Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Högupplöst neutronspektroskopi för att studera pikosekund-nanosekunddynamik hos proteiner och hydratiseringsvatten

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

Neutronbackspridningsspektroskopi erbjuder en icke-destruktiv och etikettfri tillgång till ps-ns-dynamiken hos proteiner och deras hydratiseringsvatten. Arbetsflödet presenteras med två studier på amyloidproteiner: på den tidsupplösta dynamiken av lysozym under aggregering och på hydratiseringsvattendynamiken hos tau vid fiberbildning.

Abstract

Neutronspridning erbjuder möjligheten att undersöka dynamiken i prover för ett brett spektrum av energier på ett icke-destruktivt sätt och utan annan märkning än deuterium. I synnerhet registrerar neutronspridningsspektroskopi spridningssignalerna vid flera spridningsvinklar samtidigt och är väl lämpad för att studera dynamiken i biologiska system på ps-ns tidsskala. Genom att använda D2O-och eventuellt deutererade buffertkomponenter möjliggör metoden övervakning av både masscentrumdiffusion och ryggrads- och sidokedjerörelser (inre dynamik) hos proteiner i flytande tillstånd.

Dessutom kan hydratiseringsvattendynamik studeras genom att använda pulver av perdeutererade proteiner hydratiserade medH2O. Denna uppsats presenterar arbetsflödet som används på instrumentet IN16B vid Institut Laue-Langevin (ILL) för att undersöka protein- och hydratiseringsvattendynamik. Beredningen av lösningsprover och hydratiserade proteinpulverprover med ångutbyte förklaras. Dataanalysproceduren för både protein- och hydratiseringsvattendynamik beskrivs för olika typer av dataset (kvasielastiska spektra eller fasta fönsterskanningar) som kan erhållas på en neutronspridningsspektrometer.

Metoden illustreras med två studier med amyloidproteiner. Aggregeringen av lysozym i sfäriska aggregat av μm-storlek - betecknade partiklar - visas ske i en enstegsprocess på rymd- och tidsintervallet som sonderas på IN16B, medan den interna dynamiken förblir oförändrad. Vidare studerades dynamiken hos hydratiseringsvatten av tau på hydratiserade pulver av perdeuterat protein. Det visas att translationella rörelser av vatten aktiveras vid bildandet av amyloidfibrer. Slutligen diskuteras kritiska steg i protokollet för hur neutronspridning positioneras när det gäller studier av dynamik med avseende på andra experimentella biofysiska metoder.

Introduction

Neutronen är en laddningsfri och massiv partikel som framgångsrikt har använts genom åren för att undersöka prover inom olika områden från grundläggande fysik till biologi1. För biologiska tillämpningar används neutronspridning med liten vinkel, inelastisk neutronspridning och neutronkristallografi och reflektometri i stor utsträckning 2,3,4. Inelastisk neutronspridning ger en ensemble-medelvärdesmätning av dynamiken utan att kräva specifik märkning i sig, och en signalkvalitet som inte beror på storleken eller proteinet5. Mätningen kan göras med hjälp av en mycket komplex miljö för proteinet som studeras som efterliknar det intracellulära mediet, såsom ett deutererat bakteriellt lysat eller till och med in vivo 3,6,7. Olika experimentella uppställningar kan användas för att studera dynamiken, nämligen i) time-of-flight-giving access to sub-ps-ps dynamics, ii) backscattering-giving access to ps-ns dynamics, och iii) spin-echo-giving access to dynamics from ns to hundreds ns. Neutronåterspridning använder Braggs lag 2d sinθ = nλ, där d är avståndet mellan plan i en kristall, θ spridningsvinkeln, n spridningsordningen och λ våglängden. Användningen av kristaller för bakåtspridning mot detektorerna möjliggör en hög upplösning i energi, typiskt ~ 0,8 μeV. För att mäta energiutbytet används antingen en dopplerdrivenhet som bär en kristall i backscattering för att definiera och ställa in den inkommande neutronvåglängden 8,9,10 (figur 1), eller en flygtidsinställning kan användas på bekostnad av en minskning av energiupplösningen 11.

Figure 1
Figur 1: Skiss av en neutronspridningsspektrometer med dopplerdrift. Den inkommande strålen träffar fasrumstransformationen (PST) chopper42, vilket ökar flödet vid provpositionen. Den sprids sedan bakåt mot provet av dopplerdrivningen, som väljer en energi E1 (cyanpil). Neutronerna sprids sedan av provet (med olika energier representerade av pilarnas färg) och analysatorerna, gjorda av Si 111-kristaller, kommer bara att sprida neutroner med en specifik energi E0 (rödfärgade pilar här). Därför erhålls momentöverföringen q från neutronens detekterade position på detektormatrisen och energiöverföringen erhålls från skillnaden E1- E0. Den flygtid som förväntas för neutronpulsen som produceras av PST används för att kassera signalen från neutronerna spridda direkt mot detektorrören. Förkortning: PST = fasrymdtransformation. Klicka här för att se en större version av denna figur.

För backscatteringspektroskopi kommer det huvudsakliga bidraget till signalen från väteprotonrika prover, såsom proteiner, från inkoherent spridning, för vilken spridningsintensiteten Sinc (q, ω) visas av Eq (1) 12

Equation 1 (1)

Därσ inc är det osammanhängande tvärsnittet av det element som beaktas, är k' normen för den spridda vågvektorn, k normen för den inkommande vågvektorn, q (= k - k') momentöverföringen, r j (t) positionsvektorn för atom j vid tiden t och ω frekvensen som motsvarar energiöverföringen mellan den inkommande neutronen och systemet. Vinkelparenteserna anger ensemblemedelvärdet. Därför undersöker inkoherent spridning ensemblemedelvärdet av enpartikels självkorrelation av atompositioner med tiden och ger självdynamiken i genomsnitt över alla atomer i systemet och olika tidsursprung (ensemblemedelvärde). Spridningsfunktionen är Fouriertransformen i tiden av den mellanliggande spridningsfunktionen I(q, t), som kan ses som Fouriertransformen i rummet av van Hove-korrelationsfunktionen som visas av Eq (2):

Equation 2 (2)

Där ρ(r,t) är sannolikhetstätheten för att hitta en atom vid position r och tiden t 13.

För en fickiansk diffusionsprocess resulterar självdiffusionsfunktionen (se Eq (3)) efter en dubbel Fouriertransform i en spridningsfunktion bestående av en Lorentzian med linjebredd given av γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Mer sofistikerade modeller utvecklades och befanns användbara såsom hoppdiffusionsmodellen av Singwi och Sjölander för ps-ns interna proteindynamik14 eller rotationsmodellen av Sears för hydratiseringsvatten15,16,17.

