Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri

Published: March 28, 2022 doi: 10.3791/63651
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

Summary

Fare retinalarından elde edilen Müller glia primer kültürleri, mikroRNA tedavisinden sonra retinal progenitör hücrelere glial dönüşümü incelemek için çok sağlam ve güvenilir bir araçtır. Tek moleküller veya kombinasyonlar, daha sonra in vivo yaklaşımların uygulanmasından önce test edilebilir.

Abstract

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glia'dır ve retinal nöronlar için rejeneratif bir kaynak olarak işlev görebilir. Balıklar gibi alt omurgalılarda, MG güdümlü rejenerasyon doğal olarak gerçekleşir; Bununla birlikte, memelilerde, belirli faktörlerle stimülasyon veya genetik / epigenetik manipülasyon gereklidir. MG, retinal hücre popülasyonunun sadece% 5'ini oluşturduğundan, yalnızca bu hücre popülasyonunun incelenmesine izin veren model sistemlere ihtiyaç vardır. Bu model sistemlerden biri, tekrarlanabilir ve molekül / faktör taraması ve tanımlama, bileşiklerin veya faktörlerin test edilmesi, hücre izleme ve / veya fonksiyonel testler dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilen birincil MG kültürleridir. Bu model, yapay miRNA'ların veya inhibitörlerinin transfeksiyonu yoluyla mikroRNA'ların (miRNA'lar) takviyesi veya inhibisyonundan sonra murin MG'nin retinal nöronlara dönüşme potansiyelini incelemek için kullanılır. MG'ye özgü muhabir farelerin immünofloresan etiketleme ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) ile birlikte kullanılması, bu kültürlerde bulunan hücrelerin% 80-90'ının MG olduğunu doğruladı. Bu modeli kullanarak, miRNA'ların MG'yi retinal progenitör hücrelere (RPC'ler) yeniden programlayabildiği keşfedildi. Bu tekniğin avantajları, miRNA adaylarının in vivo uygulamalarda kullanılmadan önce verimlilikleri ve sonuçları açısından test edilebilmeleridir.

Introduction

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glialardır. Merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerindeki diğer glia'lara kıyasla, su ve iyon homeostazını korumak, nöronları beslemek ve dokuyu korumak gibi benzer işlevlere sahiptirler. MG'nin başka bir büyüleyici özelliği daha vardır: olgun glia olmalarına rağmen, geç gelişim sırasında retinal progenitör hücrelerde (RPC'ler) eksprese edilen birçok geni hala eksprese ederler 1,2. Bu benzerliğin, retina hasarından sonra balık retinasında doğal olarak oluşan MG bazlı nöronal rejenerasyonun nedeni olduğu varsayılmaktadır 3,4. Bu işlem sırasında, MG hücre döngüsüne tekrar girer ve daha sonra altı tip retinal nöronun hepsine farklılaşan RPC'lere farklılaşır. Bu fenomen balıklarda doğal olarak meydana gelmesine rağmen, memeli MG nöronlara dönüşmez 5,6. Bununla birlikte, yeniden programlanabilirler. MG'yi RPC'lere / nöronlara yeniden programlayan çeşitli faktörler gösterilmiştir; Bu faktörler arasında balık rejenerasyonunda rol oynayan temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü achaete-scute homolog 1 (Ascl1) 7,8'dir. Farelerde, Ascl1 sadece retinogenez sırasında RPC'lerde eksprese edilir, ancak olgun MG veya retinal nöronlardayoktur 9.

Hücrelerin doğrudan in vivo olarak yeniden programlanması sadece metodolojik olarak zor değil, aynı zamanda kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanım komitesinin onayını gerektirir. Onay almak için, kullanılan veya değiştirilen faktör(ler), konsantrasyonlar, hedef dışı etkiler, altta yatan mekanizmalar, toksisite ve verimlilik hakkında ön veriler gereklidir. Hücre kültürü sistemleri, in vivo modellerde kullanılmadan önce bu kriterlerin test edilmesine izin verir. Dahası, MG tüm retinal hücre popülasyonunun sadece% 5'ini oluşturduğundan 10, MG kültürleri fonksiyonlarının 11'inin yanı sıra göç 12,13, proliferasyon 14, yaralanma / hasara stres reaksiyonu15,16, mikroglia 17 veya retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) gibi diğer hücre tipleriyle etkileşimleri de dahil olmak üzere davranışlarının incelenmesine izin verir. veya nörojenik potansiyelleri 19,20,21. Birçok araştırmacı, sınırsız bir proliferatif potansiyele sahip oldukları ve kolayca korunabildikleri ve transfekte edilebildikleri için çalışmaları için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanır. Bununla birlikte, birincil hücreler, biyolojik olarak ilgili analizler için ölümsüzleştirilmiş hücrelerden daha tercih edilir, çünkü gerçek hücre özelliklerine (gen ve protein ekspresyonu) sahiptirler ve daha da önemlisi, gelişimde belirli bir aşamayı temsil ederler ve bu nedenle bir "yaş" vardır. Bir hayvanın yaşı (ve dolayısıyla bir hayvandan elde edilen hücrelerin), hücresel yeniden programlamada özellikle önemli bir faktördür, çünkü hücre plastisitesi, gelişimin ilerleme aşamasıyla azalır22.

Bu protokol, primer MG'nin miRNA'larla rejenerasyonu incelemek için akım in vitro bir yöntem olarak nasıl yeniden programlanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu MG birincil kültür modeli, P53 nakavt farelerde (trp53-/- fareler)23 MG'nin hücre proliferasyon özelliklerini değerlendirmek için 2012 yılında kurulmuştur. Kültürlenmiş MG'nin glial özelliklerini koruduğu (yani, immünofloresan etiketleme yoluyla değerlendirilen S100β, Pax6 ve Sox2 proteinlerinin ekspresyonu) ve in vivo MG'ye (FACS-saflaştırılmış MG'nin mikrodizisi) benzedikleri gösterilmiştir23. Kısa bir süre sonra, glial mRNA ve protein ekspresyonu, viral vektörler20 kullanılarak farklı bir yaklaşımla doğrulandı ve doğrulandı. Birkaç yıl sonra, MG'ye özgü Rlbp1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl muhabir faresi24 kullanılarak bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğunun MG olduğu doğrulandı. Dahası, hem FACS-saflaştırılmış MG hem de kültürlenmiş primer MG'deki miRNA setinin nicelleştirilmesi, MG miRNA'larının (mGLiomiR'ler) seviyelerinin, büyüme aşamasında kültürlenmiş MG'de çok fazla değişmediğini göstermiştir. Bununla birlikte, uzamış kültür dönemleri, miRNA'lar translasyonel düzenleyiciler olduğu için miRNA seviyelerinde ve dolayısıyla mRNA seviyelerinde ve protein ekspresyonunda değişikliklere neden olur25.

2013 yılında, bu MG kültür modeli, MG'yi retinal nöronlara yeniden programlama yeteneklerine göre çeşitli transkripsiyon faktörlerini test etmek için kullanılmıştır20. Ascl1'in çok sağlam ve güvenilir bir yeniden programlama faktörü olduğu bulunmuştur. Ascl1'in viral vektörler yoluyla aşırı ekspresyonu, morfolojik değişikliklere, nöronal belirteçlerin ekspresyonuna ve nöronal elektrofizyolojik özelliklerin kazanılmasına neden olmuştur. Daha da önemlisi, bu ilk in vitro deneylerden elde edilen içgörüler ve sonuçlar, primer MG kültürlerinin in vivo uygulamadan önce ilk faktör taramaları ve glial özelliklerin değerlendirilmesi için sağlam ve güvenilir bir araç olduğunu gösteren 22,26 in vivo uygulamalara başarıyla aktarılmıştır.

Birkaç yıl önce, retinal nöronlarda da yüksek oranda eksprese edilen beyinle zenginleştirilmiş miRNA miR-124'ün, kültürlü MG21'de Ascl1 ekspresyonunu indükleyebileceği gösterilmiştir. Canlı hücrelerdeki Ascl1 ekspresyonu, bir Ascl1 muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl) aracılığıyla görselleştirildi. Bir muhabir faresi, DNA'sına yerleştirilmiş bir muhabir genine sahip genetik olarak tasarlanmış bir faredir. Bu muhabir geni, bu çalışmada kırmızı bir floresan proteini olan tdTomato'da bulunan bir muhabir proteinini kodlar. Bu muhabir proteini, ilgilenilen bir genin, bu durumda, Ascl1'in ekspresyonunu bildirir. Başka bir deyişle, Ascl1'i eksprese eden hücreler kırmızıya döner. Ascl1 yalnızca RPC9'da ifade edildiğinden, bu Ascl1 CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl faresi, MG dönüşümünün RPC'leri ifade eden Ascl1'e dönüştürülmesinin izlenmesine izin verir, yani dönüştürücü hücreler kırmızı floresan tdDomates raporlayıcı proteinini ifade edecektir. Bu, bu hücrelerin DNA'sı değiştirildiği için geri dönüşümsüz bir etiketlemedir. Sonuç olarak, sonraki herhangi bir nöronal farklılaşma görselleştirilecektir, çünkü tdDomates etiketi farklılaşan hücrelerde kalır. MG kaynaklı RPC'leri (tdDomates etiketli) ifade eden Ascl1 nöronlara farklılaşırsa, bu nöronlar hala kırmızı etiketlerine sahip olacaktır. Bu nedenle, bu fare, yalnızca MG türevli RPC'lerin canlı hücre görüntüleme için etiketlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bu MG türevi (kırmızı) RPC'lerin kader haritalamasına ve soy izlemesine de izin verir. Daha yakın zamanlarda, RPC'lerdeki miRNA seti tanımlandı ve bu miRNA'ların yeniden programlama kapasitesi ve verimliliği üzerindeki etkisini taramak ve test etmek için Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter farelerin MG kültürleri kullanıldı27. Bir aday, RPC-miRNA miR-25, kültürlenmiş MG'yi Ascl1 eksprese eden (Ascl1-Domates +) hücrelere yeniden programlayabildiği bulundu. Bu yeniden programlanmış hücreler, nöronal morfoloji (küçük somata ve kısa veya uzun ince süreçler), scRNA-Seq ile ölçülen nöronal transkriptlerin ekspresyonu ve immünofloresan etiketleme27 ile doğrulanan nöronal proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere zamanla nöronal özellikleri benimser.

