Summary
Müller glia primære kulturer hentet fra musehinnen representerer et meget robust og pålitelig verktøy for å studere glialkonvertering til retinale stamceller etter mikroRNA-behandling. Enkeltmolekyler eller kombinasjoner kan testes før deres påfølgende anvendelse av in vivo-tilnærminger .
Abstract
Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina og kan fungere som en regenerativ kilde for retinale nevroner. Hos lavere virveldyr som fisk forekommer MG-drevet regenerering naturlig; hos pattedyr er det imidlertid nødvendig med stimulering med visse faktorer eller genetisk/epigenetisk manipulasjon. Siden MG bare utgjør 5% av retinalcellepopulasjonen, er det behov for modellsystemer som utelukkende tillater studier av denne cellepopulasjonen. Et av disse modellsystemene er primære MG-kulturer som er reproduserbare og kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert screening og identifisering av molekyler / faktorer, testing av forbindelser eller faktorer, celleovervåking og / eller funksjonstester. Denne modellen brukes til å studere potensialet til murine MG for å konvertere til retinale nevroner etter tilskudd eller inhibering av mikroRNA (miRNA) via transfeksjon av kunstige miRNA eller deres hemmere. Bruken av MG-spesifikke reportermus i kombinasjon med immunfluorescerende merking og enkeltcellet RNA-sekvensering (scRNA-seq) bekreftet at 80% -90% av cellene som finnes i disse kulturene er MG. Ved hjelp av denne modellen ble det oppdaget at miRNA kan omprogrammere MG til retinale stamceller (RPC), som senere skiller seg ut i nevronlignende celler. Fordelene med denne teknikken er at miRNA-kandidater kan testes for effektivitet og utfall før de brukes i in vivo-applikasjoner .
Introduction
Müller glia (MG) er den dominerende glia i nevral retina. De har lignende funksjoner sammenlignet med andre glia i andre deler av sentralnervesystemet, for eksempel å opprettholde vann- og ionhomeostase, nærende nevroner og beskytte vevet. MG har en annen fascinerende funksjon: selv om de er modne glia, uttrykker de fortsatt mange gener uttrykt i retinale stamceller (RPC) under sen utvikling 1,2. Denne likheten antas å være årsaken til den naturlig forekommende MG-baserte nevronregenereringen i fiskehinnen etter retinal skade 3,4. I løpet av denne prosessen går MG inn i cellesyklusen og de-differensierer til RPC-er som deretter differensierer i alle seks typer retinale nevroner. Selv om dette fenomenet forekommer naturlig i fisk, konverterer ikke pattedyr MG til nevroner 5,6. De kan imidlertid omprogrammeres. En rekke faktorer har vist seg å omprogrammere MG til RPC/nevroner; blant disse faktorene er den grunnleggende helix-loop-helix (bHLH) transkripsjonsfaktoren achaete-scute homolog 1 (Ascl1) som er involvert i fiskregenerering 7,8. Hos mus uttrykkes Ascl1 bare i RPC under retinogenese, men er fraværende i modne MG- eller retinale nevroner9.
Omprogrammering av celler direkte in vivo er ikke bare metodisk utfordrende, men krever også godkjenning fra en institusjonell dyrepleie- og brukskomité. For å motta godkjenning kreves foreløpige data om faktoren(e) som er brukt eller endret, konsentrasjoner, off-target effekter, underliggende mekanismer, toksisitet og effektivitet. Cellekultursystemer tillater testing for disse kriteriene før bruk i in vivo-modeller. Videre, siden MG bare utgjør omtrent 5% av hele retinalcellepopulasjonen10, tillater MG-kulturer studier av deres funksjon11 også deres oppførsel, inkludert migrasjon12,13, spredning14, stressreaksjon på skade / skade15,16, deres interaksjon med andre celletyper som microglia17 eller retinale ganglionceller (RGCs)18, eller deres nevrogene potensial 19,20,21. Mange forskere bruker udødelige cellelinjer for sine studier siden de har et ubegrenset proliferativt potensial og lett kan vedlikeholdes og transfectederes. Primære celler er imidlertid å foretrekke for biologisk relevante analyser enn immortaliserte celler siden de har sanne celleegenskaper (gen- og proteinuttrykk), og enda viktigere, de representerer et bestemt utviklingsstadium og derfor har en "alder". Alderen til et dyr (og følgelig av cellene hentet fra et dyr) er en spesielt avgjørende faktor i cellulær omprogrammering siden celleplastisiteten reduseres med utviklet utviklingsstadium22.
Denne protokollen beskriver i detalj hvordan man omprogrammerer primær MG med miRNA som en nåværende in vitro-metode for å studere regenerering. Denne MG primære kulturmodellen ble etablert i 2012 for å evaluere celleproliferasjonsegenskaper for MG i P53 knock-out mus (trp53-/- mus)23. Det ble vist at kultivert MG opprettholder sine glialegenskaper (dvs. ekspresjon av S100β-, Pax6- og Sox2-proteiner evaluert via immunfluorescerende merking), og at de ligner in vivo MG (mikromatrise av FACS-renset MG)23. Kort tid etter ble glial mRNA og proteinuttrykk validert og bekreftet i en annen tilnærming ved bruk av virale vektorer20. Noen år senere ble det bekreftet at de aller fleste cellene som finnes i disse kulturene er MG ved hjelp av MG-spesifikke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mus24. Videre viste kvantifisering av settet av miRNA i både FACS-renset MG og kultivert primær MG at nivåene av MG miRNA (mGLiomiRs) ikke varierer mye i kultivert MG i vekstfasen. Langstrakte kulturperioder forårsaker imidlertid endringer i miRNA-nivåer og følgelig i mRNA-nivåer og proteinuttrykk siden miRNA er translasjonsregulatorer25.
I 2013 ble denne MG-kulturmodellen brukt til å teste en rekke transkripsjonsfaktorer med hensyn til deres evne til å omprogrammere MG til retinale nevroner20. Ascl1 ble funnet å være en svært robust og pålitelig omprogrammeringsfaktor. Overekspresjon av Ascl1 via virale vektorer induserte morfologiske endringer, ekspresjon av nevronmarkører og oppkjøp av nevronale elektrofysiologiske egenskaper. Enda viktigere, innsikten og resultatene fra disse første in vitro-eksperimentene ble vellykket overført til in vivo-applikasjoner 22,26 som viser at primære MG-kulturer representerer et solid og pålitelig verktøy for innledende faktorscreening og evaluering av glialfunksjoner før in vivo implementering.
For noen år siden ble det vist at hjerneberiket miRNA miR-124, som også er sterkt uttrykt i retinale nevroner, kan indusere Ascl1-uttrykk i dyrket MG21. Ascl1-uttrykk i levende celler ble visualisert via en Ascl1 reportermus (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl). En reportermus er en genmodifisert mus som har et reportergen satt inn i sitt DNA. Dette reportergenet koder for et reporterprotein, som er i denne studien tdTomato, et rødt fluorescerende protein. Dette reporterproteinet rapporterer uttrykket av et gen av interesse, i dette tilfellet Ascl1. Med andre ord, celler som uttrykker Ascl1 vil bli røde. Siden Ascl1 bare uttrykkes i RPC9, tillater denne Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-musen sporing av MG-konvertering til Ascl1-uttrykk for RPC-er, noe som betyr at konvertering av celler vil uttrykke rødt fluorescerende tdTomato reporterprotein. Dette er irreversibel merking siden DNA fra disse cellene er endret. Følgelig vil enhver etterfølgende nevrondifferensiering bli visualisert fordi tdTomato-etiketten forblir i differensierende celler. Hvis Ascl1 som uttrykker MG-avledede RPC-er (med tdTomato-etikett) skiller seg ut i nevroner, vil disse nevronene fortsatt ha sin røde etikett. Denne musen tillater derfor ikke bare merking av MG-avledede RPC-er for levende celleavbildning, men tillater også skjebnekartlegging og avstamningssporing av disse MG-avledede (røde) RPC-ene. Mer nylig ble settet med miRNA i RPC-er identifisert, og MG-kulturer av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermus ble brukt til å skjerme og teste effekten av disse miRNA-ene på omprogrammeringskapasitet og effektivitet27. En kandidat, RPC-miRNA miR-25, ble funnet i stand til å omprogrammere kultivert MG til Ascl1-uttrykkende (Ascl1-Tomato +) celler. Disse omprogrammerte cellene adopterer nevronale egenskaper over tid, inkludert nevronmorfologi (liten somata og enten korte eller lange fine prosesser), uttrykk for nevronale transkripsjoner målt via scRNA-Seq, samt ekspresjon av nevronproteiner validert via immunfluorescerende merking27.
