ce protocole, une concentration finale de 200 nM est utilisée.
      1. Pour le traitement miR-25 (trois puits), 150 μL de milieu sérique réduit et 3 μL d’imitations miR-25 (solution mère de 100 μM) sont combinés et bien mélangés en piquant doucement de haut en bas. Incuber pendant 5 min.
        Pour le traitement des mimiques de contrôle (trois puits), 150 μL de milieu sérique réduit et 3 μL d’imitations de miARN de contrôle (solution mère de 100 μM) sont combinés et bien mélangés en pipetant doucement de haut en bas. Incuber pendant 5 min.
        REMARQUE: Le volume d’imitations de miARN dépend du facteur de dilution et de la concentration nécessaires (20-500 nM). Les inhibiteurs de miARN (antagomiRs), ou d’autres molécules, y compris les plasmides, peuvent également être utilisés. En outre, des combinaisons de molécules peuvent être transfectées.
  5. Combinez le mélange d’imitation de miARN et le mélange de réactif de transfection. Mélanger soigneusement en pipetant lentement et soigneusement en pipetant doucement de haut en bas. Incuber pendant 20 min à température ambiante (selon les instructions du fabricant).
  6. Ajouter le mélange de transfection ci-dessus goutte à goutte et lentement sur le dessus des cellules, près de la surface du milieu dans le puits à l’aide d’une pipette de 20 μL. Bercez doucement la plaque (d’avant en arrière, de gauche à droite).
  7. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 3 h.
  8. Après 3 h, ajouter un milieu neuronal aux puits (500 μL par puits) complété par du 4-hydroxytamoxifène (stock de 5 mM reconstitué avec 2,58 mL d’éthanol, concentration finale de 250 nM) pour activer la Cre recombinase et la 5-éthyynyl-2'-désoxyuridine (EdU, solution mère de 10 mM reconstituée avec 2 mL de DMSO, concentration finale de 1 μM) pour suivre la prolifération cellulaire.
    ATTENTION : Le 4-hydroxytamoxifène et l’EdU sont connus pour être des cancérogènes, des tératogènes et des mutagènes pour l’homme. Lisez la fiche de données de sécurité avant utilisation et portez des gants, des lunettes et des blouses de laboratoire. Reconstituer les deux réactifs selon les recommandations du fabricant. Ne pas inhaler la substance/le mélange. Fermer hermétiquement après utilisation. Les déchets doivent être éliminés conformément aux réglementations nationales et locales. Lavez-vous les mains et le visage après avoir travaillé avec la substance.
  9. Incuber dans un incubateur à 37 °C pendant 2 jours (Figure 1B).

8. Conversion cellulaire

REMARQUE: La phase de conversion cellulaire a une durée d’environ 5-6 jours (Figure 1B), mais des périodes plus longues sont possibles.

  1. Vérifiez quotidiennement les cellules pour une induction réussie de l’expression de tdTomato, une mort cellulaire potentielle et / ou une contamination. La densité cellulaire ne change pas (Figure 4). Les premières cellules fluorescentes rouges faibles peuvent être observées 1 jour après le traitement au 4-hydroxytamoxifène. Un microscope fluorescent est nécessaire pour surveiller et imager les cellules.
    REMARQUE: Dans cette étude, un microscope à fluorescence est utilisé pour l’imagerie en direct. Les images sont prises avec des objectifs 4x, 10x ou 20x.
  2. Deux jours après la transfection, retirer le milieu et ajouter 500 μL de milieu neuronal préchauffé complété par du 4-hydroxytamoxifène et de l’EdU dans chaque puits.
  3. Remplacez le milieu par un milieu frais tous les deux jours jusqu’à ce que les cellules soient récoltées.
  4. Prenez des images en direct pour l’évaluation et l’évaluation du nombre de cellules fluorescentes rouges (exprimant Ascl1) et de leurs changements morphologiques (Figure 4 et Figure 5A-C).

9. Récolte cellulaire : fixation pour marquage immunofluorescent

REMARQUE: Les cellules peuvent être récoltées pour d’autres applications en aval, y compris le vrac ou scRNA-Seq, RT-qPCR ou Western Blot.

