Summary
中性子後方散乱分光法は、タンパク質とその水和水のps-nsダイナミクスへの非破壊でラベルフリーのアクセスを提供します。このワークフローには、アミロイドタンパク質に関する2つの研究、すなわち凝集中のリゾチームの時間分解ダイナミクスと、繊維形成時のタウの水和水ダイナミクスに関する研究が提示されています。
Abstract
中性子散乱は、重水素以外の標識なしに、非破壊的な方法で広範囲のエネルギーのサンプル内のダイナミクスをプローブする可能性を提供します。特に、中性子後方散乱分光法は、複数の散乱角度で同時に散乱信号を記録し、ps-nsタイムスケールでの生物系のダイナミクスの研究に適しています。D2Oおよび場合によっては重水素化緩衝液成分を使用することにより、この方法は、液体状態のタンパク質の重心拡散と骨格および側鎖運動(内部ダイナミクス)の両方をモニタリングすることを可能にする。
さらに、水和水の動態は、H2Oで水和された過重水素化タンパク質の粉末を使用することによって研究することができる。この論文では、タンパク質と水分補給の水動態を調査するために、ラウエランジュバン研究所(ILL)の装置IN16Bで採用されたワークフローを紹介します。蒸気交換を用いた溶液サンプルおよび水和タンパク質粉末サンプルの調製について説明する。タンパク質と水和水ダイナミクスの両方のデータ解析手順は、中性子後方散乱分光計で取得できるさまざまなタイプのデータセット(準弾性スペクトルまたは固定ウィンドウスキャン)について説明されています。
この方法は、アミロイドタンパク質を含む2つの研究で示されています。リゾチームのμmサイズの球状凝集体(微粒子と表記)への凝集は、IN16Bで調査された空間および時間範囲でのワンステッププロセスで発生することが示されていますが、内部ダイナミクスは変化しません。さらに、タウの水和水の動態を過重水素化タンパク質の水和粉末で研究した。水の並進運動はアミロイド線維の形成時に活性化されることが示されている。最後に、他の実験的生物物理学的方法に関するダイナミクスの研究に関して中性子散乱がどのように位置付けられているかに関して、プロトコルの重要なステップが議論されます。
Introduction
中性子は電荷のない巨大な粒子であり、基礎物理学から生物学まで、さまざまな分野のサンプルを調べるために長年にわたって成功裏に使用されてきました1。生物学的用途では、小角中性子散乱、非弾性中性子散乱、中性子結晶構造解析および反射率測定が広く使用されています2,3,4。非弾性中性子散乱は、特定の標識自体を必要とせずにダイナミクスのアンサンブル平均測定を提供し、サイズやタンパク質に依存しない信号品質を提供します5。測定は、重水素化細菌ライセートやin vivoなどの細胞内培地を模倣する研究中のタンパク質の非常に複雑な環境を使用して行うことができます3,6,7。ダイナミクス、すなわち、i)飛行時間によるサブps-psダイナミクスへのアクセス、ii)後方散乱によるps-nsダイナミクスへのアクセス、iii)nsから数百nsまでのダイナミクスへのアクセスなど、さまざまな実験セットアップを使用してダイナミクスを研究することができます。中性子後方散乱は、ブラッグの法則2d sinθ = nλを利用しており、dは結晶内の平面間の距離、θは散乱角、nは散乱次数、λは波長です。検出器への後方散乱に結晶を使用することで、エネルギーの高分解能(通常~0.8μeV)を達成することができます。エネルギー交換を測定するには、後方散乱で結晶を運ぶドップラードライブを使用して入射中性子波長8、9、10を定義および調整するか(図1)、エネルギー分解能の低下を犠牲にして飛行時間型セットアップを使用できます11。
図1:ドップラー駆動の中性子後方散乱分光計のスケッチ。入射ビームは位相空間変換(PST)チョッパ42に当たり、試料位置における磁束を増加させる。次に、ドップラードライブによってサンプルに向かって後方散乱され、ドップラードライブはエネルギーE1(シアンの矢印)を選択します。次に、中性子はサンプルによって散乱され(矢印の色で表される異なるエネルギーで)、Si 111結晶で作られた分析装置は、特定のエネルギーE0(ここでは赤い色の矢印)の中性子のみを後方散乱します。したがって、運動量移動qは検出器アレイ上の中性子の検出位置から得られ、エネルギー移動は差E1-E0から得られます。PSTによって生成された中性子パルスに予想される飛行時間は、検出器管に向かって直接散乱された中性子からの信号を破棄するために使用されます。略語:PST =位相空間変換。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
後方散乱分光法では、タンパク質などの水素プロトンに富むサンプルからのシグナルへの主な寄与は、散乱強度Sinc(q、ω)が式(1)12で示されるインコヒーレント散乱から来ています
(1)
ここでσincは考慮される元素のインコヒーレント断面であり、k'は散乱波ベクトルのノルム、kは入射波ベクトルのノルム、q(= k - k')運動量移動、r j(t)時間tにおける原子jの位置ベクトル、ωは入射中性子と系との間のエネルギー移動に対応する周波数である。角括弧はアンサンブル平均を示します。したがって、インコヒーレント散乱は、原子位置のアンサンブル平均単粒子自己相関を時間とプローブし、システム内のすべての原子と異なる時間起源(アンサンブル平均)で平均化された自己ダイナミクスを提供します。散乱関数は、中間散乱関数 I(q, t) のときのフーリエ変換であり、式 (2) で示されるファンホーブ相関関数の空間でのフーリエ変換と見なすことができます。
(2)
ここで、ρ(r,t)は、位置rと時間t13で原子を見つける確率密度です。
フィッキアン拡散過程の場合、自己拡散関数は、γ = Dq2で与えられる線幅のローレンツ分布からなる散乱関数の二重フーリエ変換の後に生じます(式(3)を参照)。
(3)
より洗練されたモデルが開発され、ps-ns内部タンパク質ダイナミクス14のSingwiとSjölanderによるジャンプ拡散モデルや、水和水15,16,17のSearsによる回転モデルなど、有用であることがわかりました。
フランスのグルノーブルにあるILLの中性子後方散乱(NBS)装置IN16B 8,9(補足図S1)では、タンパク質で一般的に使用されるセットアップは、入射波長を調整するためのドップラードライブを備えたアナライザー用のSi 111結晶で構成され(補足図S2A)、それによって運動量伝達範囲~0.2 Å-1 < q < ~2 Å-1および-30 μeVのエネルギー伝達範囲にアクセスできます< 
< 30μeV-数psから数nsの範囲のタイムスケールと数Åの距離に対応します。さらに、IN16Bは、固定エネルギー伝達でのデータ収集を含む弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン(E/IFWS)10を実行する可能性を提供します。中性子を扱う場合、磁束が制限されるため、E/IFWSは1回のエネルギー伝達で磁束を最大化できるため、満足のいく信号対雑音比を得るために必要な取得時間を短縮できます。より最近のオプションは、後方散乱および飛行時間型分光計(BATS)モード11であり、ドップラー駆動よりも高い磁束で、広範囲のエネルギー移動(例えば、-150μeV<< 150μeV)の測定を可能にしますが、エネルギー分解能は低くなります(補足図S2B)。
中性子散乱の重要な特性は、インコヒーレント断面積σincが水素に対して重水素よりも40倍高い値を持ち、生物学的サンプルに一般的に見られる他の元素に対しては無視できることです。したがって、液体環境におけるタンパク質の動態は、重水素化緩衝液を用いて研究することができ、粉末状態は、D2Oで水和した水素化タンパク質粉末によるタンパク質内部動態の研究、またはH2Oで水和した過重化タンパク質粉末の水和水の研究を可能にする。液体状態では、中性子後方散乱は通常、タンパク質の重心自己拡散(フィッキアン型拡散)とその内部ダイナミクスに同時にアクセスすることができます。後者は、通常、いわゆるジャンプ拡散モデルなどによって記述されるバックボーンおよびサイドチェーン運動です3,18。水素化タンパク質粉末では、タンパク質の拡散は存在せず、内部ダイナミクスのみをモデル化する必要があります。水和水の場合、水分子の並進運動および回転運動の寄与は、運動量移動qに対して異なる依存性を示し、これは、データ分析プロセスにおけるそれらの区別を可能にする17。
この論文は、β鎖のスタックからなる標準的な形に展開し、凝集し、いわゆるクロスβパターン19,20-そして細長い繊維を形成することができることが判明したタンパク質の研究による中性子後方散乱法を示しています。これはいわゆるアミロイド凝集であり、アルツハイマー病やパーキンソン病などの神経変性疾患における中心的な役割のために広く研究されています21,22。アミロイドタンパク質の研究は、それらが果たすことができる機能的役割23,24または新規生体材料の開発のためのそれらの高い可能性によっても動機付けられています25。アミロイド凝集の物理化学的決定要因は依然として不明であり、過去数年間の驚異的な進歩にもかかわらず、アミロイド凝集の一般理論は利用できません21,26。
アミロイド凝集は、タンパク質の構造と経時的な安定性の変化を意味し、その研究は当然、タンパク質の立体構造安定性、タンパク質機能、およびタンパク質エネルギーランドスケープに関連するダイナミクスを意味します27。ダイナミクスは、最速の運動28のエントロピー寄与を通じて特定の状態の安定性に直接関連しており、タンパク質の機能は、光感受性タンパク質29 のサブpsからドメイン運動のmsまで、ピコ秒-ナノ秒のダイナミクス30によって促進されるさまざまなタイムスケールの運動によって維持できます。
中性子後方散乱分光法を使用してアミロイドタンパク質を研究する2つの例、1つはタンパク質のダイナミクスを研究するための液体状態、もう1つは水和水のダイナミクスを研究するための水和粉末状態の2つの例を紹介します。第1の例は、リゾチームのμmサイズの球体(微粒子と呼ばれる)への凝集に関するものであり、続いてリアルタイムで5、第2の例は、ヒトタンパク質タウ31の天然状態および凝集状態における水動態の比較に関するものである。
リゾチームは免疫防御に関与する酵素で、129個のアミノ酸残基で構成されています。リゾチームは、pD10.5および90°Cの温度で重水素化緩衝液中で微粒子を形成することができます。 中性子散乱により、リゾチームの重心拡散係数の時間発展がチオフラビンT蛍光(アミロイド交差βパターンの形成をモニターするために使用される蛍光プローブ32)の単一の指数関数的速度論に従うことを示し、粒子形成上部構造と交差βパターンが同じ速度で1つのステップで発生することを示しています。さらに、内部ダイナミクスは凝集プロセス全体を通して一定であり、これはNBS装置では観察できない速い立体構造変化、または凝集時にタンパク質の内部エネルギーに大きな変化がないことによって説明できます。
ヒトタンパク質タウは、いわゆる2N4Rアイソフォームの441アミノ酸からなる天然変性タンパク質(IDP)であり、アルツハイマー病に特に関与しています33。過重水素化タンパク質タウの粉末に対する中性子後方散乱を用いて、繊維状態で水和水ダイナミクスが増加し、並進運動を受ける水分子の集団が多いことを示しました。この結果は、水和水エントロピーの増加がタウのアミロイド細動を引き起こす可能性があることを示唆している。
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Protocol
1. 液体状態のタンパク質用の重水素化バッファーを調製します
- 緩衝液のすべての成分を純粋なD2Oに溶解する。
- pH電極をH2Oで較正した場合、NaODまたはDCl34を用いて式pD = pH + 0.4に従ってpDを調整する。
注:H2Oの代わりにD2Oを使用すると、タンパク質の溶解度に影響を与える可能性があり、緩衝条件を適応させる必要がある場合があります(たとえば、塩濃度のわずかな変化によって)。
2.過重水素化タンパク質のH2O水和粉末を調製する
- サンプルホルダーを準備します。
- インジウムワイヤーシールとネジで平らなアルミニウムサンプルホルダーを水とエタノールで完全に洗浄し、乾燥させます。
注:粉末を表面全体に均一に分布させることができるように、平らなサンプルホルダーが使用されます。粉末の量は、壁の間に維持でき、サンプルホルダーを垂直に置いたときに落下しないように十分である必要があります。 - サンプルホルダーのさまざまな部分(底部、蓋、インジウムワイヤー)を精密天びんで別々に計量します。
- サンプルホルダーの底部の溝に1mmのインジウムワイヤーシールを配置し、両端が結合する場所に小さな重なりを残します(図2A)。
- 適量の凍結乾燥タンパク質(通常~100 mgのタンパク質)を、サンプルホルダーの底部の内面を満たすように配置します。
- インジウムワイヤーシールとネジで平らなアルミニウムサンプルホルダーを水とエタノールで完全に洗浄し、乾燥させます。
- プロテインパウダーを水和させます。
- サンプルホルダーをP2O5粉末を含むペトリ皿を備えたデシケーターに24時間置き、タンパク質粉末35を完全に乾燥させます(図2B)。インジウムシールと乾燥粉末とを含むサンプルホルダーの乾燥底部を秤量し、m乾燥を得る。
注意:P2O5 粉末は非常に腐食性があります。 - デシケーターからP 2 O5を取り出し、D2Oが入ったペトリ皿を中に入れる。粉末の質量を定期的に制御して、水和レベルh = mhyd / mdryを確認します(mhydとmdryはそれぞれ水和粉末と乾燥粉末の質量です)。
注:インスリンなどの疎水性の高いタンパク質の場合、デシケーター内の温度を上げて蒸気圧を高め、目的の水和レベルhに達する必要がある場合があります。 - 手順2.2.1と2.2.2を少なくとも3回繰り返して、交換可能なすべての水素を重陽子に正しく変換します。
注:あるいは、タンパク質がそれによって影響を受けない限り、凍結乾燥および純粋なD2O中での溶解のサイクルは、より良いH / D交換のために使用され得る。 - 粉末を所望のレベルよりわずかに上に水和し、インジウムワイヤーと水和粉末を有するサンプルホルダーの底部を精密天秤に残し、質量が所望の値までゆっくりと減少するのを待って目標hを得る(中型の球状タンパク質を1つの完全な水和層で覆う場合は通常0.2〜0.4)。
- 底部にすばやく蓋をし、最初に4本のネジでサンプルホルダーを閉じて蒸気交換を停止します(補足図S3A)。
- 底部と蓋の間に隙間が見えなくなるまで、残りのすべてのネジを配置して締めます(補足図S3B)。
- 密閉されたサンプルホルダーの重量を量って、中性子実験後の漏れによる潜在的な水和損失がないか確認します。
- サンプルホルダーをP2O5粉末を含むペトリ皿を備えたデシケーターに24時間置き、タンパク質粉末35を完全に乾燥させます(図2B)。インジウムシールと乾燥粉末とを含むサンプルホルダーの乾燥底部を秤量し、m乾燥を得る。
3. インコヒーレント中性子散乱実験を行う
- 実験に必要な装置の構成について、指定されたビームタイムの数週間前に現地の担当者と話し合い、再確認します。
- 液体状態サンプルを準備します。
- タンパク質を重水素化緩衝液に溶解します。
- 水を使用してサンプルホルダーに入れる液体の適切な量を決定します(サンプルホルダーを閉じたときにオーバーフローがないことを確認してください。 図2C)。
注:次の手順(3.3および3.4)は、低温炉をサンプル環境として使用して、ILL16,8,9のNBS分光計IN8,9Bで実施された実験について説明しています。機器の制御システムは機器ごとに変更されますが、動作原理は同じままです。
- サンプルを挿入します。
- サンプルスティックを完全に乾燥させ(図2D)、材料を取り扱う前に(ILLで)電離放射線量が100μSv / h未満であることを確認した後、前のサンプルがあればそれを取り除きます。
- サンプルを置き、ビームの中心に対して適切なセンタリングを確認し(補足図S4)、サンプルスティックをクライオ炉に挿入します(図2D)。真空ポンプをオンにして10〜3バール未満に到達し、次の3 回を繰り返してクライオ炉内の空気を洗い流します:大気圧に達するまでクライオファーネスにヘリウムガスを満たし、真空ポンプを使用してガスを再度除去します。
注意: フラットサンプルホルダーの場合、サンプルホルダーは入射ビームに対して45°の角度に向ける必要があります。有用な運動量伝達範囲は、セルによる吸収と散乱のために減少する可能性があります。カドミウムなどの強力な中性子吸収材を使用して、サンプルホルダーの特定の部分(ネジ、厚い部分など)をマスクできます。 - 圧力が~0.05バールになるように、クライオ炉にヘリウムガスを導入します。
- データを取得します(たとえば、ILLでIN16BでNOMADを使用すると、準弾性中性子スペクトル(QENS)スペクトルを取得する前に200 Kの温度を好むと仮定し、次に毎分0.5 Kで310 Kへの温度ランプ中にE/IFWS、最後に310 KでQENSを好むと仮定します)。
- NOMADを使用して、実行タブで、ファーネスクライオスタットコントローラーを発射台にドラッグアンドドロップします。温度を 200 K に設定します。高速モードと30分のタイムアウトを使用して、温度が安定する時間を確保します。回転矢印アイコンをクリックしてバックグラウンドで実行し、温度低下時にデータを取得できるようにします。
- IN16DopplerSettingsコントローラーをドラッグアンドドロップし、速度プロファイルを最大ΔEによって設定された正確な速度、0.00μeVの値、128チャンネルに設定して、EFWS構成を取得します。
- カウントコントローラーをドラッグアンドドロップし、データを簡単に識別できる名前を[字幕]フィールドに入力し、30秒のスキャンを60回繰り返して設定します(補足図S5A)。
- IN16DopplerSettings コントローラーをドラッグアンドドロップし、速度プロファイルを 4.5 m/s の値と 2,048 チャネルで速度によって設定されたサインに設定して、QENS 構成を取得します。
- カウント コントローラーをドラッグ アンドドロップし、 30分間のスキャンを4回繰り返し ます(補足図S5B)。
- 温度ランプの場合は、FurnaceCryostatコントローラーをドラッグアンドドロップし、温度を310 Kに設定し、ランプをΔ = 0.05 Kおよび6秒でSetPointに設定します。220分のタイムアウトを使用します(補足図S6A)。
- for ループを 65 回繰り返します。内部に、手順16のようにIN3.4.2DopplerSettingsコントローラーを挿入し、その後に30秒のシングルカウントを挿入します。続いて、前述のようにIN16DopplerSettingsを挿入しますが、1.5μeVのエネルギーオフセットと1,024チャンネルを使用し、その後に3分のシングルカウントを使用します(補足図S6B)。
- 310 Kで最後のQENSを取得するには、IN16DopplerSettingsとCountコントローラをそれぞれ手順3.4.4と3.4.5の説明に従ってドラッグアンドドロップします。
- スタートボタン(ウィンドウの下部にある直角三角形)を押して、スクリプトを実行します。
注:すべての実験では、キャリブレーションデータの取得が必要です。すなわち、減算または吸収補正のための空のセルと、バックグラウンドをモデル化するために用いられる異なる温度でのバッファーのみ、およびバナジウムの測定(または同等には、10K以下の温度のサンプル)の装置の分解能関数を得る。
4. データ分析 - QENS
- Python ソフトウェア nPDyn v3.x36 の 'IN16B_QENS.process()' メソッドを使用してデータセットをインポートします。
nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS からの>>>>
>>>サンプル = IN16B_QENS(
...<データ ファイルへのパス>
...[detGroup=<整数または XML 内の検出器グループ化ファイル
...フォーマット>]
... ).プロセス()
>>> サンプル = sample.get_q_range(0.3, 1.8) - 次のコマンドを使用してデータ修正(オプション)を実行します(詳細については、nPDynのドキュメントを参照してください、 図3)。
#it、空のセル、バナジウム、およびバッファーのデータを想定しています
#は 'empty_cell'、 'バナジウム'というデータセットにすでにインポートされています。
#と 'バッファ'をそれぞれ。
#スケーリング係数を使用した空のセル減算の場合
# (エラーは自動的に伝播されます)
>>> サンプル = サンプル - 0.95 * empty_cell
# パールマン-Ping係数を用いた補正用
#(上記の例と相互に排他的)
>>> サンプル = サンプル.吸収補正(empty_cell)
# 正規化用
>>> サンプル = サンプル.正規化(バナジウム)
# 観測可能な軸に沿ってビニングする場合
#観測可能なのはここでの集計時間です
>>> サンプル = サンプル.bin(3、軸 = 0) - キャリブレーションデータを適合させます。データセット(空のセル、空のセル、重水素化バッファー(必要な場合)、およびバナジウム)は、組み込みモデルまたはユーザー定義モデルを使用して適合できます(nPDynのドキュメントを参照)。
>>> from nPDyn.models.builtins import (
...モデルPサイズ,
...モデル水,
...モデル校正済みD2O,
... )
# 組み込みモデルは運動量の列ベクトルを使用します
# q値を転送する
>>> q = バナジウム.q[:, なし]
#バナジウムは擬似フォークトプロファイルを使用して取り付けられています
>>> vanadium.fit(modelPVoigt(q)) - 「モデルウォーター」と呼ばれる水分補給水用の内蔵モデルを使用してください。このモデルは、式(4)17に示すように読みます
(4)
ここで、0、r、およびt は、それぞれ弾性信号、回転運動、および並進運動の相対的な寄与を説明するスカラーです。j1(qd) は l次の 球面ベッセル関数で、q は運動量伝達です。d水分子中のO-H距離;δ(ω)はディラックデルタであり、ここではEISFを掛けます。N は、使用される球面ベッセル関数の最高次 (通常は ~5) です。
であり 
、 はそれぞれローレンツ回転運動と並進運動であり、b(q) は平坦な背景項である。球面ベッセル関数は、水分子の各角運動量状態の相対的な寄与を与え、数Nは運動量伝達q範囲に基づいて決定されます。典型的なNBS分光計の場合、N = 4までの項は信号をほぼ完全に説明しています(補足図S7)。
#ここで、式2は水和水に使用されます
#解像度関数と畳み込みと追加
#D2Oの背景は、
# 提供された引数
>>> sample.fit(modelWater(q),
...res=バナジウム、
...bkgd=バッファ、
...volume_fraction_bkgd=0.95
... )
注:回転運動と並進運動の寄与は、完全に厳密になるように複雑にする必要があります。加法モデルの成功は、タンパク質表面に異なる水の集団が存在し、アクセス可能なエネルギー範囲が限られていることに起因します。 - 以下を使用してデータをプロットします(図4)。
nPDyn.plotインポートプロットからの>>>
>>>プロット(サンプル)
(4)
であり 
、 はそれぞれローレンツ回転運動と並進運動であり、b(q) は平坦な背景項である。球面ベッセル関数は、水分子の各角運動量状態の相対的な寄与を与え、数Nは運動量伝達q範囲に基づいて決定されます。典型的なNBS分光計の場合、N = 4までの項は信号をほぼ完全に説明しています(補足図S7)。5.データ分析-温度ランプ、弾性固定ウィンドウスキャン(EFWS)
- セクション4と同様の手順を使用して、最低温度(通常は10 K)での信号によって温度ランプデータを正規化します。
nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS からの>>>
>>>サンプル = IN16B_FWS(
...<データファイルへのパス>、
...detGroup=[detGroup=<整数またはディテクタの XML 形式のグループ化ファイル>]
... ).プロセス()
#オブザーバブルの最初の5つのポイントによる正規化
温度に対応する#軸
>>> サンプル /= サンプル[:5].mean(0)
#ここで使用される運動量伝達Q範囲は小さいです
#使用されるモデルは低Qに対してのみ有効です
>>> サンプル = sample.get_q_range(0.2, 0.8) - 単純なガウスモデルを使用して開始し、その幅はいわゆる平均二乗変位(MSD)によって与えられます。モデルを構築し、適合するには、次のコマンドを使用します。
>>> numpy を np としてインポートする
nPDyn.models からの>>>は、パラメータ、モデル、コンポーネントをインポートします。
#aはスケール係数です
>>>パラメータ = パラメータ(
...a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
...msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
... )
>>> モデル = モデル(パラメータ)
>>> model.addComponent(Component(
...'ガウス'、
...ラムダ x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
... ))
>>> sample.fit(model, x=sample.q[:, None])
>>>プロット(サンプル)
注:ガウス近似は、q2MSD << 1に対して常に成り立ちますが、サンプル間の相対比較には、より広い運動量伝達範囲を使用できます。ガウス近似を超えるより洗練されたモデルが開発されています37,38,39。
6.データ分析-弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン(E / IFWS)
- 手順 4 と同様に、データセットをインポートしますが、'IN16B_FWS' クラスを使用します。
nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS からの>>>
>>>サンプル = IN16B_FWS(
...<データ ファイルへのパス>
...[detGroup=<整数または XML 形式の検出器グループ化ファイル>]
... ).プロセス()
>>> サンプル = sample.get_q_range(0.3, 1.8) - キャリブレーションデータとサンプルデータを適合させます。
- 一般化されたMSD40 を使用するか、粗いQENSスペクトル(エネルギー軸上に少数のデータポイントしかない)と見なすことにより、E/IFWSデータを解析します。E/IFWSを粗QENSとして見ると、QENSに使用されるモデルを使用して、E/IFWSデータセット全体を一度に適合させます(エネルギー移動と運動量移動のグローバルフィット)。
注:後者の溶液(E/IFWSデータに対するQENSの溶液使用モデル)は、ここでは、重心拡散とタンパク質内部ダイナミクスの運動量移動依存性が課される場合に使用されます。 - 以下の式(5)を用いて液体中のタンパク質動態をモデル化する(nPDynの'modelProteinJumpDiff')。
(5)
ここで、R(q,ω) は分解能関数です。β各運動量伝達qに対して独立したスカラーである。a0は弾性インコヒーレント構造係数(EISF)です。
式(6)
で与えられる幅を持つ重心拡散を説明するローレンツ。は、重心拡散と、内部ダイナミクスを説明するジャンプ拡散モデル14(式(7);サンプル中の体積分率によって再スケーリングされたD2Oからの適合信号である)
に従う寄与を含むローレンツ分布である。
γ = Dsq2 (6)
Dsは自己拡散係数である。
(7)
Diは内部ダイナミクスの見かけの拡散係数、 τ は拡散運動の緩和時間です。
>>> from nPDyn.models.builtins import (
...モデルPサイズ,
...モデルプロテインジャンプ差分、
...モデル校正済みD2O,
... )
# 組み込みモデルは運動量の列ベクトルを使用します
# q値を転送する
>>> q = バナジウム.q[:, なし]
#バナジウムは擬似フォークトプロファイルを使用して取り付けられています
>>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
#純粋なD2Oの場合、キャリブレーションされた線幅のモデル
#異なる温度のためにnPDynに含まれています
>>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))
#ここでは、式3は液体サンプルに使用されます
#解像度関数と畳み込みと追加
#D2Oの背景は、#指定された引数で自動的に行われます
>>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
...res=バナジウム、
...bkgd=バッファ、
...volume_fraction_bkgd=0.95
... )
- 一般化されたMSD40 を使用するか、粗いQENSスペクトル(エネルギー軸上に少数のデータポイントしかない)と見なすことにより、E/IFWSデータを解析します。E/IFWSを粗QENSとして見ると、QENSに使用されるモデルを使用して、E/IFWSデータセット全体を一度に適合させます(エネルギー移動と運動量移動のグローバルフィット)。
- 以下を使用して適合データをプロットします。
nPDyn.plotインポートプロットからの>>>
>>>プロット(サンプル)
(5)
式(6)
で与えられる幅を持つ重心拡散を説明するローレンツ。は、重心拡散と、内部ダイナミクスを説明するジャンプ拡散モデル14(式(7);サンプル中の体積分率によって再スケーリングされたD2Oからの適合信号である)
に従う寄与を含むローレンツ分布である。
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Representative Results
リゾチームの微粒子への凝集は、重水素化緩衝液(pD 10.5で0.1 M NaCl)中で50 mg/mLのタンパク質濃度で90°Cで実施しました。微粒子の形成は、90°Cへの温度上昇によって引き起こされ、6時間以内に発生します(補足図S8)。データ取得は、上記のプロトコルで説明されているように、IN16Bで実行されました(データはILLによって永続的にキュレーションされ、http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811 でアクセスできます)。
初期状態を完全に特徴付けるために、7°CでQENSスペクトルを取得しました。その後、温度を90°Cに上昇させ(通常、IN16Bでは~30分、 補足図S9)、集約プロセスをトリガーしました。QENSスペクトルのスライディング平均を使用して速度論を追跡できるため、エネルギー伝達の全範囲にアクセスできますが、時間の分解能は限られています。時間分解能は、4つのエネルギー伝達値5で、EFWSを使用して~1分、E/IFWSを使用して~20分に改善することができます。
提示された例では、0、0.6、1.5、および3μeVのエネルギー移動を調査しました。E/IFWSスキャンは集約プロセス中に連続的に取得され、90°Cでの最終状態のQENSスペクトルが取得されました。 E/IFWSデータは、空セルのE/IFWSを用いて吸収を補正し、バナジウムデータを用いて正規化した。
リゾチームE/IFWSでは、低運動量移動と低エネルギー移動では時間的にシグナルが増加し、高エネルギー移動と低運動量移動ではシグナルが減少します(補足図10)。この定性的観察は、より大きな物体の形成を示し、よりゆっくりと拡散し、凝集プロセスが起こったことを確認しています。この分析では、式(4)によると、小さなタンパク質クラスター(動的光散乱とHYDROPRO計算5,41によってサポート)の存在と一致して、初期重心拡散係数は15 Å2 / nsになり、時間の経過とともに指数関数的に減少します(図5)。内部ダイナミクスの見かけの拡散係数は、集約プロセス全体を通して一定のままです。したがって、リゾチーム微粒子の形成は、単一の凝集相で起こるようである。内部タンパク質ダイナミクスに変化がないことは、交差βへの変換とそれに伴うエネルギーの変化が速すぎるか、溶媒エントロピーの増加などの他の駆動効果が調査されたエネルギー範囲内で完全に支配的である可能性があることを示唆しています。
タウのモノマーと繊維周辺の水和水ダイナミクスの研究は、ドイツのガルヒングにあるマイヤーライプニッツツェントルム(MLZ)のSPHERESで、粉末サンプルについて上記のプロトコルを使用して実施されました。タンパク質1g当たり0.4gのH2Oに水和した約100mgの重水素化タウタンパク質粉末を使用した。EFWSは温度上昇中に取得され、QENSスペクトルは一定温度で取得されました。EFWSは、20 Kから始まり、5分間のスキャン中にデータを継続的に取得しながら、0.2 K/minの速度で温度を300 Kに上昇させて記録されました。
QENSスペクトルは20および280 Kで記録された。EFWSデータは、運動量伝達q範囲0.2 Å-1
図2:平らなアルミニウムサンプルホルダーのベース。 (A)平らなアルミニウムサンプルホルダーは、中性子にさらされる中央部分を示し、タンパク質粉末はベースと蓋の間の小さな隙間(通常~0.3 mm)内に維持されます。インジウム線は、90°Cまでの温度上昇に耐えるため、シーリングに使用できます。 高温の場合は、テフロンシールを使用できます。(B)タンパク質粉末を、インジウムワイヤーを所定の位置に置いた状態でサンプルホルダーのベースに配置します。サンプルホルダーは、乾燥用のP 2 O5または水和用のH2O / D2Oの存在下でデシケーターに入れられます。デシケーターの底部と蓋の間の漏れを防ぐために、真空グリースが追加されます。真空は、乾燥プロセスを加速するために注意して使用できます。疎水性の高いサンプルには、デシケーターの底部の加熱が必要になる場合があります。(C)タンパク質溶液を内筒と外筒の間に配置します。液体をピペットで入れすぎないように注意してください(サンプルホルダーを閉じたときにオーバーフローがあってはなりません)。インジウム線は円形の溝に配置されます。(D)サンプルスティック(バックグラウンド)は、サンプルの高さと向きを制御し、サンプル環境(温度、圧力)用のさまざまなコントローラーと検出器を含めることができます。サンプルスティックはクライオ炉の上部(前面)から挿入され、実験中の温度を制御します。実験中、白い長方形で示されているように、中性子ビームは通常、クライオ炉の底に当たります(ビームのサイズは機器の構成によって異なります)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:データの修正と正規化により、適合度が向上する可能性があります。 データは、プロトコルで説明されているように、nPDynを使用してインポートされました。 左は、モニターのデータのみを使用してデータセットを正規化しました。 右、空の缶の信号は、サンプルホルダーからの中性子吸収を補正するためにPaalman-Ping係数43 とともに使用されました。続いて、バナジウム信号の適合モデルを運動量伝達qごとに独立して積分し、その結果を使用してサンプルデータセットを正規化しました。どちらのプロットでも、S(q,ω)は散乱信号、qは運動量移動、 エネルギー移動を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:適合の結果を示すnPDynによって生成されたプロットウィンドウ。QENSデータは、プロトコルに記載されているように、nPDynを使用して適合されました。プロットウィンドウでは、観測可能な軸(時間、温度、圧力)、運動量伝達q、エネルギー伝達など、さまざまな軸に沿ってデータをプロットでき、セレクターを使用して他の軸に沿ってナビゲートできます。さまざまなタイプのプロットが利用可能で、(A)に「プロット」、(B)に「分析-qワイズ」が表示されます。「プロット」ボタンは異なるデータセットを別々のサブプロットで表示し、「比較」ボタンはデータセットを同じプロットで示し、「3Dプロット」はsと同様の異なる3Dサブプロットのデータセットを示し、「分析-qワイズ」ボタンは運動量伝達qの関数として適合パラメータを示し、「分析-観察可能ワイズ」ボタンは適合パラメータを運動量伝達qの関数として表示し、「分析-観測可能ワイズ」'は、適合されたパラメータを観測可能な関数(時間、温度、または圧力)として示します。略語:QENS =準弾性中性子散乱。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:リゾチームの凝集は、一定の内部ダイナミクスを持つワンステッププロセスで発生します。 リゾチームは凝集バッファー(他の5に記載)に溶解され、E/IFWSは凝集全体を通して獲得され、これは温度を90°Cに上昇させることによって引き起こされた。 空のセルによる吸収補正とバナジウム信号を使用した正規化の後、プロトコルに記載されているようにジャンプ拡散モデルを使用してデータを分析しました。適合された重心自己拡散係数は、時間の関数(青い三角形)と内部ダイナミクスの見かけの拡散係数(オレンジ色の四角形)としてプロットされます。この数字は 5からです。省略形: E / IFWS = 弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:タウ繊維周辺で水和水のダイナミクスが増加する。重水素化タウ繊維およびモノマーのH2O水和粉末を平らなアルミニウムサンプルホルダーに密封し、EFWSデータを20〜300Kの温度上昇中に取得した。空のセルによる吸収補正とバナジウム信号を使用した正規化の後、プロトコルに記載されているようにジャンプ拡散モデルを使用してデータを分析しました。この画像は、31のデータからより小さなq範囲(0.2 < q < 0.8 Å-1)を使用して再描画されました。省略形: EFWS = エラスティック固定ウィンドウスキャン。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足図S1:ILLでの機器IN16Bの写真。(トップ) 機器専用の放射線制御ゾーンから見た機器IN16B。入射ビームは、中性子ガイド内を真空チャンバー内を移動し、機器のほとんどの要素(PSTチョッパー、アナライザー、サンプル、検出器)が含まれています。 (下) 真空チャンバーの内部。PSTチョッパーは、サンプルを含むクライオ炉を囲む分析装置と同様に見えます。検出器はクライオ炉の後ろにあります。ローラン・ティオンの礼儀、黄道。略語:PST =位相空間変換。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S2:クラシック(ドップラー駆動)およびBATSモードでのIN16Bのスケッチ。 (A)中性子ビームは、速度セレクターによって部分的に単色化されています。その後、バックグラウンドチョッパーとPSTチョッパーが中性子パルスを生成し、そこからドップラーモノクロメーター(E / IFWSまたはQENSモード)によってエネルギープロファイルが選択されます。次に、中性子はサンプルによって散乱され、単一のエネルギーが分析装置によって検出器に向かって反射されます。ILLの礼儀。(B)BATSチョッパーは、定義されたエネルギー範囲で単一の中性子パルスを定義するために使用されます。中性子ビームは、速度セレクターによって部分的に単色化されます。その後、バックグラウンドチョッパーは、選択したパルスに属さない不要な中性子を除去します。次に、中性子はサンプルによって散乱され、単一のエネルギーが分析装置によって検出器に向かって反射されます。ILLの礼儀。略語:BATS =後方散乱および飛行時間型分光計。PST = 位相空間変換;E/IFWS = エラスティックおよび非エラスティック固定ウィンドウスキャン。QENS = 準弾性中性子散乱;PG =熱分解グラファイト。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S3:サンプルホルダーは、粉末が所望の水和に達し、密封された後、すぐに閉じられる。 (A)平らなサンプルホルダーは、4本のネジを使用してすばやく閉じます。インジウム線のために小さな隙間が残ります。次に、他のネジを追加し、各ネジを数回静かに締めてインジウムをリラックスさせることで、サンプルホルダーをゆっくりと密閉します。(B)ホルダーベースと蓋の間に隙間が見えなくなった場合、平らなサンプルホルダーは適切に密閉されています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S4:サンプルホルダーは中性子ビームに対して中央に配置されています。 円筒形のサンプルホルダーがサンプルスティックに配置されています。サンプルホルダーの位置は、ビームがホルダーの底部に当たるようにチェックされます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S5:EFWSの取得とそれに続くNOMADによるIN16BのQENSの取得。 (A)プロトコルで説明されているように、関連するコントローラーを 発射台 にドラッグアンドドロップします(手順3.4.1から3.4.3)。インターフェイスを制御するには、ロック(右上隅の緑色のアイコン-垂直ペイン)をクリックする必要がある場合があります。(B)関連するコントローラーは、プロトコルで説明されているように 発射台 にドラッグアンドドロップされます(手順3.4.4から3.4.5)。ここでは、最後の2つのコントローラーの名前は IN16ドップラー設定 と カウントです。略語:QENS =準弾性中性子散乱、EFWS =弾性固定窓スキャン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S6:NOMADを使用したIN16Bでの温度ランプとE / IFWSのセットアップ。 (A) ファーネスクライオスタット コントローラーを 発射台 に追加し、プロトコル(ステップ3.4.6)で説明されているように構成します。(B) Forループ コントローラーを 発射台 に追加し、関連するコントローラーを挿入して、プロトコルの説明に従って構成します(手順3.4.7)。省略形: E / IFWS = 弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S7:最初の5つの球面ベッセル関数は、水和水の回転寄与の大部分を説明します。 最初の8つの球面ベッセル関数は、値d = 0.98 Åと0から3 Åまでの運動量伝達qの値(実線)を使用してプロットされます。0.3 Å < q < 1.8 Åの運動量伝達範囲は、青い点線で区切られています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S8:リゾチームは再現性よく微粒子を形成する。 リゾチームを凝集バッファー(プロトコル、ステップ1に記載されているように調製)に溶解し、ThTを最終濃度2 μMまで添加して、蛍光を使用して交叉β構造の形成をモニターしました。プロットは3つの独立した測定値の平均を表し、エラーバーは標準偏差です。挿入図は、凝集の6時間後に形成された微粒子の蛍光顕微鏡写真を示す。スケールバー = 20 μm。この数字は 5からです。略称:ThT =チオフラビンT。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S9:IN16Bで利用可能な高速温度ランプ。 IN16Bの 高速 モードでは、約30分で温度を280Kから363Kに上げることができます。この数字は 5からです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S10:微粒子への凝集中のリゾチームに関するE/IFWSデータ。 リゾチームは凝集バッファー(他の5に記載)に溶解され、E/IFWSは凝集全体を通して獲得され、これは温度を90°Cに上昇させることによって引き起こされた。 空のセルによる吸収補正後のデータとバナジウムのシグナルを用いた正規化を、測定した異なるエネルギー移動の運動量移動qと時間に対してプロットし、0 μeV(左上)、0.6 μeV(右上)、1.5 μeV(左下)、3 μeV(右下)を測定しました。各サブプロットについて、縦軸は散乱信号S(q、ΔE)に対応し、実験時間(時間)と運動量伝達qに対してプロットされます。この数字は 5からです。省略形: E / IFWS = 弾性および非弾性固定ウィンドウスキャン。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図S11:タウの水和水データのフィッティング。(A) ガウス分布を用いたEFWSデータの適合。重水素化タウモノマーのH2O水和粉末を平らなアルミニウムサンプルホルダーに密封し、EFWSを20〜300Kの温度上昇中に取得した。実験データ(垂直軸上の弾性信号S(q, 0)-エラーバー付きの青い線)は、MSDを抽出するために使用された適合ガウス分布とともに、運動量伝達q範囲0.2
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Discussion
中性子分光法は、重水素化を使用した場合のタンパク質のサイズや溶液の複雑さに関係なく、タンパク質サンプルのアンサンブル平均ps-nsダイナミクスをプローブできる唯一の方法です6。具体的には、溶液中でのタンパク質集合体の自己拡散を調べることにより、そのような集合体の流体力学的サイズを明確に決定することができる。それにもかかわらず、この方法は一般に中性子束が低いために制限され、これは長い取得時間と、割り当てられたビーム時間内に良好な信号対雑音比を得るために大量のサンプル(通常は100 mgのタンパク質)を必要とすることを意味します。
サンプル調製(プロトコルステップ1および2)。 液体状態サンプルの場合、使用できる最小濃度は~50 mg/mLです(取得時間を延長する代わりに、より低い濃度を使用できます)。タンパク質濃度が高いとフィブリル化速度が速くなり、割り当てられたビーム時間で測定を適合させるのに役立ちますが、凝集経路にも影響を与える可能性があります44。したがって、原子間力や電子顕微鏡などの相補的な方法による徹底的なサンプル特性評価が必要です。
試料ホルダーの材質も、アルミニウム合金が腐食を受けるように試料を調製する際に対処すべき点である45。腐食に対する優れた耐性を示し、中性子吸光度が低い典型的なアルミニウム合金は、98%-98.75%Al、0.1%Ti、0.15%Zn、0.05%Cr、0.35%-0.6%Mg、0.1%Mn、0.1%Cu、0.1%-0.3%Fe、および0.3%-0.6%Siで作られた欧州規格(EN)AW-6060 [AlMgSi]です。 腐食は、たとえば、サンプルホルダーでの時間を短縮するか、次のような保護コーティング(バックグラウンド信号に追加できる)を使用することで最小限に抑えることができます。ニッケルまたは金。
水素化タンパク質の粉末試料の場合、凍結乾燥手順は、P2O5粉末の存在下でデシケーター中で、できるだけ多くの残留軽水を除去する工程で効率的に完了することが示された35。粉末サンプルの場合、最終的な水和状態の粉末を(原子間力顕微鏡と粉末X線回折を使用して)特性評価し、モノマー状態と繊維状態の両方に対する重水素化、凍結乾燥、および蒸気拡散の影響を評価することもお勧めします。特に、凍結乾燥は繊維を破壊し、形態に影響を与えることなくセグメントを短くする可能性があります。さらに、X線パワー回折により、液体窒素中でのフラッシュ冷却ではなく、徐冷がアミロイド様構造の存在を誘発できることが観察されています(未発表の結果)。
データ収集(プロトコルステップ3)。 実験の前に、地元の連絡先とデータ収集を計画することをお勧めします(提案の作成プロセス中に議論された場合でも)。データ収集計画は、得られた信号対雑音比に応じて、最初のスキャン後に変更される可能性があります。特に時間分解実験では、E/IFWSを使用することで、弾性線で30秒から1分、3μeV 5のデータポイントで4〜5分の高速データ収集が可能になりますが、アクセス可能なエネルギー移動の範囲は本質的に制限されます。あるいは、QENSデータの摺動平均を使用することができる46。この目的のために、IN16Bの新しい後方散乱および飛行時間分光法(BATS)オプションは、エネルギー11の分解能が低く、エネルギー範囲が±150μeV(または使用する構成によってはそれ以上)の従来のIN16Bよりも高いフラックスを提供します。したがって、BATSオプションは、時間分解研究、特に数時間にわたって行われるアミロイド凝集などのプロセスに推奨されます。
データ分析(プロトコルステップ4、5、および6)。 散乱関数 S(q,ω)には、サンプル内のすべてのタイプの運動が含まれ、上記のプロトコルで説明されているモデルは近似値です。特に、液体状態のIDPの場合、無秩序鎖の大規模な運動は、タンパク質全体の重心拡散と同じ長さと時間スケールで発生する可能性があります。したがって、ユーザーは、重心拡散とタンパク質内部ダイナミクスの分離は必ずしも簡単ではないことに留意する必要があります。フィッティング手順は、このパラメータを固定して(他の方法では異なる時間と長さのスケールに関連する集合拡散係数を提供できることに留意してください)、内部ダイナミクスに対してより堅牢な結果を得ることができるように、相補的な方法を介して得られた重心拡散に関する情報から恩恵を受けることができます。
中性子散乱に加えて、分子系のダイナミクスは、同位体標識タンパク質および広範囲の時間スケール47,48,49に関する局所的な情報を提供する核磁気共鳴(NMR)によって特徴付けることができる。この方法は、アミロイド系48,50,51,52,53の研究に首尾よく使用されているが、タンパク質サイズに対する固有の制限のために、ユーザーが単に水和水を研究したり、アミロイド凝集プロセスをリアルタイムで追跡したりすることができない。電子常磁性共鳴分光法(EPR)とEPRから派生した方法オーバーハウザー動的核分極(ODNP)の最近の開発は、中性子散乱と組み合わせると優れた視点を提供します。実際、部位特異的スピン標識(SDSL)では、ESRとODNPは、導入されたスピン標識の周りのps-nsタイムスケールで、それぞれタンパク質54と水和ダイナミクス55をプローブすることができます。
これらの方法は、タウ56,57タンパク質の凝集を研究するために使用され、同様の情報を取得できるが、サンプル全体で平均化された中性子散乱との大きな相補性を提供します。さらに、赤外分光法は、特定の構造パターンに関連する高エネルギー運動の動的情報を提供することができるが、タンパク質環境(使用される緩衝液)の複雑さは、データの解釈に影響を与える可能性がある58,59。中性子後方散乱法は、前述の方法の結果とともに、ps-nsタイムスケールでのタンパク質と水和水のダイナミクスに関するユニークで補完的なビューを提供します。サンプルの特異的標識を必要とせず、シグナル品質はタンパク質のサイズに敏感ではなく、測定はin vivoまたは重水素化細菌溶解物3,6,7などの非常に複雑な重水素化環境で行うことができます。この方法はアンサンブル平均化された結果を提供するため、分子動力学シミュレーションによって十分に補完され、研究中のシステムに関する原子の詳細情報が得られます。シミュレーションは、実験データセットと、mdanse60などのソフトウェアを使用してシミュレーション軌道から計算された理論QENSスペクトルを直接比較することで簡単に検証できます。
アミロイド系に関しては、中性子後方散乱は、様々な系および条件に対するps−nsタンパク質および水の動態を特徴付けるのに有用であることが証明されている5、31、61、61、62、63、64。特に、中性子後方散乱を用いて、交差β構造に関与するタンパク質配列の割合とフィブリル化時の水エントロピーゲインの振幅との相関を明らかにしました(未発表の結果)。さらに、試料環境の開発により、中性子スペクトルと誘電緩和データ65またはラマン散乱データ66のいずれかを同時に取得することができる。さらに、IN16Bには回折検出器があり、動的データとともに構造データを取得します。さらに、入射中性子束は、いわゆる可変フォーカシングガイドの使用により、近い将来、IN16BのBATSモードで改善されることが期待されており、その形状は、使用される機器のセットアップにオンデマンドで適合させることができます。高度なサンプル環境と機器の開発をさらに進めることで、将来的にはさらに複雑な実験が可能になり、さらに動的な情報と構造情報を同時に提供できる可能性があります。
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Disclosures
著者は、開示すべき利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、ドイツのガルヒングにあるハインツ・マイヤー・ライプニッツ・ツェントルムにあるユーリッヒ中性子科学センターのミカエラ・ザンポーニ氏に、SPHERES装置で行われた中性子散乱実験の一部に感謝している。この研究は、欧州連合がHPRI-2001-50065およびRII3-CT-2003-505925の契約に基づいて資金提供する重水素化研究所(DLAB)コンソーシアムの活動、および英国工学物理科学研究評議会(EPSRC)が資金提供する助成金GR/R99393/01およびEP/C015452/1に基づくラウエランジュバンEMBL研究所内の活動から恩恵を受けています。主要行動を通じた第7次枠組みプログラムに基づく欧州委員会による支援:欧州研究領域、研究インフラストラクチャの強化が認められています[契約226507(NMI3)]。ケビン・ポウノットとクリスチャン・ベックは、ポスドクフェローシップの資金提供について、連邦教育研究省(BMBF、助成金番号05K19VTB)に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aluminum sample holder | Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact. | ||
| Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D | Sigma-Aldrich | 543047 |
|
| Deuterium oxide (D, 99.9%) | Eurisotop | DLM-4DR-PK | |
| Dow Corning high-vacuum silicone grease | Sigma-Aldrich | Z273554-1EA | |
| Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur | Sigma-Aldrich | 1.5901 | |
| Glass dessicator | VWR | 75871-660 | |
| Glass dessicator plate, 140 mm | VWR | 89038-068 | |
| Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% | Alfa Aesar | 00470.G1 | |
| Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg | Sigma-Aldrich | 62970 | |
| nPDyn | v3.x | see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software | |
| OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration | Dutscher | 92641 | |
| Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% | Sigma-Aldrich | 214701 | |
| Pipette ErgoOne 0.5-10 μL | Starlab | S7100-0510 | |
| Pipette ErgoOne 100-1,000 μL | Starlab | S7100-1000 | |
| Pipette ErgoOne 20-200 μL | Starlab | S7100-2200 | |
| Pipette tip TipOne 1,000 μL | Starlab | S1111-6001 | |
| Pipette tip TipOne 10 μL | Starlab | S1111-3200 | |
| Pipette tip TipOne 200 μL | Starlab | S1111-0206 | |
| Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D | Sigma-Aldrich | 372072 |
References
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