Her beskriver protokollen hvordan man dyrker og transfekterer MG fra P12-mus tilpasset fra forrige arbeid 21,24,27. Valgt for denne protokollen er den nevnte miRNA miR-25, et miRNA sterkt uttrykt i RPC, med lave ekspresjonsnivåer i MG eller retinale nevroner. For å overuttrykke miR-25, brukes murine miR-25 etterligner, dvs. kunstige miRNA-molekyler. Som en kontroll velges etterligninger av et miRNA fra Caenorhabditis elegans, som ikke har noen funksjon i pattedyrceller. Visualisering av konverteringen av MG til RPC-er ble oppnådd via RPC-reportermusen (Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl), en mus med blandet bakgrunn (C57BL / 6, S129 og ICR-stammer). Denne kulturen kan imidlertid utføres med alle musestammer, inkludert villtypestammer. I løpet av de siste årene har den opprinnelige protokollen blitt modifisert for å redusere vekstfasevarigheten og den generelle kulturperioden og sikre en mer robust gliacellestatus og minimere graden av cellulær degenerasjon, som oppstår i lengre kulturperioder. Det vanlige transfeksjonstidsvinduet ble også utvidet fra 3 timer til 2 dager. Som nevnt tidligere, selv om den nåværende protokollen beskriver MG-kulturer som et verktøy for regenereringsstudier, er metoden ikke bare nyttig for å teste omprogrammeringsfaktorer, men kan også tilpasses for andre applikasjoner, inkludert studier om MG-migrerende eller proliferativ oppførsel, skade / celleskaderelaterte paradigmer og / eller identifisering av underliggende mekanismer og veier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedyrer som involverer dyrefag er godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved SUNY College of Optometry.
MERK: Denne kulturprotokollen består av tre faser: vekst, transfeksjon og konverteringsfase. Et sammendrag av den samlede protokollen med tidslinjen er gitt i figur 1.
1. Fremstilling av media og alle nødvendige reagenser
MERK: Alle trinn må utføres i et A2- eller B2-biosikkerhetsskap (BSC). I vekstfasen brukes et vekstmedium med høyt serum som består av et basalt nevronmedium supplert med epidermal vekstfaktor (EGF). For konverteringsfasen brukes et nevrofysiologisk basalmedium med lavt serum supplert med nevrontilskudd for å sikre nevrondifferensiering og overlevelse.
- Forbered vekstmedium (brukt i vekstfasen) ved å supplere 200 ml basalt nevronmedium med 20 ml føtalt bovint serum (FBS, 10%), 1 ml 200 mM L-glutamin (0,5%), 2 ml penicillin / streptomycin (1%) og 2 ml N2-tilskudd (1%). Utfør steril filtrering (filterenheter med 0,22 μm porestørrelse). Forvarm mediet i 37 °C metallperlebad før bruk.
- Forbered nevronmedium (brukt i konverteringsfasen) etter produsentens instruksjoner (se materialtabell) ved å supplere 100 ml serumfritt nevrofysiologisk basalmedium med 2 ml B27 nevrontilskudd (2%), 1 ml N2-tilskudd (1%), 20 μL 100 ng / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF, rekonstituert i 0,1% bovint serumalbumin (BSA) i fosfatbufret saltvann (PBS, endelig konsentrasjon 20 ng/ml), 20 μL 100 ng/ml glia cellederivert nevrotrofisk faktor (GDNF, rekonstituert i steril Hanks balanserte saltløsning [HBSS], endelig konsentrasjon 20 ng/ml), 500 μl 100 mg/ml Dibutyryl-cAMP (rekonstituert i DMSO), 70 μL på 50 ng/ml askorbinsyre (rekonstituert i steril PBS) og 1,5 ml penicillin/streptomycin. Utfør steril filtrering (filterenheter med 0,22 μm porestørrelse). Forvarm medium i 37 °C metallperlebad før bruk.
MERK: Disse mediene kan lagres ved 4 °C i 1 måned. - Rekonstituere Papain-, DNase I- og Ovomucoid-reagenser som kreves for retinal dissosiasjon etter produsentens protokoll. Aliquot 750 μL Papain i sterile 1,5 ml slanger, 75 μL DNase I i sterile 0,6 ml rør og 750 μL Ovomucoid proteasehemmer i 2 ml rør. Frys ned Papain og DNase I aliquots ved -20 °C og hold Ovomucoid aliquots ved 4 °C for å unngå nedbrytning av reagensene. Tine ved romtemperatur rett før bruk.
MERK: Papain, DNase I og Ovomucoid finnes i et sett som heter Papain Dissociation System (se Materialtabell). - Rekonstituer poly-L-ornitin (Poly-O) og Laminin for dekslerlipbelegg hvis immunfluorescerende merking utføres i henhold til dataarkinstruksjonene (Poly-O: 0,1 mg / ml i sterilt vann; Laminin: fortynn 1,2 mg/ml ved 1:50 ved DMEM). Aliquot Poly-O og Laminin (2,5 ml) og frys aliquot ved -20 °C. Tine ved romtemperatur rett før bruk.
MERK: Trinn 1.4. er bare nødvendig hvis immunfluorescerende merking og laserskanningsmikroskopi utføres.
2. Mus og vevsekstraksjon
MERK: For disse omprogrammeringsstudiene ble Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl-musen opprettet ved å krysse en Ascl1CreERT-mus (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) med en tdTomatoSTOPfl / fl-mus (B6.Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J: Jax # 007914). Denne musen har en blandet bakgrunn (C57BL / 6, S129 og ICR-stamme). Genotypen til denne musen er vist i figur 1A. Alle stammer kan brukes til denne protokollen.
- Bruk hansker og desinfiser arbeidsområde, inkludert disseksjonsmikroskop og alle fine verktøy (Dumont # 5 fine og Dumont # 7 buede tang, fin saks og Vannas saks) med 70% etanol. Desinfiser en 10 cm silikonbelagt svart disseksjonsskål ved å utsette den for UV-lys i 20 minutter.
- Tilberedning av retter og tallerkener for vevsekstraksjon
- Forbered en 24-brønns plate for øyeinnsamling og prøveseparasjon (to øyne per mus i en brønn, merket med muse-ID) med ~ 1 ml kald HBSS (4 ° C) per brønn. Legg 24-brønnsplaten på is.
- Fyll en steril 10 cm petriskål (til vask) og den desinfiserte silikonbelagte disseksjonsskålen med flere ml kald HBSS (4 °C) for å sikre at vevet er helt dekket med HBSS.
- Forbered et sterilt 1,5 ml rør med 1 ml 70% etanol.
- Forbered en 12 brønns kulturplate ved å merke platen med kulturnummer, dato, belastning og all nødvendig informasjon.
- Avliv P12-mus ved hjelp av en godkjent metode.
- Fjerning av øyne
- Hold musehodet forsiktig med tommelen og pekefingeren rundt øyet.
- Bruk Dumont # 7 buede tang, gå forsiktig bak øyebollet og klipp optisk nerve. Ta forsiktig øyet ut.
MERK: Hvis voksne mus brukes, må du ikke bruke buede tang og ikke trekke øyet. Klipp i stedet forsiktig rundt øyekulen ved hjelp av fin saks; kutt optisk nerve, men ikke kutt selve øyet. Bruk tang for å fjerne øyebollet forsiktig.
- Rengjøring av øyeeplet
- Dypp øyebollet kort i et etanolholdig rør for å unngå overføring av bakterier fra dyret.
- Vask øyeeplet kort i 10 cm petriskålen før du legger det i 24 brønnplaten på is.
- Gjenta trinn 2.4 og 2.5 for de andre øynene. Hold brønnplaten på isen under prosessen. Plasser to øyne fra ett dyr i disseksjonsskålen plassert under et disseksjonsmikroskop med en lyskilde.
- Retina ekstraksjon
- Fest ett øyeboll ved å ta tak i optisk nerve og det omkringliggende bindevevet rundt scleraen med Dumont # 5 fine tang og trykk den forsiktig mot disseksjonsskålen (hornhinnen oppover).
- Lag et hull i midten av hornhinnen ved hjelp av en 30 G nål for å gi lettere tilgang til Vannas-saksen.
- Disseker hornhinnen rundt ciliary kroppen ved hjelp av Vannas saks og fjern hornhinnen, linsen, iris og glasslegemet forsiktig med Dumont # 5 fine tang. Figur 2A illustrerer en øyekopp med netthinnen inni.
- Disseker scleraen med Vannas saks til optisk nerve er nådd. Klipp optisk nerve og trekk forsiktig ut netthinnen ved hjelp av Dumont # 5 fine tang.
- Bruk et andre par Dumont # 5 fine tang for å presse mot netthinnen og tillate fullstendig fjerning av glasslegemet. Figur 2B illustrerer to ekstraherte netthinner.
- Overføring og vask
- Skjær ca. 2,5 cm av spissen av en steril overføringspipette for å forstørre diameteren. Bruk dette tipset til å plukke opp (suge inn) hele netthinnen uten å skade vevet.
- Overfør netthinnen til en ny steril petriskål med kald HBSS (4 °C) og rock fatet (frem og tilbake, venstre og høyre).
- Bruk overføringspipettespissen til å skyve netthinnene forsiktig rundt for å vaske av retinale pigmentepitelceller (RPE).
NOTAT: Alternativt kan hele netthinnen med linse og glasslegeme fjernes fra øyekoppen. Deretter kan linsen og glasslegemet fjernes fra den ekstraherte netthinnen. Hvis netthinnen er dratt, sørg for å samle alle brikkene for dissosiasjon; Ellers vil det ikke være tilstrekkelige mengder vev til å vokse sammenflytende cellelag.
- Plasser umiddelbart den isolerte netthinnen i en ny, ren brønn på 24-brønnsplaten fylt med 1 ml HBSS. Hold 24-brønnsplaten på isen under disseksjonsprosessen.
- Gjenta trinn 2,7-2,9 for å isolere den andre netthinnen.
3. Retina dissosiasjon
MERK: Alle følgende trinn (til cellehøsting) må utføres i et A2- eller B2-biosikkerhetsskap (BSC).
- Klargjør Papain/DNase I dissosiasjonsblandingen som følger.
- For seks netthinner, tilsett 75 μL DNase I i røret som inneholder 750 μL Papain (fra trinn 1.3) og bland forsiktig (dissosiasjonsblanding).
- For individuell prøvepreparering som kreves for denne protokollen, del det totale volumet på 825 μL i tre aliquots: 275 μL av blandingen i ett 1,5 ml rør per mus (to netthinner). Beregn de nødvendige mengdene DNase I og Papain tilsvarende.
MERK: Opptil seks netthinner kan dissosieres i ett rør av Papain / DNase I-blanding. Individuell prøvepreparering resulterer imidlertid i færre klumper og bedre cellevekst enn i kombinerte prøver.
- Overfør to netthinner til Papain / DNase I dissosiasjon blanding. Bruk en overføringspipette med forstørret spissdiameter (trinn 2.8.1), plukk opp netthinnen, vent til netthinnen legger seg nederst på spissen, og slipp deretter netthinnen uten overdreven HBSS i røret som inneholder Papain / DNase I-blandingen.
- Legg på en mutter og rug den i 10 minutter i en cellekulturinkubator (37 °C, 5 % CO2).
- Dissosier cellene ved å pipettere forsiktig opp og ned (ca. 20-30 ganger) med en 1 ml pipette. Etter at cellene er dissosiert (dvs. resulterer i en homogen løsning uten biter), tilsett 275 μL Ovomucoid proteasehemmer fra Papain Dissociation Kit for å nøytralisere Papain. Bland forsiktig ved pipettering opp og ned.
MERK: Hvis seks netthinner ble dissosiert i 825 μL Papain / DNase I-blanding, er det nødvendig med 825 μL Ovomucoid. - Sentrifuger blandingen ved 300 x g i 10 minutter ved 4 °C.
- Tilsett epidermal vekstfaktor (EGF, 1 μL per 1 ml av vekstmediet, rekonstituert ved 200 μg/ml i PBS) til det beregnede volumet av vekstmedium (1 ml per mus) forvarmet ved 37 °C.
MERK: Avhengig av den eksperimentelle utformingen kan proliferasjonsmarkøren 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU), samt 4-hydroksytamoxifen (4-OHT) eller andre nødvendige faktorer tilsettes i begynnelsen av kulturperioden. - Fjern rørene forsiktig fra sentrifugen. Ikke berør pelleten i bunnen av røret.
- Fjern supernatanten forsiktig og helt. Resuspender cellepelleten med 500 μL EGF-supplert vekstmedium.
- Overfør cellesuspensjonen til en brønn på den merkede 12-brønnsplaten (figur 2C). Skyll røret med ytterligere 500 μL av EGF-supplert vekstmedium og legg det til brønnen (totalt volum på 1 ml per brønn).
- Gjenta trinn 3.8 og 3.9 med alle andre prøver.
- Vugg brønnplaten tre ganger forsiktig (frem og tilbake, venstre og høyre). Plasser platen i inkubatoren (37 °C, CO2).
MERK: Hvis transgene mus brukes, utfør genotyping for hvert dyr (figur 2D). Identifiser Cre recombinase positive og negative mus og merk platen tilsvarende. For denne protokollen ble bare celler av Cre recombinase positive reportermus brukt til de neste trinnene. Celler av Cre-negative prøver fryses og brukes til andre applikasjoner.
4. Vekstfase
MERK: Vekstfasen har en varighet på ca. 4-5 dager (figur 1B). For å tilsette væsker til brønner som inneholder celler, må pipetten peke på brønnens vegg, og væsken må frigjøres sakte for å unngå celleløsning. Ikke pipette direkte på toppen av cellene.
- En dag etter dissosiasjon, fjern mediet og tilsett 1 ml fersk EGF-supplert vekstmedium.
- På dag 3, fjern mediet og tilsett 1 ml HBSS (romtemperatur) for å fjerne celleavfall. Vugg forsiktig frem og tilbake fra venstre til høyre. Fjern HBSS, gjenta vasketrinnet og tilsett 1 ml forvarmet EGF-supplert vekstmedium.
- Overvåk cellene hver dag og evaluer vekststatusen til cellene når 90% -100% sammenløp. Figur 3 viser et eksempel på god MG-vekst over tid. Sjekk for mulig kontaminering eller celledød (supplerende figur 1). Kast bort forurensede kulturer.
MERK: For å overvåke og registrere celletilstand, ta bilder med forskjellige forstørrelser ved hjelp av et lysmikroskop med et tilkoblet kamera og 4x, 10x eller 20x mål. I denne studien brukes et fluorescensmikroskop.
5. Fremstilling av deksler med poly-L-ornitin (Poly-O) og Laminin-belegg
MERK: Dette trinnet er bare nødvendig hvis immunfluorescerende merking og konfokal laserskanningsmikroskopi utføres. Runde glassdeksler (12 mm diameter) kreves for riktig avbildning. Beleggprotokollen finnes også i databladet for nevronmedium (se Materialtabell).
- Plasser sterile deksler forsiktig i midten av hver brønn på en 24-brønns plate ved hjelp av sterile Dumont-#2AP tang.
MERK: Plasser deksler i midten av brønnen. Plassering av deksler nær veggen til en brønn vil forårsake overflatespenningsproblemer for følgende trinn. - Tin en 2,5 ml Poly-O aliquot ved romtemperatur og plasser 100 μL av den i midten av hver dekslipp.
- Inkuber brønnplaten i 30 minutter i en inkubator på 37 °C.
- Fjern Poly-O og vask brønnen med dekslippen tre ganger med ~ 1 ml sterilt vann.
- La brønnplaten tørke over natten i BSC. Tin 2,5 ml Laminin ved 4 °C over natten.
- Neste morgen tilsetter du 100 μL Laminin i midten av hvert omslag og ruger i 4 timer i en 37 °C inkubator.
- Fjern Laminin forsiktig og helt.
- Hold platen på 4 °C hvis passering ikke kan utføres umiddelbart.
MERK: De belagte dekslene i preparerte plater kan oppbevares i noen dager ved 4 °C.
6. Cellepassasje for å fjerne nevronale overlevende
MERK: Cellepassasje er nødvendig for å fjerne nevronceller, ikke for å øke cellepopulasjonen. Glia deler seg bare noen få ganger og vil ikke vokse videre etter passering. Ikke fortynn cellesuspensjoner. Cellene i en sammenflytende brønn på en 12-brønns plate kan fordeles på en brønn av en 12-brønns plate eller to brønner av en 24-brønns plate. Når belagte deksler brukes, er bare omtrent en tredjedel av dekslippen belagt. Derfor kan seks deksler som sitter i en 24-brønns plate, med konfluente celler (~ 80% -90%) oppnås fra en brønn med konfluente celler i en 12-brønns plate. Andre forhold kan også velges for å øke eller redusere celletettheten. For denne protokollen brukes en Cre + reportermus [ett eksperiment, to behandlinger: miR-25 eller control-miR; tekniske replikasjoner n = 3 (tre coverlips per behandling), biologisk replikasjon n = 1]. Antall tekniske og biologiske replikasjoner kan defineres forskjellig avhengig av eksperimentell design.
- Kontroller om cellene er 90% -100% sammenflytende (også i brønnens margin; Figur 3E,F).
- Fjern mediet og tilsett 1 ml HBSS (romtemperatur) for å vaske. Vugg platen forsiktig (frem og tilbake, venstre og høyre). Fjern HBSS helt.
- Tilsett 500 μL av en forvarmet trypsinholdig løsning (forvarmet ved 37 °C i et metallperlebad) for å løsne cellene fra brønnen. Vugg forsiktig (frem og tilbake, fra venstre mot høyre) og rug i 2 minutter i en inkubator på 37 °C.
- Flytt platen fra inkubatoren til BSC. Mens du vipper, aspirer den trypsinholdige løsningen og spre den forsiktig og sakte over brønnen flere ganger til cellene løsner helt. Hold platen mot lyset og sørg for at ingen celler er igjen i bunnen.
- Overfør denne cellesuspensjonen til et sterilt rør på 1,5 ml. Sentrifuge ved 300 x g i 8 min ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten forsiktig ved å tilsette 600 μL (100 μL per brønn for 6 brønner/deksler) forvarmet vekstmedium (supplert med EGF; 1:1000). og pipettering opp og ned ~30-40 ganger.
MERK: Cellene kan fryses på dette tidspunktet ved -80 ° C eller i flytende nitrogen og tines etter standardprotokoller for tining av cellelinjer. Hvis celler fryses, vil de ikke bli resuspendert i EGF-supplert medium (vekstmedium). De vil bli resuspendert i basisk medium (uten EGF) og fryseløsning (1/1 forhold). Trinn 6.1.1 til 6.6.2 beskriver trinnene for å fryse cellene. Hvis ingen celler er frosset, fortsetter du med trinn 6.7.- Forbered fryseoppløsning ved å blande 100 μL DMSO og 400 μL FBS (totalt volum på 500 μL per brønn / prøve).
- Resuspender cellepelleten i 500 μL forvarmet vekstmedium. Tilsett cellesuspensjonen til 500 μL DMSO/FBS fryseoppløsning (totalt volum på 1 ml). Hold rørene på is til alle prøvene er behandlet. Frys ned celler ved -20 °C i 1 time, og oppbevar deretter ved -80 °C.
- Frøceller ved å plassere 100 μL av 600 μL celle/ media suspensjon (trinn 6.6) i midten av seks belagte deksler (se trinn 5) av 24-brønnsplaten. Plasser platen forsiktig i inkubatoren og la cellene slå seg ned.
MERK: 100 μL av 600 μL celle suspensjon (høstet fra en brønn av en 12-brønn plate) vil resultere i 90% -100% cellekonfluens, som er nødvendig for transfeksjon. - Kontroller cellene etter 3 timer for å se om de har satt seg på dekslippen. Tilsett 400 μL vekstmedium supplert med EGF.
MERK: Cellene er vanligvis klare for transfeksjon neste dag (figur 3G). Hvis ikke sammenflytende (90% -100%), la dem stå en annen dag. Hvis det fortsatt ikke er sammenflytende, ikke bruk dem til transfeksjon. Hvis andre nedstrømsapplikasjoner utføres, for eksempel miRNA-profilering, RNA-Seq, RT-qPCR eller western blot, må celler føres inn i 12-brønnsplater (1: 1-forhold, ingen platebehandling nødvendig) og høstes for RNA / proteinekstraksjon.
7. Transfeksjon
MERK: Transfeksjonsfasen består av en 3 timers fase bare i transfeksjonsmedium (transfeksjonsprosedyrer er beskrevet i transfeksjonshåndboken som følger med transfeksjonsreagenset) og en langstrakt fase der transfeksjonsreagens og miRNA fortsatt er tilstede, men nevronmedium med nødvendige kosttilskudd tilsettes (total varighet er 2 dager; Figur 1B). I denne protokollen skal seks brønner transfekteres: Tre brønner skal omprogrammeres miRNA miR-25 og tre brønner skal få kontrollmiRNA.
- Kontroller om cellene nådde 90% sammenløp og ta opp / bilde cellene før transfeksjon.
- Fjern vekstmediet og tilsett 500 μL HBSS (romtemperatur) for å vaske cellene.
- Fjern HBSS og tilsett 400 μL redusert serummedium som brukes til transfeksjoner. Plasser platen tilbake i en inkubator på 37 °C.
- Forbered transfeksjonsblandingen ved å følge instruksjonene i produsentens transfeksjonsreagensprotokoll. Lag to blandinger: transfeksjonsreagensblanding og miRNA-blanding (se figur 1B for illustrasjon).
- Forbered transfeksjonsreagensblandingen: For en 24-brønns plate kreves 49 μL redusert serummedium og 1 μL transfeksjonsreagens for en brønn (totalt 50 μL). For seks brønner kombineres og blandes 294 μL redusert serummedium og 6 μL transfeksjonsreagens ved forsiktig pipettering opp og ned.
- Forbered miRNA-etterligningsblanding: For en 24-brønns plate er det nødvendig med et totalt volum på 50 μL av etterligningsblandingen for en brønn. Tre brønner vil motta kontrollmiRNA og de tre andre brønnene vil bli behandlet med miR-25. For denne protokollen brukes en 200 nM endelig konsentrasjon.
- For miR-25-behandlingen (tre brønner) kombineres og blandes 150 μL redusert serummedium og 3 μL miR-25 mimics (100 μM lagerløsning) godt ved forsiktig pipettering opp og ned. Rug i 5 min.
For kontrollhermerbehandlingen (tre brønner) kombineres og blandes 150 μL redusert serummedium og 3 μL kontroll-miRNA-etterligninger (100 μM stamløsning) godt ved forsiktig pipettering opp og ned. Rug i 5 min.
MERK: Volumet av miRNA-etterligninger avhenger av fortynningsfaktoren og konsentrasjonen som trengs (20-500 nM). miRNA-hemmere (antagomiRer), eller andre molekyler inkludert plasmider, kan også brukes. Også kombinasjoner av molekyler er mulig å bli transfisert.
- For miR-25-behandlingen (tre brønner) kombineres og blandes 150 μL redusert serummedium og 3 μL miR-25 mimics (100 μM lagerløsning) godt ved forsiktig pipettering opp og ned. Rug i 5 min.
- Kombiner miRNA etterligne blanding og transfeksjon reagens blanding. Bland forsiktig ved å pipettere sakte og grundig ved å pipettere forsiktig opp og ned. Rug i 20 minutter ved romtemperatur (i henhold til produsentens instruksjoner).
- Tilsett ovennevnte transfeksjonsblanding dråpevis og sakte på toppen av cellene, nær medieoverflaten i brønnen ved hjelp av en 20 μL pipette. Vugg platen forsiktig (frem og tilbake, fra venstre til høyre).
- Rug i en 37 °C inkubator i 3 timer.
- Etter 3 timer, tilsett nevronmedium til brønnene (500 μL per brønn) supplert med 4-Hydroxytamoxifen (5 mM lager rekonstituert med 2,58 ml etanol, 250 nM endelig konsentrasjon) for å aktivere Cre rekombininase og 5-ethynyl-2'-deoksyuridin (EdU, 10 mM stamløsning rekonstituert med 2 ml DMSO, 1 μM endelig konsentrasjon) for å spore celleproliferasjon.
FORSIKTIG: 4-Hydroxytamoxifen og EdU er kjent for å være humane kreftfremkallende stoffer, teratogener og mutagener. Les sikkerhetsdatablad før bruk og bruk hansker, vernebriller og laboratoriefrakk. Rekonstituer begge reagensene i henhold til produsentens anbefalinger. Ikke inhaler stoffet/blandingen. Tett lukk etter bruk. Avfall må kastes i henhold til nasjonale og lokale forskrifter. Vask hender og ansikt etter arbeid med stoffet. - Inkubere i en 37 °C inkubator i 2 dager (figur 1B).
8. Celle konvertering
MERK: Cellekonverteringsfasen har en varighet på omtrent 5-6 dager (figur 1B), men lengre perioder er mulig.
- Kontroller celler daglig for vellykket induksjon av tdTomato-uttrykk, potensiell celledød og / eller forurensning. Celletettheten endres ikke (figur 4). Første svake røde fluorescerende merkede celler kan observeres 1 dag etter 4-Hydroxytamoxifen behandling. Et fluorescerende mikroskop er nødvendig for å overvåke og avbilde cellene.
MERK: I denne studien brukes et fluorescensmikroskop til levende bildebehandling. Bilder er tatt med 4x, 10x eller 20x mål. - To dager etter transfeksjon, fjern mediet og tilsett 500 μL forvarmet nevronmedium supplert med 4-hydroksytamoxifen og EdU i hver brønn.
- Bytt ut mediet med et friskt medium annenhver dag til cellene høstes.
- Ta levende bilder for evaluering og vurdering av antall røde fluorescerende (Ascl1-uttrykkende) celler og deres morfologiske endringer (figur 4 og figur 5A-C).
9. Cellehøsting: fiksering for immunfluorescerende merking
MERK: Celler kan høstes for andre nedstrømsapplikasjoner, inkludert bulk eller scRNA-Seq, RT-qPCR eller western blot.
- Fjern mediet og tilsett 500 μL kald HBSS (4 °C) per brønn og vugg platen forsiktig (frem og tilbake, fra venstre til høyre). Fjern HBSS.
- Fest cellene ved å tilsette 500 μL 2% Paraformaldehyd (PFA) og inkubere i 20 minutter ved romtemperatur.
- Utfør immunfluorescerende merking i henhold til etablerte protokoller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver hvordan du dyrker MG fra P12 musehinner og hvordan du omprogrammerer disse cellene med miR-25 til retinale nevroner ved hjelp av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC reportermus. Denne metoden ble brukt i tidligere arbeidsrapportering i detalj andre egnede miRNA (etterligner eller hemmere, som enkeltmolekyler eller i kombinasjon) for å omprogrammere MG til RPC som deretter vedtar nevroncelleegenskaper27. Denne metoden har blitt modifisert for å dyrke kulturer raskere og dermed minimere de cellulære endringene forårsaket av det kunstige miljøet over tid 24,28,29.
Retinal dissosiasjon og vekstfase av primære MG-kulturer
Den første MG kan oppdages så tidlig som dag én in vitro ved hjelp av et lysmikroskop. MG har en rørformet, langstrakt form og lysegrå cellelegemer (Figur 3A-D, røde pilspisser). De fleste av dem er imidlertid dekket av cellulært rusk i disse tidlige stadiene. MG fra to netthinner av en mus, vokst i en brønn av en 12-brønns plate, når 90% -95% samløp innen 4-5 dager (figur 3E, F). Over tid vil alle neuronale rusk bli ryddet, og et tett cellelag vil være til stede. Celler er ikke klare for passasje hvis bunnen av brønnen ikke er helt sammenflytende. Passasje bør imidlertid ikke gjøres senere enn 6 dager in vitro siden glia mister sine glialegenskaper i kulturen over tid. Før transfeksjon eller annen behandling, må cellene kontrolleres for tetthet og vitalitet. Transfeksjon skal kun utføres på 90%-95% konfluente celler (figur 3G). For immunfluorescerende merking og konfokal mikroskopianalyse må celler sås på belagte deksler.
Tidlig og sen fase av cellekonverteringsperioden
Så tidlig som 15 timer etter transfeksjon og 4-Hydroxytamoxifen behandling, begynner de første cellene å uttrykke svak rød fluorescens, dvs. tdTomato rød fluorescerende reporter protein drevet under (aktivert) Ascl1 promotor. Ascl1-uttrykkende celler blir nå videre referert til som Ascl1-Tom + -celler. Mer robust Ascl1-Tom-ekspresjon kan observeres 2 dager etter transfeksjon med økende rød fluorescens over tid (figur 4). Omprogrammeringseffekten blir synlig rundt 2 dager i kultur med mange Ascl1-Tom+ celler per felt funnet i omprogrammering av miRNA-behandling: vist her for henholdsvis control-miR og miR-25 (Figur 4B-B''' og Figur 4C-C'''). I begge behandlingene er Ascl1-Tom+ celler fortsatt ganske runde og relativt store, med en mer glia/stamcellelignende morfologi. Videre påvirker induksjonen av den røde fluorescerende reporteren ikke kulturens celletetthet (fortsatt 90% -95% sammenflytende).
Tre til fem dager etter transfeksjon (figur 4A og figur 5A) blir økningen i antall Ascl1-Tom+-celler tydeligere i de miR-25 behandlede brønnene (figur 5B-D) som viser en firedobling i antall etter miR-25-behandlinger sammenlignet med kontrollpersoner. Videre blir de første morfologiske endringene synlige. Disse endringene inkluderer reduksjon av celle soma størrelse og utvikling av fine prosesser. Mens de aller fleste cellene er store og flate (glial/stamfarlignende, Figur-5B-B''), vises mange celler med små kjerner og flere små prosesser som ligner retinale nevroner i miR-25-behandlingen (Figur- 5C-C''). Disse nevronlignende cellene representerer omtrent 70% av den totale Ascl1-Tom-populasjonen (15% i kontrollbehandling; Figur 5E). Cellene er mindre tette på grunn av cellekonvertering (mindre celler krever mindre plass). Interessant nok ser disse nevronlignende cellene til og med ut til å danne små nettverk (figur 5C''). På dette tidspunktet kan celler høstes for immunfluorescerende merking for å bekrefte nevronidentitet.
Bekreftelse av nevronidentitet
Celler er merket med antistoffer mot mikrotubuli-assosiert protein 2 (Map2), en markør for nevronspesifikke cytoskeletale proteiner30,31, og mot Orthodenticle homeobox 2 (Otx2) for å validere nevronidentitet32,33. Begge markørene ble også brukt i tidligere omprogrammeringsstudier21,27. Otx2 er en transkripsjonsfaktor som finnes i RPC 34,35,36, modne bipolare celler 34,35,37,38,39 og fotoreseptorer 35,36,37,38,40 . DAPI kjernefysisk merking brukes til å motvirke kulturene. Immunfluorescerende merking viser lite til fraværende Map2- eller Otx2-uttrykk under kontrollforhold (figur 6A-A''', C). MiR-25 behandlede prøver har imidlertid mange Map2+ og Otx2+-celler (figur 6B-B'''). Kvantifisering av konfokale bilder viser at etter miR-25-overekspresjon er ca. 40 nevronceller per felt tilstede sammenlignet med fem nevronceller per felt i kontroller (figur 6C, feltstørrelse: 630 μm x 630 μm). Bildene ble tatt med 20x objektiv. Disse nevroncellene utgjør ca. 70 % av den totale Ascl1-Tom+-cellepopulasjonen i de miR-25 behandlede prøvene (kontroll ~20 %, figur 6D). Alle nevronlignende Ascl1-Tom+ celler var Map2+ og Otx2+, som bekrefter nevronidentitet. Videre var det absolutte antallet Otx2+ og Map2+-celler høyere etter miR-25-behandlinger sammenlignet med kontroll-miRNA-behandling (miR-25: 60 celler per felt; kontroll-miR: 10 celler per felt; Figur 6E).
Samlet sett viser resultatene at MG-kulturer kan dyrkes og omprogrammeres med miRNA. miR-25-tilskudd induserer Ascl1-Tom-uttrykk i primær MG. Mange MG konverterer til RPC-er som vedtar en nevronmorfologi og uttrykker nevronmarkørene Map2 og Otx2 etter noen dager.
Figur 1: Eksperimentell design og tidsforløp for en primær Müller glia-kultur. (A) Skjematisk av Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl mus, en retinal stamfar reportermus som brukes til å spore konverteringen av Müller glia (MG) til retinale stamceller (RPC). (B) Tidsforløp for kulturperiodene som består av vekstfase (blå, 0-4/5 dager in vitro, div), transfeksjonsfase (lilla, 5/6-7/8 div) og MG-konverteringsfase (gul, starter 7/8 div). Vekstfase: Dissosierte netthinner (to netthinner av en mus) dyrkes i en brønn av en 12-brønns plate i et vekstmedium. Rundt dag 4/6 føres cellene inn i en 24-brønns plate som inneholder belagte deksler. Transfeksjonsfase: 5-7 div (1 dag etter passasje) celler transfekteres med miRNA i 2 dager i transfeksjonsmedium. Cre recombinase aktiveres med 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT). Celleproliferasjon spores med EdU. MG konverteringsfasen starter 1 dag etter transfeksjon. Celler dyrkes nå i nevronmediet til høsting (6-7 dager etter transfeksjoner, dpTF). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 Retinal dissosiasjon og genotyping. (A) Øyekopp med fjernet hornhinne, linse, iris og glasslegeme. (B) Isolerte netthinner; retinale pigmentepitelceller (RPE) fjernes etter grundig vask. (C) 12-brønns plate med dissosierte netthinner (to netthinner per brønn). (D) Utskjæring av et genotyping gelbildeeksempel. Genotyping er nødvendig for å identifisere musene som har Ascl1-drevet Cre recombinase-uttrykk og vil bli brukt til å spore cellekonvertering. Skalafelt: 1 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3 Primær Müller glia i vekstfasen. (A) Tidsforløp for kulturperioder i vekstfasen (0-4/5 dager in vitro (div)) uthevet i blått. (B-G) Levende bilder (fase) av Müller glia (MG) i vekstfase etter 1 div (B), 2 div etter medium endring (C), 3 div (D), 4 div før passasje (E,F) og 5 div, 1 dag etter passasje og før transfeksjon (G). MG-cellelegemer er indikert med røde pilspisser. Etter 3 div er kulturer 60% -80% sammenflytende (D), etter 4-5 div er kulturer 90% -100% sammenflytende og klare til å passeres (E-F). Etter passasje på coverlips må cellekulturer være 80% -90% konfluent for påfølgende transfeksjon (G). Skala barer: 50 μm (A-D), 100 μm (E), 200 μm (F). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Tidlige stadier i Müller glia-konverteringsfasen. (A) Tidsforløp for kulturperioder i konverteringsfasen uthevet i gult (starter 7/8 dager in vitro (div)). Analysetidspunktet vist i denne figuren er indikert med den røde stjernen: 7 div, 2 dager etter transfeksjon (dpTF). (B-C''') Levende bilder av Müller glia (MG)-kulturer i fase og rød fluorescens, kombinert eller enkeltrød fluorescens. Rød fluorescens visualiserer Ascl1 som uttrykker MG (tdTomato+, forkortet Ascl1-Tom), 2 dager etter transfeksjon med enten kontroll miRNA mimics (control-miR, B-B''') eller miR-25 mimics (C-C'''). Områder i B /B' og C/C' er vist i høyere forstørrelse i B''/B''', C''/C'''. Skalafelt 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Sluttstadier i Müller glia-konverteringsfasen. (A) Tidsforløp for kulturperioder i konverteringsfasen uthevet i gult (starter 7/8 dager in vitro (div)). Analysetidspunktet vist i denne figuren er indikert av den røde stjernen: 10 div, 5 dager etter transfeksjon (dpTF). (B-C'') Levende bilder av Müller glia (MG)-kulturer i fase og rød fluorescens, kombinert eller enkeltrød fluorescens. Rød fluorescens visualiserer Ascl1 som uttrykker MG (tdTomato+, forkortet Ascl1-Tom), 5 dager etter transfeksjon (pTF) med enten kontroll miRNA-etterligninger (control-miR, B-B'') eller miR-25 mimics (C-C''). Innfelt i B'/C' vises i henholdsvis høyere forstørrelse i B''/C''. (D) Det absolutte antall Ascl1-Tomato+-celler per felt (10x; 1440 μm x 1080 μm) etter kontroll-miRNA- eller miR-25-behandling, 2- og 5-dager etter transfeksjon (dpTF; n =1, fem bilder per brønn telles; gjennomsnittlig ± S.D.). (E) Prosentandel av nevronlignende Ascl1-Tomato+-celler av totalt Ascl1-Tomato+-celler per felt (10x; 1440 μm x 1080 μm) etter kontroll-miRNA- eller miR-25-behandling, 5 dager etter transfeksjon (5dpTF, n = 1, gjennomsnittlig ± S.D.). Skalafelt: 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Bekreftelse av nevronidentiteten til omprogrammerte celler. B-B''') Immunfluorescerende merking av primærmus Müller glia (MG) kulturer 5 dager etter transfeksjon behandlet med kontroll miRNA etterligner (control-miR, A-A''') eller miR-25 mimics (B-B'''). Celler ble festet med 2% paraformaldehyd (PFA) og inkubert med antistoffer mot RFP for å merke tdTomato, Map2 og Otx2 for å merke nevroner. DAPI kjernefysisk merking (blå) ble brukt til å farge alle cellekjerner. (CE) Kvantifisering (n = 1; fem bilder per omslagslip telles, gjennomsnitt ± S.D.) av det absolutte antallet Ascl1-Tom+Otx2+ Map2+-celler per felt (C), prosentandel av Ascl1-Tom+Otx2+Map2+-celler av totalt Ascl1-Tom+-celler (D), og det absolutte antallet Otx2+Map2+-celler per felt (E). Resultatene viser et høyere antall nevroner i miR-25-behandlingen sammenlignet med kontroller. Feltstørrelse: 630 μm x 630 μm. Skalafelt: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur 1: Celledød og bakteriell forurensning. (A-A'') Levende bilder av Müller glia (MG) kulturer 3 div forurenset med bakterier. Innfelt 1 i A vises i høyere forstørrelse i A' og viser atrofisk, død glia. Innfelt 2 i A er vist i A'' med levende glia. Skala barer: 100 μm. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen beskriver hvordan man dyrker MG fra dissosierte musehinner for omprogrammering av studier ved bruk av miRNA. Som vist og bekreftet i en rekke tidligere studier, er det store flertallet (80% -90%) av cellene som finnes i disse kulturer MG 20,23,24. Denne metoden er en veldig robust og pålitelig teknikk, og resultatene kan enkelt reproduseres hvis protokollen følges riktig21,27. Den vellykkede veksten og omprogrammeringseffektiviteten til kulturen avhenger imidlertid av en rekke faktorer.
For det første spiller musens alder en viktig rolle i vellykket cellevekst. Derfor, hvis MG-kulturer dyrkes fra villtypemus eller transgene mus som ligner ville typer som reportermus, er den siste alderen for å vokse sammenflytende MG-monolag P12. Ved P12 er alle retinale nevroner og MG differensiert, og ingen RPC er tilstede i netthinnen lenger. MG uttrykker modne MG-markører som glutaminsyntetase eller glutamat aspartattransportør (GLAST)20,23,41,42. Kultivert P12 MG kan fortsatt gå inn i cellesyklusen igjen når den utsettes for EGF, men antall sykluser er begrenset, om enn nok til å danne konfluente cellelag in vitro. Likevel kan det forekomme at selv P12 MG ikke vokser godt fordi EGF eller komponenter i mediet kan nedbrytes. Ufullstendig dissosiasjon (biter) kan også resultere i mindre eller forsinket MG-vekst. En viktig årsak til ufullstendig dissosiasjon er inaktivering av DNase I som brukes til retinal dissosiasjon ved hard håndtering av enzymet (rask pipettering, vortexing, etc.). Selv om cellene vokser godt til passasje, kan cellene være mindre sammenflytende etter passasje. Årsaker til dette kan være hard håndtering under passasjeprosessen som fører til økt celledød eller fordi cellene ble sådd for sparsomt. Siden glia ikke vokser mye, bør cellene være belagt i samme forhold som vokst, ikke fortynnet (i motsetning til passaging prosedyrer av immortalized celle linjer). Merk at fordi MG-kulturer vokser fra sentrum til periferi av en brønn, vil høyere celletetthet alltid bli funnet i sentrum. Det er derfor viktig å sjekke marginene til hver brønn før passering for å sikre at hele brønnen er dekket av celler. Cellekonsentrasjonsmålinger bør utføres for å sikre behandling av tilstrekkelige mengder celler.
I tillegg vil primære kulturer hentet fra mus på P6 eller yngre ikke inneholde noen MG, siden MG er i ferd med å modnes på dette tidspunktet. Dette ble vist via encellet RNA-seq analyse43. Immunfluorescerende merking med modne MG-markører i denne alderen vil også bekrefte dette. Fraksjonen av RPC-er er imidlertid betydelig på P6. Resultatene bør derfor tolkes nøye. Videre er markører som de mellomliggende filamentmarkørene vimentin og nestin ikke egnet til å identifisere primær MG siden disse markørene også uttrykkes i astrocytter 44,45,46, microglia 47,48, endotelceller og pericytter 49,50,51,52 , og er ikke MG-spesifikke. GFAP, uttrykt i retinale astrocytter, men ikke i MG av uskadede retinas, er ikke en god markør for dyrket MG. Selv om det er oppregulert i dissosiert MG på grunn av mekanisk skade under dissosiasjon, blir det nedregulert etter 3 dager i kultur28.
Siden MG deler mange RPC-markører, er den sikreste prosedyren for å sikre en robust MG-kultur å bruke mus på P12 eller eldre mus. Selv om denne protokollen beskriver kulturer hentet fra P12 mus MG, kan voksen mus MG dyrkes og omprogrammeres27. Imidlertid må mer vev per brønn belagt (fire til seks netthinner). Dette skyldes at voksen glia ikke deler seg mye, selv om det utsettes for EGF og 10% serum. Reduserte cellekontakter vil føre til celledød og celledegenerasjon (utstrakte celler, forstørrede celler). Voksen glia er et flott verktøy for samkulturparadigmer18 , og celletetthet betyr kanskje ikke så mye i disse applikasjonene. For nedstrømsapplikasjoner som transfeksjon eller transduksjon er imidlertid konfluente cellelag et krav.
Foruten nedsatt vekst, kan celledød forekomme. Hvis celledød oppstår uten åpenbare tegn, bør mykoplasmakontaminering vurderes (mykoplasmastørrelse 0,1-0,3 μm) og et mykoplasmadeteksjonssett bør brukes. Å holde hver prøve atskilt (ikke samle prøver) kan også redusere risikoen for krysskontaminering. Imidlertid kan større bakterier også overføres fra dyret og kan forårsake forurensning selv om alt arbeid gjøres i et rent, sterilt miljø. Dyppe øyebollet kort i 70% etanol og en grundig vask i ytterligere 10 cm petriskål anbefales før du dissekerer øyet. For å oppnå en vellykket kultur er det viktig å jobbe under sterile forhold siden forurensning kan skje raskt. Når bakterier, gjær eller mugg / sopp er funnet i en tallerken, selv om ikke alle brønner er berørt, går kulturen tapt. Forurensninger vil forårsake celledød (supplerende figur 1) og vil påvirke cellene, noe som resulterer i ikke-representative data.
Celledød kan også skyldes reagenser som kreves for nedstrøms applikasjoner som Poly-O (eller Poly-D-Lysine) som brukes til å belegge deksler. Disse stoffene er giftige og grundig vask er nødvendig før Laminin brukes. Deksler skal holde seg til bunnen av brønnen, ikke flyte inne i en brønn. Luftbobler må unngås. Videre er komplett belegg med Laminin avgjørende for å sikre celleadhesjon til dekslippen. Mangel på Laminin vil også føre til mindre celletetthet og/eller celledød.
For identifisering av ekte omprogrammert glia, bør reportermus og celleproliferasjonsmarkører som tillater cellesporing, for eksempel EdU eller BrdU, brukes. Siden hele netthinnen er belagt, er nevronale overlevende til stede i alle kulturer. De er imidlertid nesten helt fjernet etter passering i de fleste tilfeller. Likevel bør EdU (eller BrdU) merking utføres for å validere at nevroner stammer fra prolifererende MG / RPC og ikke er nevronale overlevende (post-mitotiske). Det lille antallet nevroner som finnes i kontrollene som brukes her, er nevronoverlevende.
Interessant nok er noen få Ascl1-Tom+ celler også til stede i kontrollbehandlingen med litt økende antall over tid. Disse cellene kan være noen ganske umodne MG uttrykke Ascl1 når isolert og dyrket. Andelen av denne Ascl1-Tom+ cellepopulasjonen er imidlertid liten. Videre uttrykker de fleste av disse Ascl1-Tom + -cellene som finnes i kontrollbehandlingen ikke Otx2 og / eller Map2 og holder en ganske flat celleform. Ingen nevrondifferensiering ser ut til å forekomme under kontrollforhold. Svært delikate nevronlignende celler som ser ut til å danne nettverk, finnes først etter miR-25-behandling.
Protokollen beskrevet her ble brukt i tidligere studier for å teste miRNA for MG-omprogrammering21,27 og har blitt modifisert litt de siste årene med hensyn til brønnplatene for å vokse glia. De dyrkes nå i 12-brønns plater, i stedet for 6-brønns plater. Konfluerende monolag kan oppnås i 12-brønns plater etter 4/5 dager (mot 6/8 dager med 6-brønns plater), og derfor reduseres den totale kulturperioden som fører til celleendring / degenerasjon. Transfeksjonstidsvinduet er også langstrakt. Regelmessige transfeksjonsprotokoller har en 3 timers transfeksjonsvarighet, hvoretter en fullstendig mediumendring må utføres for å sikre celleoverlevelse. Alle molekyler fjernes etter denne mediumendringen. I den nåværende protokollen ble tidsvinduet utvidet og lengre eksponering for miRNA ble tillatt ved å legge til 50% nevronmedium (supplert med faktorene som kreves for Cre-induksjon og celleproliferasjonssporing) til transfeksjonsreagensmediet. Cellene var sunne og ingen problemer ble oppstått med denne modifikasjonen. Det ser ut til at transfeksjonsresultatene er bedre med den langstrakte transfeksjonstiden, men det kreves flere data for å bekrefte den observasjonen.
Videre er alle trinn som kreves for immunfluorescerende merking for å utføre konfokal laserskanningsmikroskopi beskrevet her. Derfor må MG føres på glassdeksler. Siden dekslene er mindre enn arealet av en 24 brønnplate, passer bare om lag en tredjedel av cellene som vil dekke en full brønn på en 24-brønns plate på den belagte dekspen. For andre applikasjoner som qPCR, RNA-Seq eller western blots, blir celler passert i forholdet 1: 1, behandlet og høstet på ønsket tidspunkt.
Som nevnt tidligere, kan dette kultursystemet også brukes til andre applikasjoner, for eksempel for å studere glialadferd, inkludert nevrobeskyttende mekanismer, gliose og / eller for å profilere mRNA, miRNA eller proteiner av dyrket glia som ligner på studiene som brukte litt forskjellige kulturparadigmer eller arter 11,28,29,54 . Disse applikasjonene vil verken kreve nevronmedium for å sikre nevronoverlevelse etter omprogrammering, eller tillegg av EdU for å visualisere celleproliferasjon. Et lavt serummedium uten nevrontilskudd bør brukes i stedet.
Selv om denne metoden er robust og pålitelig, i likhet med alle primære kultursystemer, har den begrensninger; Disse er begrenset levetid for cellene, progressiv celledegenerasjon over tid28, og det faktum at det er et 2-dimensjonalt, kunstig kultursystem som ikke kan etterligne den fysiologiske konteksten med hensyn til både andre retinale celletyper og ekstracellulær matrise. Derfor, etter å ha identifisert toppkandidater og deres mest effektive konsentrasjoner i MG primære kulturer, bør retinal explant kulturer, et 3-dimensjonalt kultursystem som ligner retinalvevet, utføres. Eksplantkulturer har også begrensede dyrkningsperioder, og celler i eksplanter degenererer også over tid. Imidlertid tillater de studiet av MG i sitt naturlige 3-dimensjonale miljø og kan utføres i ulike aldre som gjenspeiler utviklingsstadiet av dyret 23,32,55,56.
Samlet sett rapporterer denne studien om MG-kulturer som brukes til å overvåke potensialet til RPC miRNA miR-25 for å omprogrammere MG til nevronlignende celler, validert ved immunfluorescerende merking. Denne protokollen ble brukt i de tidligere arbeidene 21,24,27 og er en nåværende in vitro-metode for å studere det regenerative potensialet til MG. Totalt sett er MG primære kulturer en robust teknikk og tillater reproduserbare resultater20,21. Selv om miRNA-overekspresjon for MG-omprogrammering er beskrevet her utelukkende, kan andre faktorer som små molekyler, DNA (enten plasmider eller pakket inn i virale vektorer), antistoffer for proteinhemming32 eller spesifikke forbindelser brukes / testes i MG primære kulturer. Det er også et bredt spekter av nedstrømsapplikasjoner, inkludert miRNA-profilering24, scRNA-seq27, RT-qPCR20,21 eller western blots20. Videre tillater MG primære kulturer daglig observasjon og overvåking av cellene. Dette kan være en betydelig fordel for å bestemme tidspunkter, for eksempel for utbruddet, varigheten og / eller slutten av en viss reaksjon eller cellerespons. Migrerende eller proliferativ atferd samt skade-/celleskaderelaterte paradigmer (for eksempel global miRNA-delesjon i MG-kulturer)32 kan studeres og analyseres i MG primære kulturer for å identifisere underliggende mekanismer og veier. Derfor er MG-kulturer et veldig kraftig verktøy for å studere MG på molekylært og cellulært nivå før implementering i in vivo-systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Et patent inkludert noen av funnene i denne rapporten har blitt arkivert av University of Washington med oppfinnere Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl og Thomas A. Reh. Patentet har tittelen '' Metoder og komposisjoner for å stimulere retinal regenerering.
Acknowledgments
Forfatterne takker Dr. Ann Beaton og alle laboratoriemedlemmer for deres innspill til manuskriptet. Spesiell takk går til Dr. Tom Reh, Julia Pollak og Russ Taylor for å introdusere MG primære kulturer som et screeningsverktøy til S.G.W. under postdoktorutdanning ved University of Washington i Seattle. Studien ble finansiert av Empire Innovation Program (EIP) Grant til S.G.W. og oppstartsmidler fra SUNY Optometry til S.G.W., samt R01EY032532-prisen fra National Eye Institute (NEI) til S.G.W.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J | Jax laboratories | #012882 | Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice |
| tdTomato-STOPfl/fl mouse B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | Jax laboratories | #007914 | Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice |
| Reagents | |||
| (Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomer | Sigma-Aldrich | H7904-5MG | reconstituted in ethanol, frozen aliquots |
| 16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solution | VWR | 100504-782 | 2% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots |
| Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-546-152 | dilution 1:500 |
| Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 705-606-147 | dilution 1:500 |
| Anti-human Otx2 Antibody, R&D Systems | Fisher Scientific | AF1979 | dilution 1:500 |
| Anti-rabbit MAP2 antibody | Sigma-Aldrich | M9942-200UL | dilution 1:250 |
| Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibody | Antibodies-Online | ABIN334653 | dilution 1:500 |
| Ascorbic Acid | STEMCELL Technologies | 72132 | reconstituted in PBS, frozen aliquots |
| B-27 Supplement | Fisher Scientific | 17-504-044 | frozen aliquots |
| Brain Phys Neuronal Medium | STEMCELL Technologies | 05790 | used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) |
| Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging Kit | Fisher Scientific | C10340 | reconstitute following manual, 4°C |
| Dibutyryl-cAMP | STEMCELL Technologies | 73886 | reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | MT-25950CQC | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fisher Scientific | MT35010CV | frozen aliquots |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX Supplement | Fisher Scientific | 51-985-034 | store at 4 °C |
| Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Fisher Scientific | 12-605-028 | used as solution containing trypsin, store at 4 °C |
| HBSS | Fisher Scientific | 14-025-134 | store at 4 °C |
| Laminin mouse protein, natural | Fisher Scientific | 23-017-015 | frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. |
| L-Glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control | Horizon | CN-001000-01-50 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic | Horizon | C-310564-05-0050 | reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots |
| N-2 Supplement | Fisher Scientific | 17-502-048 | frozen aliquots |
| Neurobasal Medium | Fisher Scientific | 21-103-049 | used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C |
| Papain Dissociation System | Worthington Biochemical | LK003153 | reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific | 15-140-122 | frozen aliquots |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | 20-012-043 | |
| Poly-L-ornithine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P4538-50MG | reconstituted in steriled water, frozen aliquots |
| Recombinant Human BDNF Protein | R&D Systems | 248-BDB-050/CF | reconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots |
| Recombinant Mouse EGF Protein | Fisher Scientific | 2028EG200 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Recombinant Rat GDNF Protein | Fisher Scientific | 512GF010 | reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots |
| Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 712-296-150 | dilution 1:1,000 |
| Slide Mounting Medium | Fisher Scientific | OB100-01 | |
| Transfection Reagent (Lipofectamine 3000) | Fisher Scientific | L3000015 | store at 4 °C |
| plasticware/supplies | |||
| 0.6 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-120 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-129 | |
| 10 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-439 | |
| 100 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-431 | |
| 1000 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-404 | |
| 2.0 mL microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 50-408-138 | |
| 20 µL TIP sterile filter Pipette Tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL) | Eppendorf | 2231300008 | |
| Disposable Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-669-12 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24 | Fisher Scientific | 08-772-1 | |
| PIPET sterile filter 10ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10J | |
| PIPET sterile filter 50ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10Q | |
| PIPET sterile filter 5ML Disposable Serological Pipets | Fisher Scientific | 13-676-10H | |
| Powder-Free Nitrile Exam Gloves | Fisher Scientific | 19-130-1597B | |
| Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness) | Fisher Scientific | 22293232 | |
| Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µm | Fisher Scientific | 09-761-106 | |
| equipment | |||
| 1300 B2 Biosafety cabinet | Thermo Scientific | 1310 | |
| All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810 | Keyence | 9011800000 | |
| Binocular Zoom Stereo Microscope | Vision Scientific | VS-1EZ-IFR07 | |
| Disposable Petri Dishes (100 mm diameter) | VWR | 25384-088 | |
| Dumont #5 Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11252-40 | |
| Dumont #55 Forceps - Biologie/Inox | Fine Science Tools | 11255-20 | |
| Dumont #7 curved Forceps - Biologie/Titanium | Fine Science Tools | 11272-40 | |
| Eppendorf Centrifuge 5430 R | Eppendorf | 2231000508 | |
| Fine Scissors-sharp | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| McPherson-Vannas Scissors, 8 cm | World Precision Instruments | 14124 | |
| Metal bead bath | Lab Armor | 74309-714 | |
| Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpm | VWR | 82007-202 | |
| Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter) | Living Systems Instrumentation | DD-ECON-90-BLK-5PK | |
| Tweezers, economy #5 | World Precision Instruments | 501979 | |
| Water Jacketed CO2 Incubator | VWR | 10810-744 |
References
- Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
- Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
- Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
- Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
- Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
- Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
- Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
- Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
- Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
- Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
- Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
- Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
- Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
- Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
- Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
- Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
- Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
- Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
- Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
- Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
- Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
- Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
- Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
- Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
- Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
- Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
- Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
- Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
- Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
- Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
- Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
- Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
- Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
- Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
- Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
- Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
- Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
- VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
- Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
- Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
- Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
- Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
- Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
- Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
- Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
- Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
- Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
- Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
- Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
- Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).