  1. Retirer le milieu et ajouter 500 μL de HBSS froid (4 °C) par puits et balancer doucement la plaque (d’avant en arrière, de gauche à droite). Supprimez HBSS.
  2. Fixez les cellules en ajoutant 500 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 2 % et en incubant pendant 20 min à température ambiante.
  3. Effectuer un marquage immunofluorescent selon les protocoles établis.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ce protocole décrit comment cultiver mg à partir de rétines de souris P12 et comment reprogrammer ces cellules avec miR-25 en neurones rétiniens à l’aide de la souris rapporteur Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Cette méthode a été utilisée dans des travaux antérieurs rapportant en détail d’autres miARN appropriés (mimiques ou inhibiteurs, en tant que molécules uniques ou en combinaison) pour reprogrammer MG en RPC qui adoptent ensuite les caractéristiques des cellules neuronales27. Cette méthode a été modifiée pour faire pousser les cultures plus rapidement et ainsi minimiser les altérations cellulaires causées par l’environnement artificiel au fil du temps 24,28,29.

Dissociation rétinienne et phase de croissance des cultures MG primaires
Le premier MG peut être repéré dès le premier jour in vitro à l’aide d’un microscope optique. Les MG ont une forme tubulaire allongée et des corps cellulaires gris clair (Figure 3A-D, pointes de flèches rouges). La plupart d’entre eux sont cependant recouverts de débris cellulaires à ces premiers stades. Mg de deux rétines d’une souris, cultivées dans un puits d’une plaque de 12 puits, atteint une confluence de 90% à 95% en 4-5 jours (Figure 3E, F). Au fil du temps, tous les débris neuronaux seront éliminés et une couche cellulaire dense sera présente. Les cellules ne sont pas prêtes à être passées si le fond du puits n’est pas complètement confluent. Cependant, le passage ne doit pas être fait plus de 6 jours in vitro car la glie perd ses caractéristiques gliales en culture au fil du temps. Avant la transfection ou tout autre traitement, les cellules doivent être vérifiées pour la densité et la vitalité. La transfection ne doit être effectuée que sur des cellules confluentes à 90 % à 95 % (figure 3G). Pour le marquage immunofluorescent et l’analyse par microscopie confocale, les cellules doivent être ensemencées sur des couvercles enrobés.

Phase précoce et tardive de la période de conversion cellulaire
Dès 15 heures après la transfection et le traitement au 4-hydroxytamoxifène, les premières cellules commencent à exprimer une faible fluorescence rouge, c’est-à-dire la protéine rapporteur fluorescente rouge tdTomato entraînée sous le promoteur Ascl1 (activé). Les cellules exprimant Ascl1 sont maintenant appelées cellules Ascl1-Tom+. Une expression plus robuste d’Ascl1-Tom peut être observée 2 jours après la transfection avec une fluorescence rouge croissante au fil du temps (Figure 4). L’effet de reprogrammation devient visible vers 2 jours en culture avec de nombreuses cellules Ascl1-Tom+ par champ trouvées dans le traitement de reprogrammation des miARN: montré ici pour le contrôle-miR et miR-25 (Figure 4B-B''' et Figure 4C-C''', respectivement). Dans les deux traitements, les cellules Ascl1-Tom+ sont encore assez rondes et relativement grandes, avec une morphologie plus glia/progénitrice. De plus, l’induction du rapporteur fluorescent rouge n’influence pas la densité cellulaire de la culture (encore confluente à 90%-95%).

Trois à cinq jours après la transfection (figure 4A et figure 5A), l’augmentation du nombre de cellules Ascl1-Tom+ devient plus évidente dans les puits traités par miR-25 (figure 5B-D), montrant une multiplication par quatre après les traitements miR-25 par rapport aux témoins. De plus, les premiers changements morphologiques deviennent visibles. Ces changements comprennent la réduction de la taille du soma cellulaire et le développement de processus fins. Alors que dans des conditions de contrôle, la grande majorité des cellules sont grandes et plates (gliales / progénitrices, Figure- 5B-B''), de nombreuses cellules avec de petits noyaux et plusieurs petits processus ressemblant à des neurones rétiniens apparaissent dans le traitement miR-25 (Figure- 5C-C''). Ces cellules de type neuronal représentent environ 70 % de la population totale d’Ascl1-Tom (15 % en traitement témoin; Figure 5E). Les cellules sont moins denses en raison de la conversion cellulaire (les cellules plus petites nécessitent moins d’espace). Fait intéressant, ces cellules neuronales semblent même former de minuscules réseaux (Figure 5C''). À l’heure actuelle, les cellules peuvent être récoltées pour un marquage immunofluorescent afin de confirmer l’identité neuronale.

Confirmation de l’identité neuronale
Les cellules sont marquées avec des anticorps contre la protéine 2 associée aux microtubules (Map2), un marqueur des protéines cytosquelettiques spécifiques aux neurones30,31, et contre l’homéobox orthodenticle 2 (Otx2) pour valider l’identité neuronale32,33. Les deux marqueurs ont également été utilisés dans des études de reprogrammation antérieures21,27. Otx2 est un facteur de transcription présent dans les RPC 34,35,36, les cellules bipolaires matures 34,35,37,38,39 et les photorécepteurs 35,36,37,38,40 . L’étiquetage nucléaire DAPI est utilisé pour contrer les cultures. L’étiquetage immunofluorescent montre peu ou pas d’expression de Map2 ou d’Otx2 dans les conditions de contrôle (Figure 6A-A''',C). Les échantillons traités miR-25, cependant, ont de nombreuses cellules Map2+ et Otx2+ (Figure 6B-B'''). La quantification des images confocales montre qu’après une surexpression de miR-25, environ 40 cellules neuronales par champ sont présentes par rapport à cinq cellules neuronales par champ chez les témoins (Figure 6C, taille du champ : 630 μm x 630 μm). Les images ont été prises avec un objectif 20x. Ces cellules neuronales constituent environ 70 % de la population totale de cellules Ascl1-Tom+ des échantillons traités miR-25 (contrôle ~20 %, Figure 6D). Toutes les cellules Ascl1-Tom+ de type neuronal étaient Map2+ et Otx2+, confirmant l’identité neuronale. De plus, le nombre absolu de cellules Otx2+ et Map2+ était plus élevé après les traitements miR-25 par rapport au traitement par miARN témoin (miR-25: 60 cellules par champ; control-miR: 10 cellules par champ; Figure 6E).

Pris ensemble, les résultats démontrent que les cultures MG peuvent être cultivées et reprogrammées avec des miARN. La supplémentation en miR-25 induit l’expression d’Ascl1-Tom dans la MG primaire. Beaucoup de MG se transforment en RPC qui adoptent une morphologie neuronale et expriment les marqueurs neuronaux Map2 et Otx2 après quelques jours.

Figure 1
Figure 1 : Conception expérimentale et évolution dans le temps d’une culture primaire de glie de Müller. (A) Schéma de la souris Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl, une souris rapporteure progénitrice rétinienne utilisée pour suivre la conversion de la glie de Müller (MG) en cellules progénitrices rétiniennes (RPC). (B) Déroulement temporel des périodes de culture comprenant la phase de croissance (bleu, 0-4/5 jours in vitro, div), la phase de transfection (violet, 5/6-7/8 div) et la phase de conversion MG (jaune, commence 7/8 div). Phase de croissance: les rétines dissociées (deux rétines d’une souris) sont cultivées dans un puits d’une plaque de 12 puits dans un milieu de croissance. Vers le jour 4/6, les cellules sont passées dans une plaque de 24 puits qui contient des couvercles enduits. Phase de transfection: 5-7 div (1 jour après le passage) les cellules sont transfectées avec des miARN pendant 2 jours dans le milieu de transfection. La cre recombinase est activée avec le 4-hydroxytamoxifène (4-OHT). La prolifération cellulaire est suivie avec EdU. La phase de conversion MG commence 1 jour après la transfection. Les cellules sont maintenant cultivées dans le milieu neuronal jusqu’à la récolte (6-7 jours après les transfections, dpTF). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Dissociation rétinienne et génotypage. (A) Coupe oculaire avec cornée, lentille, iris et vitré enlevés. B) Rétines isolées; les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) sont enlevées après un lavage en profondeur. (C) Plaque à 12 puits avec rétines dissociées (deux rétines par puits). (D) Découpe d’un exemple d’image de gel de génotypage. Le génotypage est nécessaire pour identifier les souris qui ont une expression de Cre recombinase induite par Ascl1 et sera utilisé pour suivre la conversion cellulaire. Barres d’échelle: 1 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3: Glie de Müller primaire pendant la phase de croissance. (A) Durée des périodes de culture pendant la phase de croissance (0-4/5 jours in vitro (div)) surlignée en bleu. (B-G) Images en direct (phase) de la glie de Müller (MG) pendant la phase de croissance après 1 div (B), 2 div après le changement de milieu (C), 3 div (D), 4 div avant le passage (E, F) et 5 div, 1 jour après le passage et avant la transfection (G). Les corps des cellules MG sont indiqués par des pointes de flèches rouges. Après 3 div, les cultures sont confluentes à 60% à 80% (D), après 4 à 5 div, les cultures sont confluentes à 90% à 100% et prêtes à être traversées (E-F). Après le passage sur les couvertures, les cultures cellulaires doivent être confluentes à 80% à 90% pour une transfection ultérieure (G). Barres d’échelle : 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4: Premiers stades de la phase de conversion de la glie de Müller. (A) Déroulement des périodes de culture pendant la phase de conversion surligné en jaune (début 7/8 jours in vitro (div)). Le point temporel d’analyse indiqué dans cette figure est indiqué par l’étoile rouge : 7 div, 2 jours après la transfection (dpTF). (B-C''') Images en direct de cultures de glie de Müller (MG) en phase et en fluorescence rouge, fluorescence rouge combinée ou unique. La fluorescence rouge visualise Ascl1 exprimant MG (tdTomato+, abrégé Ascl1-Tom), 2 jours après la transfection avec des mimiques de miARN de contrôle (control-miR, B-B''') ou des mimiques miR-25 (C-C'''). Les zones en B/B' et C/C’sont représentées par un grossissement plus élevé en B''/B''', C''/C'''. Barres d’échelle 200 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Étapes finales de la phase de conversion gliale de Müller. (A) Déroulement des périodes de culture pendant la phase de conversion surligné en jaune (début 7/8 jours in vitro (div)). Le point temporel d’analyse indiqué dans cette figure est indiqué par l’étoile rouge : 10 div, 5 jours après la transfection (dpTF). (B-C'') Images en direct de cultures de glie de Müller (MG) en phase et en fluorescence rouge, fluorescence rouge combinée ou unique. La fluorescence rouge visualise Ascl1 exprimant MG (tdTomato+, abrégé Ascl1-Tom), 5 jours après la transfection (pTF) avec des mimiques de miARN de contrôle (control-miR, B-B'') ou des mimiques miR-25 (C-C''). Les encarts en B'/C’sont affichés dans un grossissement plus élevé en B''/C'', respectivement. (D) Le nombre absolu de cellules Ascl1-Tomato+ par champ (10x; 1440 μm x 1080 μm) après traitement par miARN de contrôle ou miR-25, 2 et 5 jours après la transfection (dpTF; n = 1, cinq images par puits sont comptées; moyenne ± S.D.). (E) Pourcentage de cellules Ascl1-Tomato+ de type neuronal de cellules Ascl1-Tomato+ totales par champ (10x; 1440 μm x 1080 μm) après traitement par miARN de contrôle ou miR-25, 5 jours après la transfection (5dpTF, n = 1, moyenne ± S.D.). Barres d’échelle : 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Confirmation de l’identité neuronale des cellules reprogrammées. (A-A'''; B-B''') Marquage immunofluorescent de cultures primaires de souris gliales de Müller (MG) 5 jours après la transfection traitées avec des mimiques de miARN témoins (control-miR, A-A''') ou des mimiques miR-25 (B-B'''). Les cellules ont été fixées avec 2% de paraformaldéhyde (PFA) et incubées avec des anticorps contre RFP pour marquer tdTomato, Map2 et Otx2 pour marquer les neurones. Le marquage nucléaire DAPI (bleu) a été utilisé pour colorer tous les noyaux cellulaires. (C-E) Quantification (n = 1 ; cinq images par coverslip sont comptées ; moyenne ± S.D.) du nombre absolu de cellules Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ par champ (C), pourcentage de cellules Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ du total des cellules Ascl1-Tom+ (D), et nombre absolu de cellules Otx2+Map2+ par champ (E). Les résultats montrent un plus grand nombre de neurones dans le traitement miR-25 par rapport aux témoins. Taille du champ : 630 μm x 630 μm. Barres d’échelle : 50 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Mort cellulaire et contamination bactérienne. (A-A'') Images en direct de cultures de glia de Müller (MG) 3 div contaminées par des bactéries. L’encart 1 en A est représenté en grossissement plus élevé en A' et affiche une glie morte atrophique. L’encart 2 en A est représenté en A'' avec une glie vivante. Barres d’échelle:100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ce protocole décrit comment cultiver la MG à partir de rétines de souris dissociées pour des études de reprogrammation à l’aide de miARN. Comme l’ont montré et confirmé diverses études antérieures, la grande majorité (80% à 90%) des cellules trouvées dans ces cultures sont MG 20,23,24. Cette méthode est une technique très robuste et fiable et les résultats peuvent être facilement reproduits si le protocole est suivi correctement21,27. La croissance réussie et l’efficacité de la reprogrammation de la culture dépendent toutefois de divers facteurs.

Tout d’abord, l’âge de la souris joue un rôle important dans la réussite de la croissance cellulaire. Par conséquent, si les cultures MG sont cultivées à partir de souris de type sauvage ou de souris transgéniques qui ressemblent à des types sauvages tels que les souris rapporteures, le dernier âge pour développer des monocouches MG confluentes est P12. À P12, tous les neurones rétiniens et le MG sont différenciés, et plus aucun RPC n’est présent dans la rétine. MG exprime des marqueurs MG matures tels que la glutamine synthétase ou le transporteur d’aspartate de glutamate (GLAST)20,23,41,42. Le P12 MG cultivé peut encore réintégrer le cycle cellulaire lorsqu’il est exposé à l’EGF, mais le nombre de cycles est limité, bien que suffisant pour former des couches cellulaires confluentes in vitro. Néanmoins, il peut arriver que même le P12 MG ne se développe pas bien parce que l’EGF ou les composants du milieu peuvent être dégradés. Une dissociation incomplète (morceaux) peut également entraîner une croissance de MG moindre ou retardée. Une cause majeure de dissociation incomplète est l’inactivation de la DNase I utilisée pour la dissociation rétinienne par une manipulation sévère de l’enzyme (pipetage rapide, vortex, etc.). Même si les cellules se développent bien jusqu’au passage, les cellules peuvent être moins confluentes après le passage. Cela peut s’expliquer par une manipulation difficile pendant le processus de passage qui entraîne une augmentation de la mort cellulaire ou parce que les cellules ont été ensemencées trop rarement. Étant donné que la glie ne se développe pas beaucoup, les cellules doivent être plaquées dans le même rapport que celles cultivées, et non diluées (contrairement aux procédures de passage des lignées cellulaires immortalisées). Il est à noter que, comme les cultures MG se développent du centre à la périphérie d’un puits, des densités cellulaires plus élevées seront toujours trouvées au centre. Il est donc impératif de vérifier les marges de chaque puits avant le passage pour s’assurer que l’ensemble du puits est recouvert de cellules. Des mesures de concentration cellulaire doivent être effectuées pour assurer le traitement de quantités suffisantes de cellules.

De plus, les cultures primaires obtenues à partir de souris à P6 ou plus jeunes ne contiendront pas de MG, car les MG sont sur le point de mûrir à ce stade. Cela a été démontré par l’analyse de séquençage d’ARN unicellulaire43. Le marquage immunofluorescent avec des marqueurs MG matures à cet âge le confirmera également. La fraction des RPC est toutefois substantielle à P6. Les résultats doivent donc être interprétés avec prudence. De plus, les marqueurs tels que les marqueurs de filament intermédiaires vimentine et nestine ne sont pas appropriés pour identifier la MG primaire puisque ces marqueurs sont également exprimés dans les astrocytes 44,45,46, la microglie 47,48, les cellules endothéliales et les péricytes 49,50,51,52 , et ne sont pas spécifiques à MG. Le GFAP, exprimé dans les astrocytes rétiniens mais pas dans la MG des rétines non endommagées, n’est pas un bon marqueur de la MG cultivée. Bien qu’il soit régulé à la hausse dans la MG dissociée en raison des dommages mécaniques lors de la dissociation, il est régulé à la baisse après 3 jours en culture28.

Étant donné que MG partage de nombreux marqueurs RPC, la procédure la plus sûre pour assurer une culture MG robuste consiste à utiliser des souris à P12 ou des souris plus âgées. Bien que ce protocole décrive des cultures obtenues à partir de MG de souris P12, mg de souris adultes peut être cultivée et reprogrammée27. Cependant, plus de tissu par puits doit être plaqué (quatre à six rétines). En effet, la glie adulte ne se divise pas beaucoup, même si elle est exposée à l’EGF et à 10% de sérum. La réduction des contacts cellulaires entraînera la mort cellulaire et la dégénérescence cellulaire (cellules étirées, cellules élargies). La glie adulte est un excellent outil pour les paradigmes de co-culture18 et la densité cellulaire peut ne pas avoir autant d’importance dans ces applications. Pour les applications en aval telles que la transfection ou la transduction, cependant, les couches cellulaires confluentes sont une exigence.

Outre une croissance altérée, la mort cellulaire peut survenir. Si la mort cellulaire se produit sans signes évidents, une contamination par les mycoplasmes doit être envisagée (taille des mycoplasmes 0,1-0,3 μm) et un kit de détection des mycoplasmes doit être utilisé. Garder chaque échantillon séparé (pas de regrouper les échantillons) peut également réduire le risque de contamination croisée. Cependant, les bactéries plus grosses peuvent également être transportées de l’animal et peuvent causer une contamination même si tout le travail est effectué dans un environnement propre et stérile. Tremper brièvement le globe oculaire dans de l’éthanol à 70% et un lavage complet dans une boîte de Petri supplémentaire de 10 cm sont recommandés avant de disséquer l’œil. Pour réussir la culture, il est impératif de travailler dans des conditions stériles, car la contamination peut se produire rapidement. Une fois que des bactéries, des levures ou des moisissures / champignons sont trouvés dans une plaque, même si tous les puits ne sont pas affectés, la culture est perdue. Les contaminations entraîneront la mort cellulaire (figure supplémentaire 1) et affecteront les cellules, ce qui entraînera des données non représentatives.

La mort cellulaire peut également être causée par des réactifs nécessaires pour les applications en aval telles que Poly-O (ou Poly-D-Lysine) utilisés pour recouvrir les couvercles. Ces substances sont toxiques et des lavages approfondis sont nécessaires avant l’utilisation de Laminin. Les couvercles doivent coller au fond du puits, pas flotter à l’intérieur d’un puits. Les bulles d’air doivent être évitées. De plus, un revêtement complet avec de la laminine est crucial pour assurer l’adhérence des cellules à la lèvre de couverture. Le manque de laminine entraînera également une diminution de la densité cellulaire et / ou de la mort cellulaire.

Pour identifier la véritable glie reprogrammée, il convient d’utiliser des souris rapporteures et des marqueurs de prolifération cellulaire permettant le suivi cellulaire, tels que EdU ou BrdU. Comme les rétines entières sont plaquées, les survivants neuronaux sont présents dans toutes les cultures. Ils sont, cependant, presque complètement enlevés après le passage dans la plupart des cas. Néanmoins, un marquage EdU (ou BrdU) doit être effectué pour valider que les neurones proviennent de MG/RPC proliférants et ne sont pas des survivants neuronaux (post-mitotique). Le petit nombre de neurones trouvés dans les contrôles utilisés ici sont des survivants neuronaux.

Fait intéressant, quelques cellules Ascl1-Tom+ sont également présentes dans le traitement de contrôle avec un nombre légèrement croissant au fil du temps. Ces cellules pourraient être des MG express Ascl1 plutôt immatures lorsqu’elles sont isolées et cultivées. La fraction de cette population de cellules Ascl1-Tom+ est cependant faible. De plus, la plupart de ces cellules Ascl1-Tom+ présentes dans le traitement témoin n’expriment pas Otx2 et/ou Map2 et conservent une forme cellulaire plutôt plate. Aucune différenciation neuronale ne semble se produire dans des conditions de contrôle. Les cellules neuronales très délicates qui semblent former des réseaux ne sont trouvées qu’après un traitement miR-25.

Le protocole décrit ici a été utilisé dans des études antérieures pour tester les miARN pour la reprogrammation MG21,27 et a été légèrement modifié au cours des dernières années en ce qui concerne les plaques de puits pour faire croître la glie. Ils sont maintenant cultivés dans des plaques de 12 puits, au lieu de plaques de 6 puits. Les monocouches confluentes peuvent être obtenues dans des plaques à 12 puits après 4/5 jours (contre 6/8 jours avec des plaques à 6 puits) et, par conséquent, la période de culture globale qui conduit à l’altération / dégénérescence cellulaire est réduite. La fenêtre de temps de transfection est également allongée. Les protocoles de transfection réguliers ont une durée de transfection de 3 heures, après quoi un changement complet du milieu doit être effectué pour assurer la survie des cellules. Toutes les molécules sont éliminées après ce changement de milieu. Dans le protocole actuel, la fenêtre de temps a été prolongée et une exposition plus longue aux miARN a été autorisée en ajoutant 50% de milieu neuronal (complété par les facteurs requis pour l’induction de Cre et le suivi de la prolifération cellulaire) au milieu réactif de transfection. Les cellules étaient en bonne santé et aucun problème n’a été rencontré avec cette modification. Il semble que les résultats de la transfection soient meilleurs avec le temps de transfection allongé, mais plus de données sont nécessaires pour confirmer cette observation.

De plus, toutes les étapes requises pour le marquage immunofluorescent pour effectuer une microscopie confocale à balayage laser sont décrites ici. Par conséquent, le MG doit être passé sur des couvercles en verre. Étant donné que les couvercles sont plus petits que la surface d’une plaque de 24 puits, seulement environ un tiers des cellules qui couvriraient un puits complet d’une plaque de 24 puits s’adaptent sur le couvercle revêtu. Pour d’autres applications telles que la qPCR, l’ARN-Seq ou les transferts occidentaux, les cellules sont passées dans un rapport de 1:1, traitées et récoltées au moment souhaité.

Comme mentionné précédemment, ce système de culture peut également être utilisé pour d’autres applications, par exemple, pour étudier le comportement glial, y compris les mécanismes neuroprotecteurs, la gliose et / ou pour profiler l’ARNm, le miARN ou les protéines de la glie cultivée similaire aux études qui ont utilisé des paradigmes de culture légèrement différents ou des espèces 11,28,29,54 . Ces applications ne nécessiteraient ni le milieu neuronal pour assurer la survie neuronale après la reprogrammation, ni l’ajout d’EdU pour visualiser la prolifération cellulaire. Un milieu faiblement sérique sans suppléments neuronaux doit être utilisé à la place.

Bien que cette méthode soit robuste et fiable, semblable à tous les systèmes de culture primaire, elle a des limites; Il s’agit d’une durée de vie limitée des cellules, d’une dégénérescence cellulaire progressive au fil du temps28 et du fait qu’il s’agit d’un système de culture artificielle en 2 dimensions qui ne peut pas imiter le contexte physiologique en ce qui concerne à la fois d’autres types de cellules rétiniennes et une matrice extracellulaire. Par conséquent, après avoir identifié les principaux candidats et leurs concentrations les plus efficaces dans les cultures primaires mg, des cultures d’explants rétiniens, un système de culture en 3 dimensions ressemblant au tissu rétinien, doivent être effectuées. Les cultures d’explants ont également des périodes de culture limitées et les cellules des explants dégénèrent également au fil du temps. Cependant, ils permettent l’étude de la MG dans leur environnement naturel en 3 dimensions et peuvent être effectués à différents âges reflétant le stade de développement de l’animal 23,32,55,56.

Dans l’ensemble, cette étude rend compte des cultures mg utilisées pour surveiller le potentiel du miARN RPC miR-25 à reprogrammer MG en cellules neuronales, validées par marquage immunofluorescent. Ce protocole a été utilisé dans les travaux précédents 21,24,27 et est une méthode in vitro actuelle pour étudier le potentiel régénératif de MG. Dans l’ensemble, les cultures primaires MG sont une technique robuste et permettent des résultats reproductibles20,21. Bien que la surexpression du miARN pour la reprogrammation MG soit décrite ici exclusivement, d’autres facteurs tels que les petites molécules, l’ADN (plasmidiques ou emballé dans des vecteurs viraux), les anticorps pour l’inhibition des protéines32 ou des composés spécifiques peuvent être utilisés / testés dans des cultures primaires MG. Il existe également un large éventail d’applications en aval, y compris le profilage miARN24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 ou Western Blots20. De plus, les cultures primaires MG permettent l’observation et la surveillance quotidiennes des cellules. Cela peut être un avantage substantiel pour déterminer les points temporels, par exemple, pour le début, la durée et / ou la fin d’une certaine réaction ou réponse cellulaire. Le comportement migratoire ou prolifératif ainsi que les paradigmes liés aux blessures et aux dommages cellulaires (par exemple, la délétion globale des miARN dans les cultures MG)32 peuvent être étudiés et analysés dans les cultures primaires MG afin d’identifier les mécanismes et les voies sous-jacents. Par conséquent, les cultures MG sont un outil très puissant pour étudier la MG aux niveaux moléculaire et cellulaire avant la mise en œuvre dans des systèmes in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Un brevet incluant certaines des conclusions de ce rapport a été déposé par l’Université de Washington auprès des inventeurs Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl et Thomas A. Reh. Le brevet s’intitule « Méthodes et compositions pour stimuler la régénération rétinienne.

Acknowledgments

Les auteurs remercient la Dre Ann Beaton et tous les membres du laboratoire pour leur contribution au manuscrit. Nous remercions tout particulièrement les Drs Tom Reh, Julia Pollak et Russ Taylor d’avoir présenté les cultures primaires MG comme outil de dépistage à S.G.W. lors d’une formation postdoctorale à l’Université de Washington à Seattle. L’étude a été financée par la subvention empire innovation program (EIP) à S.G.W. et des fonds de démarrage de SUNY Optometry à S.G.W., ainsi que par le prix R01EY032532 du National Eye Institute (NEI) à S.G.W.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jax laboratories #012882 Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Jax laboratories #007914 Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer Sigma-Aldrich H7904-5MG reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution VWR 100504-782 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-546-152 dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 705-606-147 dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems Fisher Scientific AF1979 dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody Sigma-Aldrich M9942-200UL dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody Antibodies-Online ABIN334653 dilution 1:500
Ascorbic Acid STEMCELL Technologies 72132 reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044 frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium STEMCELL Technologies 05790 used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Fisher Scientific C10340 reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP STEMCELL Technologies 73886 reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35010CV frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Fisher Scientific 51-985-034 store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Fisher Scientific 12-605-028 used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS Fisher Scientific 14-025-134 store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural Fisher Scientific 23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine Fisher Scientific 25-030-081 frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control Horizon CN-001000-01-50 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic Horizon C-310564-05-0050 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement Fisher Scientific 17-502-048 frozen aliquots
Neurobasal Medium Fisher Scientific 21-103-049 used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK003153 reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific 20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P4538-50MG reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein R&D Systems 248-BDB-050/CF reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein Fisher Scientific 2028EG200 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein Fisher Scientific 512GF010 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-296-150 dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) Fisher Scientific L3000015 store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) Eppendorf 2231300008
Disposable Transfer Pipets Fisher Scientific 13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 Fisher Scientific 08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 Fisher Scientific 08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves Fisher Scientific 19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) Fisher Scientific 22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm Fisher Scientific 09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet Thermo Scientific 1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 Keyence 9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope Vision Scientific VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) VWR 25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R Eppendorf 2231000508
Fine Scissors-sharp Fine Science Tools 14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm World Precision Instruments 14124
Metal bead bath Lab Armor 74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm VWR 82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) Living Systems Instrumentation DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5 World Precision Instruments 501979
Water Jacketed CO2 Incubator VWR 10810-744

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
  37. Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Tags

Biologie du développement numéro 181
Cultures cellulaires primaires pour étudier le potentiel de régénération de murin Müller Glia après un traitement par microARN
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell… More

Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine Müller Glia after MicroRNA Treatment. J. Vis. Exp. (181), e63651, doi:10.3791/63651 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter