Summary
माउस रेटिना से प्राप्त मुलर ग्लिया प्राथमिक संस्कृतियां माइक्रोआरएनए उपचार के बाद रेटिना पूर्वज कोशिकाओं में ग्लियाल रूपांतरण का अध्ययन करने के लिए एक बहुत मजबूत और विश्वसनीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं। विवो दृष्टिकोण में उनके बाद के आवेदन से पहले एकल अणुओं या संयोजनों का परीक्षण किया जा सकता है।
Abstract
मुलर ग्लिया (एमजी) तंत्रिका रेटिना में प्रमुख ग्लिया हैं और रेटिना न्यूरॉन्स के लिए पुनर्योजी स्रोत के रूप में कार्य कर सकते हैं। मछली जैसे निचले कशेरुकियों में, एमजी-चालित उत्थान स्वाभाविक रूप से होता है; स्तनधारियों में, हालांकि, कुछ कारकों या आनुवंशिक / एपिजेनेटिक हेरफेर के साथ उत्तेजना की आवश्यकता होती है। चूंकि एमजी में रेटिना सेल आबादी का केवल 5% शामिल है, इसलिए मॉडल सिस्टम की आवश्यकता है जो विशेष रूप से इस सेल आबादी के अध्ययन की अनुमति देते हैं। इन मॉडल प्रणालियों में से एक प्राथमिक एमजी संस्कृतियां हैं जो प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं और इसका उपयोग विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें अणु / कारक स्क्रीनिंग और पहचान, यौगिकों या कारकों का परीक्षण, सेल निगरानी और / या कार्यात्मक परीक्षण शामिल हैं। इस मॉडल का उपयोग कृत्रिम एमआईआरएनए या उनके अवरोधकों के अभिकर्मक के माध्यम से माइक्रोआरएनए (एमआईआरएनए) के पूरक या निषेध के बाद रेटिना न्यूरॉन्स में परिवर्तित करने के लिए म्यूरिन एमजी की क्षमता का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग और सिंगल-सेल आरएनए अनुक्रमण (एससीआरएनए-सेक) के संयोजन में एमजी-विशिष्ट रिपोर्टर चूहों के उपयोग ने पुष्टि की कि इन संस्कृतियों में पाई जाने वाली 80% -90% कोशिकाएं एमजी हैं। इस मॉडल का उपयोग करके, यह पता चला कि एमआईआरएनए एमजी को रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी) में पुन: प्रोग्राम कर सकते हैं, जो बाद में न्यूरोनल जैसी कोशिकाओं में अंतर करते हैं। इस तकनीक के फायदे यह हैं कि एमआईआरएनए उम्मीदवारों को विवो अनुप्रयोगों में उनके उपयोग से पहले उनकी दक्षता और परिणाम के लिए परीक्षण किया जा सकता है।
Introduction
मुलर ग्लिया (एमजी) तंत्रिका रेटिना में प्रमुख ग्लिया हैं। उनके पास केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के अन्य हिस्सों में अन्य ग्लिया की तुलना में समान कार्य हैं जैसे कि पानी और आयन होमियोस्टेसिस को बनाए रखना, न्यूरॉन्स को पौष्टिक करना और ऊतक की रक्षा करना। एमजी की एक और आकर्षक विशेषता है: हालांकि वे परिपक्व ग्लिया हैं, फिर भी वे देर से विकास 1,2 के दौरान रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी) में व्यक्त कई जीन व्यक्त करते हैं। इस समानता को रेटिना क्षति 3,4 के बाद मछली रेटिना में स्वाभाविक रूप से होने वाली एमजी-आधारित न्यूरोनल पुनर्जननका कारण माना जाता है। इस प्रक्रिया के दौरान, एमजी सेल चक्र में फिर से प्रवेश करता है और आरपीसी में अंतर करता है जो तब सभी छह प्रकार के रेटिना न्यूरॉन्स में अंतर करता है। यद्यपि यह घटना मछली में स्वाभाविक रूप से होती है, स्तनधारी एमजी न्यूरॉन्स 5,6 में परिवर्तित नहीं होता है। हालाँकि, उन्हें फिर से प्रोग्राम किया जा सकता है। न्यूरॉन्स में एमजी को पुन: प्रोग्राम करने के लिए विभिन्न कारकों को दिखाया गया है; इन कारकों में मूल हेलिक्स-लूप-हेलिक्स (बीएचएलएच) प्रतिलेखन कारक अचेट-स्कूट होमोलॉग 1 (एएससीएल 1) है जो मछली पुनर्जनन 7,8 में शामिल है। चूहों में, एएससीएल 1 केवल रेटिनोजेनेसिस के दौरान आरपीसी में व्यक्त किया जाता है लेकिन परिपक्व एमजी या रेटिना न्यूरॉन्स9 में अनुपस्थित है।
विवो में सीधे कोशिकाओं को रीप्रोग्राम करना न केवल पद्धतिगत रूप से चुनौतीपूर्ण है, बल्कि एक संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति से अनुमोदन की भी आवश्यकता है। अनुमोदन प्राप्त करने के लिए, उपयोग किए गए या परिवर्तित किए गए कारकों, सांद्रता, ऑफ-टारगेट प्रभाव, अंतर्निहित तंत्र, विषाक्तता और दक्षता के बारे में प्रारंभिक डेटा की आवश्यकता होती है। सेल संस्कृति प्रणाली विवो मॉडल में उपयोग से पहले इन मानदंडों के लिए परीक्षण की अनुमति देती है। इसके अलावा, चूंकि एमजी में पूरे रेटिना सेल आबादी10 का केवल 5% शामिल है, एमजी संस्कृतियां उनके कार्य11 के अध्ययन के साथ-साथ उनके व्यवहार की अनुमति देती हैं, जिसमें माइग्रेशन12,13, प्रसार14, चोट / क्षति 15,16 के लिए तनाव प्रतिक्रिया, माइक्रोग्लिया17 या रेटिना गैंग्लियन कोशिकाओं (आरजीसी) 18 जैसे अन्य सेल प्रकारों के साथ उनकी बातचीत शामिल है, या उनकी न्यूरोजेनिक क्षमता 19,20,21। कई शोधकर्ता अपने अध्ययन के लिए अमर सेल लाइनों का उपयोग करते हैं क्योंकि उनके पास असीमित प्रसार क्षमता होती है और आसानी से बनाए रखा जा सकता है और ट्रांसफेक्ट किया जा सकता है। प्राथमिक कोशिकाएं, हालांकि, अमर कोशिकाओं की तुलना में जैविक रूप से प्रासंगिक परखों के लिए बेहतर हैं क्योंकि उनके पास सच्ची कोशिका विशेषताएं (जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति) हैं और इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि वे विकास में एक निश्चित चरण का प्रतिनिधित्व करते हैं और इसलिए "उम्र" है। एक जानवर की उम्र (और परिणामस्वरूप एक जानवर से प्राप्त कोशिकाओं की) सेलुलर रिप्रोग्रामिंग में एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण कारक है क्योंकि सेल प्लास्टिसिटी विकास के प्रगतिशील चरण के साथ कम हो जाती है22.
यह प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि पुनर्जनन का अध्ययन करने के लिए वर्तमान इन विट्रो विधि के रूप में एमआईआरएनए के साथ प्राथमिक एमजी को कैसे पुन: प्रोग्राम किया जाए। यह एमजी प्राथमिक संस्कृति मॉडल 2012 में पी 53 नॉक-आउट चूहों (टीआरपी 53-/- चूहों) 23 में एमजी की सेल प्रसार विशेषताओं का मूल्यांकन करने के लिए स्थापित किया गया था। यह दिखाया गया था कि सुसंस्कृत एमजी अपनी ग्लियाल विशेषताओं को बनाए रखता है (यानी, इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के माध्यम से मूल्यांकन किए गए एस 100β, पैक्स 6 और सोक्स 2 प्रोटीन की अभिव्यक्ति), और वे विवो एमजी (एफएसीएस-शुद्ध एमजी के माइक्रोएरे) 23 में समान हैं। इसके तुरंत बाद, ग्लियाल एमआरएनए और प्रोटीन अभिव्यक्ति को वायरल वैक्टर20 का उपयोग करके एक अलग दृष्टिकोण में मान्य और पुष्टि की गई थी। कुछ साल बाद, यह पुष्टि की गई कि इन संस्कृतियों में पाई जाने वाली अधिकांश कोशिकाएं एमजी-विशिष्ट आरएलबीपी 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / इसके अलावा, एफएसीएस-शुद्ध एमजी और सुसंस्कृत प्राथमिक एमजी दोनों में एमआईआरएनए के सेट की मात्रा का ठहराव से पता चला है कि विकास चरण के दौरान सुसंस्कृत एमजी में एमजी एमआईआरएनए (एमजीलियोमिर) का स्तर बहुत भिन्न नहीं होता है। लम्बी संस्कृति अवधि, हालांकि, एमआईआरएनए के स्तर में परिवर्तन का कारण बनती है और परिणामस्वरूप एमआरएनए स्तर और प्रोटीन अभिव्यक्ति में होती है क्योंकि एमआईआरएनए ट्रांसलेशनल नियामकहैं 25.
2013 में, इस एमजी संस्कृति मॉडल का उपयोग रेटिना न्यूरॉन्स20 में एमजी को पुन: प्रोग्राम करने की उनकी क्षमता के संबंध में विभिन्न प्रतिलेखन कारकों का परीक्षण करने के लिए किया गया था। एएससीएल 1 को एक बहुत मजबूत और विश्वसनीय रिप्रोग्रामिंग कारक पाया गया। वायरल वैक्टर के माध्यम से एएससीएल 1 की ओवरएक्सप्रेशन ने रूपात्मक परिवर्तन, न्यूरोनल मार्करों की अभिव्यक्ति और न्यूरोनल इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अधिग्रहण किया। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह है कि इन पहले इन विट्रो प्रयोगों से प्राप्त अंतर्दृष्टि और परिणामों को सफलतापूर्वक विवो अनुप्रयोगों22,26 में स्थानांतरित कर दिया गया था, यह दर्शाता है कि प्राथमिक एमजी संस्कृतियां प्रारंभिक कारक स्क्रीनिंग और विवो कार्यान्वयन से पहले ग्लियाल सुविधाओं के मूल्यांकन के लिए एक ठोस और विश्वसनीय उपकरण का प्रतिनिधित्व करती हैं।
कुछ साल पहले, यह दिखाया गया था कि मस्तिष्क समृद्ध एमआईआरएनए एमआईआर -124, जो रेटिना न्यूरॉन्स में भी अत्यधिक व्यक्त किया जाता है, सुसंस्कृत एमजी21 में एएससीएल 1 अभिव्यक्ति को प्रेरित कर सकता है। जीवित कोशिकाओं में एएससीएल 1 अभिव्यक्ति को एएससीएल 1 रिपोर्टर माउस (एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एक रिपोर्टर माउस एक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस है जिसके डीएनए में एक रिपोर्टर जीन डाला जाता है। यह रिपोर्टर जीन एक रिपोर्टर प्रोटीन के लिए एन्कोड करता है, जो इस अध्ययन में है टीडीटोमैटो, एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन। यह रिपोर्टर प्रोटीन ब्याज के एक जीन की अभिव्यक्ति की रिपोर्ट करता है, इस मामले में, एएससीएल 1। दूसरे शब्दों में, एएससीएल 1 व्यक्त करने वाली कोशिकाएं लाल हो जाएंगी। चूंकि एएससीएल 1 केवल आरपीसी9 में व्यक्त किया जाता है, इसलिए यह एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल माउस एमजी रूपांतरण को एएससीएल 1 व्यक्त करने वाले आरपीसी में ट्रैकिंग की अनुमति देता है, जिसका अर्थ है कि परिवर्तित कोशिकाएं लाल फ्लोरोसेंट टीडीटोमैटो रिपोर्टर प्रोटीन व्यक्त करेंगी। यह अपरिवर्तनीय लेबलिंग है क्योंकि इन कोशिकाओं के डीएनए को बदल दिया जाता है। नतीजतन, किसी भी बाद के न्यूरोनल भेदभाव की कल्पना की जाएगी क्योंकि टीडीटोमैटो लेबल विभेदक कोशिकाओं में रहता है। यदि एमजी-व्युत्पन्न आरपीसी (टीडीटोमैटो लेबल के साथ) व्यक्त करने वाले एएससीएल 1 न्यूरॉन्स में अंतर करते हैं, तो इन न्यूरॉन्स में अभी भी उनका लाल लेबल होगा। इसलिए, यह माउस न केवल लाइव-सेल इमेजिंग के लिए एमजी-व्युत्पन्न आरपीसी की लेबलिंग की अनुमति देता है, बल्कि इन एमजी-व्युत्पन्न (लाल) आरपीसी के भाग्य मानचित्रण और वंश अनुरेखण की भी अनुमति देता है। हाल ही में, आरपीसी में एमआईआरएनए के सेट की पहचान की गई थी और एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल आरपीसी-रिपोर्टर चूहों की एमजी संस्कृतियों का उपयोग रीप्रोग्रामिंग क्षमता और दक्षता27 पर इन एमआईआरएनए के प्रभाव को स्क्रीन और परीक्षण करने के लिए किया गया था। एक उम्मीदवार, आरपीसी-एमआईआरएनए एमआईआर -25, सुसंस्कृत एमजी को एएससीएल 1 एक्सप्रेसिंग (एएससीएल 1-टमाटर +) कोशिकाओं में रीप्रोग्रामकरने में सक्षम पाया गया था। ये पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाएं समय के साथ न्यूरोनल विशेषताओं को अपनाती हैं, जिसमें न्यूरोनल आकृति विज्ञान (छोटे सोमाटा और या तो छोटी या लंबी ठीक प्रक्रियाएं), एससीआरएनए-सेक के माध्यम से मापा गया न्यूरोनल टेप की अभिव्यक्ति, साथ ही इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग27 के माध्यम से मान्य न्यूरोनल प्रोटीन की अभिव्यक्ति शामिल है।
यहां, प्रोटोकॉल विवरण कैसे बढ़ने के लिए और पिछले काम 21,24,27 से अनुकूलित पी12 चूहों से एमजी ट्रांसफेक्ट करने के लिए। इस प्रोटोकॉल के लिए चुना गया उपरोक्त एमआईआरएनए एमआईआर -25 है, जो एमजी या रेटिना न्यूरॉन्स में कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ आरपीसी में अत्यधिक व्यक्त किया गया एक एमआईआरएनए है। एमआईआर -25 को ओवरएक्सप्रेस करने के लिए, म्यूरिन एमआईआर -25 नकल, यानी, कृत्रिम एमआईआरएनए अणुओं का उपयोग किया जाता है। एक नियंत्रण के रूप में, कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस से एमआईआरएनए की नकल को चुना जाता है, जिसका स्तनधारी कोशिकाओं में कोई कार्य नहीं होता है। आरपीसी में एमजी के रूपांतरण का दृश्य आरपीसी रिपोर्टर माउस (एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल) के माध्यम से पूरा किया गया था, मिश्रित पृष्ठभूमि (सी 57 बीएल / 6, एस 12 9, और आईसीआर उपभेदों) के साथ एक माउस। हालांकि, यह संस्कृति जंगली प्रकार के उपभेदों सहित सभी माउस उपभेदों के साथ की जा सकती है। पिछले कुछ वर्षों में, मूल प्रोटोकॉल को विकास चरण अवधि और समग्र संस्कृति अवधि को कम करने और अधिक मजबूत ग्लिया सेल की स्थिति सुनिश्चित करने और सेलुलर अध: पतन की डिग्री को कम करने के लिए संशोधित किया गया है, जो लंबे समय तक संस्कृति अवधि में होता है। नियमित अभिकर्मक समय खिड़की को भी 3 घंटे से 2 दिनों तक बढ़ाया गया था। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, हालांकि वर्तमान प्रोटोकॉल एमजी संस्कृतियों को पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक उपकरण के रूप में वर्णित करता है, विधि न केवल रीप्रोग्रामिंग कारकों के परीक्षण के लिए उपयोगी है, बल्कि अन्य अनुप्रयोगों के लिए भी अनुकूलित की जा सकती है, जिसमें एमजी प्रवासी या प्रसार व्यवहार, चोट /
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Protocol
पशु विषयों से जुड़ी प्रक्रियाओं को सनी कॉलेज ऑफ ऑप्टोमेट्री में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया है।
नोट: इस संस्कृति प्रोटोकॉल में तीन चरण होते हैं: विकास, अभिकर्मक और रूपांतरण चरण। समयरेखा के साथ समग्र प्रोटोकॉल का सारांश चित्र 1 में दिया गया है।
1. मीडिया और सभी आवश्यक अभिकर्मकों की तैयारी
नोट: सभी चरणों को ए 2 या बी 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किया जाना चाहिए। विकास चरण के दौरान, एक उच्च-सीरम विकास माध्यम का उपयोग किया जाता है जिसमें एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) के साथ पूरक बेसल न्यूरोनल माध्यम होता है। रूपांतरण चरण के लिए, न्यूरोनल भेदभाव और अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए न्यूरोनल सप्लीमेंट्स के साथ पूरक एक कम-सीरम न्यूरोफिजियोलॉजिकल बेसल माध्यम का उपयोग किया जाता है।
- भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस, 10%) के 20 एमएल के साथ बेसल न्यूरोनल माध्यम के 200 एमएल, 200 एमएम एल-ग्लूटामाइन (0.5%), पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) के 2 एमएल, और एन 2 पूरक (1%) के 2 एमएल के साथ 200 एमएल के पूरक द्वारा विकास माध्यम (विकास चरण के दौरान उपयोग किया जाता है) तैयार करें। बाँझ निस्पंदन (0.22 μm ताकना आकार के साथ फ़िल्टर इकाइयों) प्रदर्शन करें। उपयोग करने से पहले 37 डिग्री सेल्सियस धातु मनका स्नान में माध्यम को पूर्व-गर्म करें।
- बी 27 न्यूरोनल पूरक (2%) के 2 एमएल के साथ सीरम मुक्त न्यूरोफिजियोलॉजिकल बेसल माध्यम के 100 एमएल पूरक द्वारा निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए न्यूरोनल माध्यम (रूपांतरण चरण के दौरान उपयोग किया जाता है) न्यूरोनल माध्यम तैयार करें ( सामग्री की तालिका देखें), एन 2 पूरक के 1 एमएल (1%), 100 एनजी / एमएल ग्लिया सेल-व्युत्पन्न न्यूरोट्रॉफिक कारक (जीडीएनएफ, बाँझ हैंक्स के संतुलित नमक समाधान [एचबीएसएस], अंतिम एकाग्रता 20 एनजी / एमएल में पुनर्गठित), 100 मिलीग्राम / एमएल डिब्यूटिरिल-सीएमपी (डीएमएसओ में पुनर्गठित), 50 μL 50 एनजी / बाँझ निस्पंदन (0.22 μm ताकना आकार के साथ फ़िल्टर इकाइयों) प्रदर्शन करें। उपयोग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस धातु मनका स्नान में पूर्व गर्म माध्यम।
नोट: इन मीडिया को 1 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। - निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद रेटिना पृथक्करण के लिए आवश्यक पपैन, डीएनएएसई आई और ओवोमुकोइड अभिकर्मकों का पुनर्गठन करें। बाँझ 1.5 एमएल ट्यूबों में पपैन के विभाज्य 750 μL, बाँझ 0.6 एमएल ट्यूबों में DNase I के 75 μL, और 2 एमएल ट्यूबों में ओवोमुकोइड प्रोटीज अवरोधक के 750 μL। -20 डिग्री सेल्सियस पर पपैन और डीएनएएसई आई एलिकोट्स को फ्रीज करें और अभिकर्मकों के क्षरण से बचने के लिए ओवोमुकोइड एलिकोट्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें। उपयोग करने से ठीक पहले कमरे के तापमान पर पिघलना।
नोट: पपैन, डीएनएएसई आई, और ओवोमुकोइड पपैन पृथक्करण प्रणाली नामक एक किट में पाए जाते हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। - कवरस्लिप कोटिंग के लिए पॉली-एल-ऑर्निथिन (पॉली-ओ) और लैमिनिन का पुनर्गठन करें यदि इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग डेटाशीट निर्देशों (पॉली-ओ: बाँझ पानी में 0.1 मिलीग्राम / लैमिनिन: डीएमईएम में 1:50 पर 1.2 मिलीग्राम / विभाज्य पॉली-ओ और लैमिनिन (2.5 एमएल) और -20 डिग्री सेल्सियस पर विभाज्य फ्रीज करें। उपयोग करने से ठीक पहले कमरे के तापमान पर पिघलना।
नोट: चरण 1.4. केवल तभी आवश्यक है जब इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग और लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी की जाती है।
2. चूहों और ऊतक निष्कर्षण
नोट: इन रीप्रोग्रामिंग अध्ययनों के लिए, एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल माउस को एएससीएल 1सीआरईआरटी माउस (एएससीएल 1-सीआरईआरटी: जैक्स # 012882) को पार करके बनाया गया था, जिसमें टीडीटोमैटो एसटीओपीएफएल / एफएल माउस (B6.Cg-जीटी (आरओएसए) 26एसओआरएम 14 (सीएजी-टीडीटोमैटो) एचजेड / जे: जैक्स # 007914)। इस माउस में एक मिश्रित पृष्ठभूमि (सी 57 बीएल / 6, एस 12 9 और आईसीआर तनाव) है। इस माउस के जीनोटाइप चित्रा 1 ए में दिखाया गया है। सभी उपभेदों इस प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
- 70% इथेनॉल के साथ विच्छेदन माइक्रोस्कोप और सभी ठीक उपकरण (ड्यूमोंट # 5 ठीक और ड्यूमोंट # 7 घुमावदार संदंश, ठीक कैंची, और वन्नास कैंची) सहित दस्ताने और स्वच्छता कार्यक्षेत्र पहनें। 20 मिनट के लिए यूवी प्रकाश को उजागर करके 10 सेमी सिलिकॉन-लेपित काले विच्छेदन पकवान को साफ करें।
- ऊतक निष्कर्षण के लिए व्यंजन और प्लेटों की तैयारी
- आंखों के संग्रह और नमूना पृथक्करण के लिए एक 24-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें (एक कुएं में माउस प्रति दो आंखें, माउस आईडी के साथ लेबल किया गया) ठंडे एचबीएसएस (4 डिग्री सेल्सियस) के ~ 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से। 24-अच्छी तरह से प्लेट को बर्फ पर रखें।
- एक बाँझ 10 सेमी पेट्री डिश (धोने के लिए) और स्वच्छ सिलिकॉन लेपित विच्छेदन पकवान को ठंडे एचबीएसएस (4 डिग्री सेल्सियस) के कई एमएल के साथ भरें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऊतक एचबीएसएस के साथ पूरी तरह से कवर किया गया है।
- 70% इथेनॉल के 1 एमएल के साथ एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब तैयार करें।
- संस्कृति संख्या, तिथि, तनाव और सभी आवश्यक जानकारी के साथ प्लेट को लेबल करके 12 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट तैयार करें।
- किसी भी अनुमोदित विधि का उपयोग करके पी 12 चूहों को इच्छामृत्यु दें।
- आंखों को निकालना
- धीरे से आंख के चारों ओर अंगूठे और तर्जनी के साथ माउस सिर पकड़ो।
- ड्यूमोंट # 7 घुमावदार संदंश का उपयोग करके, धीरे-धीरे नेत्रगोलक के पीछे जाएं और ऑप्टिक तंत्रिका को क्लिप करें। सावधानी से आंख ों को बाहर निकालें।
नोट: वयस्क चूहों का उपयोग कर रहे हैं, घुमावदार संदंश का उपयोग न करें, और आंख खींच नहीं है। इसके बजाय ठीक कैंची का उपयोग करके आंखों की दुनिया भर में सावधानी से कटौती करें; ऑप्टिक तंत्रिका को काटें लेकिन आंख को ही न काटें। ध्यान से नेत्रगोलक को हटाने के लिए संदंश का प्रयोग करें।
- नेत्रगोलक की सफाई
- जानवर से बैक्टीरिया के कैरीओवर से बचने के लिए नेत्रगोलक को एक इथेनॉल युक्त ट्यूब में संक्षेप में डुबोएं।
- बर्फ पर 24 अच्छी तरह से प्लेट में रखने से पहले नेत्रगोलक को 10 सेमी पेट्री डिश में संक्षेप में धो लें।
- दूसरी आंखों के लिए चरण 2.4 और 2.5 दोहराएं। प्रक्रिया के दौरान अच्छी तरह से प्लेट को बर्फ पर रखें। एक प्रकाश स्रोत के साथ एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रखा विच्छेदन पकवान में एक जानवर से दो आँखें रखें।
- रेटिना निष्कर्षण
- ड्यूमोंट # 5 ठीक संदंश के साथ श्वेतपटल के चारों ओर ऑप्टिक तंत्रिका और आसपास के संयोजी ऊतक को पकड़कर एक नेत्रगोलक को ठीक करें और विच्छेदन पकवान (कॉर्निया ऊपर की ओर) के खिलाफ इसे सावधानी से दबाएं।
- वन्नास कैंची के लिए आसान पहुंच की अनुमति देने के लिए 30 जी सुई का उपयोग करके कॉर्निया के केंद्र में एक छेद बनाएं।
- वन्नास कैंची का उपयोग करके सिलिअरी शरीर के चारों ओर कॉर्निया को विच्छेदित करें और ड्यूमोंट # 5 ठीक संदंश के साथ कॉर्निया, लेंस, आईरिस और कांच के शरीर को सावधानीपूर्वक हटा दें। चित्रा 2 ए अंदर रेटिना के साथ एक आंख कप दिखाता है।
- ऑप्टिक तंत्रिका तक पहुंचने तक वन्नास कैंची के साथ श्वेतपटल को विच्छेदित करें। ऑप्टिक तंत्रिका क्लिप और ध्यान से ड्यूमोंट # 5 ठीक संदंश का उपयोग कर रेटिना निकालने।
- रेटिना के खिलाफ धक्का देने और कांच के शरीर को पूरी तरह से हटाने की अनुमति देने के लिए ड्यूमोंट # 5 ठीक संदंश की एक दूसरी जोड़ी का उपयोग करें। चित्रा 2 बी दो निकाले गए रेटिना को दर्शाता है।
- स्थानांतरण और धोने
- व्यास को बड़ा करने के लिए एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट की नोक के बारे में 2.5 सेमी काट लें। इस टिप का उपयोग करके, ऊतक को नुकसान पहुंचाए बिना पूरे रेटिना को उठाएं (चूसें)।
- रेटिना को ठंडे एचबीएसएस (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ एक नए बाँझ पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और पकवान (आगे और पीछे, बाएं और दाएं) रॉक करें।
- हस्तांतरण विंदुक टिप का उपयोग करके, रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं को धोने के लिए रेटिना को ध्यान से धक्का दें।
नोट: वैकल्पिक रूप से, लेंस और कांच के शरीर के साथ पूरे रेटिना को आंख कप से हटाया जा सकता है। फिर, निकाले गए रेटिना से लेंस और कांच के शरीर को हटाया जा सकता है। यदि रेटिना फट गया है, तो पृथक्करण के लिए सभी टुकड़ों को इकट्ठा करना सुनिश्चित करें; अन्यथा, संगम कोशिका परतों को विकसित करने के लिए ऊतक की अपर्याप्त मात्रा होगी।
- एचबीएसएस के 1 एमएल से भरे 24-अच्छी तरह से प्लेट के एक नए, साफ कुएं में पृथक रेटिना को तुरंत रखें। विच्छेदन प्रक्रिया के दौरान बर्फ पर 24-अच्छी तरह से प्लेट रखें।
- दूसरे रेटिना को अलग करने के लिए चरण 2.7-2.9 दोहराएं।
3. रेटिना पृथक्करण
नोट: सभी निम्नलिखित चरणों (सेल फसल तक) को ए 2 या बी 2 जैव सुरक्षा कैबिनेट (बीएससी) में किया जाना चाहिए।
- पपैन/डीएनएएसई आई पृथक्करण मिश्रण निम्नानुसार तैयार करें।
- छह रेटिना के लिए, पपैन के 750 μL (चरण 1.3 से) युक्त ट्यूब में DNase I के 75 μL जोड़ें और ध्यान से मिश्रण (पृथक्करण मिश्रण)।
- इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक है कि व्यक्तिगत नमूना तैयारी के लिए, तीन विभाज्य में 825 μL की कुल मात्रा विभाजित: माउस प्रति एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब (दो रेटिना) में मिश्रण के 275 μL। तदनुसार डीएनएएसई आई और पपैन की आवश्यक मात्रा की गणना करें।
नोट: पपैन/डीएनएएसई आई मिश्रण की एक ट्यूब में छह रेटिना तक को अलग किया जा सकता है। हालांकि, व्यक्तिगत नमूना तैयारी के परिणामस्वरूप संयुक्त नमूनों की तुलना में कम गुच्छे और बेहतर सेल वृद्धि होती है।
- दो रेटिना को पपैन/डीएनएएसई आई पृथक्करण मिश्रण में स्थानांतरित करें। एक बढ़े हुए टिप व्यास (चरण 2.8.1) के साथ एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करें, रेटिना उठाओ, रेटिना टिप के तल पर बसने तक प्रतीक्षा करें, और फिर अत्यधिक एचबीएसएस के बिना रेटिना को पपैन /
- एक नटेटर पर रखें और इसे सेल संस्कृति इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2) में 10 मिनट के लिए सेते हैं।
- ध्यान से ऊपर और नीचे (के बारे में 20-30 बार) एक 1 एमएल विंदुक के साथ पाइपिंग द्वारा कोशिकाओं को अलग करें। कोशिकाओं को अलग करने के बाद (यानी, बिना किसी टुकड़े के साथ एक समरूप समाधान के परिणामस्वरूप), पपैन को बेअसर करने के लिए पपैन पृथक्करण किट से ओवोमुकोइड प्रोटीज अवरोधक के 275 μL जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके धीरे से मिलाएं।
नोट: यदि छह रेटिनापैन/डीएनएएसई I मिश्रण के 825 μL में अलग हो गए थे, तो ओवोमुकोइड के 825 μL की आवश्यकता होती है। - 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर मिश्रण अपकेंद्रित्र।
- एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ, 1 μL प्रति 1 एमएल विकास माध्यम, पीबीएस में 200 μg / mL पर पुनर्गठित) 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म विकास माध्यम (1 एमएल प्रति माउस) की गणना मात्रा में जोड़ें।
नोट: प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर, प्रसार मार्कर 5-एथिनाइल -2 '-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू), साथ ही 4-हाइड्रॉक्सीटामोक्सिफेन (4-ओएचटी) या अन्य आवश्यक कारकों को संस्कृति अवधि की शुरुआत में जोड़ा जा सकता है। - अपकेंद्रित्र से ट्यूबों को सावधानीपूर्वक निकालें। ट्यूब के तल पर गोली को स्पर्श न करें।
- सतह पर तैरनेवाला ध्यान से और पूरी तरह से निकालें। ईजीएफ-पूरक विकास माध्यम के 500 μL के साथ सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
- लेबल 12 अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 2 सी) में से एक अच्छी तरह से सेल निलंबन स्थानांतरण। ईजीएफ-पूरक विकास माध्यम के एक और 500 μL के साथ ट्यूब कुल्ला और इसे अच्छी तरह से (अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा) में जोड़ें।
- अन्य सभी नमूनों के साथ चरण 3.8 और 3.9 दोहराएँ।
- अच्छी तरह से प्लेट को तीन बार ध्यान से रॉक करें (आगे और पीछे; बाएं, और दाएं)। प्लेट को इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, सीओ2) में रखें।
नोट: यदि ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग किया जाता है, तो प्रत्येक जानवर (चित्रा 2 डी) के लिए जीनोटाइपिंग करें। क्रे सकारात्मक और नकारात्मक चूहों को पुन: संयोजित करें और तदनुसार प्लेट को लेबल करें। इस प्रोटोकॉल के लिए, क्रे पुन: संयोजक सकारात्मक रिपोर्टर चूहों की केवल कोशिकाओं अगले चरणों के लिए इस्तेमाल किया गया. क्रे नकारात्मक नमूनों की कोशिकाएं जमे हुए हैं और अन्य अनुप्रयोगों के लिए उपयोग की जाती हैं।
4. विकास चरण
नोट: विकास चरण के बारे में 4-5 दिनों (चित्रा 1 बी) की अवधि है। कोशिकाओं युक्त कुओं में तरल पदार्थ जोड़ने के लिए, पिपेट को कुएं की दीवार को इंगित करने की आवश्यकता होती है और सेल टुकड़ी से बचने के लिए तरल को धीरे-धीरे जारी करने की आवश्यकता होती है। कोशिकाओं के शीर्ष पर सीधे विंदुक मत करो।
- पृथक्करण के एक दिन बाद, माध्यम को हटा दें और ताजा ईजीएफ-पूरक विकास माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- दिन 3 पर, माध्यम को हटा दें और सेल मलबे को हटाने के लिए एचबीएसएस (कमरे का तापमान) के 1 एमएल जोड़ें। धीरे-धीरे आगे और पीछे बाएं से दाएं रॉक करें। एचबीएसएस निकालें, धोने के चरण को दोहराएं, और पूर्व-गर्म ईजीएफ-पूरक विकास माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
- हर दिन कोशिकाओं की निगरानी करें और उनकी वृद्धि की स्थिति का मूल्यांकन करें जब तक कि कोशिकाएं 90% -100% संगम तक न पहुंच जाएं। चित्रा 3 समय के साथ अच्छी एमजी वृद्धि का एक उदाहरण दिखाता है। संभावित संदूषण या कोशिका मृत्यु (पूरक चित्रा 1) के लिए जाँच करें। दूषित संस्कृतियों को त्यागें।
नोट: सेल स्थिति की निगरानी और रिकॉर्ड करने के लिए, संलग्न कैमरे और 4x, 10x, या 20x उद्देश्यों के साथ एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके विभिन्न आवर्धन पर छवियां लें। इस अध्ययन में, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है।
5. पॉली-एल-ऑर्निथिन (पॉली-ओ) और लैमिनिन कोट के साथ कवरलिप्स की तैयारी
नोट: यह कदम केवल तभी आवश्यक है जब इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग और कॉन्फोकल लेजर-स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी की जाती है। उचित इमेजिंग के लिए गोल ग्लास कवरलिप्स (12 मिमी व्यास) की आवश्यकता होती है। कोटिंग प्रोटोकॉल न्यूरोनल माध्यम डेटाशीट में भी पाया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)।
- बाँझ ड्यूमोंट #2AP संदंश का उपयोग कर एक 24 अच्छी तरह से प्लेट के हर कुएं के केंद्र में ध्यान से बाँझ कवरलिप्स प्लेस।
नोट: कुएं के केंद्र में कवरलिप्स रखें। एक कुएं की दीवार के करीब कवरलिप्स रखने से निम्नलिखित चरणों के लिए सतह तनाव के मुद्दे पैदा होंगे। - कमरे के तापमान पर 2.5 एमएल पॉली-ओ विभाज्य को पिघलाएं और प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में इसका 100 μL रखें।
- एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए अच्छी तरह से थाली सेते हैं।
- पॉली-ओ निकालें और बाँझ पानी के ~ 1 एमएल के साथ कवरस्लिप के साथ तीन बार अच्छी तरह से धो लें।
- बीएससी में अच्छी तरह से प्लेट को रात भर सूखने दें। रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर लैमिनिन के 2.5 मिलीलीटर पिघलना।
- अगली सुबह, प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में लैमिनिन के 100 μL जोड़ें और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए सेते हैं।
- लैमिनिन को सावधानीपूर्वक और पूरी तरह से हटा दें।
- प्लेट को 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें यदि पासिंग तुरंत नहीं की जा सकती है।
नोट: तैयार प्लेटों में लेपित कवरलिप्स को 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए रखा जा सकता है।
6. न्यूरोनल बचे लोगों को हटाने के लिए सेल मार्ग
नोट: सेल मार्ग न्यूरोनल कोशिकाओं को हटाने के लिए आवश्यक है, सेल आबादी में वृद्धि करने के लिए नहीं। ग्लिया केवल कुछ बार विभाजित करता है और पारित होने के बाद आगे नहीं बढ़ेगा। सेल निलंबन को पतला न करें। 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक संगम कुएं की कोशिकाओं को 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं या 24-अच्छी तरह से प्लेट के दो कुओं पर वितरित किया जा सकता है। जब लेपित कवरलिप्स का उपयोग किया जाता है, तो कवरस्लिप का केवल एक तिहाई लेपित होता है। इसलिए, संगम कोशिकाओं (~ 80% -90%) के साथ 24-अच्छी तरह से प्लेट में बैठे छह कवरलिप्स को 12-अच्छी तरह से प्लेट के संगम कोशिकाओं के एक कुएं से प्राप्त किया जा सकता है। सेल घनत्व को बढ़ाने या घटाने के लिए अन्य अनुपातों को भी चुना जा सकता है। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक क्रे + रिपोर्टर माउस का उपयोग किया जाता है [एक प्रयोग, दो उपचार: एमआईआर -25 या नियंत्रण-एमआईआर; तकनीकी प्रतिकृति एन = 3 (प्रति उपचार तीन कवरलिप्स), जैविक प्रतिकृति एन = 1]। प्रयोगात्मक डिजाइन के आधार पर तकनीकी और जैविक प्रतिकृतियों की संख्या को अलग-अलग परिभाषित किया जा सकता है।
- जांचें कि क्या कोशिकाएं 90% -100% संगम हैं (कुएं के मार्जिन पर भी; चित्रा 3 ई, एफ)।
- माध्यम निकालें और धोने के लिए एचबीएसएस (कमरे का तापमान) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे से प्लेट रॉक (आगे और पीछे, बाएं और दाएं)। एचबीएस को पूरी तरह से हटा दें।
- कुएं से कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन युक्त समाधान (धातु मनका स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म) के 500 μL जोड़ें। रॉक धीरे (आगे और पीछे, बाएं से दाएं) और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में 2 मिनट के लिए सेते हैं।
- प्लेट को इनक्यूबेटर से बीएससी में ले जाएं। झुकाव करते समय, ट्रिप्सिन युक्त समाधान की आकांक्षा करें और इसे सावधानीपूर्वक और धीरे-धीरे कुएं पर कई बार फैलाएं जब तक कि कोशिकाएं पूरी तरह से अलग न हो जाएं। प्रकाश के खिलाफ प्लेट पकड़ो और सुनिश्चित करें कि नीचे कोई कोशिकाएं नहीं बची हैं।
- एक बाँझ 1.5 एमएल ट्यूब के लिए इस सेल निलंबन स्थानांतरण। 4 डिग्री सेल्सियस पर 8 मिनट के लिए 300 एक्स जी पर अपकेंद्रित्र।
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और ध्यान से पूर्व गर्म विकास माध्यम (ईजीएफ के साथ पूरक; 1: 1000) के 600 μL (6 कुओं / कवरलिप्स के लिए अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से 100 μL) जोड़कर सेल गोली को फिर से निलंबित करें। और ऊपर और नीचे पाइपिंग ~ 30-40 बार।
नोट: कोशिकाओं को इस समय -80 डिग्री सेल्सियस पर या तरल नाइट्रोजन में जमे हुए किया जा सकता है और सेल लाइनों को पिघलने के लिए मानक प्रोटोकॉल के बाद डीफ्रॉस्ट किया जा सकता है। यदि कोशिकाएं जमे हुए हैं, तो उन्हें ईजीएफ-पूरक माध्यम (विकास माध्यम) में फिर से निलंबित नहीं किया जाएगा। उन्हें मूल माध्यम (ईजीएफ के बिना) और ठंड समाधान (1/1 अनुपात) में फिर से निलंबित कर दिया जाएगा। चरण 6.1.1 से 6.6.2 कोशिकाओं को ठंडा करने के चरणों का वर्णन करते हैं। यदि कोई कोशिकाएं जमे हुए नहीं हैं, तो चरण 6.7 के साथ जारी रखें।- डीएमएसओ के 100 μL और एफबीएस के 400 μL (अच्छी तरह से / नमूना प्रति 500 μL की कुल मात्रा) मिश्रण करके ठंड समाधान तैयार करें।
- पूर्व गर्म विकास माध्यम के 500 μL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। एफबीएस ठंड समाधान (1 एमएल की कुल मात्रा) के 500 μL करने के लिए सेल निलंबन जोड़ें। सभी नमूनों को संसाधित होने तक बर्फ पर ट्यूब रखें। 1 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज कोशिकाओं, और फिर -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
- मीडिया निलंबन (चरण 6.6) के 100 μL रखकर बीज कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह से प्लेट के छह लेपित कवरलिप्स (चरण 5 देखें) के केंद्र में रखा गया है। प्लेट को इनक्यूबेटर में सावधानी से रखें और कोशिकाओं को व्यवस्थित होने दें।
नोट: 600 μL सेल निलंबन के 100 μL (एक 12 अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं से कटाई) 90% -100% सेल संगम है, जो अभिकर्मक के लिए आवश्यक है में परिणाम होगा। - 3 घंटे के बाद कोशिकाओं की जाँच करें कि क्या वे कवरस्लिप पर बस गए हैं। ईजीएफ के साथ पूरक विकास माध्यम के 400 μL जोड़ें।
नोट: कोशिकाएं आमतौर पर अगले दिन अभिकर्मक के लिए तैयार होती हैं (चित्रा 3 जी)। यदि संगम (90% -100%) नहीं है, तो उन्हें एक और दिन के लिए छोड़ दें। यदि अभी भी संगम नहीं है, तो अभिकर्मक के लिए उनका उपयोग न करें। यदि अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग आयोजित किए जाते हैं, जैसे कि एमआईआरएनए प्रोफाइलिंग, आरएनए-सेक, आरटी-क्यूपीसीआर, या पश्चिमी धब्बा, कोशिकाओं को 12-अच्छी तरह से प्लेटों (1: 1 अनुपात; कोई प्लेट उपचार आवश्यक नहीं) में पारित करने की आवश्यकता होती है और आरएनए /
7. अभिकर्मक
नोट: अभिकर्मक चरण में केवल अभिकर्मक माध्यम में 3 घंटे का चरण होता है (अभिकर्मक प्रक्रियाओं को अभिकर्मक मैनुअल में वर्णित किया जाता है जो अभिकर्मक अभिकर्मक के साथ आता है) और एक लम्बी चरण जिसमें अभिकर्मक अभिकर्मक और एमआईआरएनए अभी भी मौजूद हैं, लेकिन आवश्यक पूरक के साथ न्यूरोनल माध्यम जोड़ा जाता है (कुल अवधि 2 दिन है; चित्रा 1 बी)। इस प्रोटोकॉल में, छह कुओं को ट्रांसफ़ेक्ट किया जाएगा: तीन कुओं को रीप्रोग्रामिंग एमआईआरएनए एमआईआर -25 प्राप्त होगा और तीन कुओं को नियंत्रण एमआईआरएनए प्राप्त होगा।
- जांचें कि क्या कोशिकाएं 90% संगम तक पहुंच गई हैं और अभिकर्मक से पहले कोशिकाओं को रिकॉर्ड /
- विकास माध्यम निकालें और कोशिकाओं को धोने के लिए एचबीएसएस (कमरे का तापमान) के 500 μL जोड़ें।
- एचबीएसएस निकालें और अभिकर्मकों के लिए उपयोग किए जाने वाले कम सीरम माध्यम के 400 μL जोड़ें। प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में वापस रखें।
- निर्माता के अभिकर्मक अभिकर्मक प्रोटोकॉल के निर्देशों का पालन करके अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें। दो मिश्रण बनाएं: अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण और एमआईआरएनए मिश्रण (चित्रण के लिए चित्रा 1 बी देखें)।
- अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण तैयार करें: 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, कम सीरम माध्यम के 49 μL और अभिकर्मक अभिकर्मक के 1 μL एक अच्छी तरह से (कुल 50 μL) के लिए आवश्यक हैं। छह कुओं के लिए, कम सीरम माध्यम के 294 μL और अभिकर्मक अभिकर्मक के 6 μL को धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइप करके संयुक्त और मिश्रित किया जाता है।
- एमआईआरएनए मिमिक मिश्रण तैयार करें: 24-अच्छी तरह से प्लेट के लिए, एक कुएं के लिए नकल मिश्रण की कुल मात्रा 50 μL की आवश्यकता होती है। तीन कुओं को नियंत्रण एमआईआरएनए प्राप्त होगा और अन्य तीन कुओं को एमआईआर -25 के साथ इलाज किया जाएगा। इस प्रोटोकॉल के लिए, एक 200 एनएम अंतिम एकाग्रता का उपयोग किया जाता है।
- एमआईआर -25 उपचार (तीन कुओं) के लिए, कम सीरम माध्यम के 150 μL और एमआईआर -25 मिमिक्स (100 μM स्टॉक समाधान) के 3 μL को जोड़ा जाता है और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाया जाता है। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
नियंत्रण उपचार (तीन कुओं) के लिए, कम सीरम माध्यम के 150 μL और नियंत्रण-MiRNA नकल (100 μM स्टॉक समाधान) के 3 μL संयुक्त कर रहे हैं और धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा अच्छी तरह से मिश्रित कर रहे हैं। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
नोट: एमआईआरएनए नकल की मात्रा कमजोर पड़ने वाले कारक और एकाग्रता की आवश्यकता (20-500 एनएम) पर निर्भर करती है। एमआईआरएनए अवरोधक (एंटागोमिर), या प्लास्मिड सहित अन्य अणुओं का भी उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, अणुओं के संयोजन को ट्रांसफ़ेक्ट किया जाना संभव है।
- एमआईआर -25 उपचार (तीन कुओं) के लिए, कम सीरम माध्यम के 150 μL और एमआईआर -25 मिमिक्स (100 μM स्टॉक समाधान) के 3 μL को जोड़ा जाता है और धीरे-धीरे ऊपर और नीचे पाइपिंग करके अच्छी तरह से मिलाया जाता है। 5 मिनट के लिए सेते हैं।
- एमआईआरएनए नकल मिश्रण और अभिकर्मक अभिकर्मक मिश्रण को मिलाएं। धीरे-धीरे और अच्छी तरह से पाइपिंग करके सावधानी से ऊपर और नीचे पाइपिंग करके मिलाएं। कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं (निर्माता के निर्देशों के अनुसार)।
- उपरोक्त अभिकर्मक मिश्रण ड्रॉपवाइज और धीरे-धीरे कोशिकाओं के शीर्ष पर जोड़ें, एक 20 μL विंदुक का उपयोग कर अच्छी तरह से मीडिया की सतह के करीब। प्लेट को धीरे-धीरे रॉक करें (आगे और पीछे, बाएं से दाएं)।
- 3 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
- 3 घंटे के बाद, कुओं में न्यूरोनल माध्यम जोड़ें (500 μL प्रति अच्छी तरह से) 4-हाइड्रोक्सिटामोक्सिफेन (5 एमएम स्टॉक इथेनॉल के 2.58 एमएल के साथ पुनर्गठित, 250 एनएम अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक क्रे पुन: संयोजक और 5-एथिनाइल -2'-डीऑक्सीयूरिडीन (ईडीयू, डीएमएसओ के 2 एमएल के साथ पुनर्गठित 10 एमएम स्टॉक समाधान, 1 μM अंतिम एकाग्रता)
सावधानी: 4-हाइड्रोक्सिटामोक्सिफेन और ईडीयू को मानव कार्सिनोजेन्स, टेराटोजेन और उत्परिवर्तजन के रूप में जाना जाता है। उपयोग करने से पहले सामग्री सुरक्षा डेटा शीट पढ़ें और दस्ताने, चश्मे और प्रयोगशाला कोट पहनें। निर्माता की सिफारिशों के अनुसार दोनों अभिकर्मकों का पुनर्गठन करें। पदार्थ/मिश्रण को साँस न लें। उपयोग के बाद कसकर बंद करें। अपशिष्ट सामग्री का निपटान राष्ट्रीय और स्थानीय नियमों का पालन करते हुए किया जाना चाहिए। पदार्थ के साथ काम करने के बाद हाथ और चेहरा धो लें। - 2 दिनों (चित्रा 1 बी) के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं।
8. सेल रूपांतरण
नोट: सेल रूपांतरण चरण के बारे में 5-6 दिनों (चित्रा 1 बी) की अवधि है, लेकिन लंबी अवधि संभव हैं।
- टीडीटोमैटो अभिव्यक्ति, संभावित कोशिका मृत्यु और / या संदूषण के सफल प्रेरण के लिए दैनिक कोशिकाओं की जांच करें। सेल घनत्व नहीं बदलता है (चित्रा 4)। पहले बेहोश लाल फ्लोरोसेंट-लेबल वाली कोशिकाओं को 4-हाइड्रॉक्सीटामोक्सिफेन उपचार के 1 दिन बाद देखा जा सकता है। कोशिकाओं की निगरानी और छवि के लिए एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है।
नोट: इस अध्ययन में, लाइव इमेजिंग के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग किया जाता है। छवियां 4x, 10x, या 20x उद्देश्यों के साथ ली जाती हैं। - अभिकर्मक के दो दिन बाद, माध्यम को हटा दें और प्रत्येक कुएं में 4-हाइड्रॉक्सीटामोक्सिफेन और ईडीयू के साथ पूरक पूर्व-गर्म न्यूरोनल माध्यम के 500 μL जोड़ें।
- कोशिकाओं की कटाई होने तक हर दूसरे दिन एक ताजा माध्यम के साथ माध्यम को बदलें।
- लाल फ्लोरोसेंट (एएससीएल 1 व्यक्त) कोशिकाओं और उनके रूपात्मक परिवर्तन (चित्रा 4 और चित्रा 5 ए-सी) की संख्या के मूल्यांकन और मूल्यांकन के लिए लाइव छवियां लें।
9. सेल फसल: इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए निर्धारण
नोट: कोशिकाओं को थोक या एससीआरएनए-सेक, आरटी-क्यूपीसीआर, या पश्चिमी धब्बा सहित अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए काटा जा सकता है।
- माध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रति ठंडे एचबीएसएस (4 डिग्री सेल्सियस) के 500 μL जोड़ें और प्लेट को धीरे-धीरे रॉक करें (आगे और पीछे, बाएं से दाएं)। एचबीएस निकालें।
- 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 500 μL जोड़कर कोशिकाओं को ठीक करें और कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए सेते हैं।
- स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग करें।
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Representative Results
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि पी 12 माउस रेटिना से एमजी कैसे विकसित किया जाए और एएससीएल 1सीआरईआरटी: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल आरपीसी रिपोर्टर माउस का उपयोग करके रेटिना न्यूरॉन्स में एमआईआर -25 के साथ इन कोशिकाओं को फिर से प्रोग्राम कैसे किया जाए। इस पद्धति का उपयोग पिछले काम की रिपोर्टिंग में अन्य उपयुक्त एमआईआरएनए (नकल या अवरोधक, एकल अणुओं के रूप में या संयोजन में) एमजी को आरपीसी में पुन: प्रोग्राम करने के लिए किया गया था जो तब न्यूरोनल सेल विशेषताओं को अपनाते हैं27. संस्कृतियों को तेजी से विकसित करने के लिए इस पद्धति को संशोधित किया गया है और इस प्रकार समय24,28,29 के साथ कृत्रिम वातावरण के कारण सेलुलर परिवर्तनों को कम किया गया है।
रेटिना पृथक्करण और प्राथमिक एमजी संस्कृतियों के विकास चरण
पहले एमजी को प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके इन विट्रो में पहले दिन के रूप में देखा जा सकता है। एमजी में एक ट्यूबलर, लम्बी आकृति और हल्के भूरे रंग के सेल निकाय (चित्रा 3 ए-डी, लाल तीरहेड्स) हैं। हालांकि, उनमें से अधिकांश इन शुरुआती चरणों में सेलुलर मलबे से ढके हुए हैं। एक माउस के दो रेटिना से एमजी, एक 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में उगाया जाता है, 4-5 दिनों (चित्रा 3 ई, एफ) के भीतर 90% -95% संगम तक पहुंच जाता है। समय के साथ, सभी न्यूरोनल मलबे को साफ किया जाएगा, और एक घनी कोशिका परत मौजूद होगी। यदि कुएं का निचला भाग पूरी तरह से संगम नहीं है तो कोशिकाएं पारित होने के लिए तैयार नहीं हैं। हालांकि, इन विट्रो में 6 दिनों के बाद मार्ग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि ग्लिया समय के साथ संस्कृति में अपनी ग्लियाल विशेषताओं को खो देता है। अभिकर्मक या किसी अन्य उपचार से पहले, कोशिकाओं को घनत्व और जीवन शक्ति के लिए जांचने की आवश्यकता होती है। अभिकर्मक केवल 90% -95% संगम कोशिकाओं (चित्रा 3 जी) पर किया जाना चाहिए। इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग और कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं को लेपित कवरलिप्स पर वरीयता प्राप्त करने की आवश्यकता होती है।
सेल रूपांतरण अवधि का प्रारंभिक और देर से चरण
अभिकर्मक और 4-हाइड्रॉक्सीटामोक्सिफेन उपचार के बाद 15 घंटे की शुरुआत में, पहली कोशिकाएं बेहोश लाल प्रतिदीप्ति को व्यक्त करना शुरू कर देती हैं, अर्थात, (सक्रिय) एएससीएल 1 प्रमोटर के तहत संचालित टीडीटोमैटो लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर प्रोटीन। एएससीएल 1 व्यक्त कोशिकाओं को अब एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाओं के रूप में जाना जाता है। अधिक मजबूत एएससीएल 1-टॉम अभिव्यक्ति समय के साथ बढ़ती लाल प्रतिदीप्ति (चित्रा 4) के साथ अभिकर्मक के 2 दिन बाद देखी जा सकती है। रिप्रोग्रामिंग प्रभाव रीप्रोग्रामिंग एमआईआरएनए उपचार में पाए जाने वाले प्रति क्षेत्र कई एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाओं के साथ संस्कृति में लगभग 2 दिनों तक दिखाई देता है: नियंत्रण-एमआईआर और एमआईआर -25 (चित्रा 4 बी-बी 'और चित्रा 4 सी-सी', क्रमशः) के लिए यहां दिखाया गया है। दोनों उपचारों में, एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाएं अभी भी गोल और अपेक्षाकृत बड़ी हैं, जिसमें अधिक ग्लिया / इसके अलावा, लाल फ्लोरोसेंट रिपोर्टर का प्रेरण संस्कृति के सेल घनत्व को प्रभावित नहीं करता है (अभी भी 90% -95% संगम)।
अभिकर्मक (चित्रा 4 ए और चित्रा 5 ए) के तीन से पांच दिन बाद, एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि एमआईआर -25 उपचारित कुओं (चित्रा 5 बी-डी) में अधिक स्पष्ट हो जाती है जो नियंत्रण की तुलना में एमआईआर -25 उपचार के बाद संख्या में चार गुना वृद्धि दिखाती है। इसके अलावा, पहले रूपात्मक परिवर्तन दिखाई देते हैं। इन परिवर्तनों में सेल सोमा आकार में कमी और ठीक प्रक्रियाओं का विकास शामिल है। जबकि नियंत्रण स्थितियों में कोशिकाओं के विशाल बहुमत बड़े और सपाट होते हैं (ग्लियाल / पूर्वज की तरह, चित्रा- 5 बी-बी '), छोटे नाभिक के साथ कई कोशिकाएं और रेटिना न्यूरॉन्स जैसी कई छोटी प्रक्रियाएं एमआईआर -25 उपचार (चित्रा- 5 सी-सी ') में दिखाई देती हैं। ये न्यूरोनल जैसी कोशिकाएं कुल एएससीएल 1-टॉम आबादी का लगभग 70% (नियंत्रण उपचार में 15%) का प्रतिनिधित्व करती हैं; चित्रा 5 ई)। सेल रूपांतरण के कारण कोशिकाएं कम घनी होती हैं (छोटी कोशिकाओं को कम स्थान की आवश्यकता होती है)। दिलचस्प बात यह है कि ये न्यूरोनल जैसी कोशिकाएं छोटे नेटवर्क (चित्रा 5 सी ') बनाने के लिए भी दिखाई देती हैं। इस समय, न्यूरोनल पहचान की पुष्टि करने के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए कोशिकाओं को काटा जा सकता है।
न्यूरोनल पहचान की पुष्टि
कोशिकाओं को सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन 2 (एमएपी 2) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ लेबल किया जाता है, न्यूरॉन-विशिष्ट साइटोस्केलेटल प्रोटीन30,31 के लिए एक मार्कर, और ऑर्थोडेंटिकल होमोबॉक्स 2 (ओटीएक्स 2) के खिलाफ न्यूरोनल पहचान32,33 को मान्य करने के लिए। दोनों मार्करों का उपयोग पिछले रीप्रोग्रामिंग अध्ययनों21,27 में भी किया गया था। ओटीएक्स2 एक प्रतिलेखन कारक है जो आरपीसीके 34,35,36, परिपक्व द्विध्रुवी कोशिकाओं 34,35,37,38,39 और फोटोरिसेप्टर35,36,37,38,40 में पाया जाता है। . डीएपीआई परमाणु लेबलिंग का उपयोग संस्कृतियों का मुकाबला करने के लिए किया जाता है। इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग नियंत्रण स्थितियों (चित्रा 6 ए-ए', सी) में अनुपस्थित मैप 2 या ओटीएक्स 2 अभिव्यक्ति के लिए बहुत कम दिखाता है। एमआईआर -25 उपचारित नमूने, हालांकि, कई मैप 2 + और ओटीएक्स 2 + कोशिकाएं हैं (चित्रा 6 बी-बी '')। कॉन्फोकल छवियों की मात्रा का ठहराव से पता चलता है कि एमआईआर -25 ओवरएक्सप्रेशन के बाद, नियंत्रण में प्रति क्षेत्र पांच न्यूरोनल कोशिकाओं की तुलना में प्रति क्षेत्र लगभग 40 न्यूरोनल कोशिकाएं मौजूद हैं (चित्रा 6 सी, क्षेत्र का आकार: 630 μm x 630 μm)। छवियों को 20x उद्देश्य के साथ लिया गया था। ये न्यूरोनल कोशिकाएं एमआईआर -25 उपचारित नमूनों (नियंत्रण ~ 20%, चित्रा 6 डी) की कुल एएससीएल 1-टॉम + सेल आबादी का लगभग 70% का गठन करती हैं। सभी न्यूरोनल-जैसे एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाएं मैप 2 + और ओटीएक्स 2 + थीं, जो न्यूरोनल पहचान की पुष्टि करती हैं। इसके अलावा, नियंत्रण-एमआईआरएनए उपचार (एमआईआर -25: प्रति क्षेत्र 60 कोशिकाएं; नियंत्रण-एमआईआर: प्रति क्षेत्र 10 कोशिकाएं) की तुलना में एमआईआर -25 उपचार के बाद ओटीएक्स 2 + और एमएपी 2 + कोशिकाओं की पूर्ण संख्या अधिक थी; चित्रा 6 ई)।
एक साथ लिया गया, परिणाम दर्शाते हैं कि एमजी संस्कृतियों को एमआईआरएनए के साथ उगाया और पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है। एमआईआर -25 पूरकता प्राथमिक एमजी में एएससीएल 1-टॉम अभिव्यक्ति को प्रेरित करती है। कई एमजी आरपीसी में परिवर्तित हो जाते हैं जो एक न्यूरोनल आकृति विज्ञान को अपनाते हैं और कुछ दिनों के बाद न्यूरोनल मार्कर मैप 2 और ओटीएक्स 2 को व्यक्त करते हैं।
चित्रा 1: एक प्राथमिक मुलर ग्लिया संस्कृति का प्रायोगिक डिजाइन और समय पाठ्यक्रम( ए) एएससीएल 1सीआरईआरटी की योजनाबद्ध: टीडीटोमैटोएसटीओपीएफएल / एफएल माउस, एक रेटिना पूर्वज रिपोर्टर माउस जिसका उपयोग रेटिना पूर्वज कोशिकाओं (आरपीसी) में मुलर ग्लिया (एमजी) के रूपांतरण को ट्रैक करने के लिए किया जाता है। (बी) संस्कृति अवधि का समय पाठ्यक्रम जिसमें विकास चरण (नीला, इन विट्रो, डिव में 0-4/5 दिन), अभिकर्मक चरण (बैंगनी, 5/6-7/8 डिव), और एमजी रूपांतरण चरण (पीला, 7/8 डिव शुरू होता है) शामिल हैं। विकास चरण: पृथक रेटिना (एक माउस के दो रेटिना) एक विकास माध्यम में 12-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं में उगाए जाते हैं। दिन 4/6 के आसपास, कोशिकाओं को 24-अच्छी तरह से प्लेट में पारित किया जाता है जिसमें लेपित कवरलिप्स होते हैं। अभिकर्मक चरण: अभिकर्मक माध्यम में 2 दिनों के लिए 5-7 डिव (पारित होने के 1 दिन बाद) कोशिकाओं को एमआईआरएनए से संक्रमित किया जाता है। क्रे रीकॉम्बिनेज 4-हाइड्रॉक्सीटामोक्सिफेन (4-ओएचटी) के साथ सक्रिय होता है। सेल प्रसार को ईडीयू के साथ ट्रैक किया जाता है। एमजी रूपांतरण चरण अभिकर्मक के 1 दिन बाद शुरू होता है। कोशिकाओं को अब फसल तक न्यूरोनल माध्यम में उगाया जाता है (अभिकर्मक के बाद 6-7 दिन, डीपीटीएफ)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: रेटिना पृथक्करण और जीनोटाइपिंग ( ए ) हटाए गए कॉर्निया, लेंस, आईरिस और कांच के साथ आई कप। (बी) पृथक रेटिना; रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) कोशिकाओं को पूरी तरह से धोने के बाद हटा दिया जाता है। (सी) पृथक रेटिना (अच्छी तरह से प्रति दो रेटिना) के साथ 12-अच्छी तरह से प्लेट। (डी) जीनोटाइपिंग जेल छवि उदाहरण का कटआउट। जीनोटाइपिंग को उन चूहों की पहचान करने की आवश्यकता होती है जिनके पास एएससीएल 1 संचालित क्रे पुन: संयोजक अभिव्यक्ति होती है और इसका उपयोग सेल रूपांतरण को ट्रैक करने के लिए किया जाएगा। स्केल बार: 1 मिमी कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: विकास चरण के दौरान प्राथमिक मुलर ग्लिया( ए) विकास चरण के दौरान संस्कृति अवधि का समय पाठ्यक्रम (इन विट्रो (डिव)) में 0-4/ (बी-जी) 1 डिव (बी) के बाद विकास चरण के दौरान मुलर ग्लिया (एमजी) की लाइव छवियां (चरण), मध्यम परिवर्तन (सी) के बाद 2 डिव, 3 डिव (डी), मार्ग से पहले 4 डिव (ई, एफ) और 5 डिव, पारित होने के 1 दिन बाद और अभिकर्मक (जी) से पहले। एमजी सेल निकायों को लाल तीरहेड्स द्वारा इंगित किया जाता है। 3 डिव के बाद, संस्कृतियां 60% -80% संगम (डी) हैं, 4-5 डिव के बाद, संस्कृतियां 90% -100% संगम हैं और पारित होने के लिए तैयार हैं (ई-एफ)। कवरलिप्स पर पारित होने के बाद, सेल संस्कृतियों को बाद के अभिकर्मक (जी) के लिए 80% -90% संगम होना चाहिए। स्केल बार: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: मुलर ग्लिया रूपांतरण चरण में प्रारंभिक चरण (ए) पीले रंग में हाइलाइट किए गए रूपांतरण चरण के दौरान संस्कृति अवधि का समय पाठ्यक्रम (इन विट्रो (डिव) में 7/8 दिन शुरू होता है)। इस आंकड़े में दिखाए गए विश्लेषण का समय बिंदु लाल तारे द्वारा इंगित किया गया है: 7 डिव, 2 दिन पोस्ट-अभिकर्मक (डीपीटीएफ)। (बी-सी'') चरण और लाल प्रतिदीप्ति, संयुक्त या एकल लाल प्रतिदीप्ति में मुलर ग्लिया (एमजी) संस्कृतियों की लाइव छवियां। लाल प्रतिदीप्ति एमजी (टीडीटोमैटो +, संक्षिप्त एएससीएल 1-टॉम) को व्यक्त करने वाले एएससीएल 1 की कल्पना करती है, या तो नियंत्रण एमआईआरएनए मिमिक्स (नियंत्रण-एमआईआर, बी-बी '' ) या एमआईआर -25 मिमिक्स (सी-सी '') के साथ अभिकर्मक के 2 दिन बाद। बी /बी 'और सी/सी' में क्षेत्रों को बी '/बी', 'सी'/सी' में उच्च आवर्धन में दिखाया गया है। स्केल सलाखों 200 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: मुलर ग्लिया रूपांतरण चरण में अंतिम चरण (ए) पीले रंग में हाइलाइट किए गए रूपांतरण चरण के दौरान संस्कृति अवधि का समय पाठ्यक्रम (इन विट्रो (डिव) में 7/8 दिन शुरू होता है)। इस आंकड़े में दिखाए गए विश्लेषण का समय बिंदु लाल तारे द्वारा इंगित किया गया है: 10 डिव, 5 दिन पोस्ट-अभिकर्मक (डीपीटीएफ)। (बी-सी') चरण और लाल प्रतिदीप्ति, संयुक्त या एकल लाल प्रतिदीप्ति में मुलर ग्लिया (एमजी) संस्कृतियों की लाइव छवियां। लाल प्रतिदीप्ति एमजी (टीडीटोमैटो +, संक्षिप्त एएससीएल 1-टॉम) को व्यक्त करने वाले एएससीएल 1 की कल्पना करती है, अभिकर्मक (पीटीएफ) के 5 दिन बाद या तो नियंत्रण एमआईआरएनए मिमिक्स (नियंत्रण-एमआईआर, बी-बी ') या एमआईआर -25 नकल (सी-सी ')। बी '/सी' में इनसेट क्रमशः बी '/सी' में उच्च आवर्धन में दिखाए गए हैं। (डी) नियंत्रण-एमआईआरएनए या एमआईआर -25 उपचार, 2- और 5-दिन के बाद अभिकर्मक (डीपीटीएफ; एन = 1, प्रति अच्छी तरह से पांच छवियों की गणना की जाती है; एसडी ± मतलब) प्रति क्षेत्र एएससीएल 1-टमाटर + कोशिकाओं की पूर्ण संख्या ( 10x; 1440 μm x 1080 μm)। (ई) नियंत्रण-एमआईआरएनए या एमआईआर -25 उपचार के बाद प्रति क्षेत्र कुल एएससीएल 1-टमाटर + कोशिकाओं (10x; 1440 μm x 1080 μm) के न्यूरोनल-जैसे एएससीएल 1-टमाटर + कोशिकाओं का प्रतिशत, अभिकर्मक के बाद 5 दिन (5 डीपीटीएफ, एन = 1, मतलब ± एसडी)। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: पुन: प्रोग्राम की गई कोशिकाओं की न्यूरोनल पहचान की पुष्टि। बी-बी '') प्राथमिक माउस मुलर ग्लिया (एमजी) संस्कृतियों के इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग 5 दिन बाद अभिकर्मक नियंत्रण एमआईआरएनए मिमिक्स (नियंत्रण-एमआईआर, ए-ए '' ) या एमआईआर -25 मिमिक्स (बी-बी '') के साथ इलाज किया जाता है। कोशिकाओं को 2% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया गया था और न्यूरॉन्स को लेबल करने के लिए टीडीटोमैटो, मैप 2 और ओटीएक्स 2 को लेबल करने के लिए आरएफपी के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था। डीएपीआई परमाणु लेबलिंग (नीला) का उपयोग सभी सेल नाभिक को दागने के लिए किया गया था। (सी-ई) मात्रा का ठहराव (एन = 1; कवरस्लिप प्रति पांच छवियों की गणना की जाती है; एएससीएल 1-टॉम + ओटीएक्स 2 + मैप 2 + प्रति क्षेत्र (सी) कोशिकाओं की निरपेक्ष संख्या का मतलब ± एसडी), एएससीएल 1-टॉम + ओटीएक्स 2 + मैप 2 + कुल एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाओं (डी) की कोशिकाओं का प्रतिशत, और प्रति क्षेत्र ओटीएक्स 2 + मैप 2 + कोशिकाओं की पूर्ण संख्या (ई)। परिणाम नियंत्रण की तुलना में एमआईआर -25 उपचार में न्यूरॉन्स की अधिक संख्या दिखाते हैं। क्षेत्र का आकार: 630 μm x 630 μm। स्केल सलाखों: 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
पूरक चित्रा 1: कोशिका मृत्यु और जीवाणु संदूषण। (ए-ए') मुलर ग्लिया (एमजी) संस्कृतियों की लाइव छवियां 3 बैक्टीरिया से दूषित हैं। ए में इनसेट 1 को ए में उच्च आवर्धन में दिखाया गया है और एट्रोफिक, मृत ग्लिया प्रदर्शित करता है। ए में इनसेट 2 को जिंदा ग्लिया के साथ ए ' में दिखाया गया है। स्केल सलाखों: 100 μm. कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि एमआईआरएनए का उपयोग करके रीप्रोग्रामिंग अध्ययन के लिए अलग-अलग माउस रेटिना से एमजी कैसे विकसित किया जाए। जैसा कि पिछले अध्ययनों की एक किस्म में दिखाया गया है और पुष्टि की गई है, इन संस्कृतियों में पाए जाने वाले कोशिकाओं का विशाल बहुमत (80% -90%) एमजी 20,23,24 है। यह विधि एक बहुत ही मजबूत और विश्वसनीय तकनीक है और परिणाम आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है यदि प्रोटोकॉल का सही ढंग से पालन किया जाता है21,27। संस्कृति की सफल वृद्धि और रीप्रोग्रामिंग दक्षता, हालांकि, विभिन्न कारकों पर निर्भर करती है।
सबसे पहले, माउस की उम्र सफल सेल विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। इसलिए, यदि एमजी संस्कृतियों को जंगली प्रकार के चूहों या ट्रांसजेनिक चूहों से उगाया जाता है जो रिपोर्टर चूहों जैसे जंगली प्रकारों से मिलते जुलते हैं, तो संगम एमजी मोनोलेयर विकसित करने की नवीनतम आयु पी 12 है। पी 12 में, सभी रेटिना न्यूरॉन्स और एमजी विभेदित होते हैं, और रेटिना में अब कोई आरपीसी मौजूद नहीं है। एमजी ग्लूटामाइन सिंथेटेज या ग्लूटामेट एस्पार्टेट ट्रांसपोर्टर (जीएलएएसटी) 20,23,41,42 जैसे परिपक्व एमजी मार्करों को व्यक्त करता है। सुसंस्कृत पी 12 एमजी अभी भी ईजीएफ के संपर्क में आने पर सेल चक्र में फिर से प्रवेश कर सकता है, लेकिन चक्रों की संख्या सीमित है, यद्यपि इन विट्रो में संगम सेल परतों को बनाने के लिए पर्याप्त है। फिर भी, यह हो सकता है कि पी 12 एमजी भी अच्छी तरह से नहीं बढ़ता है क्योंकि माध्यम में ईजीएफ या घटकों को नीचा दिखाया जा सकता है। अपूर्ण पृथक्करण (विखंडू) के परिणामस्वरूप कम या विलंबित एमजी वृद्धि भी हो सकती है। अपूर्ण पृथक्करण का एक प्रमुख कारण एंजाइम (तेजी से पाइपिंग, भंवर, आदि) के कठोर हैंडलिंग द्वारा रेटिना पृथक्करण के लिए उपयोग किए जाने वाले डीएनएएसई की निष्क्रियता। यहां तक कि अगर कोशिकाएं पारित होने तक अच्छी तरह से बढ़ती हैं, तो कोशिकाएं पारित होने के बाद कम संगम हो सकती हैं। इसके कारण मार्ग प्रक्रिया के दौरान कठोर हैंडलिंग हो सकते हैं जो कोशिका मृत्यु में वृद्धि की ओर जाता है या क्योंकि कोशिकाओं को बहुत कम वरीयता दी गई थी। चूंकि ग्लिया ज्यादा नहीं बढ़ता है, इसलिए कोशिकाओं को उसी अनुपात में चढ़ाया जाना चाहिए जैसा कि उगाया जाता है, पतला नहीं होता है (अमर सेल लाइनों की पासिंग प्रक्रियाओं के विपरीत)। ध्यान दें, क्योंकि एमजी संस्कृतियां केंद्र से एक कुएं की परिधि तक बढ़ती हैं, उच्च सेल घनत्व हमेशा केंद्र में पाया जाएगा। इसलिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि पूरा कुआं कोशिकाओं द्वारा कवर किया गया है, पारित होने से पहले हर कुएं के मार्जिन की जांच करना आवश्यक है। कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा के प्रसंस्करण को सुनिश्चित करने के लिए सेल एकाग्रता माप किया जाना चाहिए।
इसके अतिरिक्त, पी 6 या उससे कम उम्र के चूहों से प्राप्त प्राथमिक संस्कृतियों में कोई एमजी नहीं होगा, क्योंकि एमजी इस समय परिपक्व होने वाला है। यह एकल-कोशिका आरएनए-सेक विश्लेषण43 के माध्यम से दिखाया गया था। इस उम्र में परिपक्व एमजी मार्करों के साथ इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग भी इसकी पुष्टि करेगी। हालांकि, आरपीसी का अंश पी 6 पर पर्याप्त है। इसलिए परिणामों की सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए। इसके अलावा, मध्यवर्ती फिलामेंट मार्कर विमेंटिन और नेस्टिन जैसे मार्कर प्राथमिक एमजी की पहचान करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं क्योंकि इन मार्करों को एस्ट्रोसाइट्स 44,45,46, माइक्रोग्लिया47,48, एंडोथेलियल कोशिकाओं और पेरिसाइट्स 49,50,51,52 में भी व्यक्त किया जाता है , और एमजी-विशिष्ट नहीं हैं। जीएफएपी, रेटिना एस्ट्रोसाइट्स में व्यक्त किया गया है, लेकिन अक्षतिग्रस्त रेटिना के एमजी में नहीं, सुसंस्कृत एमजी के लिए एक अच्छा मार्कर नहीं है। यद्यपि यह पृथक्करण के दौरान यांत्रिक क्षति के कारण पृथक एमजी में अपग्रेड किया जाता है, लेकिन संस्कृति28 में 3 दिनों के बाद इसे डाउनरेगुलेट किया जाता है।
चूंकि एमजी कई आरपीसी मार्करों को साझा करता है, इसलिए एक मजबूत एमजी संस्कृति सुनिश्चित करने के लिए सबसे सुरक्षित प्रक्रिया पी 12 या पुराने चूहों पर चूहों का उपयोग करना है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल पी 12 माउस एमजी से प्राप्त संस्कृतियों का वर्णन करता है, वयस्क माउस एमजी को सुसंस्कृत और पुन: प्रोग्राम किया जा सकता है27। हालांकि, प्रति अच्छी तरह से अधिक ऊतक चढ़ाने की आवश्यकता होती है (चार से छह रेटिना)। ऐसा इसलिए है क्योंकि वयस्क ग्लिया ज्यादा विभाजित नहीं होता है, भले ही ईजीएफ और 10% सीरम के संपर्क में हो। कम सेल संपर्क कोशिका मृत्यु और कोशिका अध: पतन (फैली हुई कोशिकाओं, बढ़ी हुई कोशिकाओं) को जन्म देगा। वयस्क ग्लिया सह-संस्कृति प्रतिमान18 के लिए एक महान उपकरण हैं और सेल घनत्व इन अनुप्रयोगों में उतना मायने नहीं रख सकता है। अभिकर्मक या पारगमन जैसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, हालांकि, संगम सेल परतें एक आवश्यकता हैं।
बिगड़ा हुआ विकास के अलावा, कोशिका मृत्यु हो सकती है। यदि कोशिका मृत्यु बिना किसी स्पष्ट संकेत के होती है, तो माइकोप्लाज्मा संदूषण पर विचार किया जाना चाहिए (माइकोप्लाज्मा आकार 0.1-0.3 μm) और एक माइकोप्लाज्मा डिटेक्शन किट का उपयोग किया जाना चाहिए। प्रत्येक नमूने को अलग रखना (नमूने पूलिंग नहीं करना) क्रॉस-संदूषण के जोखिम को भी कम कर सकता है। हालांकि, बड़े बैक्टीरिया को जानवर से भी ले जाया जा सकता है और संदूषण का कारण बन सकता है, भले ही सभी काम स्वच्छ, बाँझ वातावरण में किए जाते हैं। नेत्रगोलक को 70% इथेनॉल में संक्षेप में डुबोना और आंखों को विच्छेदन करने से पहले अतिरिक्त 10 सेमी पेट्री डिश में पूरी तरह से धोने की सिफारिश की जाती है। एक सफल संस्कृति प्राप्त करने के लिए, बाँझ परिस्थितियों में काम करना अनिवार्य है क्योंकि संदूषण जल्दी से हो सकता है। एक बार जब बैक्टीरिया, खमीर, या मोल्ड / कवक एक प्लेट में पाए जाते हैं, भले ही सभी कुएं प्रभावित न हों, संस्कृति खो जाती है। संदूषण कोशिका मृत्यु (पूरक चित्रा 1) का कारण होगा और कोशिकाओं को प्रभावित करेगा, जिसके परिणामस्वरूप गैर-प्रतिनिधि डेटा होगा।
कोशिका मृत्यु डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों जैसे पॉली-ओ (या पॉली-डी-लाइसिन) के लिए आवश्यक अभिकर्मकों के कारण भी हो सकती है जिसका उपयोग कवरलिप्स को कोट करने के लिए किया जाता है। ये पदार्थ विषाक्त होते हैं और लैमिनिन का उपयोग करने से पहले पूरी तरह से धोने की आवश्यकता होती है। कवरलिप्स को कुएं के नीचे चिपकना चाहिए, कुएं के अंदर तैरना नहीं चाहिए। हवा के बुलबुले से बचने की जरूरत है। इसके अलावा, कवरस्लिप के लिए सेल आसंजन सुनिश्चित करने के लिए लैमिनिन के साथ पूर्ण कोटिंग महत्वपूर्ण है। लैमिनिन की कमी से कोशिका घनत्व और / या कोशिका मृत्यु भी कम हो जाएगी।
सच्चे रीप्रोग्राम्ड ग्लिया की पहचान के लिए, रिपोर्टर चूहों और सेल प्रसार मार्कर जो सेल ट्रैकिंग की अनुमति देते हैं, जैसे कि ईडीयू या बीआरडीयू, का उपयोग किया जाना चाहिए। चूंकि पूरे रेटिना चढ़ाया जाता है, इसलिए न्यूरोनल बचे सभी संस्कृतियों में मौजूद होते हैं। हालांकि, ज्यादातर मामलों में पारित होने के बाद उन्हें लगभग पूरी तरह से हटा दिया जाता है। फिर भी, ईडीयू (या बीआरडीयू) लेबलिंग को यह मान्य करने के लिए किया जाना चाहिए कि न्यूरॉन्स एमजी / आरपीसी के प्रसार से उत्पन्न हुए हैं और न्यूरोनल बचे (पोस्ट-माइटोटिक) नहीं हैं। यहां उपयोग किए जाने वाले नियंत्रणों में पाए जाने वाले न्यूरॉन्स की छोटी संख्या न्यूरोनल बचे हुए हैं।
दिलचस्प बात यह है कि कुछ एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाएं समय के साथ थोड़ी बढ़ती संख्या के साथ नियंत्रण उपचार में भी मौजूद हैं। ये कोशिकाएं कुछ अपरिपक्व हो सकती हैं एमजी एक्सप्रेस एएससीएल 1 जब पृथक और सुसंस्कृत होता है। हालांकि, इस एएससीएल 1-टॉम + सेल आबादी का अंश छोटा है। इसके अलावा, नियंत्रण उपचार में पाए जाने वाले इन एएससीएल 1-टॉम + कोशिकाओं में से अधिकांश ओटीएक्स 2 और / या मैप 2 को व्यक्त नहीं करते हैं और एक फ्लैट सेल आकार रखते हैं। नियंत्रण स्थितियों के तहत कोई न्यूरोनल भेदभाव नहीं होता है। बहुत नाजुक न्यूरोनल जैसी कोशिकाएं जो नेटवर्क बनाने के लिए दिखाई देती हैं, केवल एमआईआर -25 उपचार के बाद पाई जाती हैं।
यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग पिछले अध्ययनों में एमजीरिप्रोग्रामिंग 21,27 के लिए एमआईआरएनए का परीक्षण करने के लिए किया गया था और ग्लिया को विकसित करने के लिए अच्छी तरह से प्लेटों के संबंध में पिछले वर्षों में थोड़ा संशोधित किया गया है। वे अब 6-अच्छी तरह से प्लेटों के बजाय 12-अच्छी तरह से प्लेटों में उगाए जाते हैं। संगम मोनोलेयर 4/5 दिनों के बाद 12-अच्छी तरह से प्लेटों में प्राप्त किया जा सकता है (बनाम 6-अच्छी तरह से प्लेटों के साथ 6/8 दिन) और इसलिए, समग्र संस्कृति अवधि जो सेल परिवर्तन / अभिकर्मक समय खिड़की भी लम्बी है। नियमित अभिकर्मक प्रोटोकॉल में 3 घंटे अभिकर्मक अवधि होती है जिसके बाद सेल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए एक पूर्ण मध्यम परिवर्तन करने की आवश्यकता होती है। इस माध्यम परिवर्तन के बाद सभी अणुओं को हटा दिया जाता है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, समय खिड़की को बढ़ाया गया था और अभिकर्मक अभिकर्मक माध्यम में 50% न्यूरोनल माध्यम (क्रे प्रेरण और सेल प्रसार ट्रैकिंग के लिए आवश्यक कारकों के साथ पूरक) जोड़कर एमआईआरएनए के लिए लंबे समय तक जोखिम की अनुमति दी गई थी। कोशिकाएं स्वस्थ थीं और इस संशोधन के साथ कोई समस्या नहीं थी। ऐसा प्रतीत होता है कि अभिकर्मक परिणाम लम्बी अभिकर्मक समय के साथ बेहतर होते हैं, लेकिन उस अवलोकन की पुष्टि करने के लिए अधिक डेटा की आवश्यकता होती है।
इसके अलावा, कॉन्फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोपी करने के लिए इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए आवश्यक सभी चरणों का वर्णन यहां किया गया है। इसलिए, एमजी को ग्लास कवरलिप्स पर पारित करने की आवश्यकता है। चूंकि कवरलिप्स 24 अच्छी तरह से प्लेट के क्षेत्र से छोटे होते हैं, इसलिए केवल एक तिहाई कोशिकाएं जो 24-अच्छी तरह से प्लेट के पूर्ण कुएं को कवर करेंगी, लेपित कवरस्लिप पर फिट बैठती हैं। क्यूपीसीआर, आरएनए-सेक, या पश्चिमी धब्बों जैसे अन्य अनुप्रयोगों के लिए, कोशिकाओं को 1: 1 अनुपात में पारित किया जाता है, वांछित समय बिंदु पर इलाज और कटाई की जाती है।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इस संस्कृति प्रणाली का उपयोग अन्य अनुप्रयोगों के लिए भी किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, ग्लियाल व्यवहार का अध्ययन करने के लिए, जिसमें न्यूरोप्रोटेक्टिव तंत्र, ग्लियोसिस और / या एमआरएनए, एमआईआरएनए, या सुसंस्कृत ग्लिया के प्रोटीन को प्रोफाइल करने के लिए अध्ययन ों के समान अध्ययन ों के समान है जो थोड़ा अलग संस्कृति प्रतिमान या प्रजातियों 11,28,29,54 का उपयोग करते थे। . इन अनुप्रयोगों को रिप्रोग्रामिंग के बाद न्यूरोनल अस्तित्व सुनिश्चित करने के लिए न तो न्यूरोनल माध्यम की आवश्यकता होगी, न ही सेल प्रसार की कल्पना करने के लिए ईडीयू के अलावा। इसके बजाय न्यूरोनल सप्लीमेंट्स के बिना कम सीरम माध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए।
यद्यपि यह विधि मजबूत और विश्वसनीय है, सभी प्राथमिक संस्कृति प्रणालियों के समान इसकी सीमाएं हैं; ये कोशिकाओं के सीमित जीवन काल हैं, समय28 के साथ प्रगतिशील कोशिका अध: पतन, और तथ्य यह है कि यह एक 2-आयामी, कृत्रिम संस्कृति प्रणाली है जो अन्य रेटिना सेल प्रकार और बाह्य मैट्रिक्स दोनों के संबंध में शारीरिक संदर्भ की नकल नहीं कर सकती है। इसलिए, एमजी प्राथमिक संस्कृतियों में शीर्ष उम्मीदवारों और उनकी सबसे कुशल सांद्रता की पहचान करने के बाद, रेटिना एक्सप्लांट संस्कृतियों, रेटिना ऊतक जैसा दिखने वाला एक 3-आयामी संस्कृति प्रणाली, प्रदर्शन किया जाना चाहिए। एक्सप्लांट संस्कृतियों में सीमित संस्कृति अवधि भी होती है और एक्सप्लांट्स में कोशिकाएं समय के साथ-साथ पतित हो जाती हैं। हालांकि, वे अपने प्राकृतिक 3-आयामी वातावरण में एमजी के अध्ययन की अनुमति देते हैं और जानवर 23,32,55,56 के विकास के चरण को दर्शाते हुए विभिन्न उम्र में किया जा सकता है।
एक साथ लिया गया, यह अध्ययन एमजी संस्कृतियों के बारे में रिपोर्ट करता है जिसका उपयोग आरपीसी एमआईआरएनए एमआईआर -25 की क्षमता की निगरानी करने के लिए किया जाता है ताकि एमजी को न्यूरोनल जैसी कोशिकाओं में फिर से प्रोग्राम किया जा सके, जो इम्यूनोफ्लोरोसेंट लेबलिंग द्वारा मान्य है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग पिछलेकार्यों 21,24,27 में किया गया था और एमजी की पुनर्योजी क्षमता का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विधि में एक वर्तमान है कुल मिलाकर, एमजी प्राथमिक संस्कृतियां एक मजबूत तकनीक हैं और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम20,21 की अनुमति देती हैं। यद्यपि एमजी रिप्रोग्रामिंग के लिए एमआईआरएनए ओवरएक्सप्रेशन यहां विशेष रूप से वर्णित है, अन्य कारक जैसे कि छोटे अणु, डीएनए (या तो प्लास्मिड या वायरल वैक्टर में पैक), प्रोटीन निषेध32 के लिए एंटीबॉडी, या विशिष्ट यौगिकों का उपयोग / डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों का एक व्यापक स्पेक्ट्रम भी है, जिसमें एमआईआरएनए प्रोफाइलिंग24, एससीआरएनए-सेक27, आरटी-क्यूपीसीआर20,21, या पश्चिमी धब्बे20 शामिल हैं। इसके अलावा, एमजी प्राथमिक संस्कृतियां कोशिकाओं के दैनिक अवलोकन और निगरानी की अनुमति देती हैं। यह समय बिंदुओं को निर्धारित करने के लिए एक पर्याप्त लाभ हो सकता है, उदाहरण के लिए, एक निश्चित प्रतिक्रिया या सेल प्रतिक्रिया की शुरुआत, अवधि और / प्रवासी या प्रसार व्यवहार के साथ-साथ चोट / सेल क्षति से संबंधित प्रतिमान (उदाहरण के लिए, एमजी संस्कृतियों में वैश्विक एमआईआरएनए विलोपन) 32 का अध्ययन और विश्लेषण एमजी प्राथमिक संस्कृतियों में अंतर्निहित तंत्र और मार्गों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है। इसलिए, विवो सिस्टम में कार्यान्वयन से पहले आणविक और सेलुलर स्तरों पर एमजी का अध्ययन करने के लिए एमजी संस्कृतियां एक बहुत शक्तिशाली उपकरण हैं।
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Disclosures
इस रिपोर्ट में कुछ निष्कर्षों सहित एक पेटेंट वाशिंगटन विश्वविद्यालय द्वारा आविष्कारक निकोलस जोरस्टेड, स्टेफनी जी वोहल और थॉमस ए रेह के साथ दायर किया गया है। पेटेंट का शीर्षक रेटिना पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने के तरीके और रचनाएं हैं।
Acknowledgments
लेखक पांडुलिपि पर अपने इनपुट के लिए डॉ एन बीटन और सभी प्रयोगशाला सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। सिएटल में वाशिंगटन विश्वविद्यालय में पोस्टडॉक्टोरल प्रशिक्षण के दौरान एसजीडब्ल्यू को स्क्रीनिंग टूल के रूप में एमजी प्राथमिक संस्कृतियों को पेश करने के लिए डॉ टॉम रेह, जूलिया पोलक और रस टेलर को विशेष धन्यवाद। अध्ययन को एसजीडब्ल्यू को एम्पायर इनोवेशन प्रोग्राम (ईआईपी) अनुदान और सनी ऑप्टोमेट्री से एसजीडब्ल्यू तक स्टार्ट-अप फंड के साथ-साथ नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) से एसजीडब्ल्यू तक आर 01 ईवाई032532 पुरस्कार द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
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