Burada, protokol, önceki çalışma21,24,27'den uyarlanmış P12 farelerinden MG'nin nasıl yetiştirileceğini ve transfekte edileceğini detaylandırıyor. Bu protokol için seçilen, yukarıda belirtilen miRNA miR-25, RPC'lerde yüksek oranda eksprese edilen, MG veya retinal nöronlarda düşük ekspresyon seviyelerine sahip bir miRNA'dır. MiR-25'i aşırı eksprese etmek için murin miR-25 taklitleri, yani yapay miRNA molekülleri kullanılır. Kontrol olarak, Caenorhabditis elegans'tan bir miRNA'nın taklitleri, memeli hücrelerinde hiçbir işlevi olmayan seçilir. MG'nin RPC'lere dönüşümünün görselleştirilmesi, RPC muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl), karışık arka plana sahip bir fare (C57BL/6, S129 ve ICR suşları) ile gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu kültür, vahşi tip suşlar da dahil olmak üzere tüm fare suşlarıyla gerçekleştirilebilir. Son birkaç yılda, orijinal protokol, büyüme fazı süresini ve genel kültür dönemini azaltmak ve daha sağlam bir glia hücresi durumu sağlamak ve uzun kültür dönemlerinde meydana gelen hücresel dejenerasyon derecesini en aza indirmek için değiştirilmiştir. Düzenli transfeksiyon süresi de 3 saatten 2 güne uzatıldı. Daha önce de belirtildiği gibi, mevcut protokol MG kültürlerini rejenerasyon çalışmaları için bir araç olarak tanımlasa da, yöntem sadece yeniden programlama faktörlerini test etmek için yararlı değildir, aynı zamanda MG göçü veya proliferatif davranışı, yaralanma / hücre hasarı ile ilgili paradigmalar ve / veya altta yatan mekanizmaların ve yolların tanımlanması ile ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere diğer uygulamalar için de uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Hayvan denekleri içeren prosedürler, SUNY College of Optometry'deki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Bu kültür protokolü üç aşamadan oluşur: büyüme, transfeksiyon ve dönüşüm aşaması. Zaman çizelgesi ile genel protokolün bir özeti Şekil 1'de verilmiştir.

1. Ortamın ve gerekli tüm reaktiflerin hazırlanması

NOT: Tüm adımların bir A2 veya B2 biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir. Büyüme aşamasında, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş bir bazal nöronal ortamdan oluşan yüksek serum büyüme ortamı kullanılır. Konversiyon fazı için, nöronal farklılaşma ve sağkalımı sağlamak için nöronal takviyelerle desteklenmiş düşük serum nörofizyolojik bazal bir ortam kullanılır.

  1. 200 mL bazal nöronal besiyeri (FBS, %10), 1 mL 200 mM L-glutamin (%0.5), 2 mL penisilin/streptomisin (%1) ve 2 mL N2 takviyesi (%1) ile takviye ederek büyüme ortamı hazırlayın (büyüme aşamasında kullanılır). Steril filtreleme gerçekleştirin (0,22 μm gözenek boyutuna sahip filtre üniteleri). Kullanmadan önce ortamı 37 °C metal boncuk banyosunda önceden ısıtın.
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek nöronal ortam hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) 100 mL serumsuz nörofizyolojik bazal ortamı 2 mL B27 nöronal takviyesi (%2), 1 mL N2 takviyesi (%1), 20 μL 100 ng/ mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF, fosfat tamponlu salin (PBS, nihai konsantrasyon 20 ng / mL), 100 ng / mL glia hücresi kaynaklı nörotrofik faktörün 20 μL'si (GDNF, steril Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisinde [HBSS], nihai konsantrasyon 20 ng / mL'de reforme olur), 500 μL 100 mg / mL Dibutyryl-cAMP (DMSO'da reforme olur), 70 μL 50 ng / mL askorbik asit (steril PBS'de reforme olur) ve 1.5 mL penisilin / streptomisin. Steril filtreleme gerçekleştirin (0,22 μm gözenek boyutuna sahip filtre üniteleri). Kullanmadan önce 37 °C metal boncuk banyosunda ön ılık ortam.
    NOT: Bu ortamlar 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek retina ayrışması için gerekli Papain, DNaz I ve Ovomukoid reaktifleri yeniden oluşturur. Steril 1.5 mL tüplerde Aliquot 750 μL Papain, steril 0.6 mL tüplerde 75 μL DNaz I ve 2 mL tüplerde 750 μL Ovomukoid proteaz inhibitörü. Papain ve DNaz I alikotlarını -20 ° C'de dondurun ve reaktiflerin bozulmasını önlemek için Ovomukoid alikotları 4 ° C'de tutun. Kullanmadan hemen önce oda sıcaklığında çözün.
    NOT: Papain, DNaz I ve Ovomukoid, Papain Dissosiyasyon Sistemi adı verilen bir kitte bulunur (bkz.
  4. Veri sayfası talimatlarını izleyerek immünofloresan etiketleme yapılırsa, kapak kaplaması için poli-L-ornitin (Poli-O) ve Laminin'i yeniden oluşturur (Poli-O: steril suda 0.1 mg/mL; Laminin: DMEM'de 1:50'de 1.2 mg / mL seyreltin). Aliquot Poly-O ve Laminin (2.5 mL) ve -20 °C'de alikotları dondurun. Kullanmadan hemen önce oda sıcaklığında çözün.
    NOT: Adım 1.4. sadece immünofloresan etiketleme ve lazer tarama mikroskobu yapılırsa gereklidir.

2. Fareler ve doku ekstraksiyonu

NOT: Bu yeniden programlama çalışmaları için Ascl1 CreERT:tdDomates STOPfl/fl fare, bir Ascl1CreERT fareyi (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) bir tdDomatesSTOPfl/fl fare (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914) ile geçerek oluşturulmuştur. Bu fare karışık bir arka plana sahiptir (C57BL/6, S129 ve ICR suşu). Bu farenin genotipi Şekil 1A'da gösterilmiştir. Tüm suşlar bu protokol için kullanılabilir.

  1. Diseksiyon mikroskobu ve tüm ince aletler (Dumont #5 fine ve Dumont #7 kavisli forseps, ince makas ve Vannas makas) dahil olmak üzere eldiven giyin ve çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin. 10 cm'lik silikon kaplı siyah diseksiyon kabını 20 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin.
  2. Doku ekstraksiyonu için tabakların ve tabakların hazırlanması
    1. Göz toplama ve numune ayırma için 24 delikli bir plaka hazırlayın (bir kuyucukta fare başına iki göz, fare kimlikleriyle etiketlenmiş) kuyu başına ~1 mL soğuk HBSS (4 ° C) ile. 24 kuyucuklu plakayı buzun üzerine yerleştirin.
    2. Steril bir 10 cm'lik Petri kabını (yıkamak için) ve sterilize silikon kaplı diseksiyon kabını, dokunun HBSS ile tamamen kaplandığından emin olmak için birkaç mL soğuk HBSS (4 ° C) ile doldurun.
    3. 1 mL% 70 etanol içeren steril bir 1,5 mL tüp hazırlayın.
    4. Plakayı kültür numarası, tarih, gerinim ve gerekli tüm bilgilerle etiketleyerek 12 kuyu kültür plakası hazırlayın.
  3. Onaylanmış herhangi bir yöntemi kullanarak P12 farelerini ötenazileştirin.
  4. Göz giderme
    1. Fare kafasını başparmağı ve işaret parmağı gözün etrafına gelecek şekilde yavaşça tutun.
    2. Dumont #7 kavisli forseps kullanarak, yavaşça göz küresinin arkasına geçin ve optik siniri kırpın. Dikkatlice gözünüzü dışarı çıkarın.
      NOT: Yetişkin fareler kullanılıyorsa, kavisli forseps kullanmayın ve gözü çekmeyin. Bunun yerine ince makas kullanarak göz küresinin etrafını dikkatlice kesin; optik siniri kesin, ancak gözün kendisini kesmeyin. Göz küresini dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.
  5. Göz küresi temizliği
    1. Bakterilerin hayvandan taşınmasını önlemek için göz küresini kısaca etanol içeren bir tüpe batırın.
    2. Göz küresini buz üzerindeki 24 kuyucuklu tabağa yerleştirmeden önce 10 cm'lik Petri kabında kısaca yıkayın.
  6. Diğer gözler için 2.4 ve 2.5 adımlarını tekrarlayın. İşlem sırasında kuyu plakasını buzun üzerinde tutun. Bir hayvandan iki gözü, ışık kaynağı olan bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilen diseksiyon kabına yerleştirin.
  7. Retina ekstraksiyonu
    1. Optik siniri ve skleranın etrafındaki bağ dokusunu Dumont #5 ince forseps ile tutarak bir göz küresini sabitleyin ve diseksiyon kabına (kornea yukarı doğru) dikkatlice bastırın.
    2. Vannas makaslarına daha kolay erişim sağlamak için 30 G'lik bir iğne kullanarak korneanın merkezinde bir delik açın.
    3. Vannas makası kullanarak siliyer cismin etrafındaki korneayı diseke edin ve kornea, lens, iris ve vitreus gövdesini Dumont #5 ince forseps ile dikkatlice çıkarın. Şekil 2A , retinanın içinde olduğu bir göz kapağını göstermektedir.
    4. Optik sinire ulaşana kadar sklerayı Vannas makası ile diseke edin. Optik siniri kırpın ve Dumont #5 ince forseps kullanarak retinayı dikkatlice çıkarın.
    5. Retinaya doğru itmek ve vitreus gövdesinin tamamen çıkarılmasına izin vermek için ikinci bir çift Dumont # 5 ince forseps kullanın. Şekil 2B , çıkarılan iki retinayı göstermektedir.
  8. Transfer ve yıkama
    1. Çapı büyütmek için steril bir transfer pipetinin ucunun yaklaşık 2,5 cm'sini kesin. Bu ucu kullanarak, dokuya zarar vermeden tüm retinaları alın (emer).
    2. Retinaları soğuk HBSS (4 ° C) ile yeni bir steril Petri kabına aktarın ve çanağı sallayın (ileri geri, sol ve sağ).
    3. Transfer pipet ucunu kullanarak, retinal pigment epitel (RPE) hücrelerini yıkamak için retinaları dikkatlice itin.
      NOT: Alternatif olarak, lens ve vitreus gövdeli retinanın tamamı vizör adaptöründen çıkarılabilir. Daha sonra, lens ve vitreus gövdesi çıkarılan retinadan çıkarılabilir. Retina yırtılırsa, ayrışma için tüm parçaları topladığınızdan emin olun; aksi takdirde, akan hücre katmanlarını büyütmek için yetersiz miktarda doku olacaktır.
  9. İzole edilmiş retinayı derhal 1 mL HBSS ile doldurulmuş 24 delikli plakanın yeni, temiz bir kuyucuğuna yerleştirin. Diseksiyon işlemi sırasında 24 delikli plakayı buzun üzerinde tutun.
  10. İkinci retinayı izole etmek için 2.7-2.9 arasındaki adımları tekrarlayın.

3. Retina ayrışması

NOT: Aşağıdaki tüm adımların (hücre hasadına kadar) bir A2 veya B2 biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Papain/DNase I ayrışma karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Altı retina için, 750 μL Papain içeren tüpe 75 μL DNaz I ekleyin (adım 1.3'ten itibaren) ve dikkatlice karıştırın (ayrışma karışımı).
    2. Bu protokol için gerekli olan bireysel numune hazırlama için, toplam 825 μL hacmini üç alikota bölün: fare başına bir 1.5 mL tüpte (iki retina) karışımın 275 μL'si. Gerekli DNase I ve Papain miktarlarını buna göre hesaplayın.
      NOT: Bir Papain/DNaz I karışımı tüpünde altı adede kadar retina ayrıştırılabilir. Bununla birlikte, bireysel numune hazırlama, kombine numunelere göre daha az kümelenme ve daha iyi hücre büyümesi ile sonuçlanır.
  2. İki retinayı Papain/DNaz I ayrışma karışımına aktarın. Büyütülmüş uç çapına sahip bir transfer pipeti kullanın (adım 2.8.1), retinaları alın, retinalar ucun altına yerleşene kadar bekleyin ve ardından retinaları aşırı HBSS olmadan Papain / DNaz I karışımını içeren tüpe bırakın.
  3. Bir nutator üzerine yerleştirin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 10 dakika boyunca inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2).
  4. 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice yukarı ve aşağı pipetle (yaklaşık 20-30 kez) pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücreler ayrıştıktan sonra (yani, parçasız homojen bir çözelti ile sonuçlanır), Papain'i nötralize etmek için Papain Dissosiyasyon Kitinden 275 μL Ovomukoid proteaz inhibitörü ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın.
    NOT: 825 μL Papain/DNaz I karışımında altı retina ayrışmışsa, 825 μL Ovomukoid gereklidir.
  5. Karışımı 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
  6. Epidermal büyüme faktörünü (EGF, büyüme ortamının 1 mL'si başına 1 μL, PBS'de 200 μg / mL'de yeniden yapılandırılmış) 37 ° C'de önceden ısıtılmış hesaplanan büyüme ortamı hacmine (fare başına 1 mL) ekleyin.
    NOT: Deneysel tasarıma bağlı olarak, proliferasyon belirteci 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ve ayrıca 4-Hidroksitamoksifen (4-OHT) veya diğer gerekli faktörler kültür periyodunun başında eklenebilir.
  7. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Tüpün altındaki pelete dokunmayın.
  8. Süpernatantı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Hücre peletini 500 μL EGF takviyeli büyüme ortamı ile yeniden askıya alın.
  9. Hücre süspansiyonunu etiketli 12 delikli plakanın bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 2C). Tüpü EGF takviyeli büyüme ortamının başka bir 500 μL'si ile durulayın ve kuyuya ekleyin (kuyu başına toplam 1 mL hacim).
  10. 3.8 ve 3.9 numaralı adımları diğer tüm örneklerle birlikte yineleyin.
  11. Kuyu plakasını üç kez dikkatlice sallayın (ileri geri; sol ve sağ). Plakayı inkübatöre yerleştirin (37 °C, CO2).
    NOT: Transgenik fareler kullanılıyorsa, her hayvan için genotipleme yapın (Şekil 2D). Cre rekombinaz pozitif ve negatif fareleri tanımlayın ve plakayı buna göre etiketleyin. Bu protokol için, sonraki adımlar için sadece Cre rekombinaz pozitif muhabir farelerin hücreleri kullanılmıştır. Cre negatif numunelerin hücreleri dondurulur ve diğer uygulamalar için kullanılır.

4. Büyüme aşaması

NOT: Büyüme aşaması yaklaşık 4-5 günlük bir süreye sahiptir (Şekil 1B). Hücreleri içeren kuyucuklara sıvı eklemek için, pipetin kuyunun duvarına işaret etmesi ve hücre ayrılmasını önlemek için sıvının yavaşça serbest bırakılması gerekir. Doğrudan hücrelerin üzerine pipet uygulamayın.

  1. Ayrışmadan bir gün sonra, ortamı çıkarın ve 1 mL taze EGF takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
  2. 3. günde, ortamı çıkarın ve hücre kalıntılarını gidermek için 1 mL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin. Yavaşça ileri geri soldan sağa doğru sallayın. HBSS'yi çıkarın, yıkama adımını tekrarlayın ve 1 mL önceden ısıtılmış EGF takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
  3. Hücreleri her gün izleyin ve hücreler% 90 -% 100 akıcılığa ulaşana kadar büyüme durumlarını değerlendirin. Şekil 3 , zaman içinde iyi MG büyümesinin bir örneğini göstermektedir. Olası kontaminasyon veya hücre ölümünü kontrol edin (Ek Şekil 1). Kirlenmiş kültürleri atın.
    NOT: Hücre durumunu izlemek ve kaydetmek için, bağlı bir kameraya ve 4x, 10x veya 20x hedeflerine sahip bir ışık mikroskobu kullanarak çeşitli büyütmelerde görüntüler çekin. Bu çalışmada floresan mikroskobu kullanılmıştır.

5. Poli-L-ornitin (Poli-O) ve Laminin kaplama ile kapak kapaklarının hazırlanması

NOT: Bu adım yalnızca immünofloresan etiketleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu yapıldığında gereklidir. Doğru görüntüleme için yuvarlak cam kapaklar (12 mm çaplı) gereklidir. Kaplama protokolü ayrıca nöronal ortam veri sayfasında da bulunabilir (bkz.

  1. Steril Dumont #2AP forseps kullanarak steril kapakları 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunun ortasına dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Kapak fişlerini kuyunun ortasına yerleştirin. Kapak kaymalarını bir kuyunun duvarına yakın bir yere yerleştirmek, aşağıdaki adımlar için yüzey gerilimi sorunlarına neden olacaktır.
  2. Oda sıcaklığında 2,5 mL'lik bir Poli-O aliquot'u çözün ve her bir kapak kaymasının ortasına 100 μL'sini yerleştirin.
  3. Kuyu plakasını 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Poly-O'yu çıkarın ve kuyuyu ~ 1 mL steril su ile üç kez kapak kaymasıyla yıkayın.
  5. Kuyu plakasının BSC'de gece boyunca kurumasını bekleyin. Gece boyunca 4 °C'de 2,5 mL Laminin çözün.
  6. Ertesi sabah, her bir kapak kapağının ortasına 100 μL Laminin ekleyin ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 4 saat boyunca inkübe edin.
  7. Laminin'i dikkatlice ve tamamen çıkarın.
  8. Pasaj hemen yapılamazsa plakayı 4 ° C'de tutun.
    NOT: Hazırlanan plakalardaki kaplamalı kapaklar 4 °C'de birkaç gün bekletilebilmektedir.

6. Nöronal hayatta kalanları çıkarmak için hücre geçişi

NOT: Hücre geçişi, hücre popülasyonunu arttırmak için değil, nöronal hücreleri çıkarmak için gereklidir. Glia sadece birkaç kez bölünür ve geçişten sonra daha fazla büyümez. Hücre süspansiyonlarını seyreltmeyin. 12 delikli bir plakanın bir akıcılık kuyusunun hücreleri, 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna veya 24 delikli bir plakanın iki kuyucuğuna dağıtılabilir. Kaplamalı kapak kaymaları kullanıldığında, kapak kaymasının sadece üçte biri kaplanır. Bu nedenle, 24 delikli bir plakada oturan, birleşik hücrelerle (~% 80 -% 90) altı kapak kayması, 12 delikli bir plakanın birleştirilmiş hücrelerinin bir kuyucuğundan elde edilebilir. Hücre yoğunluğunu artırmak veya azaltmak için diğer oranlar da seçilebilir. Bu protokol için bir Cre+ muhabir faresi kullanılır [bir deney, iki tedavi: miR-25 veya kontrol-miR; teknik replikasyonlar n = 3 (tedavi başına üç kapak kayması), biyolojik replikasyon n = 1]. Teknik ve biyolojik replikaların sayısı, deneysel tasarıma bağlı olarak farklı şekilde tanımlanabilir.

  1. Hücrelerin% 90 -% 100 birleşik olup olmadığını kontrol edin (ayrıca kuyunun kenarında; Şekil 3E,F).
  2. Ortamı çıkarın ve yıkamak için 1 mL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın (ileri geri, sola ve sağa). HBSS'yi tamamen kaldırın.
  3. Hücreleri kuyudan ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin içeren bir çözeltiden 500 μL (metal boncuk banyosunda 37 ° C'de önceden ısıtılmış) ekleyin. Yavaşça sallayın (ileri geri, soldan sağa) ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Plakayı inkübatörden BSC'ye taşıyın. Eğerken, tripsin içeren çözeltiyi aspire edin ve hücreler tamamen ayrılana kadar dikkatlice ve yavaşça kuyunun üzerine birkaç kez dağıtın. Plakayı ışığa karşı tutun ve altta hücre kalmadığından emin olun.
  5. Bu hücre süspansiyonunu steril bir 1,5 mL tüpe aktarın. 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
  6. Süpernatantı çıkarın ve önceden ısıtılmış büyüme ortamının (EGF ile desteklenmiş; 1:1000) 600 μL (6 kuyucuk / kapak kayması için kuyucuk başına 100 μL) ekleyerek hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın. ve ~ 30-40 kez yukarı ve aşağı pipetleme.
    NOT: Hücreler şu anda -80 °C'de veya sıvı azotta dondurulabilir ve hücre hatlarının çözülmesi için standart protokoller izlenerek çözülebilir. Hücreler dondurulmuşsa, EGF takviyeli ortamda (büyüme ortamı) yeniden askıya alınmazlar. Temel ortamda (EGF'siz) ve dondurma çözeltisinde (1/1 oranında) yeniden askıya alınacaklardır. 6.1.1 ila 6.6.2 arasındaki adımlar, hücreleri dondurma adımlarını açıklar. Hiçbir hücre dondurulmamışsa, adım 6.7 ile devam edin.
    1. 100 μL DMSO ve 400 μL FBS (kuyu/numune başına toplam hacim 500 μL) karıştırarak dondurma çözeltisi hazırlayın.
    2. Hücre peletini 500 μL önceden ısıtılmış büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 500 μL DMSO / FBS dondurma çözeltisine ekleyin (toplam hacim 1 mL). Tüm numuneler işlenene kadar tüpleri buz üzerinde tutun. Hücreleri -20 °C'de 1 saat boyunca dondurun ve ardından -80 °C'de saklayın.
  7. 600 μL hücre/ortam süspansiyonunun 100 μL'sini (adım 6.6) 24 delikli plakanın altı kaplamalı kapak kapağının ortasına (bkz. adım 5) yerleştirerek tohum hücreleri. Plakayı dikkatlice inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin yerleşmesine izin verin.
    NOT: 600 μL hücre süspansiyonunun 100 μL'si (12 delikli bir plakanın bir kuyucuğundan toplanır), transfeksiyon için gerekli olan% 90-100 hücre akıcılığına neden olur.
  8. Kapak kapağına yerleşip yerleşmediklerini görmek için hücreleri 3 saat sonra kontrol edin. EGF ile desteklenmiş 400 μL büyüme ortamı ekleyin.
    NOT: Hücreler genellikle ertesi gün transfeksiyona hazırdır (Şekil 3G). Akıcı değilse (% 90 -% 100), onları başka bir güne bırakın. Hala birleşik değilse, bunları transfeksiyon için kullanmayın. MiRNA profilleme, RNA-Seq, RT-qPCR veya batı lekesi gibi diğer aşağı akış uygulamaları yapılırsa, hücrelerin 12 delikli plakalara (1: 1 oranı; plaka tedavisi gerekmez) geçirilmesi ve RNA / protein ekstraksiyonu için toplanması gerekir.

7. Transfeksiyon

NOT: Transfeksiyon fazı, sadece transfeksiyon ortamında 3 saatlik bir fazdan (transfeksiyon prosedürleri, transfeksiyon reaktifi ile birlikte gelen transfeksiyon el kitabında açıklanmıştır) ve transfeksiyon reaktifi ve miRNA'ların hala mevcut olduğu, ancak gerekli takviyeleri içeren nöronal ortamın eklendiği uzun bir fazdan oluşur (toplam süre 2 gündür; Şekil 1B). Bu protokolde, altı kuyu transfekte edilecek: üç kuyu yeniden programlama miRNA miR-25'i alacak ve üç kuyu kontrol miRNA'sını alacak.

  1. Hücrelerin% 90 akıcılığa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve transfeksiyondan önce hücreleri kaydedin / görüntüleyin.
  2. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri yıkamak için 500 μL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin.
  3. HBSS'yi çıkarın ve transfeksiyonlar için kullanılan 400 μL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Plakayı tekrar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  4. Transfeksiyon karışımını, üreticinin transfeksiyon reaktif protokolünün talimatlarını izleyerek hazırlayın. İki karışım yapın: transfeksiyon reaktif karışımı ve miRNA karışımı (örnek için Şekil 1B'ye bakınız).
    1. Transfeksiyon reaktif karışımını hazırlayın: 24 delikli bir plaka için, bir kuyucuk için 49 μL indirgenmiş serum ortamı ve 1 μL transfeksiyon reaktifi gereklidir (toplamda 50 μL). Altı kuyucuk için, 294 μL indirgenmiş serum ortamı ve 6 μL transfeksiyon reaktifi birleştirilir ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenerek iyice karıştırılır.
    2. MiRNA mimik karışımını hazırlayın: 24 delikli bir plaka için, bir kuyucuk için toplam 50 μL mimik karışımı hacmi gereklidir. Üç kuyu kontrol miRNA'sını alacak ve diğer üç kuyu miR-25 ile muamele edilecektir. Bu protokol için 200 nM'lik bir nihai konsantrasyon kullanılır.
      1. MiR-25 tedavisi için (üç kuyucuk), 150 μL indirgenmiş serum ortamı ve 3 μL miR-25 mimik (100 μM stok çözeltisi) birleştirilir ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenerek iyice karıştırılır. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
        Kontrol mimikleri tedavisi için (üç kuyucuk), 150 μL indirgenmiş serum ortamı ve 3 μL kontrol-miRNA taklitleri (100 μM stok çözeltisi) birleştirilir ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenerek iyice karıştırılır. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
        NOT: miRNA taklitlerinin hacmi, seyreltme faktörüne ve gereken konsantrasyona (20-500 nM) bağlıdır. miRNA inhibitörleri (antagomiR'ler) veya plazmidler de dahil olmak üzere diğer moleküller de kullanılabilir. Ayrıca, molekül kombinasyonlarının transfekte edilmesi mümkündür.
  5. MiRNA mimik karışımı ve transfeksiyon reaktif karışımını birleştirin. Yavaşça ve iyice pipetleyerek yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek dikkatlice karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin (üreticinin talimatlarına göre).
  6. Yukarıdaki transfeksiyon karışımını, 20 μL'lik bir pipet kullanarak kuyucuktaki ortam yüzeyine yakın bir yerde, hücrelerin üzerine damla damla ve yavaşça ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın (ileri geri, soldan sağa).
  7. 37 °C'lik bir inkübatörde 3 saat boyunca inkübe edin.
  8. 3 saat sonra, hücre proliferasyonunu izlemek için Cre rekombinazını ve 5-etinil-2'-deoksiüridini (EdU, 2 mL DMSO, 1 μM nihai konsantrasyon ile yeniden oluşturulmuş 10 mM stok çözeltisi) aktive etmek için 4-Hidroksitamoksifen (2.58 mL etanol ile yeniden yapılandırılmış 5 mM stok, 250 nM nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş kuyucuklara (kuyu başına 500 μL) nöronal ortam ekleyin.
    DİKKAT: 4-Hidroksitamoksifen ve EdU'nun insan kanserojenleri, teratojenleri ve mutajenleri olduğu bilinmektedir. Kullanmadan önce Malzeme Güvenlik Bilgi Formu'nu okuyun ve eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü giyin. Her iki reaktifi de üreticinin tavsiyelerine göre yeniden oluşturun. Maddeyi/karışımı solumayın. Kullanımdan sonra sıkıca kapatın. Atık malzemeler ulusal ve yerel yönetmeliklere uygun olarak bertaraf edilmelidir. Madde ile çalıştıktan sonra ellerinizi ve yüzünüzü yıkayın.
  9. 37 °C'lik bir inkübatörde 2 gün boyunca inkübe edin (Şekil 1B).

8. Hücre dönüşümü

NOT: Hücre dönüştürme aşaması yaklaşık 5-6 günlük bir süreye sahiptir (Şekil 1B), ancak daha uzun süreler mümkündür.

  1. TdDomates ekspresyonunun başarılı bir şekilde indüklenmesi, potansiyel hücre ölümü ve / veya kontaminasyon için hücreleri günlük olarak kontrol edin. Hücre yoğunluğu değişmez (Şekil 4). İlk soluk kırmızı floresan etiketli hücreler, 4-Hidroksitamoksifen tedavisinden 1 gün sonra gözlemlenebilir. Hücreleri izlemek ve görüntülemek için bir floresan mikroskop gereklidir.
    NOT: Bu çalışmada canlı görüntüleme için floresan mikroskop kullanılmıştır. Görüntüler 4x, 10x veya 20x hedeflerle çekilir.
  2. Transfeksiyondan iki gün sonra, ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 4-Hidroksitamoksifen ve EdU ile desteklenmiş 500 μL önceden ısıtılmış nöronal ortam ekleyin.
  3. Hücreler toplanana kadar ortamı her gün taze bir ortamla değiştirin.
  4. Kırmızı floresan (Ascl1 eksprese eden) hücrelerin sayısının ve bunların morfolojik değişikliklerinin değerlendirilmesi ve değerlendirilmesi için canlı görüntüler alın (Şekil 4 ve Şekil 5A-C).

9. Hücre hasadı: immünofloresan etiketleme için fiksasyon

NOT: Hücreler, dökme veya scRNA-Seq, RT-qPCR veya batı lekesi dahil olmak üzere diğer aşağı akış uygulamaları için toplanabilir.

  1. Ortamı çıkarın ve kuyucuk başına 500 μL soğuk HBSS (4 ° C) ekleyin ve plakayı yavaşça sallayın (ileri geri, soldan sağa). HBSS'yi kaldırın.
  2. 500 μL% 2 Paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  3. Yerleşik protokollere göre immünofloresan etiketleme yapın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, P12 fare retinalarından MG'nin nasıl yetiştirileceğini ve bu hücrelerin miR-25 ile Ascl1CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl RPC muhabir faresini kullanarak retinal nöronlara nasıl yeniden programlanacağını açıklar. Bu yöntem, MG'yi RPC'ye yeniden programlamak için diğer uygun miRNA'ları (mimikler veya inhibitörler, tek moleküller olarak veya kombinasyon halinde) ayrıntılı olarak rapor eden önceki çalışmalarda kullanılmış ve daha sonra nöronal hücre özelliklerini benimsemiştir27. Bu yöntem, kültürleri daha hızlı büyütmek ve böylece yapay ortamın zaman içinde neden olduğu hücresel değişiklikleri en aza indirmek için modifiye edilmiştir24,28,29.

Primer MG kültürlerinde retinal dissosiyasyon ve büyüme fazı
İlk MG, bir ışık mikroskobu kullanılarak in vitro olarak ilk gün kadar erken tespit edilebilir. MG boru şeklinde, uzun bir şekle ve açık gri hücre gövdelerine sahiptir (Şekil 3A-D, kırmızı ok uçları). Bununla birlikte, çoğu, bu erken aşamalarda hücresel enkaz ile kaplıdır. 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda yetiştirilen bir farenin iki retinasından MG, 4-5 gün içinde% 90-95 akıcılığa ulaşır (Şekil 3E, F). Zamanla, tüm nöronal döküntüler temizlenecek ve yoğun bir hücre tabakası mevcut olacaktır. Kuyunun dibi tamamen birleşmiyorsa hücreler geçiş için hazır değildir. Bununla birlikte, glia zamanla kültürdeki glial özelliklerini kaybettiğinden, in vitro olarak 6 günden daha geç geçiş yapılmamalıdır. Transfeksiyon veya başka bir tedaviden önce, hücrelerin yoğunluk ve canlılık açısından kontrol edilmesi gerekir. Transfeksiyon sadece %90-%95 oranında kaynayan hücrelerde yapılmalıdır (Şekil 3G). İmmünofloresan etiketleme ve konfokal mikroskopi analizi için, hücrelerin kaplanmış kapaklara tohumlanması gerekir.

Hücre dönüşüm periyodunun erken ve geç fazı
Transfeksiyon ve 4-Hidroksitamoksifen tedavisinden 15 saat sonra, ilk hücreler soluk kırmızı floresansı, yani (aktive edilmiş) Ascl1 promotoru altında sürülen tdDomates kırmızı floresan muhabir proteinini eksprese etmeye başlar. Ascl1 eksprese eden hücreler artık Ascl1-Tom + hücreleri olarak da adlandırılmaktadır. Transfeksiyondan 2 gün sonra daha sağlam Ascl1-Tom ekspresyonu gözlenebilir ve zamanla kırmızı floresan artmıştır (Şekil 4). Yeniden programlama etkisi, yeniden programlama miRNA tedavisinde bulunan alan başına birçok Ascl1-Tom + hücresi ile kültürde yaklaşık 2 gün görünür hale gelir: burada control-miR ve miR-25 için gösterilmiştir (sırasıyla Şekil 4B-B '' ve Şekil 4C-C '' ''). Her iki tedavide de, Ascl1-Tom + hücreleri hala oldukça yuvarlak ve nispeten büyüktür, daha glia / progenitör hücre benzeri bir morfolojiye sahiptir. Dahası, kırmızı floresan muhabirin indüksiyonu, kültürün hücre yoğunluğunu etkilemez (hala% 90 -% 95 birleşir).

Transfeksiyondan üç ila beş gün sonra (Şekil 4A ve Şekil 5A), Ascl1-Tom + hücrelerinin sayısındaki artış, miR-25 ile tedavi edilen kuyularda (Şekil 5B-D), kontrollere kıyasla miR-25 tedavilerinden sonra sayıda dört kat artış gösteren daha belirgin hale gelir. Dahası, ilk morfolojik değişiklikler görünür hale gelir. Bu değişiklikler hücre soma boyutunun azaltılmasını ve ince işlemlerin geliştirilmesini içerir. Kontrol koşullarında hücrelerin büyük çoğunluğu büyük ve düz (glial/progenitör benzeri, Şekil- 5B-B''), küçük çekirdeğe sahip birçok hücre ve retinal nöronlara benzeyen birkaç küçük süreç miR-25 tedavisinde ortaya çıkar (Şekil- 5C-C''). Bu nöronal benzeri hücreler toplam Ascl1-Tom popülasyonunun yaklaşık% 70'ini temsil eder (kontrol tedavisinde% 15; Şekil 5E). Hücreler, hücre dönüşümü nedeniyle daha az yoğundur (daha küçük hücreler daha az alan gerektirir). İlginçtir ki, bu nöronal benzeri hücreler küçük ağlar bile oluşturuyor gibi görünmektedir (Şekil 5C''). Şu anda, nöronal kimliği doğrulamak için immünofloresan etiketleme için hücreler toplanabilir.

Nöronal kimliğin doğrulanması
Hücreler, nörona özgü sitoiskelet proteinleri 30,31 için bir belirteç olan mikrotübül ile ilişkili protein 2'ye (Map2) ve nöronal kimliği doğrulamak için Ortodentikle homeobox 2'ye (Otx2) karşı antikorlarla etiketlenir32,33. Her iki belirteç de önceki yeniden programlama çalışmalarında kullanılmış21,27. Otx2, RPC'lerde 34,35,36, olgun bipolar hücrelerde 34,35,37,38,39 ve fotoreseptörlerde 35,36,37,38,40 bulunan bir transkripsiyon faktörüdür. . DAPI nükleer etiketleme, kültürleri lekelemek için kullanılır. İmmünofloresan etiketleme, kontrol koşullarında Map2 veya Otx2 ekspresyonunun çok az veya hiç olmadığını gösterir (Şekil 6A-A'', C). Bununla birlikte, miR-25 ile tedavi edilen örnekler birçok Map2+ ve Otx2+ hücresine sahiptir (Şekil 6B-B''). Konfokal görüntülerin nicelleştirilmesi, miR-25 aşırı ekspresyonundan sonra, kontrollerde alan başına beş nöronal hücreye kıyasla alan başına yaklaşık 40 nöronal hücrenin mevcut olduğunu göstermektedir (Şekil 6C, alan boyutu: 630 μm x 630 μm). Görüntüler 20x objektif ile çekilmiştir. Bu nöronal hücreler, miR-25 ile tedavi edilen örneklerin toplam Ascl1-Tom + hücre popülasyonunun yaklaşık% 70'ini oluşturur (kontrol ~% 20, Şekil 6D). Tüm nöronal benzeri Ascl1-Tom + hücreleri, nöronal kimliği doğrulayan Map2 + ve Otx2 + idi. Ayrıca, Otx2+ ve Map2+ hücrelerinin mutlak sayısı, miR-25 tedavilerinden sonra kontrol-miRNA tedavisine kıyasla daha yüksekti (miR-25: alan başına 60 hücre; kontrol-miR: alan başına 10 hücre; Şekil 6E).

Birlikte ele alındığında, sonuçlar MG kültürlerinin miRNA'larla yetiştirilebileceğini ve yeniden programlanabileceğini göstermektedir. miR-25 takviyesi primer MG'de Ascl1-Tom ekspresyonunu indükler. Birçok MG, nöronal morfolojiyi benimseyen ve birkaç gün sonra nöronal belirteçler Map2 ve Otx2'yi eksprese eden RPC'lere dönüşür.

Figure 1
Şekil 1: Birincil Müller glia kültürünün deneysel tasarımı ve zaman seyri. (A) Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl faresinin şeması, Müller glia'nın (MG) retinal progenitör hücrelere (RPC'ler) dönüşümünü izlemek için kullanılan retinal progenitör raporlayıcı fare. (B) Büyüme fazı (mavi, 0-4/5 gün in vitro, div), transfeksiyon fazı (mor, 5/6-7/8 div) ve MG dönüşüm fazından (sarı, 7/8 div başlar) oluşan kültür periyotlarının zaman seyri. Büyüme aşaması: ayrışmış retinalar (bir farenin iki retinası), bir büyüme ortamında 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğunda yetiştirilir. 4/6 gün civarında, hücreler kaplamalı kapaklar içeren 24 delikli bir plakaya geçirilir. Transfeksiyon fazı: 5-7 div (geçişten 1 gün sonra) hücreler, transfeksiyon ortamında 2 gün boyunca miRNA'larla transfekte edilir. Cre rekombinaz 4-Hidroksitamoksifen (4-OHT) ile aktive edilir. Hücre proliferasyonu EdU ile izlenir. MG dönüşüm fazı transfeksiyondan 1 gün sonra başlar. Hücreler artık hasada kadar nöronal ortamda yetiştirilmektedir (transfeksiyonlardan 6-7 gün sonra, dpTF). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Retinal ayrışma ve genotipleme . (A) Kornea, lens, iris ve vitreus çıkarılmış göz kapağı. (B) İzole retinalar; retinal pigment epitel (RPE) hücreleri iyice yıkandıktan sonra çıkarılır. (C) ayrışmış retinalara sahip 12 delikli plaka (kuyu başına iki retina). (D) Genotipleme jeli görüntü örneğinin kesilmesi. Genotipleme, Ascl1 güdümlü Cre rekombinaz ekspresyonuna sahip fareleri tanımlamak için gereklidir ve hücre dönüşümünü izlemek için kullanılacaktır. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Büyüme aşamasında primer Müller glia. (A) Büyüme aşamasında kültür dönemlerinin zaman seyri (0-4/5 gün in vitro (div)) mavi renkle vurgulanır. (B-G) Müller glia'nın (MG) büyüme fazı sırasında 1 div (B), orta değişimden sonra 2 div (C), 3 div (D), geçişten önce 4 div (E,F) ve 5 div, geçişten 1 gün sonra ve transfeksiyondan önce (G) canlı görüntüleri (faz). MG hücre gövdeleri kırmızı ok uçları ile gösterilir. 3 dalıştan sonra kültürler %60-%80 oranında akıcıdır (D), 4-5 dalıştan sonra kültürler %90-%100 kaynaşır ve geçişe hazırdır (E-F). Kapak kapaklarına geçtikten sonra, hücre kültürlerinin sonraki transfeksiyon (G) için% 80-90 oranında birleşik olması gerekir. Ölçek çubukları: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Müller glia dönüşüm fazındaki erken aşamalar. (A) Dönüşüm fazı sırasında kültür periyotlarının zaman seyri sarı renkle vurgulanır (in vitro (div) 7/8 gün başlar). Bu şekilde gösterilen analizin zaman noktası kırmızı yıldız ile gösterilir: 7 div, transfeksiyondan 2 gün sonra (dpTF). (B-C'') Müller glia (MG) kültürlerinin faz ve kırmızı floresan, kombine veya tek kırmızı floresan halinde canlı görüntüleri. Kırmızı floresan, MG'yi (tdTomato+, kısaltılmış Ascl1-Tom) ifade eden Ascl1'i, transfeksiyondan 2 gün sonra, kontrol miRNA taklitleri (kontrol-miR, B-B') veya miR-25 taklitleri (C-C''') ile görselleştirir. B/B' ve C/C' içindeki alanlar B''/B'', C''/C'de daha yüksek büyütmede gösterilir. Ölçek çubukları 200 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Müller glia dönüşüm aşamasındaki son aşamalar. (A) Sarı renkle vurgulanan dönüşüm aşamasındaki kültür dönemlerinin zaman seyri (in vitro (div) 7/8 gün başlar). Bu şekilde gösterilen analizin zaman noktası kırmızı yıldız ile gösterilir: 10 div, transfeksiyondan 5 gün sonra (dpTF). (B-C'') Müller glia (MG) kültürlerinin faz ve kırmızı floresan, kombine veya tek kırmızı floresan halinde canlı görüntüleri. Kırmızı floresan, MG'yi (tdTomato+, kısaltılmış Ascl1-Tom) ifade eden Ascl1'i, transfeksiyondan (pTF) 5 gün sonra, kontrol miRNA taklitleri (kontrol-miR, B-B'') veya miR-25 taklitleri (C-C'') ile görselleştirir. B'/C' içindeki girintiler sırasıyla B''/C'''de daha yüksek büyütme ile gösterilir. (D) Kontrol-miRNA veya miR-25 tedavisinden sonra, transfeksiyondan 2 ve 5 gün sonra alan başına mutlak Ascl1-Domates + hücresi sayısı (10x; 1440 μm x 1080 μm) (dpTF; n = 1, kuyu başına beş görüntü sayılır; ortalama ± S.D.). (E) Kontrol-miRNA veya miR-25 tedavisinden sonra, transfeksiyondan 5 gün sonra alan başına toplam Ascl1-Domates + hücrelerinin nöronal benzeri Ascl1-Domates + hücrelerinin yüzdesi (10x; 1440 μm x 1080 μm), transfeksiyondan 5 gün sonra (5dpTF, n = 1, ortalama ± S.D.). Ölçek çubukları: 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Yeniden programlanmış hücrelerin nöronal kimliğinin doğrulanması. (A-A''; B-B') Primer fare Müller glia (MG) kültürlerinin immünofloresan etiketlemesi, transfeksiyondan 5 gün sonra, kontrol miRNA taklitleri (control-miR, A-A''') veya miR-25 taklitleri (B-B''') ile tedavi edilir. Hücreler% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitlendi ve nöronları etiketlemek için tdTomato, Map2 ve Otx2'yi etiketlemek için RFP'ye karşı antikorlarla inkübe edildi. Tüm hücre çekirdeklerini boyamak için DAPI nükleer etiketleme (mavi) kullanıldı. (C-E) Alan başına Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ hücrelerinin mutlak sayısının (C), toplam Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ hücrelerinin yüzdesinin (D) ve alan başına Otx2+Map2+ hücrelerinin mutlak sayısının (E) nicelleştirilmesi (n = 1; kapak fişi başına beş görüntü sayılır; ortalama ± S.D.), Sonuçlar, miR-25 tedavisinde kontrollere kıyasla daha fazla sayıda nöron olduğunu göstermektedir. Alan boyutu: 630 μm x 630 μm. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Hücre ölümü ve bakteriyel kontaminasyon. (A-A'') Bakterilerle kontamine olmuş Müller glia (MG) kültürlerinin 3 div canlı görüntüleri. A'daki 1 numaralı kısım, A' da daha yüksek büyütme ile gösterilir ve atrofik, ölü glia görüntüler. A'daki 2. kısım, canlı glia ile A'' da gösterilir. Ölçek çubukları:100 μm. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu protokol, miRNA'ları kullanarak yeniden programlama çalışmaları için ayrışmış fare retinalarından MG'nin nasıl yetiştirileceğini açıklar. Önceki çeşitli çalışmalarda gösterildiği ve doğrulandığı gibi, bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğu (% 80-90) MG 20,23,24'tür. Bu yöntem çok sağlam ve güvenilir bir tekniktir ve protokol doğru takip edilirse sonuçlar kolayca çoğaltılabilir21,27. Bununla birlikte, kültürün başarılı büyümesi ve yeniden programlama verimliliği, çeşitli faktörlere bağlıdır.

İlk olarak, farenin yaşı başarılı hücre büyümesinde önemli bir rol oynar. Bu nedenle, MG kültürleri vahşi tip farelerden veya muhabir fareler gibi vahşi türlere benzeyen transgenik farelerden yetiştirilirse, akıcılık MG monokatmanlarını büyütmek için en son yaş P12'dir. P12'de, tüm retinal nöronlar ve MG farklılaşır ve retinada artık RPC yoktur. MG, glutamin sentetaz veya glutamat aspartat taşıyıcı (GLAST) gibi olgun MG belirteçlerini eksprese eder20,23,41,42. Kültürlü P12 MG, EGF'ye maruz kaldığında hücre döngüsüne tekrar girebilir, ancak döngü sayısı, in vitro olarak birleşik hücre katmanları oluşturmak için yeterli olsa da sınırlıdır. Bununla birlikte, P12 MG'nin bile iyi büyümemesi ortaya çıkabilir, çünkü EGF veya ortamdaki bileşenler bozulabilir. Eksik ayrışma (parçalar) da MG büyümesinin azalmasına veya gecikmesine neden olabilir. Eksik ayrışmanın önemli bir nedeni, retinal ayrışma için kullandığım DNaz'ın, enzimin sert kullanımı (hızlı pipetleme, vorteks, vb.) Hücreler geçene kadar iyi büyüse bile, hücreler geçişten sonra daha az akıcı olabilir. Bunun nedenleri, artan hücre ölümüne yol açan geçiş işlemi sırasında sert kullanım veya hücrelerin çok seyrek tohumlanması olabilir. Glia fazla büyümediğinden, hücreler büyümüş ile aynı oranda kaplanmalı, seyreltilmemelidir (ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarının pasaj prosedürlerinin aksine). MG kültürleri merkezden bir kuyunun çevresine doğru büyüdüğü için, merkezde her zaman daha yüksek hücre yoğunlukları bulunacaktır. Bu nedenle, tüm kuyunun hücreler tarafından kaplandığından emin olmak için geçişten önce her kuyucuğun kenarlarını kontrol etmek zorunludur. Yeterli miktarda hücrenin işlenmesini sağlamak için hücre konsantrasyonu ölçümleri yapılmalıdır.

Ek olarak, P6 veya daha genç farelerden elde edilen birincil kültürler herhangi bir MG içermeyecektir, çünkü MG bu zaman noktasında olgunlaşmak üzeredir. Bu, tek hücreli RNA-seq analizi43 ile gösterilmiştir. Bu yaşta olgun MG belirteçleri ile immünofloresan etiketleme de bunu doğrulayacaktır. Bununla birlikte, RPC'lerin oranı P6'da önemlidir. Bu nedenle sonuçlar dikkatli bir şekilde yorumlanmalıdır. Ayrıca, ara filament belirteçleri vimentin ve nestin gibi belirteçler primer MG'yi tanımlamak için uygun değildir, çünkü bu belirteçler astrositler44,45,46, mikroglia47,48, endotel hücreleri ve perisitler 49,50,51,52 ile de ifade edilir. ve MG'ye özgü değildir. Retinal astrositlerde eksprese edilen, ancak hasar görmemiş retinaların MG'sinde ifade edilmeyen GFAP, kültürlü MG için iyi bir belirteç değildir. Dissosiyasyon sırasında mekanik hasar nedeniyle ayrışmış MG'de yukarı regüle olmasına rağmen, kültür28'de 3 gün sonra aşağı regüle edilir.

MG birçok RPC belirtecini paylaştığından, sağlam bir MG kültürü sağlamak için en güvenli prosedür, P12 veya daha yaşlı farelerde fareleri kullanmaktır. Bu protokol P12 fare MG'den elde edilen kültürleri tanımlasa da, yetişkin fare MG kültürlenebilir ve yeniden programlanabilir27. Bununla birlikte, kuyu başına daha fazla dokunun kaplanması gerekir (dört ila altı retina). Bunun nedeni, yetişkin glia'nın EGF ve% 10 seruma maruz kalsa bile fazla bölünmemesidir. Azalmış hücre temasları hücre ölümüne ve hücre dejenerasyonuna (gerilmiş hücreler, genişlemiş hücreler) yol açacaktır. Yetişkin glia, ko-kültür paradigmaları18 için harika bir araçtır ve hücre yoğunluğu bu uygulamalarda o kadar önemli olmayabilir. Bununla birlikte, transfeksiyon veya transdüksiyon gibi aşağı akış uygulamaları için, akan hücre katmanları bir gerekliliktir.

Bozulmuş büyümenin yanı sıra, hücre ölümü de meydana gelebilir. Belirgin bir belirti olmadan hücre ölümü meydana gelirse, mikoplazma kontaminasyonu düşünülmeli (mikoplazma boyutu 0.1-0.3 μm) ve bir mikoplazma tespit kiti kullanılmalıdır. Her numuneyi ayrı tutmak (numuneleri bir araya getirmek değil) çapraz kontaminasyon riskini de azaltabilir. Bununla birlikte, daha büyük bakteriler de hayvandan taşınabilir ve tüm işler temiz, steril bir ortamda yapılsa bile kirlenmeye neden olabilir. Göz küresinin kısaca% 70 etanol içine batırılması ve gözün diseke edilmesinden önce ilave 10 cm'lik Petri kabında iyice yıkanması önerilir. Başarılı bir kültür elde etmek için, steril koşullar altında çalışmak zorunludur, çünkü kontaminasyon hızlı bir şekilde gerçekleşebilir. Bir plakada bakteri, maya veya küf / mantar bulunduğunda, tüm kuyular etkilenmese bile, kültür kaybolur. Kontaminasyonlar hücre ölümüne neden olur (Ek Şekil 1) ve hücreleri etkileyerek temsili olmayan verilerle sonuçlanır.

Hücre ölümüne, örtü kapaklarını kaplamak için kullanılan Poli-O (veya Poli-D-Lisin) gibi aşağı akış uygulamaları için gerekli olan reaktifler de neden olabilir. Bu maddeler toksiktir ve Laminin kullanılmadan önce kapsamlı yıkamalar gereklidir. Kapaklar kuyunun dibine yapışmalı, kuyunun içinde yüzmemelidir. Hava kabarcıklarından kaçınılması gerekir. Ayrıca, Laminin ile tam kaplama, kapak kaymasına hücre yapışmasını sağlamak için çok önemlidir. Laminin eksikliği ayrıca daha az hücre yoğunluğuna ve / veya hücre ölümüne yol açacaktır.

Gerçek yeniden programlanmış glia'nın tanımlanması için, muhabir fareler ve EdU veya BrdU gibi hücre takibine izin veren hücre proliferasyon belirteçleri kullanılmalıdır. Tüm retinalar kaplandığından, nöronal hayatta kalanlar tüm kültürlerde mevcuttur. Bununla birlikte, çoğu durumda geçişten sonra neredeyse tamamen çıkarılırlar. Bununla birlikte, nöronların çoğalan MG / RPC'lerden kaynaklandığını ve nöronal hayatta kalanlar (post-mitotik) olmadığını doğrulamak için EdU (veya BrdU) etiketlemesi yapılmalıdır. Burada kullanılan kontrollerde bulunan az sayıda nöron, nöronal hayatta kalanlardır.

İlginçtir ki, kontrol tedavisinde birkaç Ascl1-Tom + hücresi de zamanla biraz artan sayılarla mevcuttur. Bu hücreler, izole edildiğinde ve kültürlendiğinde Ascl1 eksprese eden oldukça olgunlaşmamış MG olabilir. Bununla birlikte, bu Ascl1-Tom + hücre popülasyonunun fraksiyonu küçüktür. Dahası, kontrol tedavisinde bulunan bu Ascl1-Tom + hücrelerinin çoğu Otx2 ve / veya Map2'yi eksprese etmez ve oldukça düz bir hücre şeklini korur. Kontrol koşulları altında nöronal farklılaşma meydana gelmiyor gibi görünmektedir. Ağ oluşturuyor gibi görünen çok hassas nöronal benzeri hücreler ancak miR-25 tedavisinden sonra bulunur.

Burada açıklanan protokol, MG yeniden programlama21,27 için miRNA'ları test etmek için önceki çalışmalarda kullanılmış ve glia'yı büyütmek için kuyu plakalarına göre geçmiş yıllarda biraz değiştirilmiştir. Artık 6 kuyulu plakalar yerine 12 kuyulu plakalarda yetiştiriliyorlar. Akıcı tek katmanlar, 4/5 gün sonra 12 delikli plakalarda elde edilebilir (6 delikli plakalarla 6/8 güne karşılık) ve bu nedenle, hücre değişikliğine / dejenerasyonuna yol açan genel kültür süresi azalır. Transfeksiyon zaman penceresi de uzatılmıştır. Düzenli transfeksiyon protokolleri 3 saatlik bir transfeksiyon süresine sahiptir ve bundan sonra hücre sağkalımını sağlamak için tam bir orta değişimin yapılması gerekir. Bu ortam değişiminden sonra tüm moleküller uzaklaştırılır. Mevcut protokolde, zaman aralığı uzatıldı ve transfeksiyon reaktif ortamına% 50 nöronal ortam (Cre indüksiyonu ve hücre proliferasyon takibi için gerekli faktörlerle desteklenmiş) eklenerek miRNA'lara daha uzun süre maruz kalmaya izin verildi. Hücreler sağlıklıydı ve bu modifikasyonla ilgili herhangi bir sorunla karşılaşılmadı. Transfeksiyon sonuçlarının uzatılmış transfeksiyon süresi ile daha iyi olduğu görülmektedir, ancak bu gözlemi doğrulamak için daha fazla veriye ihtiyaç vardır.

Ayrıca, konfokal lazer tarama mikroskobu gerçekleştirmek için immünofloresan etiketleme için gereken tüm adımlar burada açıklanmıştır. Bu nedenle, MG'nin cam kapaklar üzerinde geçirilmesi gerekir. Kapak kaymaları 24 kuyu plakasının alanından daha küçük olduğundan, 24 kuyucuklu bir plakanın tam bir kuyusunu kaplayacak hücrelerin sadece üçte biri kaplanmış kapak kapağına sığar. qPCR, RNA-Seq veya batı lekeleri gibi diğer uygulamalar için, hücreler 1: 1 oranında geçirilir, tedavi edilir ve istenen zaman noktasında hasat edilir.

Daha önce de belirtildiği gibi, bu kültür sistemi, örneğin nöroprotektif mekanizmalar, glioz dahil olmak üzere glial davranışı incelemek ve / veya biraz farklı kültür paradigmaları veya türleri kullanan çalışmalara benzer mRNA, miRNA veya kültürlenmiş glia proteinlerinin profilini çıkarmak için diğer uygulamalar için de kullanılabilir 11,28,29,54 . Bu uygulamalar ne yeniden programlandıktan sonra nöronal sağkalımı sağlamak için nöronal ortam ne de hücre proliferasyonunu görselleştirmek için EdU'nun eklenmesini gerektirecektir. Bunun yerine nöronal takviyeleri olmayan düşük serumlu bir ortam kullanılmalıdır.

Bu yöntem sağlam ve güvenilir olmasına rağmen, tüm birincil kültür sistemlerine benzer şekilde sınırlamaları vardır; Bunlar hücrelerin sınırlı yaşam süresi, zaman içinde ilerleyici hücre dejenerasyonu28 ve hem diğer retinal hücre tipleri hem de hücre dışı matriks açısından fizyolojik bağlamı taklit edemeyen 2 boyutlu, yapay bir kültür sistemi olmasıdır. Bu nedenle MG primer kültürlerinde en iyi adaylar ve en etkili konsantrasyonları belirlendikten sonra, retina dokusuna benzeyen 3 boyutlu bir kültür sistemi olan retinal eksplant kültürleri uygulanmalıdır. Eksplant kültürleri ayrıca sınırlı kültür dönemlerine sahiptir ve eksplantlardaki hücreler de zamanla dejenere olur. Bununla birlikte, MG'nin doğal 3 boyutlu ortamlarında incelenmesine izin verirler ve hayvanın gelişim aşamasını yansıtan çeşitli yaşlarda yapılabilirler 23,32,55,56.

Birlikte ele alındığında, bu çalışma, RPC miRNA miR-25'in MG'yi immünofloresan etiketleme ile doğrulanan nöronal benzeri hücrelere yeniden programlama potansiyelini izlemek için kullanılan MG kültürleri hakkında rapor vermektedir. Bu protokol önceki çalışmalarda 21,24,27 kullanılmıştır ve MG'nin rejeneratif potansiyelini incelemek için güncel bir in vitro yöntemdir. genel olarak, MG birincil kültürleri sağlam bir tekniktir ve tekrarlanabilir sonuçlara izin verir20,21. MG yeniden programlaması için miRNA aşırı ekspresyonu burada özel olarak tanımlanmış olsa da, küçük moleküller, DNA (plazmidler veya viral vektörlere paketlenmiş), protein inhibisyonu32 için antikorlar veya spesifik bileşikler gibi diğer faktörler MG primer kültürlerinde kullanılabilir / test edilebilir. Ayrıca, miRNA profilleme 24, scRNA-seq27, RT-qPCR 20,21 veyabatı lekeleri 20 dahil olmak üzere geniş bir aşağı akış uygulamaları yelpazesi vardır. Ayrıca, MG birincil kültürleri, hücrelerin günlük gözlemine ve gözetimine izin verir. Bu, zaman noktalarını belirlemek için, örneğin belirli bir reaksiyonun veya hücre tepkisinin başlangıcı, süresi ve / veya sonu için önemli bir avantaj olabilir. Göçmen veya proliferatif davranışın yanı sıra yaralanma/hücre hasarı ile ilgili paradigmalar (örneğin, MG kültürlerinde global miRNA delesyonu)32, altta yatan mekanizmaları ve yolları tanımlamak için MG primer kültürlerinde incelenebilir ve analiz edilebilir. Bu nedenle, MG kültürleri, in vivo sistemlerde uygulanmadan önce MG'yi moleküler ve hücresel seviyelerde incelemek için çok güçlü bir araçtır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Bu rapordaki bulguların bazılarını içeren bir patent, Washington Üniversitesi tarafından mucitler Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl ve Thomas A. Reh ile birlikte dosyalanmıştır. Patentin başlığı "Retina rejenerasyonunu uyarmak için yöntemler ve bileşimler.

Acknowledgments

Yazarlar, Dr. Ann Beaton'a ve tüm laboratuvar üyelerine makaleye katkıları için teşekkür eder. Seattle'daki Washington Üniversitesi'nde doktora sonrası eğitim sırasında MG birincil kültürlerini S.G.W.'ye bir tarama aracı olarak tanıttıkları için Dr. Tom Reh, Julia Pollak ve Russ Taylor'a özel teşekkürler. Çalışma, S.G.W.'ye Empire İnovasyon Programı (EIP) Hibesi ve SUNY Optometri'den S.G.W.'ye başlangıç fonlarının yanı sıra Ulusal Göz Enstitüsü'nden (NEI) S.G.W.'ye R01EY032532 ödülü ile finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J Jax laboratories #012882 Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J Jax laboratories #007914 Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer Sigma-Aldrich H7904-5MG reconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution VWR 100504-782 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 711-546-152 dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 705-606-147 dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems Fisher Scientific AF1979 dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibody Sigma-Aldrich M9942-200UL dilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody Antibodies-Online ABIN334653 dilution 1:500
Ascorbic Acid STEMCELL Technologies 72132 reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 Supplement Fisher Scientific 17-504-044 frozen aliquots
Brain Phys Neuronal Medium STEMCELL Technologies 05790 used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit Fisher Scientific C10340 reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMP STEMCELL Technologies 73886 reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Fisher Scientific MT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS) Fisher Scientific MT35010CV frozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement Fisher Scientific 51-985-034 store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red Fisher Scientific 12-605-028 used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSS Fisher Scientific 14-025-134 store at 4 °C
Laminin mouse protein, natural Fisher Scientific 23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
L-Glutamine Fisher Scientific 25-030-081 frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control Horizon CN-001000-01-50 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic Horizon C-310564-05-0050 reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 Supplement Fisher Scientific 17-502-048 frozen aliquots
Neurobasal Medium Fisher Scientific 21-103-049 used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation System Worthington Biochemical LK003153 reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific 15-140-122 frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS) Fisher Scientific 20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromide Sigma-Aldrich P4538-50MG reconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF Protein R&D Systems 248-BDB-050/CF reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF Protein Fisher Scientific 2028EG200 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF Protein Fisher Scientific 512GF010 reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch Laboratories 712-296-150 dilution 1:1,000
Slide Mounting Medium Fisher Scientific OB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) Fisher Scientific L3000015 store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tube Fisher Scientific 50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette Tips Fisher Scientific 02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) Eppendorf 2231300008
Disposable Transfer Pipets Fisher Scientific 13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 Fisher Scientific 08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 Fisher Scientific 08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets Fisher Scientific 13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam Gloves Fisher Scientific 19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) Fisher Scientific 22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm Fisher Scientific 09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinet Thermo Scientific 1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 Keyence 9011800000
Binocular Zoom Stereo Microscope Vision Scientific VS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) VWR 25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox Fine Science Tools 11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium Fine Science Tools 11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 R Eppendorf 2231000508
Fine Scissors-sharp Fine Science Tools 14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cm World Precision Instruments 14124
Metal bead bath Lab Armor 74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm VWR 82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) Living Systems Instrumentation DD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5 World Precision Instruments 501979
Water Jacketed CO2 Incubator VWR 10810-744

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
  37. Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Tags

Gelişim Biyolojisi Sayı 181
MikroRNA Tedavisi Sonrası Murine Müller Glia'nın Rejenerasyon Potansiyelini İncelemek için Birincil Hücre Kültürleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell… More

Kang, S., Wohl, S. G. Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine Müller Glia after MicroRNA Treatment. J. Vis. Exp. (181), e63651, doi:10.3791/63651 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter