Summary
마우스 망막으로부터 수득된 뮐러 글리아 일차 배양물은 마이크로RNA 처리 후 망막 전구 세포로의 신경교세포 전환을 연구하는 매우 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다. 단일 분자 또는 조합물은 생체내 접근법의 후속 적용 전에 시험될 수 있다.
Abstract
뮐러 글리아 (MG)는 신경 망막에서 우세한 아교 세포이며 망막 뉴런의 재생 원으로 기능 할 수 있습니다. 물고기와 같은 하부 척추 동물에서는 MG 구동 재생이 자연적으로 발생합니다. 그러나 포유류에서는 특정 요인에 대한 자극이나 유전 적 / 후성 유전 적 조작이 필요합니다. MG는 망막 세포 집단의 단지 5%만을 구성하기 때문에, 이 세포 집단의 연구를 배타적으로 허용하는 모델 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 모델 시스템 중 하나는 재현 가능한 일차 MG 배양물이며 분자/인자 스크리닝 및 식별, 화합물 또는 인자 테스트, 세포 모니터링 및/또는 기능 테스트를 포함한 다양한 용도에 사용할 수 있습니다. 이 모델은 인공 miRNA 또는 그의 억제제의 형질감염을 통해 마이크로RNA (miRNAs)의 보충 또는 억제 후에 망막 뉴런으로 전환하는 뮤린 MG의 잠재력을 연구하는 데 사용된다. MG 특이적 리포터 마우스를 면역형광 표지 및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 병용하여 이들 배양물에서 발견된 세포의 80%-90%가 MG임을 확인하였다. 이 모델을 사용하여 miRNA는 MG를 망막 전구 세포(RPCs)로 재프로그래밍할 수 있으며, 이는 이어서 신경유사 세포로 분화된다. 이 기술의 장점은 miRNA 후보가 생체 내 적용에서 사용하기 전에 효율성과 결과에 대해 테스트 할 수 있다는 것입니다.
Introduction
뮐러 글리아교(MG)는 신경망막에서 우세한 신경교세포입니다. 그들은 물과 이온 항상성 유지, 뉴런 영양 공급 및 조직 보호와 같은 중추 신경계의 다른 부위의 다른 아교세포에 비해 유사한 기능을 가지고 있습니다. MG는 또 다른 매혹적인 특징을 가지고 있습니다 : 성숙한 아교 세포이지만 발달 후반 동안 망막 전구 세포 (RPC)에서 발현되는 많은 유전자를 여전히 발현합니다 1,2. 이러한 유사성은 망막 손상 후 어망막에서 자연적으로 발생하는 MG계 신경세포 재생의 원인으로 가정된다3,4. 이 과정 동안, MG는 세포 주기에 다시 들어가고 RPC로 탈분화된 다음, 여섯 가지 유형의 망막 뉴런으로 분화된다. 이 현상은 물고기에서 자연적으로 발생하지만, 포유류 MG는 뉴런 5,6으로 변환되지 않습니다. 그러나 다시 프로그래밍 할 수 있습니다. MG를 RPC / 뉴런으로 재 프로그래밍하는 다양한 요인이 나타났습니다. 이들 인자 중에는 어류 재생 7,8에 관여하는 기본적인 나선-루프-나선 (bHLH) 전사 인자 achaete-scute homolog 1 (Ascl1)이 있다. 마우스에서, Ascl1은 망막 생성 동안 RPC에서만 발현되지만 성숙한 MG 또는 망막 뉴런9에서는 존재하지 않는다.
생체 내에서 세포를 직접 재프로그래밍하는 것은 방법론적으로 어려울 뿐만 아니라 제도적 동물 관리 및 사용 위원회의 승인이 필요합니다. 승인을 받으려면 사용 또는 변경된 요인, 농도, 오프 타겟 효과, 기본 메커니즘, 독성 및 효율성에 대한 예비 데이터가 필요합니다. 세포 배양 시스템은 생체내 모델에서 사용하기 전에 이러한 기준에 대한 테스트를 허용한다. 더욱이, MG는 전체 망막 세포 집단(10)의 약 5%만을 구성하기 때문에, MG 배양은 이동 12,13, 증식14, 부상/손상에 대한 스트레스 반응 15,16, 미세아교세포 17 또는 망막 신경절 세포(RGCs)18과 같은 다른 세포 유형과의 상호작용을 포함하는 그들의 기능(11)뿐만 아니라 그들의 행동에 대한 연구를 허용한다18, 또는 그들의 신경 인성 잠재력 19,20,21. 많은 연구자들은 무제한의 증식 잠재력을 가지고 있으며 쉽게 유지하고 형질 감염 될 수 있기 때문에 불멸의 세포주를 연구에 사용합니다. 그러나 일차 세포는 진정한 세포 특성 (유전자 및 단백질 발현)을 가지고 있기 때문에 불멸화 된 세포보다 생물학적으로 관련된 분석에 바람직하며, 더 중요한 것은 발달의 특정 단계를 나타내며 따라서 "나이"를 갖기 때문입니다. 동물의 나이 (그리고 결과적으로 동물로부터 얻은 세포의 나이)는 발달22의 진행 단계에 따라 세포 가소성이 감소하기 때문에 세포 재 프로그래밍에서 특히 중요한 요소입니다.
이 프로토콜은 재생성을 연구하기 위한 현재의 시험관내 방법으로서 miRNAs로 일차 MG를 재프로그래밍하는 방법을 상세히 기술한다. 이 MG 일차 배양 모델은 P53 녹아웃 마우스(trp53-/- 마우스)23에서 MG의 세포 증식 특성을 평가하기 위해 2012년에 확립되었다. 배양된 MG가 그들의 아교세포 특징(즉, 면역형광 표지를 통해 평가된 S100β, Pax6 및 Sox2 단백질의 발현)을 유지하고, 생체내 MG(FACS-정제된 MG의 마이크로어레이)23과 유사함을 보여주었다. 그 직후, 아교세포 mRNA 및 단백질 발현을 바이러스 벡터20을 사용하여 다른 접근법에서 검증하고 확인하였다. 몇 년 후, 이들 배양물에서 발견되는 대다수의 세포는 MG 특이적 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 리포터 마우스24를 사용하여 MG임을 확인하였다. 더욱이, FACS 정제된 MG 및 배양된 일차 MG 둘 다에서 miRNAs의 세트의 정량화는 MG miRNAs (mGLiomiRs)의 수준이 성장 단계 동안 배양된 MG에서 크게 변하지 않는다는 것을 보여주었다. 그러나 길쭉한 배양 기간은 miRNA가 번역 조절자(25)이기 때문에 miRNA 수준의 변화를 야기하고, 결과적으로 mRNA 수준 및 단백질 발현에 변화를 일으킨다.
2013년에, 이 MG 배양 모델은 MG를 망막 뉴런20으로 재프로그램하는 그들의 능력에 대하여 다양한 전사 인자를 시험하기 위해 사용되었다. Ascl1은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 재 프로그래밍 요소로 밝혀졌습니다. 바이러스 벡터를 통한 Ascl1의 과발현은 형태학적 변화, 뉴런 마커의 발현, 및 뉴런 전기생리학적 특성의 획득을 유도하였다. 더욱 중요하게는, 이러한 첫 번째 시험관내 실험으로부터 얻은 통찰력 및 결과가 생체내 응용(in vivo applications)22,26으로 성공적으로 전달되었으며, 이는 일차 MG 배양이 생체내 구현 전에 초기 인자 스크리닝 및 신경교 기능의 평가를 위한 견고하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다는 것을 입증한다.
몇 년 전, 망막 뉴런에서도 고도로 발현되는 뇌가 풍부한 miRNA miR-124가 배양된 MG21에서 Ascl1 발현을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 살아있는 세포에서의 Ascl1 발현은 Ascl1 리포터 마우스 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)를 통해 시각화되었다. 리포터 마우스는 DNA에 리포터 유전자가 삽입된 유전자 조작 마우스입니다. 이 리포터 유전자는 리포터 단백질을 암호화하며, 이는 본 연구에서 적색 형광 단백질인 tdTomato이다. 이러한 리포터 단백질은 관심있는 유전자, 이 경우 Ascl1의 발현을 보고한다. 즉, Ascl1을 발현하는 세포는 빨간색으로 변합니다. Ascl1은 RPC9에서만 발현되기 때문에, 이 Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 마우스는 MG가 Ascl1 발현 RPC로 전환되는 것을 추적할 수 있게 해주며, 이는 전환 세포가 적색 형광 tdTomato 리포터 단백질을 발현한다는 것을 의미한다. 이것은 이들 세포의 DNA가 변화되기 때문에 돌이킬 수 없는 표지이다. 결과적으로, 임의의 후속 뉴런 분화는 tdTomato 라벨이 분화 세포에 남아 있기 때문에 시각화될 것이다. MG 유래 RPC (tdTomato 라벨 포함)를 발현하는 Ascl1이 뉴런으로 분화되면 이러한 뉴런은 여전히 빨간색 레이블을 갖습니다. 따라서 이 마우스는 라이브 셀 이미징을 위한 MG 유래 RPC의 라벨링을 허용할 뿐만 아니라 이러한 MG 유래(적색) RPC의 운명 매핑 및 계보 추적을 허용합니다. 보다 최근에, RPCs에서 miRNA의 세트가 확인되었고, Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-리포터 마우스의 MG 배양물을 사용하여 이들 miRNA가 리프로그래밍 용량 및 효율27에 미치는 영향을 스크리닝하고 테스트하였다. 하나의 후보물질인 RPC-miRNA miR-25가 배양된 MG를 Ascl1 발현 (Ascl1-Tomato+) 세포로 재프로그래밍할 수 있음을 발견하였다. 이러한 재프로그램된 세포는 뉴런 형태학(작은 소마타 및 짧거나 긴 미세 과정), scRNA-Seq를 통해 측정된 뉴런 전사체의 발현, 면역형광 표지(27)를 통해 검증된 뉴런 단백질의 발현을 포함하여 시간이 지남에 따라 뉴런 특징을 채택한다.
여기서, 프로토콜은 이전 작업 21,24,27로부터 적응된 P12 마우스로부터 MG를 성장 및 형질감염시키는 방법을 상세히 설명한다. 이 프로토콜에 대해 선택된 miRNA는 앞서 언급한 miRNA-25로, MG 또는 망막 뉴런에서 낮은 발현 수준을 갖는 RPC에서 고도로 발현되는 miRNA이다. miR-25를 과발현시키기 위해, 뮤린 miR-25 모방체, 즉 인공 miRNA 분자가 사용된다. 대조군으로서, Caenorhabditis elegans로부터의 miRNA의 모방체가 선택되며, 이는 포유동물 세포에서 아무런 기능도 갖지 않는다. MG를 RPC로 변환하는 시각화는 RPC 리포터 마우스(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), 배경이 혼합된 마우스(C57BL/6, S129 및 ICR 균주)를 통해 달성되었다. 그러나, 이러한 배양은 야생형 균주를 포함한 모든 마우스 균주와 함께 수행될 수 있다. 지난 몇 년 동안, 원래의 프로토콜은 성장 단계 지속 기간 및 전체 배양 기간을 감소시키고 보다 강력한 아교세포 상태를 보장하고 장기간의 배양 기간에 발생하는 세포 변성의 정도를 최소화하기 위해 수정되었다. 규칙적인 형질감염 시간 창은 또한 3h에서 2일로 연장되었다. 앞서 언급한 바와 같이, 현재의 프로토콜은 MG 배양을 재생 연구를 위한 도구로서 기술하지만, 이 방법은 재프로그래밍 인자를 테스트하는데 유용할 뿐만 아니라, MG 이주 또는 증식성 거동, 손상/세포 손상 관련 패러다임, 및/또는 근본적인 메커니즘 및 경로의 식별에 관한 연구를 포함하는 다른 응용에도 적용될 수 있다.
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Protocol
동물 피험자와 관련된 절차는 SUNY 검안 대학의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.
참고: 이 배양 프로토콜은 성장, 형질감염 및 전환 단계의 세 단계로 구성됩니다. 타임라인이 있는 전체 프로토콜에 대한 요약은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 배지 및 모든 필수 시약의 제조
참고: 모든 단계는 A2 또는 B2 생물안전 캐비닛(BSC)에서 수행해야 합니다. 성장 단계 동안, 표피 성장 인자 (EGF)로 보충된 기초 뉴런 배지로 구성되는 고혈청 성장 배지가 사용된다. 전환 단계의 경우, 신경 보충제가 보충 된 저혈청 신경 생리 학적 기본 배지가 신경 분화 및 생존을 보장하는 데 사용됩니다.
- 기저 신경배지 200mL에 소 혈청 20mL(FBS, 10%), 200mM L-글루타민 1mL(0.5%), 페니실린/스트렙토마이신 2mL(1%), N2 보충제 2mL(1%)를 보충하여 성장 배지(성장기 동안 사용)를 준비합니다. 멸균 여과(0.22μm 기공 크기를 갖는 필터 장치)를 수행합니다. 배지를 사용 전에 37°C 금속 비드 배쓰에서 미리 가온한다.
- 무혈청 신경생리학적 기초 배지 100mL에 B27 신경세포 보충제 2mL(2%), N2 보충제 1mL(1%), 100ng/mL의 뇌 유래 신경영양 인자(BDNF, 인산완충식염수(PBS, 0.1% 소 혈청알부민(BSA)로 재구성하여 제조사의 지시에 따라 뉴런 배지(전환 단계 중 사용)를 준비합니다( 자료 표 참조), 최종 농도 20 ng/mL), 100 ng/mL 글리아 세포 유래 신경영양 인자 20 μL(GDNF, 멸균 행크스 밸런스드 솔트 용액[HBSS]에서 재구성), 최종 농도 20 ng/mL), 100 mg/mL 디부티릴-cAMP 500 μL(DMSO에서 재구성), 50 ng/mL 아스코르브산 70 μL(멸균 PBS에서 재구성), 페니실린/스트렙토마이신 1.5 mL. 멸균 여과(0.22μm 기공 크기를 갖는 필터 장치)를 수행합니다. 사용 전에 37°C 금속 비드 욕조에서 미리 따뜻한 배지.
참고: 이 매체는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다. - 제조업체의 프로토콜에 따라 망막 해리에 필요한 Papain, DNase I 및 Ovomucoid 시약을 재구성하십시오. 멸균된 1.5 mL 튜브에서 파파인 750 μL의 분취량, 멸균된 0.6 mL 튜브에서 75 μL의 DNase I, 및 2 mL 튜브에서 750 μL의 오보뮤코이드 프로테아제 억제제. 파파인 및 DNase I 분취량을 -20°C에서 동결시키고, 시약의 분해를 피하기 위해 오보무코이드 분취량을 4°C에서 유지한다. 사용 직전에 실온에서 해동하십시오.
참고: Papain, DNase I 및 Ovomucoid는 Papain Dissociation System이라는 키트에서 발견됩니다( 재료 표 참조). - 데이터시트 지침에 따라 면역형광 표지를 수행하는 경우 커버슬립 코팅을 위해 폴리-L-오르니틴(Poly-O) 및 라미닌을 재구성합니다(Poly-O: 멸균수 중 0.1mg/mL; 라미닌: DMEM에서 1:50에 1.2 mg/mL를 희석). 분취량 폴리-O 및 라미닌 (2.5 mL) 분취량을 -20°C에서 동결시킨다. 사용 직전에 실온에서 해동하십시오.
참고: 1.4 단계. 면역 형광 표지 및 레이저 스캐닝 현미경 검사가 수행되는 경우에만 필요합니다.
2. 마우스 및 조직 추출
참고 : 이러한 재 프로그래밍 연구를 위해 Ascl1 CreERT : tdTomato STOPfl / fl 마우스는 Ascl1 CreERT 마우스 (Ascl1-CreERT : Jax # 012882)와 tdTomatoSTOPfl / fl 마우스 (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J : Jax # 007914)를 교차시켜 만들어졌습니다. 이 마우스는 혼합된 배경(C57BL/6, S129 및 ICR 변형)을 갖는다. 이 마우스의 유전자형은 도 1A에 도시되어 있다. 모든 균주가 이 프로토콜에 사용될 수 있다.
- 장갑을 착용하고 해부 현미경 및 모든 고급 도구 (Dumont # 5 미세 및 Dumont # 7 곡선 포셉, 미세 가위 및 Vannas 가위)를 포함한 작업 공간을 70 % 에탄올로 소독하십시오. 10cm 실리콘 코팅 블랙 해부 접시를 20 분 동안 자외선에 노출시켜 살균하십시오.
- 조직 추출을위한 접시 및 접시의 준비
- 안구 수집 및 샘플 분리를 위한 24-웰 플레이트를 준비하고(한 웰에서 마우스당 두 눈, 마우스 ID로 표지됨) 웰당 ∼1mL의 차가운 HBSS(4°C)를 사용한다. 24웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.
- 멸균된 10 cm 페트리 접시(세척용) 및 소독된 실리콘 코팅 해부 접시를 몇 mL의 차가운 HBSS(4°C)로 채워 조직이 HBSS로 완전히 덮여 있는지 확인하십시오.
- 1 mL의 70% 에탄올로 멸균된 1.5 mL 튜브를 준비한다.
- 12 웰 배양 플레이트를 배양 번호, 날짜, 균주 및 모든 필수 정보로 라벨링하여 제조하였다.
- 임의의 승인된 방법을 사용하여 P12 마우스를 안락사시킨다.
- 눈 제거
- 엄지 손가락과 검지 손가락으로 마우스 머리를 눈 주위로 부드럽게 잡으십시오.
- Dumont # 7 곡선 포셉을 사용하여 부드럽게 안구 뒤로 이동하여 시신경을 클립하십시오. 조심스럽게 눈을 떼십시오.
참고 : 성인 마우스를 사용하는 경우 곡선 포셉을 사용하지 말고 눈을 당기지 마십시오. 대신 미세한 가위를 사용하여 눈 주위를 조심스럽게 자르십시오. 시신경을 자르지 만 눈 자체를 자르지 마십시오. 포셉을 사용하여 조심스럽게 안구를 제거하십시오.
- 안구 청소
- 동물로부터 박테리아가 이월되지 않도록 안구를 에탄올 함유 튜브에 잠깐 담그십시오.
- 얼음 위의 24 웰 플레이트에 넣기 전에 10cm 페트리 접시에서 안구를 잠깐 씻으십시오.
- 다른 눈에 대해 2.4단계와 2.5단계를 반복합니다. 이 과정에서 우물 접시를 얼음 위에 보관하십시오. 한 동물의 두 눈을 광원으로 해부 현미경 아래에 놓인 해부 접시에 넣으십시오.
- 망막 추출
- Dumont #5 미세 포셉으로 공막 주변의 시신경과 주변 결합 조직을 잡고 해부 접시 (각막 위쪽)에 조심스럽게 눌러 하나의 안구를 고정하십시오.
- Vannas 가위에 쉽게 접근 할 수 있도록 30G 바늘을 사용하여 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다.
- Vannas 가위를 사용하여 섬모 몸체 주위의 각막을 해부하고 Dumont # 5 미세 포셉으로 각막, 렌즈, 홍채 및 유리체 몸체를 조심스럽게 제거하십시오. 도 2A는 망막 내부가 있는 안구 컵을 도시한다.
- 시신경에 도달 할 때까지 Vannas 가위로 공막을 해부하십시오. 시신경을 클립하고 Dumont # 5 미세 포셉을 사용하여 망막을 조심스럽게 추출하십시오.
- Dumont # 5 미세 포셉의 두 번째 쌍을 사용하여 망막을 밀어 내고 유리체 몸체를 완전히 제거하십시오. 도 2B 는 두 개의 추출된 망막을 도시한다.
- 전송 및 세척
- 직경을 확대하기 위해 멸균 전달 피펫의 끝의 약 2.5cm를 자릅니다. 이 팁을 사용하여 조직을 손상시키지 않고 전체 망막을 집어 들으십시오.
- 망막을 차가운 HBSS (4 ° C)가있는 새로운 멸균 페트리 접시에 옮기고 접시 (앞뒤, 왼쪽 및 오른쪽)를 흔든다.
- 전사 피펫 팁을 사용하여 망막 색소 상피 (RPE) 세포를 씻어 내기 위해 망막 주위를 조심스럽게 밀어 넣으십시오.
참고: 또는 렌즈와 유리체가 있는 망막 전체를 아이컵에서 제거할 수 있습니다. 이어서, 수정체 및 유리체는 추출된 망막으로부터 제거될 수 있다. 망막이 찢어지면 해리를 위해 모든 조각을 수집해야합니다. 그렇지 않으면, 합류 세포층을 성장시키기에 불충분한 양의 조직이 존재할 것이다.
- 분리된 망막을 즉시 HBSS 1mL로 채워진 24웰 플레이트의 새롭고 깨끗한 웰에 놓으십시오. 해부 과정에서 24 웰 플레이트를 얼음 위에 보관하십시오.
- 2.7-2.9단계를 반복하여 두 번째 망막을 분리합니다.
3. 망막 해리
참고: 다음 모든 단계(세포 수확 전까지)는 A2 또는 B2 생물안전 캐비닛(BSC)에서 수행해야 합니다.
- 파파인/DNase I 해리 혼합물을 다음과 같이 준비한다.
- 6개의 망막에 대해, 750μL의 파파인이 들어있는 튜브에 75μL의 DNase I을 첨가하고(단계 1.3부터) 조심스럽게 혼합한다(해리 혼합물).
- 이 프로토콜에 필요한 개별 샘플 준비의 경우, 825 μL의 총 부피를 세 개의 분취량으로 나눕니다: 마우스 당 하나의 1.5 mL 튜브 (두 개의 망막)에서 혼합물의 275 μL. 그에 따라 DNase I 및 Papain의 필요한 양을 계산하십시오.
참고 : 최대 여섯 개의 망막이 파파인 / DNase I 혼합물의 한 튜브에서 해리 될 수 있습니다. 그러나, 개별 샘플 준비는 결합된 샘플에서보다 더 적은 덩어리와 더 나은 세포 성장을 초래한다.
- 두 개의 망막을 파파인/DNase I 해리 혼합물로 옮긴다. 확대 된 팁 직경의 전사 피펫을 사용하여 (단계 2.8.1), 망막을 집어 들고, 망막이 팁 바닥에 정착 할 때까지 기다린 다음 과도한 HBSS없이 망막을 Papain / DNase I 혼합물이 들어있는 튜브로 방출하십시오.
- 너트에이터 위에 놓고, 이를 세포 배양 인큐베이터(37°C, 5%CO2)에서 10분 동안 인큐베이션한다.
- 1 mL 피펫으로 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 해리시킵니다 (약 20-30 배). 세포가 해리된 후(즉, 덩어리가 없는 균질한 용액을 초래함), 파파인 해리 키트로부터 275 μL의 오보무코이드 프로테아제 억제제를 첨가하여 파파인을 중화시킨다. 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 섞으십시오.
참고: 6개의 망막이 파파인/DNase I 혼합물의 825μL에서 해리된 경우, 825μL의 난부가 필요합니다. - 혼합물을 4°C에서 10분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 표피 성장 인자 (EGF, PBS 중 200 μg/mL로 재구성된 성장 배지 1 mL 당 1 μL)를 37°C에서 미리 가온된 계산된 부피의 성장 배지 (마우스 당 1 mL)에 첨가하였다.
참고: 실험 설계에 따라, 증식 마커인 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU)과 4-하이드록시타목시펜(4-OHT) 또는 기타 필수 인자를 배양 기간의 초기에 첨가할 수 있습니다. - 튜브를 원심분리기에서 조심스럽게 제거하십시오. 튜브 바닥의 펠렛을 만지지 마십시오.
- 상청액을 조심스럽게 그리고 완전히 제거하십시오. 세포 펠릿을 500 μL의 EGF 보충 성장 배지로 재현탁시킨다.
- 세포 현탁액을 표지된 12-웰 플레이트의 하나의 웰 내로 옮긴다(도 2C). EGF가 보충된 성장 배지의 또 다른 500 μL로 튜브를 헹구고 웰에 첨가한다(웰 당 총 부피 1 mL).
- 다른 모든 샘플에 대해 3.8단계와 3.9단계를 반복합니다.
- 우물 접시를 세 번 조심스럽게 흔들어주십시오 (앞뒤로, 왼쪽과 오른쪽). 플레이트를 인큐베이터(37°C,CO2)에 넣는다.
참고: 트랜스제닉 마우스를 사용하는 경우 모든 동물에 대해 유전자형을 수행합니다(그림 2D). Cre 재조합효소 양성 및 음성 마우스를 확인하고 그에 따라 플레이트에 라벨을 붙인다. 이 프로토콜의 경우, Cre 재조합효소 양성 리포터 마우스의 세포만이 다음 단계에 사용되었다. Cre 음성 표본의 세포는 동결되어 다른 용도로 사용됩니다.
4. 성장기
참고: 성장 단계의 지속 기간은 약 4-5일입니다(그림 1B). 세포를 포함하는 웰에 액체를 추가하려면 피펫이 우물의 벽을 가리켜야하며 세포 분리를 피하기 위해 액체를 천천히 방출해야합니다. 세포 위에 직접 피펫을 바르지 마십시오.
- 해리 후 하루 후, 배지를 제거하고 신선한 EGF가 보충된 성장 배지 1 mL를 첨가한다.
- 3일째에, 배지를 제거하고 HBSS 1 mL(실온)를 첨가하여 세포 파편을 제거하였다. 왼쪽에서 오른쪽으로 부드럽게 앞뒤로 흔들어줍니다. HBSS를 제거하고, 세척 단계를 반복하고, 미리 가온된 EGF 보충 성장 배지 1 mL를 첨가한다.
- 매일 세포를 모니터하고 세포가 90 % -100 % 합류율에 도달 할 때까지 성장 상태를 평가하십시오. 도 3은 시간에 따른 양호한 MG 성장의 예를 나타낸다. 가능한 오염 또는 세포 사멸을 확인합니다(보충 그림 1). 오염된 문화는 버리십시오.
참고: 셀 상태를 모니터링하고 기록하려면 카메라가 부착된 광학 현미경과 4x, 10x 또는 20x 조준을 사용하여 다양한 배율로 이미지를 촬영합니다. 이 연구에서는 형광 현미경이 사용됩니다.
5. 폴리-L-오르니틴(Poly-O) 및 라미닌 코트를 사용한 커버슬립의 제조
참고: 이 단계는 면역형광 표지 및 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사가 수행되는 경우에만 필요합니다. 적절한 이미징을 위해 둥근 유리 커버 슬립 (직경 12mm)이 필요합니다. 코팅 프로토콜은 또한 뉴런 배지 데이터시트에서 찾을 수 있다( 표 참조).
- 멸균 커버슬립을 멸균 Dumont #2AP 포셉을 사용하여 24웰 플레이트의 모든 웰 중앙에 조심스럽게 놓습니다.
참고: 덮개 슬립을 웰 중앙에 놓습니다. 커버 슬립을 우물 벽 가까이에 놓으면 다음 단계에서 표면 장력 문제가 발생합니다. - 실온에서 2.5 mL Poly-O 분취량을 해동하고 100 μL의 분취량을 각 커버슬립의 중앙에 놓는다.
- 웰 플레이트를 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다.
- Poly-O를 제거하고 커버슬립으로 웰을 ~1mL의 멸균수로 세 번 세척한다.
- 웰 플레이트를 BSC에서 하룻밤 동안 말리십시오. 라미닌 2.5 mL를 4°C에서 하룻밤 동안 해동시켰다.
- 다음날 아침, 100 μL의 라미닌을 각 커버슬립의 중앙에 첨가하고, 37°C 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이션한다.
- 라미닌을 조심스럽게 그리고 완전히 제거하십시오.
- 계대배양을 즉시 수행할 수 없는 경우 플레이트를 4°C로 유지하십시오.
참고: 제조된 플레이트에 코팅된 커버슬립은 4°C에서 며칠 동안 보관할 수 있습니다.
6. 신경 생존자를 제거하는 세포 통과
참고 : 세포 통과는 신경 세포를 제거하는 데 필요하며 세포 집단을 증가시키지 않아야합니다. 글리아는 단지 몇 번만 나뉘며 통과 후 더 이상 성장하지 않습니다. 세포 현탁액을 희석하지 마십시오. 12-웰 플레이트의 하나의 합류 웰의 세포는 12-웰 플레이트의 한 웰 또는 24-웰 플레이트의 두 웰 상에 분포될 수 있다. 코팅된 커버슬립을 사용할 때, 커버슬립의 약 삼분의 일만 코팅됩니다. 따라서 합류 세포 (~ 80 % -90 %)가있는 24 웰 플레이트에 앉아있는 6 개의 커버 슬립은 12 웰 플레이트의 합류 세포 중 하나의 웰에서 얻을 수 있습니다. 다른 비율은 세포 밀도를 증가 또는 감소시키기 위해 또한 선택될 수 있다. 이 프로토콜을 위해, 하나의 Cre+ 리포터 마우스가 사용된다[하나의 실험, 두 가지 치료: miR-25 또는 대조군-miR; 기술적 복제물 n=3 (처리당 3개의 커버슬립), 생물학적 복제 n=1]. 기술적 및 생물학적 반복실험의 수는 실험 설계에 따라 다르게 정의될 수 있다.
- 세포가 90 % -100 % 합류하는지 확인하십시오 (또한 우물의 여백에서; 그림 3E, F).
- 배지를 제거하고 HBSS 1mL(실온)를 첨가하여 세척합니다. 부드럽게 접시를 흔든다 (앞뒤로, 왼쪽과 오른쪽). HBSS를 완전히 제거하십시오.
- 500 μL의 미리 가온된 트립신 함유 용액 (금속 비드 배쓰에서 37°C에서 예비가온)을 첨가하여 세포를 웰로부터 분리시킨다. 부드럽게 바위(앞뒤로, 왼쪽에서 오른쪽으로)하고 37°C 인큐베이터에서 2분 동안 인큐베이션한다.
- 플레이트를 인큐베이터에서 BSC로 옮깁니다. 기울이는 동안, 트립신 함유 용액을 흡인하고 세포가 완전히 분리될 때까지 조심스럽게 그리고 천천히 우물 위에 여러 번 분산시킨다. 플레이트를 빛에 대고 잡고 바닥에 세포가 남아 있지 않은지 확인하십시오.
- 이 세포 현탁액을 멸균된 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 4°C에서 8분 동안 300 x g 에서 원심분리한다.
- 상청액을 제거하고 미리 가온된 성장 배지(EGF 보충, 1:1000)의 600μL(6웰/커버슬립의 경우 웰당 100μL)를 첨가하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁시켰다. ~ 30-40 번 위아래로 피펫팅.
참고: 세포는 -80°C 또는 액체 질소에서 이 시간에 동결될 수 있고 세포주를 해동하기 위한 표준 프로토콜에 따라 해동될 수 있다. 세포가 동결되면 EGF 보충 배지 (성장 배지)에 재현탁되지 않습니다. 그들은 염기성 배지 (EGF 없음)와 동결 용액 (1/1 비율)에 재현탁 될 것입니다. 6.1.1~6.6.2단계는 세포를 동결시키는 단계를 설명합니다. 동결된 셀이 없으면 단계 6.7로 계속하십시오.- DMSO 100μL와 FBS 400μL(웰/샘플당 총 부피 500μL)를 혼합하여 냉동 용액을 준비합니다.
- 세포 펠릿을 500 μL의 예비가온된 성장 배지에 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 DMSO/FBS 동결 용액 500 μL(총 부피 1 mL)에 첨가한다. 모든 샘플이 처리 될 때까지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오. 세포를 -20°C에서 1시간 동안 동결시킨 다음, -80°C에서 보관한다.
- 시드 세포는 100 μL의 600 μL 세포/배지 현탁액 (단계 6.6)을 24-웰 플레이트의 6개의 코팅된 커버슬립(단계 5 참조)의 중앙에 위치시킨다. 플레이트를 조심스럽게 인큐베이터에 놓고 세포가 침전되도록하십시오.
참고: 600 μL 세포 현탁액 중 100 μL (12-웰 플레이트의 한 웰로부터 수확됨)는 형질감염에 필요한 90%-100% 세포 합류를 초래할 것이다. - 3 시간 후에 세포가 커버 슬립에 정착했는지 확인하십시오. EGF로 보충된 성장 배지 400 μL를 첨가한다.
참고: 세포는 보통 다음날 형질감염 준비가 되어 있습니다(그림 3G). 합류하지 않으면 (90 % -100 %), 다른 날 동안 그대로 두십시오. 여전히 합류하지 않으면 트랜스펙션에 사용하지 마십시오. miRNA 프로파일링, RNA-Seq, RT-qPCR 또는 웨스턴 블롯과 같은 다른 다운스트림 적용이 수행되는 경우, 세포를 12-웰 플레이트(1:1 비율, 플레이트 처리 필요 없음)로 계대하고 RNA/단백질 추출을 위해 수확해야 합니다.
7. 형질감염
참고: 형질감염 단계는 형질감염 배지에서만 3시간 단계(형질감염 시약과 함께 제공되는 형질감염 매뉴얼에 설명되어 있음)와 형질감염 시약과 miRNA가 여전히 존재하지만 필요한 보충제가 첨가되는 뉴런 배지(총 지속 기간은 2일; 그림 1B). 이 프로토콜에서, 여섯 개의 웰이 형질감염될 것이다: 세 개의 웰은 miR-25 리프로그래밍 miRNA를 수신할 것이고, 세 개의 웰은 조절된 miRNA를 수신할 것이다.
- 세포가 90 % 컨플루언시에 도달했는지 확인하고 형질감염 전에 세포를 기록 / 이미지화하십시오.
- 성장 배지를 제거하고 500 μL의 HBSS (실온)를 첨가하여 세포를 세척한다.
- HBSS를 제거하고 형질감염에 사용되는 환원된 혈청 배지 400μL를 첨가한다. 플레이트를 다시 37°C 인큐베이터에 넣는다.
- 제조자의 형질감염 시약 프로토콜의 지시에 따라 형질감염 혼합물을 준비한다. 트랜스펙션 시약 믹스와 miRNA 믹스의 두 가지 혼합물을 만드십시오 (그림은 그림 1B 참조).
- 형질감염 시약 혼합물을 준비한다: 24-웰 플레이트의 경우, 1개의 웰(총 50 μL)에 대해 49μL의 환원된 혈청 배지 및 1μL의 형질감염 시약이 요구된다. 6개의 웰에 대해, 294μL의 환원된 혈청 배지 및 6μL의 형질감염 시약이 결합되고 부드럽게 위아래로 피펫팅함으로써 잘 혼합된다.
- miRNA 모방 혼합물 준비: 24-웰 플레이트의 경우, 하나의 웰에 대해 모방 혼합물의 총 부피 50 μL가 요구된다. 세 웰은 대조군 miRNA를 받고 다른 세 웰은 miR-25로 처리될 것이다. 이 프로토콜의 경우, 200 nM 최종 농도가 사용된다.
- miR-25 처리(3개의 웰)를 위해, 150 μL의 환원된 혈청 배지 및 3 μL의 miR-25 모방체(100 μM 원액)를 조합하고, 상하로 부드럽게 피펫팅함으로써 잘 혼합한다. 5 분 동안 배양하십시오.
대조군 모방 처리(3개의 웰)를 위해, 150 μL의 감소된 혈청 배지 및 3 μL의 대조군-miRNA 모방체(100 μM 원액)가 합쳐지고 상하로 부드럽게 피펫팅함으로써 잘 혼합된다. 5 분 동안 배양하십시오.
참고: miRNA 모방체의 부피는 희석 인자 및 필요한 농도 (20-500 nM)에 의존한다. miRNA 억제제 (antagomiRs) 또는 플라스미드를 포함하는 다른 분자도 또한 사용될 수 있다. 또한, 분자들의 조합은 형질감염될 수 있다.
- miR-25 처리(3개의 웰)를 위해, 150 μL의 환원된 혈청 배지 및 3 μL의 miR-25 모방체(100 μM 원액)를 조합하고, 상하로 부드럽게 피펫팅함으로써 잘 혼합한다. 5 분 동안 배양하십시오.
- miRNA 모방 혼합물과 형질감염 시약 혼합물을 결합한다. 천천히 그리고 부드럽게 위아래로 피펫팅하여 피펫팅하여 조심스럽게 혼합하십시오. 실온에서 20 분 동안 배양하십시오 (제조업체의 지침에 따라).
- 상기 형질감염 혼합물을 세포 상부에 천천히 적가하고, 20 μL 피펫을 사용하여 웰 내의 배지 표면에 가깝게 첨가한다. 접시를 부드럽게 흔들어 놓습니다 (앞뒤로, 왼쪽에서 오른쪽으로).
- 37°C 인큐베이터에서 3시간 동안 인큐베이션한다.
- 3시간 후, 4-하이드록시타목시펜(2.58 mL의 에탄올로 재구성된 5 mM 스톡, 250 nM 최종 농도)으로 보충된 웰(웰 당 500 μL)에 뉴런 배지를 첨가하여 Cre 재조합효소 및 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU, DMSO 2 mL, 최종 농도 1 μM로 재구성된 10 mM 원액)을 활성화시켜 세포 증식을 추적하였다.
주의: 4-하이드록시타목시펜과 EdU는 인간 발암물질, 테라토겐 및 돌연변이원으로 알려져 있습니다. 사용하기 전에 물질 안전 데이터 시트를 읽고 장갑, 고글 및 실험실 코트를 착용하십시오. 제조업체의 권장 사항에 따라 두 시약을 재구성하십시오. 물질 / 혼합물을 흡입하지 마십시오. 사용 후 단단히 닫으십시오. 폐기물은 국가 및 지역 규정에 따라 폐기해야합니다. 물질로 작업 한 후 손과 얼굴을 씻으십시오. - 37°C 인큐베이터에서 2일 동안 인큐베이션한다(도 1B).
8. 세포 변환
참고: 세포 변환 단계는 약 5-6일(그림 1B)의 지속 기간을 갖지만 더 긴 기간이 가능합니다.
- tdTomato 발현의 성공적인 유도, 잠재적 인 세포 사멸 및 / 또는 오염에 대해 매일 세포를 확인하십시오. 셀 밀도는 변하지 않습니다(그림 4). 먼저 희미한 적색 형광 표지된 세포는 4-하이드록시타목시펜 처리 후 1일 후에 관찰될 수 있다. 세포를 모니터링하고 이미지화하려면 형광 현미경이 필요합니다.
참고 :이 연구에서는 형광 현미경이 라이브 이미징에 사용됩니다. 이미지는 4x, 10x 또는 20x 목표로 촬영됩니다. - 형질감염 이틀 후, 배지를 제거하고 각 웰에 4-하이드록시타목시펜 및 EdU로 보충된 500μL의 미리 가온된 뉴런 배지를 첨가한다.
- 세포가 수확 될 때까지 배지를 격일로 신선한 배지로 교체하십시오.
- 적색 형광(Ascl1 발현) 세포의 수 및 이들의 형태학적 변화에 대한 평가 및 평가를 위해 라이브 이미지를 촬영한다(도 4 및 도 5A-C).
9. 세포 수확: 면역 형광 표지를 위한 정착
참고: 전지는 벌크 또는 scRNA-Seq, RT-qPCR 또는 웨스턴 블롯을 포함한 다른 다운스트림 애플리케이션을 위해 수확될 수 있다.
- 배지를 제거하고 웰 당 500 μL의 차가운 HBSS (4 °C)를 첨가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어줍니다 (앞뒤로, 왼쪽에서 오른쪽으로). HBSS를 제거합니다.
- 500 μL의 2% 파라포름알데히드 (PFA)를 첨가하여 세포를 고정시키고 실온에서 20분 동안 인큐베이션한다.
- 확립된 프로토콜에 따라 면역형광 표지를 수행한다.
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Representative Results
이 프로토콜은 P12 마우스 망막에서 MG를 성장시키는 방법과 Ascl1CreERT : tdTomatoSTOPfl / fl RPC 리포터 마우스를 사용하여 miR-25로 이러한 세포를 망막 뉴런으로 재 프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 MG를 RPC로 재프로그래밍한 다음, 뉴런 세포 특성(27)을 채택하기 위해 다른 적합한 miRNA(모방체 또는 억제제, 단일 분자 또는 조합)를 상세히 보고하기 위한 이전 연구에서 사용되었다. 이 방법은 배양물을 더 빠르게 성장시키고, 따라서 시간24,28,29에 걸쳐 인공 환경에 의해 야기되는 세포 변화를 최소화하도록 변형되었다.
원발성 MG 배양의 망막 해리 및 성장 단계
첫 번째 MG는 광학 현미경을 사용하여 시험관 내에서 첫날부터 발견 할 수 있습니다. MG는 관형, 길쭉한 모양 및 밝은 회색 세포체를 갖는다 (그림 3A-D, 빨간 화살촉). 그러나 대부분은 이러한 초기 단계에서 세포 파편으로 덮여 있습니다. 12-웰 플레이트의 한 웰에서 자란 한 마우스의 두 망막에서 나온 MG는 4-5일 이내에 90%-95% 컨플루언시에 도달합니다(그림 3E, F). 시간이 지남에 따라 모든 신경 파편이 제거되고 조밀 한 세포층이 존재할 것입니다. 우물의 바닥이 완전히 합류하지 않으면 세포는 통과 할 준비가되지 않습니다. 그러나 통과는 glia가 시간이 지남에 따라 문화에서 신경교 기능을 잃어 버리기 때문에 시험관 내에서 6 일 이내에 수행되어서는 안됩니다. 형질감염 또는 다른 치료 전에, 세포는 밀도와 활력을 검사할 필요가 있다. 형질감염은 90%-95% 합류 세포에서만 수행되어야 한다(그림 3G). 면역 형광 표지 및 공초점 현미경 분석을 위해, 세포는 코팅 된 커버 슬립에 시딩되어야합니다.
세포 전환 기간의 초기 및 후기 단계
형질감염 후 15시간 및 4-하이드록시타목시펜 처리 후 15시간 경과에 따라, 첫 번째 세포는 희미한 적색 형광, 즉 tdTomato 적색 형광 리포터 단백질을 발현하기 시작하여(활성화된) Ascl1 프로모터 하에서 구동된다. Ascl1 발현 세포는 이제 Ascl1-Tom+ 세포로 추가로 지칭된다. 보다 강력한 Ascl1-Tom 발현은 형질감염 2일 후 시간에 따른 적색 형광 증가와 함께 관찰될 수 있다(도 4). 리프로그래밍 효과는 리프로그래밍 miRNA 처리에서 발견되는 필드 당 많은 Ascl1-Tom+ 세포와 함께 배양에서 약 2일 동안 가시화된다: 대조군-miR 및 miR-25에 대해 여기에 도시되었다 (각각 도 4B-B''' 및 도 4C-C''''). 두 치료법 모두에서 Ascl1-Tom + 세포는 여전히 둥글고 상대적으로 크며 더 많은 glia / progenitor 세포와 같은 형태가 있습니다. 더욱이, 적색 형광 리포터의 유도는 배양물의 세포 밀도에 영향을 미치지 않는다 (여전히 90%-95% 합류).
형질감염 3일 내지 오일 후(도 4A 및 도 5A), Ascl1-Tom+ 세포의 수의 증가는 대조군에 비해 miR-25 처리 후 4배 증가의 수를 나타내는 miR-25 처리 웰(도 5B-D)에서 더욱 명백해진다. 또한, 첫 번째 형태 학적 변화가 눈에 띄게됩니다. 이러한 변화에는 세포 소마 크기의 감소와 미세 공정의 개발이 포함됩니다. 통제 조건에서 대다수의 세포는 크고 편평하지만 (신경교 / 선조와 같은, 그림 - 5B-B''), 작은 핵을 가진 많은 세포와 망막 뉴런과 유사한 몇 가지 작은 과정이 miR-25 처리에서 나타납니다 (그림 - 5C-C''). 이들 신경-유사 세포는 전체 Ascl1-Tom 집단의 대략 70%를 대표한다 (대조 치료에서 15%; 그림 5E). 세포는 세포 변환으로 인해 밀도가 떨어집니다 (작은 셀은 더 적은 공간을 필요로합니다). 흥미롭게도, 이러한 신경세포들은 심지어 작은 네트워크를 형성하는 것처럼 보인다(도 5C''). 이때, 뉴런 동일성을 확인하기 위해 면역형광 표지를 위해 세포를 채취할 수 있다.
뉴런 정체성의 확인
세포는 뉴런 특이적 세포골격 단백질 30,31에 대한 마커인 미세소관 관련 단백질 2(Map2) 및 뉴런 동일성을 검증하기 위한 오르토덴티클 호메오박스 2(Otx2)에 대한 항체로 표지된다(32,33). 두 마커 모두 이전의 리프로그래밍 연구21,27에서도 사용되었다. Otx2는 RPCs 34,35,36, 성숙 양극성 세포 34,35,37,38,39, 및 광수용체 35,36,37,38,40에서 발견되는 전사 인자이다. . DAPI 핵 표지는 배양물을 염색하는데 사용된다. 면역형광 표지는 대조군 조건에서 Map2 또는 Otx2 발현이 거의 없음을 보여준다(도 6A-A''',C). 그러나 miR-25 처리된 샘플은 많은 Map2+ 및 Otx2+ 세포를 갖는다(도 6B-B''''). 공초점 이미지의 정량화는 miR-25 과발현 후, 대조군에서 필드당 5개의 뉴런 세포와 비교하여 필드당 약 40개의 뉴런 세포가 존재한다는 것을 보여준다(도 6C, 필드 크기: 630 μm x 630 μm). 이미지는 20x 목표로 촬영되었습니다. 이들 뉴런 세포는 miR-25 처리된 샘플의 총 Ascl1-Tom+ 세포 집단의 약 70%를 구성한다(대조군∼20%, 도 6D). 모든 뉴런 유사 Ascl1-Tom+ 세포는 Map2+ 및 Otx2+였으며, 뉴런 동일성을 확인하였다. 더욱이, Otx2+ 및 Map2+ 세포의 절대 수는 대조군-miRNA 처리에 비해 miR-25 처리 후 더 높았다 (miR-25: 필드 당 60 세포; 대조군-miR: 필드 당 10 세포; 도 6E).
종합하면, 결과는 MG 배양이 miRNAs로 성장되고 재 프로그래밍 될 수 있음을 보여줍니다. miR-25 보충은 1차 MG에서 Ascl1-Tom 발현을 유도한다. 많은 MG는 뉴런 형태를 채택하고 며칠 후 뉴런 마커 Map2 및 Otx2를 발현하는 RPC로 변환됩니다.
그림 1: 1차 뮐러 글리아 배양의 실험 설계 및 시간 과정 . (A) 뮐러 글리아교(MG)가 망막 전구 세포(RPC)로 전환되는 것을 추적하는 데 사용되는 망막 선조 리포터 마우스인 Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 마우스의 개략도. (b) 성장 단계 (청색, 시험관 내에서 0-4/5 일, div), 형질감염 단계 (보라색, 5/6-7/8 div) 및 MG 전환 단계 (황색, 시작 7/8 div)로 구성된 배양 기간의 시간 과정. 성장 단계: 해리된 망막(한 마우스의 두 망막)은 성장 배지에서 12-웰 플레이트의 한 웰에서 성장한다. 4/6일경, 세포는 코팅된 커버슬립이 들어있는 24웰 플레이트로 계대됩니다. 형질감염 단계: 5-7 div (계대 후 1일) 세포를 형질감염 배지에서 2일 동안 miRNA로 형질감염시킨다. Cre 재조합효소는 4-하이드록시타목시펜(4-OHT)으로 활성화된다. 세포 증식은 EdU로 추적된다. MG 전환 단계는 형질감염 후 1 일 후에 시작됩니다. 세포는 이제 수확될 때까지 뉴런 배지에서 성장한다(형질감염 후 6-7일, dpTF). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 망막 해리 및 유전자형 . (A) 각막, 렌즈, 홍채 및 유리체가 제거된 아이컵. (b) 단리된 망막; 망막 색소 상피 (RPE) 세포는 철저한 세척 후에 제거된다. (C) 해리된 망막이 있는 12-웰 플레이트(웰 당 두 개의 망막). (d) 지노타이핑 겔 이미지의 컷아웃 예. 유전자형은 Ascl1 구동 Cre 재조합효소 발현을 갖는 마우스를 확인하기 위해 요구되며, 세포 전환을 추적하는데 사용될 것이다. 배율 막대: 1mm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: 성장 단계 동안의 일차 뮐러 글리아. (A) 성장 단계 동안의 배양 기간의 시간 과정(시험관내 0-4/5일 (div))은 파란색으로 강조 표시됨. (B-G) 뮐러글리아교아(MG)의 라이브 이미지(phase)는 성장 단계 후 1 div (B), 2 div 배지 변화 후 (C), 3 div (D), 4 div 통과 전 (E,F) 및 5 div, 통과 후 1일 및 형질감염 전(G). MG 세포체는 빨간 화살촉으로 표시됩니다. 3 div 후, 배양물은 60%-80% 합류 (D), 4-5 div 후에, 배양물은 90%-100% 합류하고 계대 준비가 된다 (E-F). 커버슬립에 계대 후, 세포 배양물은 후속 형질감염(G)을 위해 80%-90% 합류될 필요가 있다. 스케일 바: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 뮐러 글리아 전환 단계의 초기 단계. (A) 전환 단계 동안의 배양 기간의 시간 과정은 노란색으로 강조 표시됨(시험관내 7/8일 시작(div)). 이 그림에 표시된 분석 시점은 적색 별표로 표시됩니다 : 7 div, 2 일 형질 감염 후 (dpTF). (B-C''') 뮐러 글리아교(MG) 배양물의 위상 및 적색 형광, 결합 또는 단일 적색 형광의 라이브 이미지. 적색 형광은 MG (tdTomato+, 약칭 Ascl1-Tom)를 발현하는 Ascl1을 시각화하며, 트랜스펙션 후 2일 후에 대조군 miRNA 모방체 (control-miR, B-B''') 또는 miR-25 모방체 (C-C'')로 시각화한다. B/B' 및 C/C'의 영역은 B''/B', C''/C'''에서 더 높은 배율로 표시됩니다. 배율 막대 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 뮐러 아교세포 전환 단계의 최종 단계. (A) 노란색으로 강조 표시된 전환 단계 동안의 배양 기간의 시간 과정(시험관내 7/8일 시작(div)). 이 그림에 표시된 분석 시점은 적색 별표로 표시됩니다 : 10 div, 5 일 형질 감염 후 (dpTF). (B-C'') 뮐러 글리아교(MG) 배양물의 위상 및 적색 형광, 결합 또는 단일 적색 형광의 라이브 이미지. 적색 형광은 MG (tdTomato+, 약칭 Ascl1-Tom)를 발현하는 Ascl1을 대조군 miRNA 모방체 (control-miR, B-B'') 또는 miR-25 모방체 (C-C''')로 형질감염 후 5일 후에 시각화한다. B'/C'의 인셋은 각각 B''/C''에서 더 높은 배율로 표시됩니다. (d) 필드 당 Ascl1-Tomato+ 세포의 절대 수 (10x; 1440 μm x 1080 μm) 대조군-miRNA 또는 miR-25 처리 후, 형질감염 후 2- 및 5일 (dpTF; n = 1, 웰 당 5개의 이미지가 계수되고; 평균 ± S.D.). (e) 대조군-miRNA 또는 miR-25 처리 후, 형질감염 후 5일 후(5dpTF, n=1, 평균 ± S.D.)의 뉴런 유사 Ascl1-Tomato+ 세포 필드 당 총 Ascl1-Tomato+ 세포의 백분율. 스케일 바: 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 6: 재프로그램된 세포의 뉴런 동일성의 확인. (A-A'''; B-B'''') 일차 마우스 뮐러글리아리아 (MG) 배양물을 트랜스펙션 후 5일간 대조군 miRNA 모방체 (control-miR, A-A') 또는 miR-25 모방체 (B-B')로 처리한 면역형광 표지. 세포를 2% 파라포름알데히드 (PFA)로 고정시키고, RFP에 대한 항체와 함께 인큐베이션하여 뉴런을 표지하기 위해 tdTomato, Map2 및 Otx2를 표지하였다. DAPI 핵 표지(파란색)를 사용하여 모든 세포 핵을 염색하였다. (C-E) 정량화(n=1; 커버슬립당 다섯 개의 이미지가 계산됨; 필드 당 Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+ 셀의 절대 수(C), 총 Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ 셀의 Ascl1-Tom+Otx2+Map2+ 셀의 백분율(D), 필드당 Otx2+Map2+ 셀의 절대 수(E)의 ±평균 S.D.가 계산됩니다. 결과는 대조군에 비해 miR-25 치료에서 더 많은 수의 뉴런을 보여준다. 필드 크기: 630 μm x 630 μm. 배율 막대: 50μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1 : 세포 사멸 및 박테리아 오염. (A-A'') 박테리아로 오염 된 뮐러 글리아 (MG) 문화 3 div의 라이브 이미지. A의 삽입물 1은 A'에서 더 높은 배율로 표시되며 위축성, 죽은 글리아를 표시합니다. A의 Inset 2는 살아있는 glia와 함께 A'''에 표시됩니다. 스케일 바: 100 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 miRNAs를 이용한 리프로그래밍 연구를 위해 해리된 마우스 망막으로부터 MG를 성장시키는 방법을 기술한다. 다양한 이전 연구에서 보여지고 확인 된 바와 같이, 이들 배양물에서 발견되는 세포의 대다수 (80 % -90 %)는 MG20,23,24입니다. 이 방법은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 기술이며 프로토콜을 올바르게 준수하면 결과를 쉽게 재현 할 수 있습니다21,27. 그러나 문화의 성공적인 성장과 재 프로그래밍 효율성은 다양한 요인에 달려 있습니다.
첫째, 마우스의 나이는 성공적인 세포 성장에 중요한 역할을합니다. 따라서, MG 배양물이 리포터 마우스와 같은 야생형과 유사한 야생형 마우스 또는 형질전환 마우스로부터 성장한다면, 합류성 MG 단층이 성장하는 최신 연령은 P12이다. P12에서는 모든 망막 뉴런과 MG가 분화되고 더 이상 망막에 RPC가 존재하지 않습니다. MG는 성숙한 MG 마커, 예컨대 글루타민 합성효소 또는 글루타메이트 아스파르테이트 수송체(GLAST)20,23,41,42를 발현한다. 배양된 P12 MG는 EGF에 노출되었을 때 여전히 세포 주기에 재진입할 수 있지만, 사이클의 수는 시험관내에서 합류 세포층을 형성하기에 충분함에도 불구하고 제한된다. 그럼에도 불구하고, 배지 내의 EGF 또는 성분이 분해될 수 있기 때문에 P12 MG조차도 잘 성장하지 못하는 것이 발생할 수 있다. 불완전한 해리 (청크)는 또한 MG 성장을 덜 또는 지연시킬 수 있습니다. 불완전한 해리의 주요 원인은 효소의 가혹한 취급 (빠른 피펫팅, 볼텍싱 등)에 의한 망막 해리에 사용되는 DNase I의 불활성화입니다. 세포가 계대 때까지 잘 성장하더라도, 세포는 계대 후 덜 합류할 수 있다. 그 이유는 세포 사멸을 증가시키는 통과 과정 동안 가혹한 취급 또는 세포가 너무 드물게 시딩되었기 때문일 수 있습니다. 신경교세포는 많이 자라지 않기 때문에, 세포는 희석되지 않고 성장한 것과 동일한 비율로 플레이팅되어야 한다(불멸화된 세포주의 계대 시술과는 반대로). 참고로, MG 배양물은 우물의 중심에서 주변부로 성장하기 때문에, 더 높은 세포 밀도는 항상 중앙에서 발견될 것이다. 따라서 전체 우물이 세포로 덮여 있는지 확인하기 위해 통과 전에 모든 우물의 여백을 확인하는 것이 필수적입니다. 세포 농도 측정은 충분한 양의 세포의 처리를 보장하기 위해 수행되어야 한다.
추가적으로, P6 이하에서 마우스로부터 수득된 일차 배양물은 MG를 함유하지 않을 것인데, 이는 MG가 이 시점에서 막 성숙하기 때문이다. 이를 단세포 RNA-seq 분석43을 통해 나타내었다. 이 나이에 성숙한 MG 마커를 사용한 면역 형광 표지도 이것을 확인할 것입니다. 그러나 RPC의 비율은 P6에서 상당합니다. 따라서 결과는 신중하게 해석되어야합니다. 더욱이, 중간 필라멘트 마커 비멘틴 및 네스틴과 같은 마커는 이들 마커가 성상세포 44,45,46, 미세아교세포47,48, 내피세포 및 혈관주위세포 49,50,51,52에서도 또한 발현되기 때문에 일차 MG를 확인하기에 적절하지 않다. , MG 특이적이지 않습니다. GFAP는 망막 성상세포에서는 발현되지만 손상되지 않은 망막의 MG에서는 발현되지 않으며, 배양된 MG에 대한 좋은 마커는 아니다. 해리 동안 기계적 손상으로 인해 해리된 MG에서 상향조절되지만, 배양28에서 3일 후에 하향조절된다.
MG는 많은 RPC 마커를 공유하기 때문에 강력한 MG 배양을 보장하는 가장 안전한 절차는 P12 또는 이전 마우스에서 마우스를 사용하는 것입니다. 이 프로토콜은 P12 마우스 MG로부터 수득된 배양물을 기술하지만, 성인 마우스 MG는 배양되고 재프로그램(27)될 수 있다. 그러나 우물 당 더 많은 조직을 도금해야합니다 (네 개에서 여섯 개의 망막). 이는 성체 아교세포가 EGF와 10% 혈청에 노출되더라도 많이 분열하지 않기 때문이다. 감소된 세포 접촉은 세포 사멸 및 세포 변성(늘어난 세포, 확대된 세포)으로 이어질 것이다. 성인 아교세포는 공동 배양 패러다임(18 )을 위한 훌륭한 도구이며, 세포 밀도는 이러한 응용에서 그다지 중요하지 않을 수 있다. 그러나 형질감염 또는 형질도입과 같은 하류 적용의 경우, 합류 세포층이 요구된다.
손상된 성장 외에도 세포 사멸이 발생할 수 있습니다. 명백한 징후없이 세포 사멸이 발생하면 마이코 플라즈마 오염 (마이코 플라즈마 크기 0.1-0.3 μm)을 고려해야하며 마이코 플라즈마 검출 키트를 사용해야합니다. 샘플을 풀링하지 않고 모든 샘플을 별도로 유지하면 교차 오염의 위험을 줄일 수 있습니다. 그러나 더 큰 박테리아는 동물로부터 옮겨 질 수 있으며 모든 작업이 깨끗하고 멸균 된 환경에서 수행되더라도 오염을 일으킬 수 있습니다. 눈을 해부하기 전에 안구를 70 % 에탄올에 잠깐 담그고 추가 10cm 페트리 접시에 철저히 씻는 것이 좋습니다. 성공적인 문화를 이루기 위해서는 오염이 빠르게 발생할 수 있기 때문에 멸균 된 조건에서 작업하는 것이 필수적입니다. 박테리아, 효모 또는 곰팡이 / 곰팡이가 접시에서 발견되면 모든 우물이 영향을받지 않더라도 배양물이 손실됩니다. 오염은 세포 사멸을 야기하고 (보충 그림 1) 세포에 영향을 미치며, 그 결과 대표적이지 않은 데이터가 생성됩니다.
세포 사멸은 또한 커버슬립을 코팅하는데 사용되는 Poly-O(또는 Poly-D-Lysine)와 같은 다운스트림 적용에 필요한 시약에 의해 야기될 수 있다. 이러한 물질은 독성이 있으며 라미닌을 사용하기 전에 철저한 세척이 필요합니다. 커버 슬립은 우물 바닥에 달라 붙어야하며 우물 안에 떠 있지 않아야합니다. 기포는 피해야합니다. 또한, 라미닌을 사용한 완전한 코팅은 커버슬립에 대한 셀 접착력을 보장하는 데 매우 중요합니다. 라미닌의 부족은 또한 더 적은 세포 밀도 및 / 또는 세포 사멸로 이어질 것입니다.
진정한 재프로그램된 신경교세포의 확인을 위해, 리포터 마우스 및 EdU 또는 BrdU와 같은 세포 추적을 허용하는 세포 증식 마커가 사용되어야 한다. 전체 망막이 도금되어 있기 때문에, 뉴런 생존자는 모든 배양물에 존재한다. 그러나 대부분의 경우 통과 후 거의 완전히 제거됩니다. 그럼에도 불구하고 EdU (또는 BrdU) 라벨링은 뉴런이 MG / RPC의 증식에서 유래했으며 신경 생존자 (유사 분열 후)가 아닌지 검증하기 위해 수행되어야합니다. 여기에 사용 된 대조군에서 발견 된 소수의 뉴런은 신경 생존자입니다.
흥미롭게도, 몇몇 Ascl1-Tom+ 세포는 또한 시간이 지남에 따라 약간 증가하는 숫자로 대조군 처리에 존재한다. 이들 세포는 단리되고 배양될 때 다소 미성숙한 MG 발현 Ascl1일 수 있었다. 그러나이 Ascl1-Tom + 세포 집단의 분율은 작습니다. 더욱이, 대조군 처리에서 발견되는 이들 Ascl1-Tom+ 세포의 대부분은 Otx2 및/또는 Map2를 발현하지 않으며 다소 편평한 세포 형태를 유지한다. 어떤 뉴런 분화도 조절 조건 하에서 발생하는 것으로 보이지 않는다. 네트워크를 형성하는 것으로 보이는 매우 섬세한 뉴런 유사 세포는 miR-25 치료 후에 만 발견됩니다.
여기에 기술된 프로토콜은 MG 리프로그래밍21,27에 대한 miRNAs를 시험하기 위해 이전 연구에서 사용되었고, 신경교를 성장시키기 위한 웰 플레이트에 대하여 지난 몇 년 동안 약간 변형되었다. 그들은 이제 6 웰 플레이트 대신 12 웰 플레이트에서 재배됩니다. 합류 단층은 4/5일 후(6-웰 플레이트의 경우 6/8일 대비) 12웰 플레이트에서 얻을 수 있으며, 따라서 세포 변경/퇴행으로 이어지는 전체 배양 기간이 감소된다. 형질감염 시간 창도 길다. 규칙적인 형질감염 프로토콜은 3시간 형질감염 기간을 가지며, 그 후 세포 생존을 보장하기 위해 완전한 배지 변화가 수행되어야 한다. 모든 분자는 이러한 배지 변화 후에 제거된다. 현재의 프로토콜에서, 시간 창이 연장되고 miRNAs에 대한 더 긴 노출은 형질감염 시약 배지에 50% 뉴런 배지 (Cre 유도 및 세포 증식 추적에 필요한 인자로 보충됨)를 첨가함으로써 허용되었다. 세포는 건강했고 이 변형으로 아무런 문제가 발생하지 않았습니다. 형질감염 결과는 길쭉한 형질감염 시간에 따라 더 나은 것으로 보이지만, 그 관찰을 확인하기 위해서는 더 많은 데이터가 필요하다.
또한, 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 수행하기 위해 면역형광 표지에 필요한 모든 단계가 여기에 기술되어 있다. 따라서 MG는 유리 커버 슬립에 통과해야합니다. 커버슬립은 24웰 플레이트의 면적보다 작기 때문에 24웰 플레이트의 전체 웰을 덮을 수 있는 셀의 약 삼분의 일만이 코팅된 커버슬립에 맞습니다. qPCR, RNA-Seq 또는 웨스턴 블로트와 같은 다른 용도의 경우, 세포는 1:1 비율로 계대되고, 처리되고, 원하는 시점에서 수확된다.
앞서 언급한 바와 같이, 이 배양 시스템은 또한 신경보호 메카니즘, 신경교증을 포함하는 신경교세포 거동을 연구하기 위해, 및/또는 약간 다른 배양 패러다 임 또는 종 11,28,29,54를 사용한 연구와 유사한 배양된 신경교의 mRNA, miRNA, 또는 단백질을 프로파일링하기 위해 다른 응용분야에 사용될 수 있다. . 이러한 응용 프로그램은 재 프로그래밍 후 신경 생존을 보장하기 위해 신경 배지를 필요로하지 않으며 세포 증식을 시각화하기 위해 EdU를 추가 할 필요가 없습니다. 신경 보충제가없는 저혈청 배지를 대신 사용해야합니다.
이 방법은 견고하고 신뢰할 수 있지만 모든 일차 배양 시스템과 유사하게 한계가 있습니다. 이들은 세포의 제한된 수명, 시간에 따른 진행성 세포 변성28, 및 그것이 다른 망막 세포 유형 및 세포외 매트릭스 둘 다와 관련하여 생리학적 맥락을 모방할 수 없는 2차원, 인공 배양 시스템이라는 사실이다. 따라서, MG 일차 배양물에서 최고 후보물질과 그들의 가장 효율적인 농도를 확인한 후, 망막 외래 배양, 망막 조직과 유사한 3차원 배양 시스템이 수행되어야 한다. Explant 배양물은 또한 제한된 배양 기간을 가지며 외식식물의 세포는 시간이 지남에 따라 퇴화합니다. 그러나, 그들은 그들의 자연적인 3 차원 환경에서 MG의 연구를 허용하고 동물의 발달 단계를 반영하는 다양한 연령대에서 수행 될 수있다 23,32,55,56.
종합하면,이 연구는 MG를 신경 유사 세포로 재 프로그래밍하기 위해 RPC miRNA miR-25의 잠재력을 모니터링하는 데 사용되는 MG 배양에 대해보고하고 면역 형광 표지에 의해 검증되었습니다. 이 프로토콜은 이전 작품 21,24,27에서 사용되었으며 MG의 재생 잠재력을 연구하기 위한 현재의 시험관내 방법입니다. 전반적으로, MG 일차 배양은 강력한 기술이며 재현 가능한 결과(20,21)를 허용한다. MG 리프로그래밍을 위한 miRNA 과발현이 여기에 독점적으로 기술되어 있지만, 소분자, DNA(플라스미드 또는 바이러스 벡터로 패킹됨), 단백질 억제(32)에 대한 항체 또는 특정 화합물과 같은 다른 인자가 MG 일차 배양물에서 사용/시험될 수 있다. 또한 miRNA 프로파일링 24, scRNA-seq 27, RT-qPCR20,21 또는 웨스턴 블롯(20)을 포함하는 광범위한 다운스트림 적용이 존재한다. 또한, MG 일차 배양은 매일 세포의 관찰 및 감시를 허용한다. 이는 시간 포인트들, 예를 들어, 특정 반응 또는 세포 반응의 발병, 지속기간, 및/또는 종료를 결정하기 위한 실질적인 이점일 수 있다. 철새 또는 증식 거동뿐만 아니라 손상/세포 손상 관련 패러다임(예를 들어, MG 배양물에서의 글로벌 miRNA 결실)32은 MG 일차 배양물에서 연구 및 분석되어 근본적인 메커니즘 및 경로를 식별할 수 있다. 따라서 MG 배양은 생체 내 시스템에서 구현되기 전에 분자 및 세포 수준에서 MG를 연구하기위한 매우 강력한 도구입니다.
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Disclosures
이 보고서의 결과 중 일부를 포함한 특허는 워싱턴 대학에서 발명가 Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl 및 Thomas A. Reh와 함께 제출했습니다. 이 특허의 제목은 '망막 재생을 자극하는 방법 및 조성물.
Acknowledgments
저자는 Ann Beaton 박사와 모든 실험실 구성원에게 원고에 대한 의견에 감사드립니다. 시애틀의 워싱턴 대학에서 박사 후 교육 기간 동안 MG 일차 문화를 S.G.W.에 선별 도구로 소개 한 Tom Reh, Julia Pollak 및 Russ Taylor 박사에게 특별한 감사를드립니다. 이 연구는 S.G.W.에 대한 엠파이어 이노베이션 프로그램 (EIP) 그랜트와 SUNY Optometry에서 S.G.W.까지의 스타트업 펀드와 National Eye Institute (NEI)에서 S.G.W.에 이르는 R01EY032532 어워드의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
