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Biochemistry

Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Abstract

O espalhamento de nêutrons oferece a possibilidade de sondar a dinâmica dentro das amostras para uma ampla gama de energias de forma não destrutiva e sem marcação além do deutério. Em particular, a espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons registra os sinais de espalhamento em vários ângulos de espalhamento simultaneamente e é adequada para estudar a dinâmica de sistemas biológicos na escala de tempo ps-ns. Ao empregar D2O - e possivelmente componentes tampão deuterizados - o método permite monitorar tanto a difusão do centro de massa quanto os movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral (dinâmica interna) de proteínas em estado líquido.

Adicionalmente, a dinâmica da água de hidratação pode ser estudada empregando-se pós de proteínas perdeuteradas hidratadas com H2O. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho empregado no instrumento IN16B no Institut Laue-Langevin (ILL) para investigar a dinâmica da água e proteína de hidratação. A preparação de amostras de solução e amostras de proteína hidratada em pó usando troca de vapor é explicada. O procedimento de análise de dados para a dinâmica da proteína e da água de hidratação é descrito para diferentes tipos de conjuntos de dados (espectros quasielásticos ou varreduras de janela fixa) que podem ser obtidos em um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons.

O método é ilustrado com dois estudos envolvendo proteínas amiloides. A agregação da lisozima em agregados esféricos de tamanho μm - partículas denotadas - é mostrada para ocorrer em um processo de uma etapa no espaço e intervalo de tempo sondados em IN16B, enquanto a dinâmica interna permanece inalterada. Posteriormente, a dinâmica da água de hidratação da tau foi estudada em pós hidratados de proteína perdeuterada. Mostra-se que os movimentos de translação da água são ativados na formação de fibras amiloides. Finalmente, etapas críticas no protocolo são discutidas quanto ao posicionamento do espalhamento de nêutrons em relação ao estudo da dinâmica em relação a outros métodos biofísicos experimentais.

Introduction

O nêutron é uma partícula massiva e sem carga que tem sido usada com sucesso ao longo dos anos para sondar amostras em vários campos, da física fundamental à biologia1. Para aplicações biológicas, o espalhamento de nêutrons a baixo ângulo, o espalhamento inelástico de nêutrons, a cristalografia e a reflectometria de nêutronssão extensivamente utilizados 2,3,4. O espalhamento inelástico de nêutrons fornece uma medida média da dinâmica sem a necessidade de marcação específica per se, e uma qualidade de sinal que não depende do tamanho ou da proteína5. A medida pode ser feita utilizando um ambiente de alta complexidade para a proteína em estudo que mimetiza o meio intracelular, como um lisado bacteriano deuterado ou mesmo invivo3,6,7. Diferentes configurações experimentais podem ser usadas para estudar a dinâmica, a saber: i) tempo de voo dando acesso à dinâmica sub-ps-ps, ii) retroespalhamento-dando acesso à dinâmica ps-ns, e iii) spin-eco-dando acesso à dinâmica de ns a centenas de ns. O retroespalhamento de nêutrons faz uso da lei de Bragg 2d sinθ = nλ, onde d é a distância entre planos em um cristal, θ o ângulo de espalhamento, n a ordem de espalhamento e λ o comprimento de onda. O uso de cristais para retroespalhamento em direção aos detectores permite alcançar uma alta resolução de energia, tipicamente ~0,8 μeV. Para medir a troca de energia, um drive Doppler carregando um cristal em retroespalhamento é usado para definir e sintonizar o comprimento de onda de nêutrons de entrada 8,9,10 (Figura 1), ou uma configuração de tempo de voo pode ser usada ao custo de uma diminuição na resolução de energia 11.

Figure 1
Figura 1: Esboço de um espectrômetro de retroespalhamento de nêutrons com acionamento Doppler. O feixe de entrada atinge o chopper42 de transformação do espaço de fase (PST), o que aumenta o fluxo na posição da amostra. Em seguida, ele é retroespalhado em direção à amostra pelo drive Doppler, que seleciona uma energia E1 (seta ciano). Os nêutrons são então espalhados pela amostra (com diferentes energias representadas pela cor das setas) e os analisadores, feitos de cristais de Si 111, só retroespalharão nêutrons com uma energia específica E0 (setas de cor vermelha aqui). Assim, a transferência de momento q é obtida a partir da posição detectada do nêutron no arranjo do detector, e a transferência de energia é obtida a partir da diferença E1- E0. O tempo de voo esperado para o pulso de nêutrons produzido pelo PST é usado para descartar o sinal dos nêutrons espalhados diretamente em direção aos tubos do detector. Abreviação: PST = transformação do espaço de fase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para a espectroscopia de retroespalhamento, a principal contribuição para o sinal de amostras ricas em prótons de hidrogênio, como proteínas, vem do espalhamento incoerente, para o qual a intensidade de espalhamento Sinc(q, ω) é mostrada por Eq (1)12

Equation 1 (1º)

Onde σinc é a seção transversal incoerente do elemento considerado, k' é a norma do vetor de onda disperso, k a norma do vetor de onda de entrada, q (= k - k') a transferência de momento, r j(t) o vetor de posição do átomo j no tempo t, e ω a frequência correspondente à transferência de energia entre o nêutron de entrada e o sistema. Os colchetes angulares denotam a média do conjunto. Assim, o espalhamento incoerente sonda a autocorrelação de partícula única média do conjunto das posições dos átomos com o tempo e fornece a autodinâmica média sobre todos os átomos no sistema e diferentes origens de tempo (média do conjunto). A função de espalhamento é a transformada de Fourier no tempo da função de espalhamento intermediário I(q, t), que pode ser vista como a transformada de Fourier no espaço da função de correlação de van Hove mostrada por Eq (2):

Equation 2 (2º)

Onde ρ(r,t) é a densidade de probabilidade de encontrar um átomo na posição r e no tempo t 13.

Para um processo de difusão fickiano, a função de autodifusão resulta (ver Eq (3)) após uma transformada dupla de Fourier em uma função de espalhamento consistindo em um Lorentziano de largura de linha dado por γ = Dq2.

Equation 10 (3º)

Modelos mais sofisticados foram desenvolvidos e considerados úteis, como o modelo de difusão por salto de Singwi e Sjölander para dinâmica interna de proteínas ps-ns14 ou o modelo de rotação por Sears para água de hidratação15,16,17.

No instrumento de retroespalhamento de nêutrons (NBS) IN16B 8,9 no ILL, Grenoble, França (Figura Suplementar S1), uma configuração comumente usada com proteínas consiste em cristais de Si 111 para os analisadores com um drive Doppler para sintonizar o comprimento de onda de entrada (Figura Suplementar S2A), dando acesso à faixa de transferência de momento ~0,2 Å-1 < q < ~2 Å-1 e faixa de transferência de energia de -30 μeV < Equation 3 < 30 μeV-correspondente a escalas de tempo que variam de alguns ps a alguns ns e distâncias de alguns Å. Além disso, o IN16B oferece a possibilidade de realizar varreduras de janela fixa elástica e inelástica (E/IFWS)10, que incluem a aquisição de dados em uma transferência de energia fixa. Como o fluxo é limitado quando se trabalha com nêutrons, o E/IFWS permite maximizar o fluxo para uma transferência de energia, reduzindo assim o tempo de aquisição necessário para obter uma relação sinal-ruído satisfatória. Uma opção mais recente é o modo11 do espectrômetro de retroespalhamento e tempo de voo (BATS), que permite a medição de uma ampla faixa de transferências de energia (por exemplo, -150 μeV < < Equation 3 150 μeV), com um fluxo maior do que com o acionamento Doppler, mas ao custo de uma resolução de energia menor (Figura Suplementar S2B).

Uma propriedade importante do espalhamento de nêutrons é que a seção transversal incoerente σinc tem um valor 40 vezes maior para o hidrogênio do que para o deutério e é insignificante para outros elementos comumente encontrados em amostras biológicas. Portanto, a dinâmica de proteínas em ambiente líquido pode ser estudada usando um tampão deuterado, e o estado de pó permite o estudo da dinâmica interna de proteínas com proteína hidrogenada em pó hidratadacom D 2 O, ou o estudo de água de hidratação para proteína perdeuterada em pó hidratada com H2O. No estado líquido, o retroespalhamento de nêutrons normalmente permite o acesso simultâneo do centro de massa de autodifusão de proteínas (difusão tipo fickiano) e sua dinâmica interna. Estes últimos são movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral usualmente descritos pelo chamado modelo de salto-difusãoou outros3,18. Em pós de proteína hidrogenada, a difusão da proteína está ausente e apenas a dinâmica interna precisa ser modelada. Para a água de hidratação, as contribuições dos movimentos de translação e rotação das moléculas de água apresentam uma dependência diferente da transferência de momento q, o que permite sua distinção no processo de análise dos dados17.

Este trabalho ilustra o método de retroespalhamento de nêutrons com o estudo de proteínas que se mostraram capazes de se desdobrar, agregar em uma forma canônica composta por pilhas de fitas de β - o chamado padrão de β cruzada19,20 - e formar fibras alongadas. Trata-se da chamada agregação amiloide, que é extensivamente estudada devido ao seu papel central em doenças neurodegenerativas, como as doenças de Alzheimer ouParkinson21,22. O estudo das proteínas amiloides também é motivado pelo papel funcional que elas podem desempenhar23,24 ou seu alto potencial para o desenvolvimento de novosbiomateriais25. Os determinantes físico-químicos da agregação amiloide permanecem obscuros, e nenhuma teoria geral da agregação amiloide está disponível, apesar do enorme progresso nos últimosanos21,26.

A agregação amiloide implica mudanças na estrutura e estabilidade de proteínas com o tempo, cujo estudo implica naturalmente dinâmica, ligada à estabilidade da conformação proteica, função proteica e paisagem energética proteica27. A dinâmica está diretamente ligada à estabilidade de um estado específico através da contribuição entrópica para os movimentos mais rápidos28, e a função da proteína pode ser sustentada por movimentos em várias escalas de tempo, desde sub-ps para proteínas sensíveis à luz29 até ms para movimentos de domínio, o que pode ser facilitado pela dinâmica picossegundo-nanossegundo30.

Dois exemplos de uso de espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons para estudar proteínas amiloides serão apresentados, um no estado líquido para estudar a dinâmica de proteínas e outro no estado pó hidratado para estudar a dinâmica da água de hidratação. O primeiro exemplo diz respeito à agregação de lisozima em esferas de tamanho μm (chamadas partículas) seguidas em tempo real5, e o segundo uma comparação da dinâmica da água em estados nativos e agregados da proteína humana tau31.

A lisozima é uma enzima envolvida na defesa imunológica e é composta por 129 resíduos de aminoácidos. A lisozima pode formar partículas em tampão deuterado a pD de 10,5 e a uma temperatura de 90 °C. Com o espalhamento de nêutrons, mostramos que a evolução temporal do coeficiente de difusão do centro de massa da lisozima segue a cinética exponencial única da fluorescência da tioflavina T (uma sonda fluorescente usada para monitorar a formação de padrões de β cruzada amiloide32), indicando que a formação de superestruturas particuladas e padrões de β cruzada ocorrem em uma única etapa com a mesma taxa. Além disso, a dinâmica interna permaneceu constante durante todo o processo de agregação, o que pode ser explicado por uma rápida mudança conformacional que não pode ser observada nos instrumentos NBS, ou pela ausência de mudança significativa na energia interna da proteína na agregação.

A proteína humana tau é uma proteína intrinsecamente desordenada (IDP) constituída por 441 aminoácidos para a chamada isoforma 2N4R, que está notavelmente envolvida na doença de Alzheimer33. Usando retroespalhamento de nêutrons em pós de proteína perdeuterada tau, mostramos que a dinâmica da água de hidratação está aumentada no estado de fibra, com uma maior população de moléculas de água sofrendo movimentos de translação. O resultado sugere que um aumento na entropia da água de hidratação pode conduzir a fibrilação amiloide da tau.

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Protocol

1. Preparar o tampão deuterado para proteínas no estado líquido

  1. Dissolva todos os componentes do tampão em D2O puro.
  2. Se o eletrodo de pH foi calibrado em H2O, ajustar o pD de acordo com a fórmula pD = pH + 0,4 usando NaOD ou DCl34.
    NOTA: A utilização de D2 O em vez de H2O pode afectar a solubilidade das proteínas e as condições de tampão poderão ter de ser adaptadas (por exemplo, por uma ligeira alteração na concentração de sal).

2. Preparar os pós H2O-hidratados de proteína perdeuterizada

  1. Prepare o porta-amostras.
    1. Limpe cuidadosamente um suporte plano de amostra de alumínio com sua vedação de fio de índio e parafusos com água e etanol e deixe secar.
      NOTA: Um suporte de amostra plano é usado de tal forma que o pó pode ser distribuído homogeneamente sobre a superfície. A quantidade de pó deve ser suficiente para que possa ser mantida entre as paredes e não caia quando o porta-amostras é colocado verticalmente.
    2. Pese as diferentes partes do suporte da amostra - fundo, tampa e fio de índio - separadamente em uma balança de precisão.
    3. Coloque o selo de fio de índio de 1 mm no sulco da parte inferior do porta-amostras, deixando uma pequena sobreposição onde as duas extremidades se unem (Figura 2A).
    4. Coloque uma quantidade adequada de proteína liofilizada (normalmente ~100 mg de proteína) de modo a preencher a superfície interior da parte inferior do porta-amostras.
  2. Hidrate a proteína em pó.
    1. Colocar o porta-amostras num exsicador com uma placa de Petri contendo pó de P2O5 durante 24 h para secar completamente o pó proteico35 (figura 2B). Pesar a parte do fundo seco do porta-amostras que contém o selo de índio e o pó seco para obter mseco.
      CUIDADO: P2O5 pó é muito corrosivo.
    2. Retire o P 2 O5 do exsicador e coloque uma placa de Petri com D2O dentro. Controle a massa do pó regularmente para verificar o nível de hidratação h = m hyd / m seco onde mhyd e m seco são a massa do pó hidratado e pó seco, respectivamente.
      NOTA: Para proteínas altamente hidrofóbicas, como a insulina, pode ser necessário aumentar a temperatura dentro do exsicador para obter uma pressão de vapor mais alta e atingir o nível de hidratação desejado h.
    3. Repetir os passos 2.2.1 e 2.2.2 pelo menos três vezes para converter correctamente todos os hidrogénios permutáveis em deuterons.
      NOTA: Alternativamente, ciclos de liofilização e dissolução em D2O puro podem ser utilizados para uma melhor troca H/D, desde que a proteína não seja afectada por ela.
    4. Hidrate o pó até um pouco acima do nível desejado, deixe a parte inferior do porta-amostras com o fio de índio e o pó hidratado permanecer na balança de precisão e espere que a massa diminua lentamente até o valor desejado para obter o h alvo (tipicamente 0,2-0,4 se uma proteína globular de tamanho médio for coberta por uma camada de hidratação completa).
    5. Coloque rapidamente a tampa na parte inferior e feche primeiro o porta-amostras com quatro parafusos para interromper a troca de vapor (Figura Suplementar S3A).
    6. Coloque e aperte todos os parafusos restantes até que não seja visível nenhum espaço entre a parte inferior e a tampa (Figura Suplementar S3B).
    7. Pesar o porta-amostras selado para verificar se existe qualquer potencial perda de hidratação devido a fugas após a experiência com neutrões.

3. Realizar o experimento de espalhamento de nêutrons incoerente

  1. Discutir e verificar novamente a configuração do instrumento necessário para o experimento com o contato local algumas semanas antes do tempo de feixe designado.
  2. Prepare a amostra no estado líquido.
    1. Dissolva a proteína no tampão deuterado.
    2. Determinar o volume adequado de líquido a colocar no porta-amostras utilizando água (certifique-se de que não há transbordamento quando o porta-amostras estiver fechado; Figura 2C).
      NOTA: As etapas a seguir (3.3 e 3.4) descrevem um experimento realizado com o espectrômetro NBS IN16B no ILL8,9, usando um crioforno como ambiente de amostra. O sistema de controlo de instrumentos mudará de um instrumento para outro, mas os princípios de funcionamento permanecem os mesmos.
  3. Insira o exemplo.
    1. Secar completamente o bastão da amostra (Figura 2D) e remover a amostra anterior, se houver, depois de verificar se a dose de radiação ionizante é inferior a 100 μSv/h antes de manusear qualquer material (no ILL).
    2. Colocar a amostra, verificar se há centralização adequada em relação ao centro do feixe (Figura Suplementar S4) e inserir o bastão da amostra no crioforno (Figura 2D). Ligue a bomba de vácuo para atingir menos de 10-3 bar e lave o ar dentro do crioforno repetindo as três vezes a seguir: encha o crioforno com gás hélio até que a pressão atmosférica seja atingida e remova o gás novamente usando a bomba de vácuo.
      NOTA: No caso de um porta-amostras plano, o porta-amostras deve ser orientado num ângulo de 45° em relação ao feixe de entrada. A faixa de transferência de momento útil pode ser reduzida devido à absorção e espalhamento pela célula. Um absorvedor de nêutrons forte, como o cádmio, pode ser usado para mascarar certas partes do suporte da amostra (por exemplo, parafusos, partes grossas).
    3. Introduza um pouco de gás hélio no crioforno de tal forma que a pressão seja de ~0,05 bar.
  4. Adquira dados (por exemplo, usando NOMAD em IN16B no ILL, supõe-se que o usuário prefere uma temperatura de 200 K antes de adquirir um espectro de nêutrons quasielástico (QENS), depois E/IFWS durante uma rampa de temperatura para 310 K a 0,5 K por minuto e, finalmente, um QENS a 310 K).
    1. Usando NOMAD, na guia de execução, arraste e solte um controlador FurnaceCryostat na Plataforma de Inicialização. Ajuste a temperatura para 200 K. Use o modo rápido e um tempo limite de 30 minutos para que a temperatura tenha tempo para estabilizar. Clique no ícone de setas giratórias para executá-lo em segundo plano para que os dados possam ser adquiridos durante a diminuição da temperatura.
    2. Arraste e solte o controlador IN16DopplerSettings , defina o perfil de velocidade como Velocidade precisa definida por Max ΔE, um valor de 0,00 μeV e 128 canais para obter uma configuração EFWS.
    3. Arraste e solte um controlador de Contagem , preencha o campo Legenda com um nome que permita fácil identificação dos dados e defina 60 repetições de varreduras de 30 s (Figura Suplementar S5A).
    4. Arraste e solte um controlador IN16DopplerSettings , defina o perfil de velocidade como Sine definido por Velocidade com um valor de 4,5 m/s e 2.048 canais para obter uma configuração QENS.
    5. Arraste e solte um controlador de contagem com 4 repetições de varreduras de 30 min (Figura suplementar S5B).
    6. Para a rampa de temperatura, arraste e solte um controlador FurnaceCryostat , ajuste a temperatura para 310 K, ajuste a rampa para SetPoint com Δ = 0,05 K e 6 s. Use um tempo limite de 220 min (Figura suplementar S6A).
    7. Use um loop for com 65 repetições. No interior, insira um controlador IN16DopplerSettings como na etapa 3.4.2, seguido por uma contagem única de 30 s. Posteriormente, insira IN16DopplerSettings, conforme descrito anteriormente, mas usando um deslocamento de energia de 1,5 μeV e 1.024 canais seguido por uma contagem única de 3 min (Figura Suplementar S6B).
    8. Para adquirir o último QENS em 310 K, arraste e solte os controladores IN16DopplerSettings e Count configurados conforme descrito nas etapas 3.4.4 e 3.4.5, respectivamente.
    9. Pressione o botão Iniciar (triângulo retângulo na parte inferior da janela) para executar o script.
      OBS: Todo experimento exigirá a aquisição de dados de calibração; isto é, a célula vazia para correções de subtração ou absorção, o tampão sozinho nas diferentes temperaturas usadas para modelar o fundo, e uma medição de vanádio (ou equivalentemente, a amostra a uma temperatura de 10 K ou inferior) para obter a função de resolução do instrumento.

4. Análise dos dados - QENS

  1. Importe o conjunto de dados usando o método 'IN16B_QENS.process()' no software Python nPDyn v3.x36
    >>>> de nPDyn.dataParsers importar IN16B_QENS

    >>> amostra = IN16B_QENS(
    ...
    ... [detGroup=... formato>]
    ... ). processo()

    >>> amostra = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Execute correções de dados (opcional) com os seguintes comandos (consulte a documentação do nPDyn para obter mais informações, Figura 3):
    #it é assumido que os dados para célula vazia, vanádio e buffer
    # foram importados já no conjunto de dados chamado 'empty_cell', 'vanádio',
    # e 'buffer', respectivamente.

    # para subtração de célula vazia com um fator de escala
    # (os erros são propagados automaticamente)
    >>> amostra = amostra - 0,95 * empty_cell

    # para correção usando o coeficiente de Paalman-Ping
    # (mutuamente exclusivo com o exemplo acima)
    >>> amostra = amostra.absorçãoCorrection(empty_cell)

    # para normalização
    >>> amostra = sample.normalize(vanádio)

    # para binning ao longo do eixo observável
    # observável é o tempo de agregação aqui
    >>> amostra = amostra.bin(3, eixo=0)
  3. Ajuste os dados de calibração. O conjunto de dados - amostras, célula vazia, buffer deuterado (se necessário) e vanádio - pode ser ajustado usando modelos internos ou um modelo definido pelo usuário (consulte a documentação do nPDyn):
    >>> da importação nPDyn.models.builtins (
    ... modeloPVoigt,
    ... modeloÁgua,
    ... modelCalibratedD2O,
    ...     )

    # Os modelos incorporados usam um vetor de coluna do momento
    # transferir valores q
    >>> q = vanádio.q[:, Nenhum]

    # o vanádio é ajustado usando um perfil pseudo-Voigt
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Use o modelo embutido para água de hidratação chamado 'modelWater'. Este modelo lê-se como mostra a Eq (4)17
    Equation 4 (4º)
    Onde a0, ar e at são escalares que representam a contribuição relativa do sinal elástico, movimentos rotacionais e movimentos de translação, respectivamente; j1(qd) é a função esférica de Bessel del ésima ordem, com q sendo a transferência de momento; d a distância O-H na molécula de água; δ(ω) é o delta de Dirac, que é multiplicado pelo EISF aqui; N é a ordem mais alta da função esférica de Bessel usada (tipicamente ~5); Equation 5 e são os movimentos rotacionais e Equation 11 translacionais de Lorentziano, respectivamente; b(q) é um termo de fundo plano. As funções esféricas de Bessel dão a contribuição relativa de cada estado de momento angular das moléculas de água, e o número N é determinado com base na faixa q de transferência de momento. No caso de um espectrômetro NBS típico, os termos até N = 4 explicam quase inteiramente o sinal (Figura Suplementar S7).
    # Aqui, a equação 2 é usada para água de hidratação
    # convolução com função de resolução e adição de
    # O fundo D2O é feito automaticamente com o
    # argumentos fornecidos
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=vanádio,
    ... bkgd=tampão,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    NOTA: As contribuições dos movimentos rotacionais e translacionais devem ser complicadas para serem perfeitamente rigorosas. O sucesso de um modelo aditivo deve ser atribuído à presença de populações distintas de água na superfície da proteína e à limitada faixa de energia acessível.
  5. Use o seguinte para plotar os dados (Figura 4):
    >>> do gráfico de importação nPDyn.plot
    >>> parcela(amostra)

5. Análise de dados - rampa de temperatura, varreduras elásticas de janela fixa (EFWS)

  1. Use um procedimento semelhante ao da seção 4 para normalizar os dados da rampa de temperatura pelo sinal na temperatura mais baixa (normalmente 10 K):
    >>> de nPDyn.dataParsers importar IN16B_FWS

    >>> amostra = IN16B_FWS(
    ... ,
    ... detGroup=[detGroup=]
    ... ). processo()

    # normalização com os 5 primeiros pontos no observável
    # eixo, que correspondem à temperatura
    >>> amostra /= amostra[:5].média(0)

    # O intervalo Momentum Transfer Q usado aqui é menor
    # como o modelo utilizado é válido apenas para baixo q
    >>> amostra = sample.get_q_range(0,2; 0,8)
  2. Use um modelo gaussiano simples para começar, cuja largura é dada pelo chamado deslocamento quadrático médio (MSD). Crie e ajuste o modelo usando os seguintes comandos:
    >>> Importar numpy como NP
    >>> de nPDyn.models importar Parâmetros, Modelo, Componente

    # a é um fator de escala
    >>> params = Parâmetros(
    ... a={'valor': 1, 'limites': (0, np.inf)},
    ... msd={'valor': 1, 'limites': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> modelo = Modelo (params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... «Gaussiano»,
    ... lambda x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, Nenhum])

    >>> parcela(amostra)
    NOTA: A aproximação gaussiana sempre vale para q2MSD << 1, mas uma faixa de transferência de momento mais ampla pode ser usada para comparação relativa entre amostras. Modelos mais sofisticados, que vão além da aproximação gaussiana, têm sido desenvolvidos37,38,39.

6. Análise dos dados - varreduras de janela fixa elástica e inelástica (E/IFWS)

  1. Semelhante à etapa 4, importe o conjunto de dados, mas usando a classe 'IN16B_FWS':
    >>> de nPDyn.dataParsers importar IN16B_FWS

    >>> amostra = IN16B_FWS(
    ...
    ... [detGroup=]
    ... ). processo()

    >>> amostra = sample.get_q_range(0,3; 1,8)
  2. Ajuste os dados de calibração e os dados de amostra.
    1. Analise os dados E/IFWS usando um MSD40 generalizado ou considerando-os como espectros QENS grosseiros (tendo apenas alguns pontos de dados no eixo de energia). Quando E/IFWS é visto como QENS-grosso, os modelos usados para QENS são usados para ajustar todo o conjunto de dados E/IFWS de uma só vez (ajuste global de transferências de energia e transferências de momento).
      NOTA: A última solução - usando modelos para QENS em dados E/IFWS - é usada aqui onde a dependência de transferência de momento da difusão do centro de massa e da dinâmica interna da proteína são impostas.
    2. Modele a dinâmica de proteínas em líquidos usando a seguinte Eq (5) ('modelProteinJumpDiff' em nPDyn):
      Equation 6 (5º)
      Onde R(q,ω) é a função de resolução; β um escalar independente para cada transferência de momento q; a0 é o fator de estrutura incoerente elástica (EISF); Equation 7 uma explicação lorentziana para o centro de difusão de massa com uma largura dada por Eq (6); Equation 12 é um Lorentziano que inclui o centro de difusão de massa e uma contribuição seguindo o modelo de salto-difusão14 levando em conta a dinâmica interna (Eq (7); Equation 8 sendo o sinal ajustado de D2O redimensionado por sua fração volumétrica na amostra.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds sendo o coeficiente de autodifusão.
      Equation 9 (7º)
      Di sendo o coeficiente de difusão aparente para a dinâmica interna e τ um tempo de relaxamento para movimentos difusivos.
      >>> da importação nPDyn.models.builtins (
      ... modeloPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modelCalibratedD2O,
      ... )

      # Os modelos incorporados usam um vetor de coluna do momento
      # transferir valores q
      >>> q = vanádio.q[:, Nenhum]

      # o vanádio é ajustado usando um perfil pseudo-Voigt
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # para D2O puro, um modelo com largura de linha calibrada
      # para diferentes temperaturas está incluído no nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Aqui, a equação 3 é usada para amostras líquidas
      # convolução com função de resolução e adição de
      # O plano de fundo do D2O é feito automaticamente com os argumentos # fornecidos
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=vanádio,
      ... bkgd=tampão,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Plote os dados ajustados usando:
    >>> do gráfico de importação nPDyn.plot
    >>> parcela(amostra)

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Representative Results

A agregação da lisozima em partículas foi realizada a 90 °C com concentração proteica de 50 mg/mL em tampão deuterado (NaCl 0,1 M a pD 10,5). A formação de particulados é desencadeada pelo aumento da temperatura para 90 °C e ocorre dentro de 6 h (Figura Suplementar S8). A aquisição de dados foi realizada no IN16B, conforme descrito no protocolo acima (os dados são permanentemente curados pelo ILL e acessíveis em http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Um espectro QENS foi adquirido a 7 °C para caracterizar completamente o estado inicial. Posteriormente, a temperatura foi aumentada para 90 °C (normalmente leva ~30 min em IN16B, Figura Suplementar S9) para desencadear o processo de agregação. A cinética pode ser acompanhada usando uma média deslizante dos espectros QENS, permitindo o acesso a toda a gama de transferência de energia, mas com uma resolução limitada no tempo. A resolução de tempo pode ser melhorada para ~1 min usando EFWS e para ~20 min usando E/IFWS em quatro valores de transferência de energia5.

No exemplo apresentado, exploramos as transferências de energia de 0, 0,6, 1,5 e 3 μeV. As varreduras E/IFWS são adquiridas continuamente durante o processo de agregação, e um espectro QENS foi adquirido para o estado final a 90 °C. Os dados de E/IFWS foram corrigidos para absorção usando o E/IFWS da célula vazia e normalizados usando os dados de vanádio.

Para a lisozima E/IFWS, observamos um aumento do sinal no tempo na transferência de baixo momento e baixa transferência de energia, enquanto o sinal na transferência de alta energia e baixa transferência de momento diminui (Figura 10 suplementar). Essa observação qualitativa indica a formação de objetos maiores, difundindo-se mais lentamente e confirmando que o processo de agregação ocorreu. A análise, segundo Eq (4), resulta em um coeficiente de difusão inicial do centro de massa de 15 Å2/ns, concordando com a presença de pequenos clusters proteicos (suportados por espalhamento dinâmico de luz e cálculos HYDROPRO 5,41), que então diminui exponencialmente ao longo do tempo (Figura 5). O coeficiente de difusão aparente para a dinâmica interna permanece constante durante todo o processo de agregação. Assim, a formação de particulados lisozima parece ocorrer em uma única fase de agregação. A ausência de mudança na dinâmica interna da proteína sugere que a conversão para β cruzada e a possível mudança associada na energia são muito rápidas ou que outros efeitos impulsionadores, como um aumento na entropia do solvente, podem estar dominando totalmente dentro da faixa de energia investigada.

O estudo da dinâmica da água de hidratação em torno de monômeros e fibras de tau foi realizado em SPHERES no Maier-Leibnitz Zentrum (MLZ) em Garching, Alemanha, utilizando o protocolo descrito acima para amostras de pó. Foram utilizados aproximadamente 100 mg de proteína deuterada de tau em pó, hidratada a 0,4 g de H2O por g de proteína. EFWS foram adquiridos durante uma rampa de temperatura e espectros QENS em temperatura constante. Os EFWS foram registrados a partir de 20 K e aumentando a temperatura para 300 K a uma taxa de 0,2 K/min enquanto os dados foram continuamente adquiridos durante 5 min de varreduras.

Os espectros QENS foram registrados em 20 e 280 K. Os dados do EFWS foram ajustados usando um Gaussiano simples sobre a faixa de transferência de momento q 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 para extrair o MSD (Figura Suplementar S11A). Os valores de DMP estão acima do limite de validade para o modelo gaussiano. Assim, recomenda-se, neste caso, explorar outros modelos além da aproximação gaussiana37,38,39. Em temperaturas superiores a 220 K, a água de hidratação ao redor das fibras de tau é significativamente mais móvel do que a água de hidratação ao redor dos monômeros de tau (Figura 6). O ajuste dos dados do QENS permite que os usuários obtenham a largura da linha e a contribuição relativa dos movimentos elásticos, rotacionais e translacionais da água de hidratação na amostra (Figura Suplementar S11B). Parece que a fração de moléculas de água em movimento de translação está aumentada ao redor das fibras, e os coeficientes de translação e rotação de difusão das moléculas de água estão aumentados ao redor das fibras17,31. Em contraste, a dinâmica interna ps-ns da proteína tau, refletindo os movimentos da espinha dorsal e da cadeia lateral, não se alterou com a fibrilação.

Figure 2
Figura 2: Base de um porta-amostra plano de alumínio. (A) O porta-amostras plano de alumínio apresenta uma parte central exposta aos nêutrons, onde o pó proteico é mantido dentro de um pequeno espaço - tipicamente ~0,3 mm - entre a base e a tampa. Um fio de índio pode ser usado para vedação, pois resiste a aumentos de temperatura de até 90 °C. Em caso de temperaturas mais altas, um selo de teflon pode ser usado. (B) O pó de proteína é colocado na base do porta-amostras com o fio de índio no lugar. O porta-amostras é colocado num exsicador na presença de P 2 O5 para secagem ou H 2 O/D2Opara hidratação. Graxa a vácuo é adicionada para evitar qualquer vazamento entre o fundo e a tampa do dessecador. O vácuo pode ser usado com cautela para acelerar o processo de secagem. O aquecimento do fundo do exsicador pode ser necessário para amostras altamente hidrofóbicas. (C) A solução proteica é colocada entre os cilindros interno e externo. Certifique-se de não pipetar muito líquido (não deve haver transbordamento quando o porta-amostras estiver fechado). O fio de índio é colocado no sulco circular. (D) O bastão de amostra (em segundo plano) fornece controle sobre a altura e orientação da amostra e pode incluir diferentes controladores e detectores para ambientes de amostra (temperatura, pressão). O bastão de amostra é inserido a partir do topo do crioforno (frente), que fornece controle para a temperatura durante o experimento. Durante o experimento, o feixe de nêutrons geralmente atinge o fundo do crioforno, como indicado pelo retângulo branco (o tamanho do feixe depende da configuração do instrumento). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Correções e normalização dos dados podem melhorar o ajuste. Os dados foram importados no programa nPDyn, conforme descrito no protocolo. À esquerda, o conjunto de dados foi normalizado usando apenas os dados do monitor. À direita, o sinal da lata vazia foi usado juntamente com os coeficientes de Paalman-Ping43 para corrigir a absorção de nêutrons do porta-amostras. Posteriormente, o modelo ajustado para o sinal de vanádio foi integrado independentemente para cada transferência de momento q, e o resultado foi usado para normalizar o conjunto de dados amostrais. Em ambos os gráficos, S(q,ω) denota o sinal de espalhamento, q é a transferência de momento e Equation 3 é a transferência de energia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Janela de plotagem gerada pelo nPDyn mostrando o resultado do ajuste. Os dados do QENS foram ajustados com nPDyn, conforme descrito no protocolo. A janela de plotagem permite que os usuários plotem os dados ao longo de diferentes eixos - observáveis (tempo, temperatura ou pressão), transferência de momento q ou transferência de energia - e seletores estão disponíveis para navegar ao longo dos outros eixos. Diferentes tipos de parcela estão disponíveis, com o simples 'Plot' apresentado em (A) e 'Analysis - q-wise' em (B). O botão 'Plot' mostra os diferentes conjuntos de dados em subplots separados, o botão 'Compare' mostra os conjuntos de dados no mesmo gráfico, o '3D plot' mostra os conjuntos de dados em diferentes subplots 3D semelhantes a s, o botão 'Analysis - q-wise' mostra os parâmetros ajustados como a função da transferência de momento q e 'Analysis - observable-wise' mostra os parâmetros ajustados em função do observável (tempo, temperatura ou pressão). Abreviação: QENS = espalhamento de nêutrons quasielástico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: A agregação da lisozima ocorre em um processo de uma etapa com dinâmica interna constante. A lisozima foi dissolvida no tampão de agregação (descrito em outra parte5), e E/IFWS foi adquirida ao longo da agregação, que foi desencadeada pelo aumento da temperatura para 90 °C. Após correção da absorção com célula vazia e normalização pelo sinal de vanádio, os dados foram analisados utilizando o modelo de salto-difusão, conforme descrito no protocolo. O coeficiente de autodifusão do centro de massa ajustado é plotado em função do tempo (triângulos azuis) juntamente com o coeficiente de difusão aparente para a dinâmica interna (quadrados laranjas). Esse número é de 5. Abreviação: E/IFWS = varreduras de janela fixa elásticas e inelásticas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: A dinâmica da água de hidratação é aumentada ao redor das fibras de tau. Os pós hidratados com H2de fibras de tau deuteradas e monômeros foram selados em um porta-amostra plano de alumínio, e os dados de EFWS foram adquiridos durante uma rampa de temperatura de 20 a 300 K. Após correção da absorção com célula vazia e normalização pelo sinal de vanádio, os dados foram analisados utilizando o modelo de salto-difusão, conforme descrito no protocolo. Esta imagem foi redesenhada usando uma faixa q menor (0,2 < q < 0,8 Å-1) a partir dos dados de 31. Abreviação: EFWS = varreduras elásticas de janela fixa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura Suplementar S1: Fotografias do instrumento IN16B no ILL. (topo) O instrumento IN16B visto da zona controlada por radiação dedicada ao instrumento. O feixe de entrada viaja dentro da guia de nêutrons para a câmara de vácuo, que contém a maioria dos elementos do instrumento (picador PST, analisadores, amostra, detectores). (abaixo) Interior da câmara de vácuo. O picador PST é visível, assim como os analisadores ao redor do crioforno que contém a amostra. Os detectores estão localizados atrás do crioforno. Cortesia de Laurent Thion, ecliptique. Abreviação: PST = transformação do espaço de fase. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S2: Esboço de IN16B nos modos clássico (com drive Doppler) e BATS. (A) O feixe de nêutrons é parcialmente monocromatizado pelo seletor de velocidade. Posteriormente, os picadores de fundo e PST produzirão um pulso de nêutrons, a partir do qual um perfil energético será selecionado pelo monocromador Doppler (modo E/IFWS ou QENS). Os nêutrons são então espalhados pela amostra, e uma única energia é refletida em direção aos detectores pelos analisadores. Cortesia do ILL. (B) Os picadores BATS são usados para definir um único pulso de nêutrons com uma faixa de energia definida. O feixe de nêutrons é parcialmente monocromatizado pelo seletor de velocidade. Posteriormente, o helicóptero de fundo removerá nêutrons indesejados que não pertencem ao pulso selecionado. Os nêutrons são então espalhados pela amostra, e uma única energia é refletida em direção aos detectores pelos analisadores. Cortesia do ILL. Abreviações: BATS = backscattering e espectrômetro de tempo de voo; PST = transformação do espaço de fase; E/IFWS = varreduras de janela fixa elástica e inelástica; QENS = espalhamento quaseelástico de nêutrons; PG = grafite pirolítico. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S3: O porta-amostras é fechado rapidamente após o pó ter atingido a hidratação desejada e selado. (A) O suporte plano da amostra é rapidamente fechado usando quatro parafusos. Uma pequena lacuna permanecerá devido ao fio de índio. Os outros parafusos são então adicionados, e o suporte da amostra é selado lentamente, apertando suavemente cada parafuso várias vezes para permitir que o índio relaxe. (B) O porta-amostras plano é devidamente selado quando não é mais visível qualquer espaço entre a base do suporte e a tampa. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S4: O suporte da amostra está centralizado em relação ao feixe de nêutrons. Foi colocado um porta-amostras cilíndrico no bastão de amostras. A posição do porta-amostras é verificada de modo a que o feixe atinja a parte inferior do suporte. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar S5: Aquisição de EFWS seguida de QENS na IN16B com NOMAD. (A) Os controladores relevantes são arrastados e soltos na Plataforma de Lançamento , conforme explicado no protocolo (etapas 3.4.1 a 3.4.3). Pode ser necessário clicar no cadeado (ícone verde no canto superior direito - painel vertical) para obter o controle na interface. (B) Os controladores relevantes são arrastados e soltos na Plataforma de Lançamento , conforme explicado no protocolo (etapas 3.4.4 a 3.4.5). Aqui, os dois últimos controladores são chamados IN16DopplerSettings e Count. Abreviações: QENS = espalhamento de nêutrons quasielástico, EFWS = varreduras de janela fixa elástica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S6: Configuração de uma rampa de temperatura e E/IFWS na IN16B com NOMAD. (A) O controlador FurnaceCryostat é adicionado na Plataforma de Lançamento e configurado conforme explicado no protocolo (etapa 3.4.6). (B) O controlador de loop For é adicionado na Plataforma de Lançamento e os controladores relevantes são inseridos nela e configurados conforme explicado no protocolo (etapa 3.4.7). Abreviação: E/IFWS = varreduras de janela fixa elásticas e inelásticas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S7: As cinco primeiras funções esféricas de Bessel explicam a maior parte da contribuição rotacional da água de hidratação. As oito primeiras funções esféricas de Bessel são plotadas usando um valor d = 0,98 Å e valores de transferência de momento q de 0 a 3 Å (linhas coloridas sólidas). O intervalo de transferência de momento de 0,3 Å < q < 1,8 Å é delimitado pelas linhas pontilhadas azuis. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S8: A lisozima forma reprodutível partículas. A lisozima foi dissolvida no tampão de agregação (preparado conforme descrito no protocolo, etapa 1), e ThT foi adicionado a uma concentração final de 2 μM para monitorar a formação da estrutura de β cruzada usando fluorescência. O gráfico representa a média de três medidas independentes, e as barras de erro são o desvio padrão. O inset mostra uma fotografia de microscopia de fluorescência das partículas formadas após 6 h de agregação. Barra de escala = 20 μm. Esse número é de 5. Abreviação: ThT = tioflavina T. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S9: Rampa de temperatura rápida conforme disponível na IN16B. No modo rápido na IN16B, a temperatura pode ser aumentada de 280 K para 363 K em aproximadamente 30 min. Esse número é de 5. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S10: Dados E/IFWS sobre lisozima durante a agregação em partículas. A lisozima foi dissolvida no tampão de agregação (descrito em outra parte5), e E/IFWS foi adquirida ao longo da agregação, que foi desencadeada pelo aumento da temperatura para 90 °C. Os dados - após a correção da absorção com uma célula vazia e normalização usando o sinal de vanádio - são plotados contra a transferência de momento q e tempo para as diferentes transferências de energia medidas, 0 μeV (superior esquerdo), 0,6 μeV (superior direito), 1,5 μeV (inferior esquerdo) e 3 μeV (inferior direito). Para cada subparcela, o eixo vertical corresponde ao sinal de espalhamento S(q, ΔE), plotado contra o tempo experimental em horas e a transferência de momento q. Esse número é de 5. Abreviação: E/IFWS = varreduras de janela fixa elásticas e inelásticas. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar S11: Adaptação dos dados de água de hidratação de tau. (A) Ajuste dos dados do EFWS usando um Gaussian. O pó hidratado de H2de monômeros deuterados de tau foi selado em um porta-amostra plano de alumínio, e EFWS foram adquiridos durante uma rampa de temperatura de 20 a 300 K. Os dados experimentais (sinal elástico S(q, 0) no eixo vertical-linha azul com barras de erro) são plotados para a faixa q de transferência de momento 0,2 < q < 0,6 Å-1 juntamente com o Gaussiano ajustado usado para extrair o MSD. (B) Movimentos de translação e rotação da água de hidratação obtidos a partir da adaptação QENS. Os pós hidratados com H2de fibras de tau deuteradas (esquerda) e monômeros (direita) foram selados em um porta-amostra plano de alumínio, e os dados do QENS foram adquiridos a 280 K. Os dados experimentais (intensidade S(q,ω) em função da transferência de energia) para fibras (triângulos azuis) e monômeros (pontos verdes) são plotados juntamente com o modelo ajustado (linha sólida preta) e seus componentes, fundo (azul), função de resolução (verde), rotações (vermelho) e translações (ciano) para a transferência de momento q = 0,783 Å-1. Esse número é de 31. Abreviações: QENS = espalhamento de nêutrons quasielástico, EFWS = varreduras de janela fixa elástica; DMP = deslocamento quadrático médio. Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

A espectroscopia de nêutrons é o único método que permite sondar a dinâmica ps-ns média do conjunto de amostras de proteínas, independentemente do tamanho da proteína ou da complexidade da solução quando a deuteração é usada6. Especificamente, investigando a autodifusão de conjuntos de proteínas em solução, o tamanho hidrodinâmico de tais montagens pode ser determinado de forma inequívoca. No entanto, o método é comumente limitado pelo baixo fluxo de nêutrons, o que implica longos tempos de aquisição e a necessidade de altas quantidades de amostra (tipicamente 100 mg de proteína) para obter uma boa relação sinal-ruído dentro do tempo de feixe alocado.

Preparo da amostra (protocolo etapas 1 e 2). Para amostras de estado líquido, a concentração mínima que pode ser usada é de ~50 mg/mL (concentrações mais baixas podem ser usadas ao custo de tempos de aquisição prolongados). A alta concentração de proteínas está associada a taxas de fibrilação mais rápidas, o que ajuda no ajuste da medida no tempo de feixe alocado, mas também pode afetar a via de agregação44. Assim, a caracterização completa das amostras com métodos complementares, como força atômica ou microscopia eletrônica, é necessária.

O material do porta-amostras também é um ponto a ser abordado na preparação das amostras, pois as ligas de alumínio estão sujeitas à corrosão45. Uma liga de alumínio típica que apresenta boa resistência à corrosão e tem baixa absorbância de nêutrons é a norma europeia (EN) AW-6060 [AlMgSi] feita de 98%-98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35%-0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1%, 0,1%-0,3% Fe e 0,3%-0,6% Si. A corrosão pode ser minimizada, por exemplo, reduzindo o tempo no porta-amostras ou usando um revestimento protetor (que pode adicionar ao sinal de fundo), como níquel ou ouro.

Para amostras de pó de proteínas hidrogenadas, o procedimento de liofilização mostrou-se eficientemente completado com uma etapa em um exsicador na presença de pó de P2O5 para remover o máximo possível de água leve residual35. Para amostras de pó, também é aconselhável caracterizar (usando microscopia de força atômica e difração de raios X do pó) o pó em seu estado final hidratado e avaliar o efeito da deuteração, liofilização e difusão de vapor nos estados de monômero e fibra. Em particular, a liofilização pode quebrar as fibras, resultando em segmentos encurtados, sem afetar a morfologia. Além disso, foi observado por difração de potência de raios X que o resfriamento lento, em vez do resfriamento flash em nitrogênio líquido, poderia induzir a presença de estruturas semelhantes a amiloide (resultado não publicado).

Coleta de dados (etapa 3 do protocolo). Recomenda-se planejar a coleta de dados com o contato local antes do experimento (mesmo que tenha sido discutido durante o processo de redação da proposta). O plano de coleta de dados está sujeito a alterações após as primeiras varreduras, dependendo da relação sinal-ruído obtida. Para experimentos resolvidos no tempo em particular, o uso de E/IFWS permite uma coleta rápida de dados - 30 s a 1 min para a linha elástica, 4-5 min para um ponto de dados a 3 μeV5 - mas o alcance das transferências de energia acessíveis é inerentemente limitado. Alternativamente, uma média móvel dos dados QENS pode ser usada46. Para este fim, a nova opção de retroespalhamento e espectroscopia de tempo de voo (BATS) no IN16B oferece um fluxo mais alto do que o IN16B clássico com uma faixa de energia de ±150 μeV (ou superior, dependendo da configuração usada) ao custo de menor resolução em energia11. Portanto, a opção BATS é recomendada para estudos resolvidos no tempo, especialmente para processos como a agregação amiloide, que ocorre ao longo de várias horas.

Análise dos dados (protocolo etapas 4, 5 e 6). A função de espalhamento S(q,ω) inclui todos os tipos de movimentos na amostra, e os modelos descritos no protocolo acima são aproximações. Em particular, para IDP no estado líquido, os movimentos em grande escala da cadeia desordenada podem ocorrer no mesmo comprimento e escala de tempo que o centro de difusão de massa de toda a proteína. Assim, o usuário deve ter em mente que a separação da difusão do centro de massa e da dinâmica interna da proteína nem sempre é direta. O procedimento de adaptação pode se beneficiar de informações sobre centro de difusão de massa obtidas por métodos complementares, de modo que este parâmetro possa ser fixado (lembrando que outros métodos podem fornecer um coeficiente de difusão coletivo associado a diferentes escalas de tempo e comprimento) para obter um resultado mais robusto para a dinâmica interna.

Além do espalhamento de nêutrons, a dinâmica de um sistema molecular pode ser caracterizada por ressonância magnética nuclear (RMN), que fornece informações locais sobre proteínas marcadas com isótopos e em uma ampla faixa de escalas de tempo47,48,49. O método tem sido utilizado com sucesso para estudar sistemas amiloides 48,50,51,52,53, mas não permite que os usuários simplesmente estudem a água de hidratação ou acompanhem o processo de agregação amiloide em tempo real devido à limitação inerente ao tamanho da proteína. Desenvolvimentos recentes em espectroscopia de ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e o método derivado de EPR Overhauser dynamic nuclear polarizization (ODNP) oferecem uma boa perspectiva quando combinados com espalhamento de nêutrons. De fato, embora a marcação de spin dirigida por sítio (SDSL), EPR e ODNP podem sondar a proteína54 e a dinâmica de hidratação55, respectivamente, na escala de tempo ps-ns em torno do rótulo de spin introduzido.

Estes métodos foram utilizados para estudar a agregação da proteína tau56,57 e oferecerão grande complementaridade com o espalhamento de nêutrons que pode obter informações semelhantes, mas calculadas em média em toda a amostra. Além disso, a espectroscopia no infravermelho pode fornecer informações dinâmicas para movimentos de alta energia associados a padrões estruturais específicos, mas a complexidade do ambiente proteico (tampão utilizado) pode afetar a interpretação dos dados58,59. As técnicas de retroespalhamento de nêutrons fornecem uma visão única e complementar sobre a dinâmica de proteínas e água de hidratação na escala de tempo ps-ns, juntamente com os resultados dos métodos acima mencionados. Não requerem marcação específica da amostra, a qualidade do sinal não é sensível ao tamanho da proteína e as medidas podem ser feitas in vivo ou em ambientes deuterados de alta complexidade, como o lisado bacteriano deuterado 3,6,7. Como este método fornece um resultado de média de conjunto, ele é bem complementado por simulações de dinâmica molecular para obter informações atômico-detalhadas sobre o sistema em estudo. As simulações podem ser facilmente validadas por uma comparação direta entre o conjunto de dados experimentais e os espectros teóricos QENS calculados a partir da trajetória da simulação usando um software como o mdanse60.

Em relação aos sistemas amiloides, o retroespalhamento de nêutrons tem se mostrado útil para caracterizar a dinâmica da proteína ps-ns e da água para vários sistemas e condições 5,31,61,62,63,64. Em particular, o retroespalhamento de nêutrons foi usado para revelar a correlação entre a proporção da sequência de proteínas envolvidas na estrutura de β cruzada e a amplitude do ganho de entropia da água após a fibrilação (resultados não publicados). Além disso, o desenvolvimento de ambientes de amostra permite a aquisição simultânea de espectros de nêutrons e dados de relaxação dielétrica65 ou dados de espalhamento Raman66. Além disso, detectores de difração estão presentes no IN16B para obter dados estruturais juntamente com dados dinâmicos. Além disso, espera-se que o fluxo de nêutrons de entrada seja melhorado para o modo BATS da IN16B em um futuro próximo, graças ao uso da chamada guia de focalização variável, cuja geometria pode ser adaptada sob demanda à configuração instrumental usada. Impulsionar ainda mais o desenvolvimento de ambientes sofisticados de amostras e instrumentação permitiria experimentos ainda mais complexos no futuro, possivelmente fornecendo mais informações dinâmicas e estruturais ao mesmo tempo.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Acknowledgments

Os autores são gratos a Michaela Zamponi, do Jülich Centre for Neutron Science no Heinz Maier-Leibnitz Zentrum, Garching, Alemanha, por parte dos experimentos de espalhamento de nêutrons realizados no instrumento SPHERES. Este trabalho beneficiou das actividades do consórcio Deuteration Laboratory (DLAB) financiado pela União Europeia ao abrigo dos contratos HPRI-2001-50065 e RII3-CT-2003-505925, e da actividade financiada pelo UK Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) no âmbito do Institut Laue Langevin EMBL DLAB ao abrigo das subvenções GR/R99393/01 e EP/C015452/1. É reconhecido o apoio da Comissão Europeia no âmbito do 7.º Programa-Quadro através da Acção-chave: Reforçar o Espaço Europeu da Investigação, as infraestruturas de investigação [Contrato 226507 (NMI3)]. Kevin Pounot e Christian Beck agradecem ao Ministério Federal de Educação e Pesquisa (BMBF, bolsa número 05K19VTB) pelo financiamento de suas bolsas de pós-doutorado.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

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References

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