På neutronspridningsinstrumentet IN16B 8,9 vid ILL, Grenoble, Frankrike (kompletterande figur S1) består en inställning som vanligtvis används med proteiner av Si 111-kristaller för analysatorerna med en dopplerdrivning för att ställa in den inkommande våglängden (kompletterande figur S2A), vilket ger tillgång till momentöverföringsområdet ~ 0,2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 och energiöverföringsområdet -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV motsvarande tidsskalor från några ps till några ns och avstånd på några Å. Dessutom erbjuder IN16B möjligheten att utföra elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster (E/IFWS)10, vilket inkluderar datainsamling vid en fast energiöverföring. Eftersom flödet är begränsat vid arbete med neutroner möjliggör E/IFWS maximering av flödet för en energiöverföring, vilket minskar förvärvstiden som behövs för att uppnå ett tillfredsställande signal-brusförhållande. Ett nyare alternativ är backscattering och time-of-flight spectrometer (BATS) mode11, som möjliggör mätning av ett brett spektrum av energiöverföringar, (t.ex. -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), med ett högre flöde än med dopplerdriften, men på bekostnad av en lägre energiupplösning (kompletterande figur S2B).

En viktig egenskap hos neutronspridning är att det inkoherenta tvärsnittet σinc har ett 40 gånger högre värde för väte än för deuterium och är försumbar för andra element som vanligtvis finns i biologiska prover. Därför kan dynamiken hos proteiner i en flytande miljö studeras med hjälp av en deutererad buffert, och pulvertillståndet möjliggör studier av antingen proteinets inre dynamik med hydrerat proteinpulver hydratiserat med D2O, eller studien av hydratiseringsvatten för perdeutererat proteinpulver hydratiserat medH2O. I flytande tillstånd tillåter neutronåterspridning typiskt samtidig åtkomst till masscentrets självdiffusion av proteiner (diffusion av fickian-typ) och deras interna dynamik. De senare är ryggrads- och sidokedjerörelser som vanligtvis beskrivs av den så kallade hoppdiffusionsmodellen eller andra 3,18. I hydrerade proteinpulver saknas proteindiffusionen och endast intern dynamik behöver modelleras. För hydratiseringsvatten uppvisar bidragen från translationella och roterande rörelser av vattenmolekyler ett annat beroende av momentöverföringen q, vilket möjliggör deras distinktion i dataanalysprocessen17.

Denna artikel illustrerar neutronspridningsmetoden med studier av proteiner som visade sig kunna utvecklas, aggregera till en kanonisk form bestående av staplar av β-strängar - det så kallade kors-β mönstret19,20 - och bilda långsträckta fibrer. Detta är den så kallade amyloidaggregeringen, som studeras omfattande på grund av dess centrala roll i neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers eller Parkinsons sjukdomar21,22. Studien av amyloidproteinerna motiveras också av den funktionella roll de kan spela 23,24 eller deras höga potential för utveckling av nya biomaterial25. De fysikalisk-kemiska determinanterna för amyloidaggregeringen är fortfarande oklara, och ingen allmän teori om amyloidaggregering finns tillgänglig, trots enorma framsteg under de senaste åren21,26.

Amyloidaggregering innebär förändringar i proteinstruktur och stabilitet med tiden, vars studie naturligtvis innebär dynamik, kopplad till proteinkonformationsstabilitet, proteinfunktion och proteinenergilandskap27. Dynamik är direkt kopplad till stabiliteten hos ett specifikt tillstånd genom det entropiska bidraget för de snabbaste rörelserna28, och proteinfunktionen kan upprätthållas av rörelser på olika tidsskalor från sub-ps för ljuskänsliga proteiner29 till ms för domänrörelser, vilket kan underlättas av picosecond-nanosecond dynamics30.

Två exempel på att använda neutronbackspridningsspektroskopi för att studera amyloidproteiner kommer att presenteras, ett i flytande tillstånd för att studera proteindynamik och ett i hydratiserat pulvertillstånd för att studera hydratiseringsvattendynamik. Det första exemplet gäller aggregering av lysozym i μm-sfärer (kallade partiklar) följt i realtid5, och det andra en jämförelse av vattendynamik i naturliga och aggregerade tillstånd av det humana proteinet tau31.

Lysozym är ett enzym som är involverat i immunförsvaret och består av 129 aminosyrarester. Lysozym kan bilda partiklar i deutererad buffert vid pD 10,5 och vid en temperatur på 90 °C. Med neutronspridning visade vi att tidsutvecklingen av massdiffusionskoefficienten för lysozym följer den enda exponentiella kinetiken för tioflavin T-fluorescens (en fluorescerande sond som används för att övervaka bildandet av amyloidkors-β mönster32), vilket indikerar att bildningspartikelformiga överbyggnader och kors-β mönster förekommer i ett enda steg med samma hastighet. Dessutom förblev den interna dynamiken konstant under hela aggregeringsprocessen, vilket kan förklaras antingen av en snabb konformationsförändring som inte kan observeras på NBS-instrument eller av frånvaron av signifikant förändring i proteinets interna energi vid aggregering.

Det humana proteinet tau är ett egenstört protein (IDP) som består av 441 aminosyror för den så kallade 2N4R-isoformen, som är särskilt involverad i Alzheimers sjukdom33. Med hjälp av neutronåterspridning på pulver av perdeutererat protein tau visade vi att hydratiseringsvattendynamiken ökar i fibertillståndet, med en högre population av vattenmolekyler som genomgår translationella rörelser. Resultatet tyder på att en ökning av hydreringsvattenentropi kan driva amyloidflimmer av tau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förbered den deutererade bufferten för proteiner i flytande tillstånd

  1. Lös upp alla buffertkomponenter i renD2O.
  2. Om pH-elektroden kalibrerades iH2O, justera pD enligt formeln pD = pH + 0,4 med NaOD eller DCl34.
    OBS: Användningen av D2O i stället förH2Okan påverkaproteinlösligheten och buffertförhållandena kan behöva anpassas (t.ex. genom en liten förändring av saltkoncentrationen).

2. FörberedH2O-hydratiserade pulver av perdeutererat protein

  1. Förbered provhållaren.
    1. Rengör noggrant en platt aluminiumprovhållare med sin indiumtrådtätning och skruvar med vatten och etanol och låt den torka.
      OBS: En platt provhållare används så att pulvret kan fördelas homogent över ytan. Mängden pulver bör vara tillräcklig så att den kan hållas mellan väggarna och inte faller när provhållaren placeras vertikalt.
    2. Väg de olika delarna av provhållaren - botten, lock och indiumtråd - separat på en precisionsvåg.
    3. Placera 1 mm tätning av indiumtråd i spåret på provhållarens nedre del och lämna en liten överlappning där de två ändarna förenas (figur 2A).
    4. Placera en lämplig mängd frystorkat protein (vanligtvis ~ 100 mg protein) så att det fyller den inre ytan av den nedre delen av provhållaren.
  2. Hydrera proteinpulvret.
    1. Placera provhållaren i exsickator med en petriskål som innehållerP2O5-pulveri 24 timmar för att fullständigt torka proteinpulvret35 (figur 2B). Väg den torra bottendelen av provhållaren som innehåller indiumförseglingen och det torra pulvret så att mblir torr.
      VARNING: P2O5 pulver är mycket frätande.
    2. Ta bort P 2 O5 från exsickatorn och lägg en petriskål med D2O inuti. Kontrollera pulvermassan regelbundet för att kontrollera hydratiseringsnivån h = m hyd / m torr där mhyd och m torr är massan av det hydratiserade pulvret respektive torrt pulver.
      OBS: För mycket hydrofoba proteiner som insulin kan det vara nödvändigt att öka temperaturen inuti exsickatorn för att få ett högre ångtryck och nå önskad hydratiseringsnivå h.
    3. Upprepa steg 2.2.1 och 2.2.2 minst tre gånger för att korrekt omvandla alla utbytbara väten till deuteroner.
      OBS: Alternativt kan cykler av frystorkning och upplösning i ren D2O användas för bättre H/D-utbyte, förutsatt att proteinet inte påverkas av det.
    4. Hydrera pulvret till något över önskad nivå, låt den nedre delen av provhållaren med indiumtråden och hydratiserat pulver förbli på precisionsbalansen och vänta tills massan långsamt minskar till önskat värde för att få målet h (vanligtvis 0,2-0,4 om ett medelstort globulärt protein ska täckas av ett komplett hydratiseringsskikt).
    5. Sätt snabbt locket på den nedre delen och stäng provhållaren först med fyra skruvar för att stoppa ångutbytet (kompletterande figur S3A).
    6. Placera och dra åt alla återstående skruvar tills inget mellanrum syns mellan den nedre delen och locket (kompletterande figur S3B).
    7. Väg den förseglade provhållaren för att kontrollera eventuell vätskeförlust via läckage efter neutronexperimentet.

3. Utför det inkoherenta neutronspridningsexperimentet

  1. Diskutera och dubbelkolla konfigurationen av instrumentet som behövs för experimentet med den lokala kontakten några veckor före den tilldelade stråltiden.
  2. Förbered provet i flytande tillstånd.
    1. Lös upp proteinet i den deutererade bufferten.
    2. Bestäm lämplig vätskevolym som ska läggas i provhållaren med vatten (se till att det inte finns något överflöde när provhållaren är stängd; Figur 2C).
      OBS: Följande steg (3.3 och 3.4) beskriver ett experiment utfört på NBS-spektrometern IN16B vid ILL8,9, med en kryougn som provmiljö. Instrumentstyrsystemet kommer att ändras från ett instrument till ett annat, men arbetsprinciperna förblir desamma.
  3. Sätt in provet.
    1. Torka provpinnen noggrant (figur 2D) och avlägsna eventuellt föregående prov efter att ha kontrollerat att joniserande strålningsdosen är lägre än 100 μSv/h innan något material hanteras (vid ILL).
    2. Placera provet, kontrollera att strålen är korrekt centrerad i förhållande till strålens centrum (kompletterande figur S4) och sätt in provpinnen i kryougnen (figur 2D). Slå på vakuumpumpen för att nå mindre än 10-3 bar och spola ut luften inuti kryougnen genom att upprepa följande tre gånger: fyll kryougnen med heliumgas tills atmosfärstrycket uppnås och ta bort gasen igen med vakuumpumpen.
      Anmärkning: Om det rör sig om en plan provhållare måste provhållaren vara orienterad i 45° vinkel i förhållande till den inkommande strålen. Det användbara momentöverföringsområdet kan minskas på grund av absorption och spridning av cellen. En stark neutronabsorberare såsom kadmium kan användas för att maskera vissa delar av provhållaren (t.ex. skruvar, tjocka delar).
    3. För in lite heliumgas i kryougnen så att trycket är ~ 0,05 bar.
  4. Inhämta data (t.ex. med hjälp av NOMAD på IN16B vid ILL, antas det att användaren föredrar en temperatur på 200 K innan man förvärvar ett kvasielastiskt neutronspektrum (QENS) spektrum, sedan E / IFWS under en temperaturramp till 310 K vid 0,5 K per min och slutligen en QENS vid 310 K).
    1. Använd NOMAD, på fliken Körning , dra och släpp en FurnaceCryostat-kontroller i startplattan. Ställ in temperaturen på 200 K. Använd snabbläget och en timeout på 30 min så att temperaturen hinner stabiliseras. Klicka på ikonen för roterande pilar för att köra den i bakgrunden så att data kan förvärvas under temperaturminskningen.
    2. Dra och släpp IN16DopplerSettings-regulatorn , ställ in hastighetsprofilen på Exakt hastighet inställd av Max ΔE, ett värde på 0,00 μeV och 128 kanaler för att få en EFWS-konfiguration.
    3. Dra och släpp en räkningskontroll , fyll i fältet Undertext med ett namn som gör det enkelt att identifiera data och ställ in 60 repetitioner av 30 s-skanningar (kompletterande figur S5A).
    4. Dra och släpp en IN16DopplerSettings-styrenhet , ställ in hastighetsprofilen på Sinus inställd efter Speed med ett värde på 4,5 m/s och 2 048 kanaler för att få en QENS-konfiguration.
    5. Dra och släpp en räkningskontroll med 4 repetitioner på 30 minuters skanningar (kompletterande figur S5B).
    6. För temperaturrampen, dra och släpp en FurnaceCryostat-regulator , ställ in temperaturen på 310 K, ställ in Ramp på SetPoint med Δ = 0,05 K och 6 s. Använd en timeout på 220 min (kompletterande figur S6A).
    7. Använd en for-slinga med 65 repetitioner. Inuti sätter du in en IN16DopplerSettings-kontroller som i steg 3.4.2, följt av ett enda antal på 30 s. Sätt sedan in IN16DopplerSettings, som beskrivits tidigare men med en energiförskjutning på 1,5 μeV och 1 024 kanaler följt av en enda räkning på 3 minuter (kompletterande figur S6B).
    8. Om du vill hämta den senaste QENS vid 310 K drar och släpper du styrenheterna IN16DopplerSettings och Count som konfigurerats enligt beskrivningen i steg 3.4.4 respektive 3.4.5.
    9. Tryck på startknappen (höger triangel längst ned i fönstret) för att köra skriptet.
      OBS: Varje experiment kräver insamling av kalibreringsdata; det vill säga den tomma cellen för subtraktions- eller absorptionskorrigeringar, bufferten ensam vid de olika temperaturer som används för att modellera bakgrunden och en mätning av vanadin (eller motsvarande, provet vid en temperatur av 10 K eller lägre) för att erhålla instrumentets upplösningsfunktion.

4. Dataanalys - QENS

  1. Importera datauppsättningen med metoden "IN16B_QENS.process()" i Python-programvaran nPDyn v3.x36
    >>>> från nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS

    >>> prov = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... format>]
    ... ). process()

    >>> prov = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Utför datakorrigeringar (valfritt) med följande kommandon (se dokumentationen för nPDyn för mer information, bild 3):
    #it antas att data för tom cell, vanadin och buffert
    # importerades redan i dataset som heter 'empty_cell', 'vanadin',
    # respektive "buffert".

    # för subtraktion av tomma celler med en skalningsfaktor
    # (fel sprids automatiskt)
    >>> prov = prov - 0,95 * empty_cell

    # för korrigering med Paalman-Ping-koefficient
    # (ömsesidigt uteslutande med exemplet ovan)
    >>> prov = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # för normalisering
    >>> prov = sample.normalisera (vanadin)

    # för binning längs observerbar axel
    # observerbar är aggregeringstiden här
    >>> prov = prov.bin(3, axel = 0)
  3. Anpassa kalibreringsdata. Datamängdsproverna, tom cell, deutererad buffert (om det behövs) och vanadin - kan monteras med hjälp av inbyggda modeller eller en användardefinierad modell (se nPDyn-dokumentationen):
    >>> från nPDyn.models.builtins import (
    ... modellPVoigt,
    ... modellVatten,
    ... modellKalibreradD2O,
    ...     )

    # Inbyggda modeller använder en kolumnvektor av momentet
    # överföra q-värden
    >>> q = vanadin.q[:, Ingen]

    # vanadin monteras med en pseudo-Voigt-profil
    >>> vanadin.fit(modellPVoigt(q))
  4. Använd den inbyggda modellen för hydreringsvatten som kallas 'modelWater'. Denna modell lyder som visas av Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    Där a0, ar och at är skalärer som står för det relativa bidraget från elastisk signal, rotationsrörelser respektive translationella rörelser; j1(qd) är den l:te ordningens sfäriska Besselfunktion, där q är rörelsemängdsöverföringen; d O-H-avståndet i vattenmolekylen; δ(ω) är Diracdeltat, som här multipliceras med EISF. N är den högsta ordningen av den sfäriska Bessel-funktionen som används (vanligtvis ~5), Equation 5 och Equation 11 är de lorentziska rotations- respektive translationsrörelserna; b(q) är en platt bakgrundsterm. De sfäriska Bessel-funktionerna ger det relativa bidraget från varje rörelsemängdsmomenttillstånd hos vattenmolekylerna, och talet N bestäms utifrån rörelsemängdsöverföringsområdet q. När det gäller en typisk NBS-spektrometer förklarar termerna upp till N = 4 nästan helt signalen (kompletterande figur S7).
    # Här används ekvation 2 för hydratiseringsvatten
    # faltning med upplösningsfunktion och tillägg av
    # D2O bakgrund görs automatiskt med
    # tillhandahöll argument
    >>> sample.fit(modellVatten(q),
    ... res=vanadin,
    ... bkgd=buffert,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    OBS: Bidragen från rotations- och translationsrörelser bör vara invecklade för att vara helt rigorösa. Framgången för en additiv modell kan tillskrivas närvaron av distinkta populationer av vatten på proteinytan och det begränsade tillgängliga energiområdet.
  5. Använd följande för att plotta data (bild 4):
    >>> från nPDyn.plot import plot
    >>> plot(prov)

5. Dataanalys - temperaturramp, elastiska skanningar med fast fönster (EFWS)

  1. Använd en procedur som liknar avsnitt 4 för att normalisera temperaturrampdata med signalen vid den lägsta temperaturen (vanligtvis 10 K):
    >>> från nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> prov = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). process()

    # normalisering med de 5 första punkterna på den observerbara
    # axel, som motsvarar temperaturen
    >>> prov /= sample[:5].mean(0)

    # Momentumöverföringens Q-intervall som används här är mindre
    # eftersom modellen som används endast gäller för låg q
    >>> prov = sample.get_q_range(0,2, 0,8)
  2. Använd en enkel gaussisk modell för att starta, vars bredd ges av den så kallade genomsnittliga kvadratförskjutningen (MSD). Skapa och anpassa modellen med följande kommandon:
    >>> importera numpy som np
    >>> från nPDyn.models importera parametrar, modell, komponent

    # a är en skalningsfaktor
    >>> parametrar = Parametrar(
    ... a={'värde': 1, 'gränser': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> modell = Modell(parametrar)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... "Gaussian",
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(modell; x=sample.q[:, Ingen])

    >>> plot(prov)
    OBS: Den gaussiska approximationen gäller alltid för q2MSD << 1, men ett bredare momentöverföringsområde kan användas för relativ jämförelse mellan prover. Mer sofistikerade modeller, som går utöver den gaussiska approximationen, har utvecklats37,38,39.

6. Dataanalys - elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster (E / IFWS)

  1. På samma sätt som i steg 4 importerar du datauppsättningen men använder klassen "IN16B_FWS":
    >>> från nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> prov = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). process()

    >>> prov = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Anpassa kalibreringsdata och exempeldata.
    1. Analysera E/IFWS-data med hjälp av en generaliserad MSD40 eller genom att betrakta dem som grov-QENS-spektra (med endast ett fåtal datapunkter på energiaxeln). När E/IFWS ses som grov-QENS används modeller som används för QENS för att passa hela E/IFWS-datauppsättningen på en gång (global anpassning av energiöverföringar och momentumöverföringar).
      OBS: Den senare lösningen-användande modeller för QENS på E/IFWS-data-används här där momentumöverföringsberoendet av masscentrumdiffusion och proteinets interna dynamik införs.
    2. Modellera proteindynamik i vätskor med hjälp av följande Eq (5) ("modelProteinJumpDiff" i nPDyn):
      Equation 6 (5)
      Där R(q,ω) är upplösningsfunktionen. β en skalär oberoende för varje momentöverföring q; a0 är den elastiska inkoherenta strukturfaktorn (EISF), Equation 7 en Lorentzisk redovisning för massdiffusion med en bredd som anges av Eq (6); Equation 12 är en Lorentzian som inkluderar massdiffusion och ett bidrag som följer hoppdiffusionsmodell14 som tar hänsyn till intern dynamik (Eq (7); Equation 8 är den anpassade signalen från D2O omskalad med sin volymfraktion i provet.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds är självdiffusionskoefficienten.
      Equation 9 (7)
      Där den skenbara diffusionskoefficienten för inre dynamik och τ en avkopplingstid för diffusiva rörelser.
      >>> från nPDyn.models.builtins import (
      ... modellPVoigt,
      ... modellProteinJumpDiff,
      ... modellKalibreradD2O,
      ... )

      # Inbyggda modeller använder en kolumnvektor av momentet
      # överföra q-värden
      >>> q = vanadin.q[:, Ingen]

      # vanadin monteras med en pseudo-Voigt-profil
      >>> vanadin.fit(modellPVoigt(q))

      # för ren D2O, en modell med kalibrerad linjebredd
      # för olika temperaturer ingår i nPDyn
      >>> buffer.fit(modellKalibreradD2O(q, temp=363))

      # Här används ekvation 3 för vätskeprover
      # faltning med upplösningsfunktion och tillägg av
      # D2O-bakgrund görs automatiskt med # angivna argument
      >>> sample.fit(modellProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanadin,
      ... bkgd=buffert,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Plotta anpassade data med:
    >>> från nPDyn.plot import plot
    >>> plot(prov)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Aggregeringen av lysozym till partiklar utfördes vid 90 °C med en proteinkoncentration på 50 mg/ml i en deutererad buffert (0,1 M NaCl vid pD 10,5). Partikelbildningen utlöses av temperaturökningen till 90 °C och sker inom 6 timmar (kompletterande figur S8). Datainsamlingen utfördes på IN16B, som beskrivs i protokollet ovan (data är permanent kuraterade av ILL och tillgängliga vid http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Ett QENS-spektrum förvärvades vid 7 °C för att fullt ut karakterisera det ursprungliga tillståndet. Därefter ökades temperaturen till 90 °C (tar vanligtvis ~ 30 min på IN16B, kompletterande figur S9) för att utlösa aggregeringsprocessen. Kinetiken kan följas med hjälp av ett glidande medelvärde av QENS-spektra, vilket ger tillgång till hela energiöverföringsområdet, men med en begränsad upplösning i tid. Tidsupplösningen kan förbättras till ~ 1 min med EFWS och till ~ 20 min med E / IFWS vid fyra energiöverföringsvärden5.

I exemplet som presenterades undersökte vi energiöverföringar på 0, 0,6, 1,5 och 3 μeV. E/IFWS-skanningarna förvärvas kontinuerligt under aggregeringsprocessen och ett QENS-spektrum förvärvades för det slutliga tillståndet vid 90 °C. E/IFWS-data korrigerades för absorption med hjälp av E/IFWS för den tomma cellen och normaliserades med hjälp av vanadindata.

För lysozymet E / IFWS observerar vi en ökning av signalen i tid vid låg momentöverföring och låg energiöverföring, medan signalen vid hög energiöverföring och låg momentöverföring minskar (kompletterande figur 10). Denna kvalitativa observation indikerar bildandet av större objekt, diffunderar långsammare och bekräftar att aggregeringsprocessen ägde rum. Analysen, enligt Eq (4), resulterar i en initial massdiffusionskoefficient på 15 Å2/ns, i överensstämmelse med närvaron av små proteinkluster (stödda av dynamisk ljusspridning och HYDROPRO-beräkningar 5,41), som sedan exponentiellt minskar över tiden (figur 5). Den skenbara diffusionskoefficienten för intern dynamik förblir konstant under hela aggregeringsprocessen. Därför verkar bildandet av lysozympartiklar ske i en enda aggregeringsfas. Frånvaron av förändring i intern proteindynamik tyder på att antingen omvandlingen till kors-β och den möjliga associerade förändringen i energi är för snabb eller att andra drivande effekter, såsom en ökning av lösningsmedelsentropi, kan dominera helt inom det undersökta energiområdet.

Studien av hydratiseringsvattendynamik runt monomerer och fibrer av tau utfördes på SPHERES vid Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) i Garching, Tyskland, med hjälp av protokollet som beskrivs ovan för pulverprover. Cirka 100 mg deutererat tauproteinpulver, hydratiserat till 0,4 gH2Oper g protein, användes. EFWS förvärvades under en temperaturramp och QENS-spektra vid konstant temperatur. EFWS registrerades med början vid 20 K och ökade temperaturen till 300 K med en hastighet av 0,2 K / min medan kontinuerligt inhämtande data under 5 minuters skanningar.

QENS-spektra registrerades vid 20 och vid 280 K. EFWS-data anpassades med hjälp av en enkel gaussisk över momentöverföringsområdet q 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 för att extrahera MSD (kompletterande figur S11A). MSD-värdena ligger över giltighetsgränsen för Gauss-modellen. Därför rekommenderas det i detta fall att utforska andra modeller utöver den gaussiska approximationen37,38,39. Vid temperaturer högre än 220 K är hydratiseringsvattnet runt fibrer av tau betydligt mer rörligt än hydratiseringsvatten runt taumonomerer (figur 6). Anpassningen av QENS-data gör det möjligt för användare att erhålla linjebredd och relativt bidrag från elastiska, roterande och translationella rörelser av hydratiseringsvatten i provet (kompletterande figur S11B). Det verkar som om fraktionen av vattenmolekyler som genomgår translationell rörelse ökas runt fibrer, och både translationella och rotationsdiffusionskoefficienter för vattenmolekyler ökas runt fibrer17,31. Däremot förändrades inte den inre dynamiken hos proteinet tau, som reflekterade ryggrad och sidokedjerörelser, vid flimmer.

Figure 2
Figur 2: Bas av en platt aluminiumprovhållare. (A) Den platta aluminiumprovhållaren presenterar en central del exponerad för neutronerna där proteinpulvret hålls inom ett litet mellanrum - vanligtvis ~ 0,3 mm - mellan basen och locket. En indiumtråd kan användas för tätning eftersom den motstår temperaturökningar upp till 90 °C. Vid högre temperaturer kan en teflontätning användas. B) Proteinpulvret placeras i basen av provhållaren med indiumtråden på plats. Provhållaren placeras i exsickator i närvaro av antingenP2O5 för torkning ellerH2O/D2Oför hydrering. Vakuumfett tillsätts för att undvika läckage mellan exsickatorns botten och lock. Vakuum kan användas med försiktighet för att påskynda torkningsprocessen. Uppvärmning av exsickatorns botten kan krävas för mycket hydrofoba prover. (C) Proteinlösningen placeras mellan de inre och yttre cylindrarna. Se till att inte pipettera för mycket vätska (det ska inte finnas något överflöde när provhållaren är stängd). Indiumtråden placeras i det cirkulära spåret. (D) Provpinnen (i bakgrunden) ger kontroll över provets höjd och orientering och kan innehålla olika styrenheter och detektorer för provmiljöer (temperatur, tryck). Provpinnen sätts in från toppen av kryougnen (framsidan), vilket ger kontroll över temperaturen under experimentet. Under experimentet träffar neutronstrålen vanligtvis botten av kryougnen, vilket indikeras av den vita rektangeln (strålens storlek beror på instrumentkonfigurationen). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Datakorrigeringar och normalisering kan förbättra passformen. Data importerades med nPDyn, enligt beskrivningen i protokollet. Till vänster normaliserades datauppsättningen endast med hjälp av data från övervakaren. Till höger användes signalen från den tomma burken tillsammans med Paalman-Ping-koefficienterna43 för att korrigera för neutronabsorption från provhållaren. Därefter integrerades den anpassade modellen för vanadinsignalen oberoende för varje momentöverföringsq, och resultatet användes för att normalisera provdatasetet. I båda diagrammen betecknar S (q, ω) spridningssignalen, q är momentöverföringen och Equation 3 är energiöverföringen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Bild 4: Ritfönster genererat av nPDyn som visar resultatet av passningen. QENS-data anpassades med nPDyn, enligt beskrivningen i protokollet. Plottningsfönstret gör det möjligt för användare att plotta data längs olika axlar - observerbara (tid, temperatur eller tryck), momentöverföring q eller energiöverföring - och väljare är tillgängliga för att navigera längs de andra axlarna. Olika typer av diagram finns tillgängliga, med den enkla "Plot" som presenteras i (A) och "Analysis - q-wise" i (B). Knappen "Plot" visar de olika datauppsättningarna i separata deldiagram, knappen "Jämför" visar datauppsättningarna i samma diagram, "3D-diagrammet" visar datauppsättningarna i olika 3D-delområden som liknar s, knappen "Analys - q-wise" visar de anpassade parametrarna som funktionen av momentöverföring q och "Analys - observerbart-vis"' visar de anpassade parametrarna som funktionen av observerbar (tid, temperatur eller tryck). Förkortning: QENS = kvasielastisk neutronspridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Lysozymaggregering sker i en enstegsprocess med konstant intern dynamik. Lysozymet löstes i aggregeringsbufferten (beskrivs på annan plats5) och E/IFWS förvärvades under hela aggregeringen, vilket utlöstes genom att temperaturen ökade till 90 °C. Efter absorptionskorrigering med en tom cell och normalisering med vanadinsignalen analyserades data med hjälp av hoppdiffusionsmodellen som beskrivs i protokollet. Den anpassade självdiffusionskoefficienten för masscentrum plottas som en funktion av tiden (blå trianglar) tillsammans med den skenbara diffusionskoefficienten för intern dynamik (orange kvadrater). Denna siffra är från 5. Förkortning: E/IFWS = elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Vattendynamiken ökar runt taufibrer. H2O-hydratiserade pulver av deutererade taufibrer och monomerer förseglades i en platt aluminiumprovhållare och EFWS-data förvärvades under en temperaturramp från 20 till 300 K. Efter absorptionskorrigering med en tom cell och normalisering med vanadinsignalen analyserades data med hjälp av hoppdiffusionsmodellen som beskrivs i protokollet. Denna bild ritades om med ett mindre q-intervall (0,2 < q < 0,8 Å-1) från data från 31. Förkortning: EFWS = elastiska skanningar med fasta fönster. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande figur S1: Fotografier av instrumentet IN16B vid ILL. (överst) Instrumentet IN16B sett från den strålningskontrollerade zon som är avsedd för instrumentet. Den inkommande strålen färdas inom neutronstyrningen till vakuumkammaren, som innehåller de flesta instrumentets element (PST-chopper, analysatorer, prov, detektorer). (nederst) Interiör av vakuumkammaren. PST-hackaren är synlig liksom analysatorerna som omger kryougnen som innehåller provet. Detektorerna är placerade bakom kryougnen. Med tillstånd av Laurent Thion, ekliptique. Förkortning: PST = fasrymdtransformation. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S2: Skiss av IN16B i klassiskt läge (med dopplerdrift) och BATS. (A) Neutronstrålen är delvis monokromatisk av hastighetsväljaren. Därefter kommer bakgrunds- och PST-choppersna att producera en neutronpuls, från vilken en energiprofil kommer att väljas av Doppler-monokromatorn (E / IFWS- eller QENS-läge). Neutronerna sprids sedan av provet, och en enda energi reflekteras mot detektorerna av analysatorerna. Med tillstånd av ILL. (B) BATS-choppers används för att definiera en enda neutronpuls med ett definierat energiområde. Neutronstrålen är delvis monokromatisk av hastighetsväljaren. Därefter tar bakgrundshackaren bort oönskade neutroner som inte tillhör den valda pulsen. Neutronerna sprids sedan av provet, och en enda energi reflekteras mot detektorerna av analysatorerna. Med tillstånd av ILL. Förkortningar: BATS = backscattering och time-of-flight spectrometer; PST = fasrymdtransformation; E / IFWS = elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster; QENS = kvasielastisk neutronspridning; PG = pyrolytisk grafit. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S3: Provhållaren stängs snabbt efter att pulvret har nått önskad hydrering och förseglas. (A) Den plana provhållaren stängs snabbt med fyra skruvar. Ett litet gap kommer att förbli på grund av indiumtråden. De andra skruvarna läggs sedan till och provhållaren förseglas långsamt genom att försiktigt dra åt varje skruv flera gånger så att indium kan slappna av. (B) Den plana provhållaren är ordentligt förseglad när inget mellanrum längre syns mellan hållarens bas och locket. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S4: Provhållaren är centrerad i förhållande till neutronstrålen. En cylinderformad provhållare har placerats på provpinnen. Provhållarens läge kontrolleras så att strålen träffar hållarens nedre del. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S5: Förvärv av EFWS följt av QENS på IN16B med NOMAD. (A) De relevanta styrenheterna dras och släpps i startplattan enligt beskrivningen i protokollet (steg 3.4.1 till 3.4.3). Det kan vara nödvändigt att klicka på låset (grön ikon längst upp till höger - vertikal ruta) för att få kontroll över gränssnittet. (B) De relevanta kontrollerna dras och släpps i startplattan enligt beskrivningen i protokollet (steg 3.4.4 till 3.4.5). Här heter de två sista styrenheterna IN16DopplerSettings och Count. Förkortningar: QENS = kvasielastisk neutronspridning, EFWS = elastiska skanningar med fasta fönster. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S6: Ställa in en temperaturramp och E / IFWS på IN16B med NOMAD. (A) FurnaceCryostat-styrenheten läggs till i startplattan och konfigureras enligt beskrivningen i protokollet (steg 3.4.6). (B) For-loop-styrenheten läggs till i startplattan och relevanta styrenheter sätts in i den och konfigureras enligt beskrivningen i protokollet (steg 3.4.7). Förkortning: E/IFWS = elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S7: De fem första sfäriska Bessel-funktionerna förklarar det mesta av rotationsbidraget från hydratiseringsvatten. De första åtta sfäriska Bessel-funktionerna plottas med ett värde d = 0,98 Å och värden för momentöverföring q från 0 till 3 Å (enfärgade linjer). Rörelsemängdsöverföringsområdet 0,3 Å < q < 1,8 Å avgränsas av de blå streckade linjerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S8: Lysozym bildar reproducerbara partiklar. Lysozym löstes i aggregeringsbufferten (beredd enligt beskrivningen i protokollet, steg 1) och ThT tillsattes till en slutlig koncentration av 2 μM för att övervaka bildandet av tvärgående β struktur med hjälp av fluorescens. Diagrammet representerar genomsnittet av tre oberoende mätningar, och felstaplarna är standardavvikelsen. Infällningen visar ett fluorescensmikroskopifotografi av de partiklar som bildas efter 6 timmars aggregering. Skalstång = 20 μm. Denna siffra är från 5. Förkortning: ThT = tioflavin T. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S9: Snabb temperaturramp som tillgänglig på IN16B. I snabbläget på IN16B kan temperaturen ökas från 280 K till 363 K på cirka 30 minuter. Denna siffra är från 5. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S10: E/IFWS-data om lysozym under aggregering till partiklar. Lysozymet löstes i aggregeringsbufferten (beskrivs på annan plats5) och E/IFWS förvärvades under hela aggregeringen, vilket utlöstes genom att temperaturen ökade till 90 °C. Data-efter absorptionskorrigering med en tom cell och normalisering med hjälp av vanadinsignalen-plottas mot momentöverföring q och tid för de olika uppmätta energiöverföringarna, 0 μeV (övre vänstra), 0,6 μeV (övre högra), 1,5 μeV (nedre vänstra) och 3 μeV (nedre högra). För varje delområde motsvarar den vertikala axeln spridningssignalen S(q, ΔE), plottad mot experimenttiden i timmar och momentöverföringen q. Denna siffra är från 5. Förkortning: E/IFWS = elastiska och oelastiska skanningar med fasta fönster. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande figur S11: Montering av vätskevattendata för tau. (A) Anpassning av EFWS-data med hjälp av en gaussian. H2O-hydratiserat pulver av deutererade taumonomerer förseglades i en platt aluminiumprovhållare och EFWS förvärvades under en temperaturramp från 20 till 300 K. Experimentella data (elastisk signal S(q, 0) på vertikal axelblå linje med felstaplar) plottas för momentöverföringen q intervall 0,2 < q < 0,6 Å-1 tillsammans med den monterade gaussiska som används för att extrahera MSD. (B) Translationella och roterande rörelser av hydratiseringsvatten erhållet från QENS-montering. H2O-hydratiserade pulver av deutererade taufibrer (vänster) och monomerer (höger) förseglades i en platt aluminiumprovhållare och QENS-data förvärvades vid 280 K. Experimentella data (intensitet S(q,ω) som funktionen av energiöverföring) för fibrer (blå trianglar) och monomerer (gröna prickar) plottas tillsammans med den anpassade modellen (svart heldragen linje) och dess komponenter, bakgrund (blå), upplösningsfunktion (grön), rotationer (röd) och translationer (cyan) för momentöverföringen q = 0,783 Å-1. Denna siffra är från 31. Förkortningar: QENS = kvasielastisk neutronspridning, EFWS = elastiska skanningar med fasta fönster; MSD = genomsnittlig kvadratförskjutning. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Neutronspektroskopi är den enda metoden som gör det möjligt att undersöka den ensemble-genomsnittliga ps-ns-dynamiken hos proteinprover oavsett proteinets storlek eller lösningens komplexitet när deuteration används6. Specifikt, genom att undersöka självdiffusion av proteinaggregat i lösning, kan den hydrodynamiska storleken hos sådana sammansättningar entydigt bestämmas. Icke desto mindre begränsas metoden vanligen av det låga neutronflödet, vilket innebär långa förvärvstider och kravet på stora mängder prov (typiskt 100 mg protein) för att erhålla ett bra signal-brusförhållande inom den tilldelade stråltiden.

Provberedning (protokollsteg 1 och 2). För flytande tillståndsprover är den minsta koncentration som kan användas ~ 50 mg / ml (lägre koncentrationer kan användas på bekostnad av förlängda förvärvstider). Hög proteinkoncentration är förknippad med snabbare flimmerhastigheter, vilket hjälper till att passa mätningen i den tilldelade stråltiden men kan påverka aggregeringsvägen också44. Därför är grundlig provkarakterisering med komplementära metoder, såsom atomkraft eller elektronmikroskopi, nödvändig.

Materialet i provhållaren är också en punkt som ska åtgärdas vid beredning av proverna eftersom aluminiumlegeringar utsätts för korrosion45. En typisk aluminiumlegering som uppvisar god korrosionsbeständighet och har låg neutronabsorbans är den europeiska normen (EN) AW-6060 [AlMgSi] tillverkad av 98% -98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35% -0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1% -0,3% Fe och 0,3% -0,6% Si. Korrosion kan minimeras till exempel genom att minska tiden i provhållaren eller använda en skyddande beläggning (som kan öka bakgrundssignalen) såsom nickel eller guld.

För pulverprover av hydrerade proteiner visade sig frystorkningsproceduren vara effektivt avslutad med ett steg i exsickator i närvaro avP2O5-pulver för att avlägsnaså mycket kvarvarande ljusvatten som möjligt35. För pulverprover rekommenderas det också att karakterisera (med hjälp av atomkraftmikroskopi och röntgenpulverdiffraktion) pulvret i sitt slutliga, hydratiserade tillstånd och bedöma effekten av deuteration, frystorkning och ångdiffusion på både monomer- och fibertillstånd. I synnerhet kan frystorkning bryta fibrerna, vilket resulterar i förkortade segment utan att påverka morfologin. Dessutom har det observerats genom röntgeneffektdiffraktion att långsam kylning, istället för flashkylning i flytande kväve, kan inducera närvaron av amyloidliknande strukturer (opublicerat resultat).

Datainsamling (protokollsteg 3). Det rekommenderas att planera datainsamlingen med den lokala kontakten före experimentet (även om det har diskuterats under förslagsskrivningsprocessen). Datainsamlingsplanen kan ändras efter de första skanningarna, beroende på det erhållna signal-brusförhållandet. I synnerhet för tidsupplösta experiment möjliggör användningen av E / IFWS snabb datainsamling-30 s till 1 min för den elastiska linjen, 4-5 min för en datapunkt vid 3 μeV5-men utbudet av tillgängliga energiöverföringar är i sig begränsat. Alternativt kan ett glidande medelvärde av QENS-data användas46. För detta ändamål erbjuder det nya alternativet backscattering and time-of-flight spectroscopy (BATS) på IN16B ett högre flöde än den klassiska IN16B med ett energiområde på ±150 μeV (eller högre beroende på vilken konfiguration som används) på bekostnad av lägre upplösning i energi11. Därför rekommenderas BATS-alternativet för tidsupplösta studier, särskilt för processer som amyloidaggregering, som äger rum under flera timmar.

Dataanalys (protokollsteg 4, 5 och 6). Spridningsfunktionen S(q,ω) inkluderar alla typer av rörelser i provet, och modellerna som beskrivs i ovanstående protokoll är approximationer. I synnerhet för IDP i flytande tillstånd kan de storskaliga rörelserna i den oordnade kedjan ske över samma längd och tidsskala som massdiffusionen av hela proteinet. Därför bör användaren komma ihåg att separationen av massdiffusion och proteinets interna dynamik inte alltid är enkel. Anpassningsproceduren kan dra nytta av information om massdiffusion som erhållits via komplementära metoder, så att denna parameter kan fixeras (med tanke på att andra metoder kan ge en kollektiv diffusionskoefficient associerad med olika tids- och längdskalor) för att få ett mer robust resultat för intern dynamik.

Förutom neutronspridning kan dynamiken i ett molekylärt system karakteriseras av kärnmagnetisk resonans (NMR), som ger lokal information om isotopmärkta proteiner och på ett brett spektrum av tidsskalor47,48,49. Metoden har använts framgångsrikt för att studera amyloidsystem 48,50,51,52,53 men tillåter inte användare att bara studera hydreringsvatten eller följa amyloidaggregeringsprocessen i realtid på grund av den inneboende begränsningen av proteinstorleken. Den senaste utvecklingen inom elektronparamagnetisk resonansspektroskopi (EPR) och den EPR-härledda metoden Overhauser dynamisk kärnpolarisering (ODNP) erbjuder ett bra perspektiv i kombination med neutronspridning. Faktum är att även om site-directed spin labeling (SDSL), EPR och ODNP kan sondera protein54 respektive hydratiseringsdynamik55 på ps-ns tidsskala runt den introducerade spinnetiketten.

Dessa metoder användes för att studera aggregeringen av tau56,57-proteinet och kommer att erbjuda stor komplementaritet med neutronspridning som kan få liknande information, men i genomsnitt över hela provet. Dessutom kan infraröd spektroskopi ge dynamisk information för högenergirörelser associerade med specifika strukturella mönster, men komplexiteten i proteinmiljön (buffert som används) kan påverka datatolkningen58,59. Neutronernas backscattering-tekniker ger en unik och kompletterande syn på protein- och hydratiseringsvattendynamik på ps-ns tidsskala tillsammans med resultat från ovan nämnda metoder. De kräver ingen specifik märkning av provet, signalkvaliteten är inte känslig för proteinets storlek och mätningar kan göras in vivo eller i mycket komplexa, deutererade miljöer såsom deutererat bakteriellt lysat 3,6,7. Eftersom denna metod ger ett ensemble-medelvärde resultat, kompletteras den väl med molekyldynamiksimuleringar för att erhålla atomdetaljerad information om systemet som studeras. Simuleringarna kan enkelt valideras genom en direkt jämförelse mellan det experimentella datasetet och de teoretiska QENS-spektra som beräknas från simuleringsbanan med hjälp av programvara som mdanse60.

När det gäller amyloidsystem har neutronbackscattering visat sig användbar för att karakterisera ps-ns-protein- och vattendynamiken för olika system och förhållanden 5,31,61,62,63,64. I synnerhet användes neutronåterspridning för att avslöja korrelationen mellan andelen proteinsekvens som är involverad i den tvärgående β strukturen och amplituden för vattenentropiförstärkningen vid fibrillering (opublicerade resultat). Vidare möjliggör utveckling av provmiljöer samtidig insamling av neutronspektra och antingen dielektriska avkopplingsdata65 eller Raman-spridningsdata66. Dessutom finns diffraktionsdetektorer på IN16B för att erhålla strukturella data tillsammans med dynamiska data. Dessutom förväntas det inkommande neutronflödet förbättras för BAT-läget för IN16B inom en snar framtid, tack vare användningen av den så kallade variabla fokuseringsguiden, vars geometri kan anpassas på begäran till den instrumentella inställningen som används. Att driva utvecklingen av sofistikerad provmiljö och instrumentering ytterligare skulle möjliggöra ännu mer komplexa experiment i framtiden, eventuellt leverera ytterligare dynamisk och strukturell information samtidigt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

Författarna är tacksamma mot Michaela Zamponi vid Jülich Centre for Neutron Science vid Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Tyskland, för en del av neutronspridningsexperimenten som utförts på instrumentet SPHERES. Detta arbete har gynnats av verksamheten i konsortiet Deuteration Laboratory (DLAB) som finansieras av Europeiska unionen enligt kontrakten HPRI-2001-50065 och RII3-CT-2003-505925, och från UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC)-finansierad verksamhet inom Institut Laue Langevin EMBL DLAB under bidrag GR/R99393/01 och EP/C015452/1. Stöd från Europeiska kommissionen inom sjunde ramprogrammet genom nyckelåtgärden: förstärkning av det europeiska området för forskningsverksamhet, forskningsinfrastruktur erkänns [kontrakt 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot och Christian Beck tackar det federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF, bidragsnummer 05K19VTB) för finansiering av sina postdoktorala stipendier.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Tags

Denna månad i JoVE nummer 182
Högupplöst neutronspektroskopi för att studera pikosekund-nanosekunddynamik hos proteiner och hydratiseringsvatten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pounot, K., Appel, M., Beck, C.,… More

Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter