Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63664
Automatic Translation
1,2, 2, 1,2, 3, 3, 4, 2, 1
1Institut für Angewandte Physik, Universität Tübingen, 2Institut Max von Laue - Paul Langevin (ILL), 3Institut de Biologie Structurale, Université Grenoble Alpes, 4Institut Européen de Chimie et Biologie, Bordeaux INP, Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (CBMN), Université de Bordeaux

Summary

Спектроскопия обратного рассеяния нейтронов обеспечивает неразрушающий и свободный от меток доступ к ps-ns динамике белков и их гидратационной воде. Рабочий процесс представлен двумя исследованиями амилоидных белков: динамики лизоцима во время агрегации с временным разрешением и динамики гидратационной воды тау при образовании волокон.

Abstract

Рассеяние нейтронов дает возможность исследовать динамику в образцах для широкого диапазона энергий неразрушающим способом и без маркировки, кроме дейтерия. В частности, спектроскопия обратного рассеяния нейтронов регистрирует сигналы рассеяния при нескольких углах рассеяния одновременно и хорошо подходит для изучения динамики биологических систем на шкале времени ps-ns. ИспользуяD2O- и, возможно, дейтерированные буферные компоненты, метод позволяет контролировать как диффузию центра масс, так и движения основной цепи и боковой цепи (внутреннюю динамику) белков в жидком состоянии.

Кроме того, динамика гидратационной воды может быть изучена с использованием порошков пердейтерированных белков, гидратированных с H2O. В этой статье представлен рабочий процесс, используемый на приборе IN16B в Институте Лауэ-Ланжевена (ILL) для исследования динамики белковой и гидратационной воды. Объясняется приготовление образцов раствора и образцов гидратированного протеинового порошка с использованием парообмена. Описана процедура анализа данных как белковой, так и гидратационной динамики воды для различных типов наборов данных (квазиупругие спектры или сканирование с фиксированным окном), которые могут быть получены на спектрометре обратного рассеяния нейтронов.

Метод проиллюстрирован двумя исследованиями с участием амилоидных белков. Показано, что агрегация лизоцима в сферические агрегаты размером с мкм, обозначенные частицами, происходит в одностадийном процессе в пространственно-временном диапазоне, исследованном на IN16B, в то время как внутренняя динамика остается неизменной. Далее изучали динамику гидратации воды тау на гидратированных порошках пердейтерированного белка. Показано, что поступательные движения воды активируются при образовании амилоидных волокон. Наконец, обсуждаются критические шаги в протоколе относительно того, как рассеяние нейтронов позиционируется по отношению к изучению динамики по отношению к другим экспериментальным биофизическим методам.

Introduction

Нейтрон представляет собой массивную частицу без заряда, которая на протяжении многих лет успешно использовалась для зондирования образцов в различных областях от фундаментальной физики до биологии1. Для биологических применений широко используются малоугловое рассеяние нейтронов, неупругое рассеяние нейтронов, а также нейтронная кристаллография и рефлектометрия 2,3,4. Неупругое рассеяние нейтронов обеспечивает усредненное по ансамблю измерение динамики, не требующее специфической маркировки как таковой, и качество сигнала, которое не зависит от размера или белка5. Измерение может быть выполнено с использованием очень сложной среды для исследуемого белка, которая имитирует внутриклеточную среду, такую как дейтерированный бактериальный лизат или даже in vivo 3,6,7. Для изучения динамики могут быть использованы различные экспериментальные установки, а именно: i) доступ к динамике суб-ps-ps, дающий время пролета, ii) доступ к динамике ps-ns, дающий обратное рассеяние, и iii) спин-эхо-дающий доступ к динамике от нс до сотен нс. Обратное рассеяние нейтронов использует закон Брэгга 2d sinθ = nλ, где d — расстояние между плоскостями в кристалле, θ — угол рассеяния, n — порядок рассеяния и λ — длина волны. Использование кристаллов для обратного рассеяния по направлению к детекторам позволяет достичь высокого разрешения по энергии, обычно ~ 0,8 мкВ. Для измерения энергообмена используется либо доплеровский привод, несущий кристалл в обратном рассеянии, для определения и настройки входящей длины волны нейтрона 8,9,10 (рис. 1), либо времяпролетная установка может быть использована за счет уменьшения энергетического разрешения 11.

Figure 1
Рисунок 1: Эскиз спектрометра обратного рассеяния нейтронов с доплеровским приводом. Входящий луч попадает на прерыватель42 преобразования фазового пространства (PST), который увеличивает поток в положении образца. Затем он обратно рассеивается по направлению к образцу доплеровским приводом, который выбирает энергию E1 (голубая стрелка). Затем нейтроны рассеиваются образцом (с различными энергиями, представленными цветом стрелок), и анализаторы, изготовленные из кристаллов Si 111, будут рассеивать только нейтроны с определенной энергией E0 (здесь красные стрелки). Следовательно, передача импульса q получается из обнаруженного положения нейтрона на матрице детекторов, а передача энергии получается из разности E1 - E0. Время пролета, ожидаемое для нейтронного импульса, создаваемого PST, используется для отбрасывания сигнала от нейтронов, рассеянных непосредственно к детекторным трубкам. Аббревиатура: PST = преобразование фазового пространства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Для спектроскопии обратного рассеяния основной вклад в сигнал от образцов, богатых протонами водорода, таких как белки, приходится на некогерентное рассеяние, для которого интенсивность рассеяния Sinc(q, ω) показана уравнением (1)12

Equation 1 (1)

Где σinc — некогерентное поперечное сечение рассматриваемого элемента, k' — норма рассеянного волнового вектора, k — норма входящего волнового вектора, q (= k - k') — передача импульса, r j(t) — вектор положения атома j в момент времени t, а ω — частота, соответствующая переносу энергии между входящим нейтроном и системой. Угловые скобки обозначают среднее значение ансамбля. Следовательно, некогерентное рассеяние исследует усредненную по ансамблю самокорреляцию положений атомов во времени и дает самодинамику, усредненную по всем атомам в системе и различным временным началам (среднее значение ансамбля). Функция рассеяния является преобразованием Фурье во времени промежуточной функции рассеяния I(q, t), которое можно рассматривать как преобразование Фурье в пространстве корреляционной функции Ван Хова, показанное уравнением (2):

Equation 2 (2)

Где ρ(r,t) — плотность вероятности нахождения атома в положении r и времени t 13.

Для фиковского диффузионного процесса функция самодиффузии возникает (см. Eq (3)) после двойного преобразования Фурье в функции рассеяния, состоящей из лоренциана ширины линии, заданной γ = Dq2.

Equation 10 (3)

Были разработаны и признаны полезными более сложные модели, такие как модель скачкообразной диффузии Сингви и Шёландера для внутренней динамики белкаps-ns 14 или модель вращения Sears для гидратационной воды15,16,17.

На приборе обратного рассеяния нейтронов (NBS) IN16B 8,9 в ILL, Гренобль, Франция (дополнительный рисунок S1), установка, обычно используемая с белками, состоит из кристаллов Si 111 для анализаторов с доплеровским приводом для настройки входящей длины волны (дополнительный рисунок S2A), тем самым предоставляя доступ к диапазону передачи импульса ~ 0,2 Å-1 < q < ~ 2 Å-1 и диапазону передачи энергии -30 мкэВ < Equation 3 < 30 мкэВ, что соответствует временным шкалам в диапазоне от нескольких пс до нескольких нс и расстояний в несколько Å. Кроме того, IN16B предлагает возможность выполнять упругое и неупругое сканирование с фиксированным окном (E/IFWS)10, которое включает сбор данных при фиксированной передаче энергии. Поскольку поток ограничен при работе с нейтронами, E/IFWS позволяет максимизировать поток для одной передачи энергии, тем самым сокращая время сбора данных, необходимое для получения удовлетворительного отношения сигнал/шум. Более поздним вариантом является режим11 спектрометра обратного рассеяния и времяпролетного спектрометра (BATS), который позволяет измерять широкий диапазон переносов энергии (например, -150 мкВ < < Equation 3 150 мкВ) с более высоким потоком, чем с доплеровским приводом, но за счет более низкого энергетического разрешения (дополнительный рисунок S2B).

Важным свойством рассеяния нейтронов является то, что некогерентное поперечное сечение σвключительно имеет в 40 раз более высокое значение для водорода, чем для дейтерия, и пренебрежимо мало для других элементов, обычно встречающихся в биологических образцах. Следовательно, динамика белков в жидкой среде может быть изучена с использованием дейтерированного буфера, а состояние порошка позволяет изучать либо внутреннюю динамику белка с гидрогенизированным протеиновым порошком, гидратированным сD2O, либо исследование гидратационной воды для пердейтерированного протеинового порошка, гидратированного с H2O. В жидком состоянии обратное рассеяние нейтронов обычно позволяет одновременно получить доступ к самодиффузии белков в центре масс (диффузия фиковского типа) и их внутренней динамике. Последние представляют собой движения основной цепи и боковой цепи, обычно описываемые так называемой скачкообразной диффузионной моделью или другими 3,18. В гидрогенизированных протеиновых порошках диффузия белка отсутствует и необходимо моделировать только внутреннюю динамику. Для гидратационной воды вклад поступательных и вращательных движений молекул воды представляет различную зависимость от передачи импульса q, что позволяет различать их в процессе анализа данных17.

Эта работа иллюстрирует метод обратного рассеяния нейтронов с изучением белков, которые, как было установлено, способны разворачиваться, агрегироваться в каноническую форму, состоящую из стопок β-нитей - так называемого перекрестного β паттерна19,20 - и образовывать удлиненные волокна. Это так называемая амилоидная агрегация, которая широко изучается из-за ее центральной роли в нейродегенеративных расстройствах, таких как болезни Альцгеймера или Паркинсона21,22. Изучение амилоидных белков также мотивировано функциональной ролью, которую они могут играть 23,24, или их высоким потенциалом для разработки новых биоматериалов25. Физико-химические детерминанты агрегации амилоида остаются неясными, и нет общей теории агрегации амилоида, несмотря на огромный прогресс за последниегоды 21,26.

Агрегация амилоида подразумевает изменения структуры и стабильности белка с течением времени, изучение которых, естественно, подразумевает динамику, связанную со стабильностью конформации белка, функцией белка и энергетическим ландшафтомбелка 27. Динамика напрямую связана со стабильностью определенного состояния через энтропийный вклад для самых быстрых движений28, и функция белка может поддерживаться движениями в различных временных масштабах от суб-пс для светочувствительных белков29 до мс для доменных движений, что может быть облегчено пикосекундно-наносекундной динамикой30.

Будут представлены два примера использования спектроскопии обратного рассеяния нейтронов для изучения амилоидных белков: один в жидком состоянии для изучения динамики белка и один в гидратированном порошковом состоянии для изучения динамики гидратационной воды. Первый пример касается агрегации лизоцима в сферы размером мкм (называемые частицами), за которой следуют в режимереального времени 5, а второй - сравнение динамики воды в нативном и агрегированном состояниях человеческого белка тау-31.

Лизоцим является ферментом, участвующим в иммунной защите и состоит из 129 аминокислотных остатков. Лизоцим может образовывать твердые частицы в дейтерированном буфере при pD 10,5 и температуре 90 °C. С помощью рассеяния нейтронов мы показали, что временная эволюция коэффициента диффузии лизоцима в центре масс следует за одной экспоненциальной кинетикой флуоресценции тиофлавина Т (флуоресцентный зонд, используемый для мониторинга образования амилоидных перекрестных β паттернов32), что указывает на то, что образование сверхструктур частиц и перекрестных β происходит за один шаг с одинаковой скоростью. Более того, внутренняя динамика оставалась постоянной на протяжении всего процесса агрегации, что можно объяснить либо быстрым конформационным изменением, которое невозможно наблюдать на приборах NBS, либо отсутствием существенного изменения внутренней энергии белка при агрегации.

Человеческий белок тау представляет собой внутренне неупорядоченный белок (IDP), состоящий из 441 аминокислоты для так называемой изоформы 2N4R, которая, в частности, участвует в болезни Альцгеймера33. Используя обратное рассеяние нейтронов на порошках пердейтерированного белка тау, мы показали, что динамика гидратационной воды увеличивается в состоянии волокна с более высокой популяцией молекул воды, претерпевающих поступательные движения. Результат свидетельствует о том, что увеличение энтропии гидратации воды может привести к фибрилляции амилоида тау.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовьте дейтерированный буфер для белков в жидком состоянии

  1. Растворите все компоненты буфера в чистом виде D2O.
  2. Если pH-электрод был откалиброван в H2O, отрегулируйте pD по формуле pD = pH + 0,4 с помощью NaOD или DCl34.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование D 2 O вместо H2O может повлиять на растворимость белка, и, возможно, потребуется адаптировать буферные условия (например, путем небольшого изменения концентрации соли).

2. Приготовьте H2O-гидратированные порошки пердейтерированного белка.

  1. Подготовьте держатель образца.
    1. Тщательно очистите плоский алюминиевый держатель образца с уплотнением из индиевой проволоки и винтами водой и этанолом и дайте ему высохнуть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Плоский держатель образца используется таким образом, чтобы порошок мог быть равномерно распределен по поверхности. Количество порошка должно быть достаточным, чтобы его можно было удерживать между стенками и не падать при вертикальном размещении держателя образца.
    2. Взвесьте различные части держателя образца - дно, крышку и индиевую проволоку - отдельно на прецизионных весах.
    3. Поместите уплотнение из индиевой проволоки диаметром 1 мм в канавку нижней части держателя образца, оставив небольшое перекрытие в месте соединения двух концов (рис. 2A).
    4. Поместите соответствующее количество лиофилизированного белка (обычно ~ 100 мг белка) так, чтобы он заполнил внутреннюю поверхность нижней части держателя образца.
  2. Увлажните протеиновый порошок.
    1. Поместите держатель образца в эксикатор с чашкой Петри, содержащей порошок P2O5 , на 24 часа, чтобы полностью высушить протеиновый порошок35 (рис. 2B). Взвесьте сухую нижнюю часть держателя образца, содержащую индиевую печать и сухой порошок, чтобы получитьm сухой.
      ВНИМАНИЕ: порошок P2O5 очень агрессивен.
    2. Извлеките P 2 O5 из эксикатора и поставьте чашку Петри с D2O внутри. Регулярно контролируйте массу порошка, чтобы проверить уровень гидратации h = m hyd / m dry, где mhyd и mdry - это масса гидратированного порошка и сухого порошка соответственно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для высокогидрофобных белков, таких как инсулин, может потребоваться повысить температуру внутри эксикатора, чтобы получить более высокое давление пара и достичь желаемого уровня гидратации h.
    3. Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 не менее трех раз, чтобы правильно преобразовать все обменные атомы водорода в дейтроны.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы для лучшего обмена H/D можно использовать циклы сублимационной сушки и растворения в чистом D2O при условии, что он не влияет на белок.
    4. Гидратируйте порошок до уровня чуть выше желаемого, оставьте нижнюю часть держателя образца с индиевой проволокой и гидратированным порошком на прецизионных весах и подождите, пока масса медленно уменьшится до желаемого значения, чтобы получить целевой h (обычно 0,2-0,4, если глобулярный белок среднего размера должен быть покрыт одним полным гидратационным слоем).
    5. Быстро наденьте крышку на нижнюю часть и сначала закройте держатель образца четырьмя винтами, чтобы остановить парообмен (дополнительный рисунок S3A).
    6. Установите и затяните все оставшиеся винты до тех пор, пока между нижней частью и крышкой не останется зазора (дополнительный рисунок S3B).
    7. Взвесьте герметичный держатель образца, чтобы проверить возможные потери гидратации из-за утечек после нейтронного эксперимента.

3. Провести эксперимент по некогерентному рассеянию нейтронов

  1. Обсудите и перепроверьте конфигурацию прибора, необходимого для эксперимента, с локальным контактом за несколько недель до назначенного времени луча.
  2. Подготовьте образец жидкого состояния.
    1. Растворите белок в дейтерированном буфере.
    2. Определите подходящий объем жидкости, который будет помещен в держатель для образца, используя воду (убедитесь, что при закрытом держателе для образца нет перелива; Рисунок 2В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие этапы (3.3 и 3.4) описывают эксперимент, проведенный на спектрометре NBS IN16B на ILL 8,9 с использованием криопечи в качестве среды для образцов. Система управления прибором будет меняться от одного прибора к другому, но принципы работы останутся прежними.
  3. Вставьте образец.
    1. Тщательно высушите стержень для образца (рис. 2D) и удалите предыдущий образец, если таковой имеется, убедившись, что доза ионизирующего излучения ниже 100 мкЗв/ч, прежде чем приступать к работе с любым материалом (в ILL).
    2. Поместите образец, проверьте правильность центрирования относительно центра луча (дополнительный рисунок S4) и вставьте палочку для образца в криопечь (рис. 2D). Включите вакуумный насос до температуры менее 10-3 бар и промойте воздух внутри криопечи, повторив следующие три раза: заполните криопечь газообразным гелием до достижения атмосферного давления и снова удалите газ с помощью вакуумного насоса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В случае плоского держателя образца держатель образца должен быть ориентирован под углом 45° относительно входящего луча. Полезный диапазон передачи импульса может быть уменьшен из-за поглощения и рассеяния ячейкой. Сильный поглотитель нейтронов, такой как кадмий, может быть использован для маскировки определенных частей держателя образца (например, винтов, толстых деталей).
    3. Введите немного газообразного гелия в криопечь так, чтобы давление составляло ~ 0,05 бар.
  4. Сбор данных (например, при использовании NOMAD на IN16B в ILL предполагается, что пользователь предпочитает температуру 200 К перед получением спектра квазиупругих нейтронов (QENS), затем E/IFWS во время изменения температуры до 310 K при 0,5 K в минуту и, наконец, QENS при 310 K).
    1. С помощью NOMAD на вкладке «Выполнение» перетащите контроллер FurnaceCryostat на стартовую площадку. Установите температуру 200 К. Используйте быстрый режим и тайм-аут в 30 минут, чтобы температура успела стабилизироваться. Нажмите на значок вращающихся стрелок, чтобы запустить его в фоновом режиме, чтобы данные можно было получить во время снижения температуры.
    2. Перетащите контроллер IN16DopplerSettings , установите профиль скорости на Точная скорость , установленная Max ΔE, значение 0,00 мкВ и 128 каналов , чтобы получить конфигурацию EFWS.
    3. Перетащите контроллер подсчета , заполните поле «Субтитры » именем, позволяющим легко идентифицировать данные, и установите 60 повторений 30-секундных сканирований (дополнительный рисунок S5A).
    4. Перетащите контроллер IN16DopplerSettings , установите профиль скорости на синусоиду , установленную скоростью , со значением 4.5 м/с и 2,048 каналами , чтобы получить конфигурацию QENS.
    5. Перетащите контроллер Count с 4 повторениями по 30 минут сканирования (дополнительный рисунок S5B).
    6. Для изменения температуры перетащите контроллер FurnaceCryostat , установите температуру на 310 К, установите для параметра Рампа значение SetPoint с Δ = 0,05 К и 6 с. Используйте тайм-аут 220 минут (дополнительный рисунок S6A).
    7. Используйте цикл for с 65 повторениями. Внутрь вставьте контроллер IN16DopplerSettings , как показано на шаге 3.4.2, а затем отсчет 30 с. Затем вставьте IN16DopplerSettings, как описано ранее, но с использованием смещения энергии 1.5 мкВ и 1,024 канала с последующим однократным отсчетом в 3 минуты (дополнительный рисунок S6B).
    8. Чтобы получить последний QENS с разрешением 310 K, перетащите контроллеры IN16DopplerSettings и Count , настроенные так, как описано в шагах 3.4.4 и 3.4.5 соответственно.
    9. Нажмите кнопку «Пуск » (прямоугольный треугольник в нижней части окна), чтобы запустить сценарий.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый эксперимент потребует сбора калибровочных данных; то есть пустая ячейка для вычитания или поправок на поглощение, только буфер при различных температурах, используемых для моделирования фона, и измерение ванадия (или, что то же самое, образца при температуре 10 К или ниже) для получения функции разрешения прибора.

4. Анализ данных - QENS

  1. Импортируйте набор данных с помощью метода 'IN16B_QENS.process()' в программном обеспечении Python nPDyn v3.x36
    >>>> из nPDyn.dataParsers import IN16B_QENS

    >>> выборка = IN16B_QENS(
    ... <путь к файлам данных>
    ... [detGroup=<целочисленный файл или файл группировки детекторов в XML
    ... формат>]
    ... ). process()

    >>> выборка = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Выполните коррекцию данных (необязательно) с помощью следующих команд (см. документацию nPDyn для получения дополнительной информации, рис. 3):
    #it предполагается, что данные для пустой ячейки, ванадия и буфера
    # были импортированы уже в набор данных под названием 'empty_cell', 'vanadium',
    # и 'buffer', соответственно.

    # для вычитания пустых ячеек с коэффициентом масштабирования
    # (ошибки распространяются автоматически)
    >>> выборка = выборка - 0,95 * empty_cell

    # для коррекции с использованием коэффициента Паалмана-Пинга
    # (взаимоисключающий с приведенным выше примером)
    >>> образец = sample.absorptionCorrection(empty_cell)

    # для нормализации
    >>> образец = sample.normalize(ванадий)

    # для биннинга вдоль наблюдаемой оси
    # наблюдаемым является время агрегации здесь
    >>> образец = образец.bin(3, ось=0)
  3. Подгонка калибровочных данных. Набор данных - образцы, пустая ячейка, дейтерированный буфер (при необходимости) и ванадий - могут быть установлены с помощью встроенных моделей или пользовательской модели (см. документацию nPDyn):
    >>> из импорта nPDyn.models.builtins (
    ... модельPVoigt,
    ... модельВода,
    ... modelCalibratedD2O,
    ...     )

    # Встроенные модели используют столбцовый вектор импульса
    # Передача значений Q
    >>> q = ванадий.q[:, Нет]

    # ванадий установлен с использованием псевдо-профиля Фойгта
    >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))
  4. Используйте встроенную модель для гидратации воды под названием «modelWater». Эта модель читается так, как показано на Eq (4)17
    Equation 4 (4)
    Где0,r иt являются скалярами, учитывающими относительный вклад упругого сигнала, вращательных движений и поступательных движений соответственно; j1(qd) — сферическая функция Бесселяl-го порядка, где q — передача импульса; d расстояние O-H в молекуле воды; δ(ω) — дельта Дирака, которая здесь умножается на EISF; N — высший порядок используемой сферической функции Бесселя (обычно ~5); Equation 5 и являются вращательными и Equation 11 поступательными движениями Лоренца соответственно; b(q) — плоский фоновый термин. Сферические функции Бесселя дают относительный вклад каждого состояния углового момента молекул воды, а число N определяется на основе q-диапазона передачи импульса. В случае типичного NBS-спектрометра термины до N = 4 почти полностью объясняют сигнал (дополнительный рисунок S7).
    # Здесь уравнение 2 используется для гидратации воды
    # свертка с функцией разрешения и добавлением
    # Фон D2O выполняется автоматически с помощью кнопки
    # предоставленные аргументы
    >>> sample.fit(modelWater(q),
    ... res=ванадий,
    ... bkgd=буфер,
    ... volume_fraction_bkgd=0,95
    ... )
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вклад вращательных и поступательных движений должен быть запутанным, чтобы быть совершенно строгим. Успех аддитивной модели следует объяснить наличием различных популяций воды на поверхности белка и ограниченным энергетическим диапазоном.
  5. Для построения графика данных используйте следующее (рис. 4):
    >>> из графика импорта nPDyn.plot
    >>> сюжет (образец)

5. Анализ данных - температурный скачок, эластичное сканирование с фиксированным окном (EFWS)

  1. Используйте процедуру, аналогичную разделу 4, для нормализации данных о переходе температуры по сигналу при самой низкой температуре (обычно 10 К):
    >>> из nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> выборка = IN16B_FWS(
    ... <путь к файлам данных>,
    ... detGroup=[detGroup=<файл группировки целых чисел или детекторов в формате XML>]
    ... ). process()

    # нормализация с 5 первыми точками на наблюдаемом
    # оси, которые соответствуют температуре
    >>> пример /= образец[:5].mean(0)

    # Используемый здесь диапазон добротности передачи импульса меньше
    # так как используемая модель действительна только для низкого q
    >>> выборка = sample.get_q_range(0,2, 0,8)
  2. Для начала используйте простую гауссову модель, ширина которой определяется так называемым средним квадратичным смещением (MSD). Постройте и подгоните модель с помощью следующих команд:
    >>> Импорт numpy как NP
    >>> из импорта nPDyn.models Параметры, Модель, Компонент

    # a - коэффициент масштабирования
    >>> params = Параметры(
    ... a={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)},
    ... msd={'value': 1, 'bounds': (0, np.inf)}
    ... )

    >>> model = Model(params)
    >>> model.addComponent(Component(
    ... 'гауссовский',
    ... лямбда x, a, msd: a * np.exp(-x ** 2 * msd / 6)
    ... ))

    >>> sample.fit(model, x=sample.q[:, None])

    >>> сюжет (образец)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гауссовское приближение всегда справедливо для q2MSD << 1, но для относительного сравнения между образцами можно использовать более широкий диапазон передачи импульса. Более сложные модели, выходящие за рамки гауссовского приближения, были разработаны37,38,39.

6. Анализ данных - эластичное и неэластичное сканирование с фиксированным окном (E/IFWS)

  1. Как и на шаге 4, импортируйте набор данных, но с помощью класса 'IN16B_FWS':
    >>> из nPDyn.dataParsers import IN16B_FWS

    >>> выборка = IN16B_FWS(
    ... <путь к файлам данных>
    ... [detGroup=<целочисленный файл или файл группировки детекторов в формате XML>]
    ... ). process()

    >>> выборка = sample.get_q_range(0,3, 1,8)
  2. Подгонка калибровочных данных и данных образца.
    1. Проанализируйте данные E/IFWS с помощью обобщенного MSD40 или рассматривая их как грубые спектры QENS (имея только несколько точек данных на оси энергии). Когда E/IFWS рассматривается как грубая QENS, модели, используемые для QENS, используются для одновременной подгонки всего набора данных E/IFWS (глобальное соответствие передач энергии и передач импульса).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последнее решение, использующее модели для QENS на данных E / IFWS, используется здесь, где накладывается зависимость передачи импульса от диффузии центра масс и внутренней динамики белка.
    2. Моделирование динамики белков в жидкостях с использованием следующего эквалайзера (5) ('modelProteinJumpDiff' в nPDyn):
      Equation 6 (5)
      Где R(q,ω) — функция разрешения; β скаляр, независимый для каждой передачи импульса q; a0 - коэффициент упругой некогерентной структуры (EISF); Equation 7 лоренцев, учитывающий диффузию центра масс с шириной, заданной уравнением (6); Equation 12 — лоренциан, включающий диффузию центра масс и вклад в соответствии с моделью скачкообразной диффузии14 , учитывающей внутреннюю динамику (Eq (7); Equation 8 являющийся подогнанным сигналом от D2O, перемасштабированным его объемной долей в образце.
      γ = Dsq2 (6)
      Ds — коэффициент самодиффузии.
      Equation 9 (7)
      Di — кажущийся коэффициент диффузии для внутренней динамики, а τ — время релаксации для диффузионных движений.
      >>> из импорта nPDyn.models.builtins (
      ... модельPVoigt,
      ... modelProteinJumpDiff,
      ... modelCalibratedD2O,
      ... )

      # Встроенные модели используют столбцовый вектор импульса
      # Передача значений Q
      >>> q = ванадий.q[:, Нет]

      # ванадий установлен с использованием псевдо-профиля Фойгта
      >>> vanadium.fit(modelPVoigt(q))

      # для чистого D2O, модели с калиброванной шириной линии
      # для разных температур включен в nPDyn
      >>> buffer.fit(modelCalibratedD2O(q, temp=363))

      # Здесь уравнение 3 используется для жидких образцов
      # свертка с функцией разрешения и добавлением
      # Фон D2O выполняется автоматически с предоставленными аргументами #
      >>> sample.fit(modelProteinJumpDiff(q),
      ... res=ванадий,
      ... bkgd=буфер,
      ... volume_fraction_bkgd=0,95
      ... )
  3. Постройте график подогнанных данных, используя:
    >>> из графика импорта nPDyn.plot
    >>> сюжет (образец)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Агрегацию лизоцима в твердые частицы проводили при 90 ° C с концентрацией белка 50 мг / мл в дейтерированном буфере (0,1 М NaCl при pD 10,5). Образование твердых частиц вызывается повышением температуры до 90 °C и происходит в течение 6 часов (дополнительный рисунок S8). Сбор данных проводился на IN16B, как описано в протоколе выше (данные постоянно курируются ILL и доступны по адресу http://dx.doi.org/10.5291/ILL-DATA.8-04-811).

Спектр QENS был получен при 7 ° C, чтобы полностью охарактеризовать исходное состояние. Впоследствии температуру повышали до 90 °C (обычно занимает ~ 30 мин на IN16B, дополнительный рисунок S9), чтобы запустить процесс агрегации. Кинетику можно проследить, используя скользящее среднее спектров QENS, что позволяет получить доступ ко всему диапазону передачи энергии, но с ограниченным разрешением во времени. Временное разрешение может быть улучшено до ~1 мин с помощью EFWS и до ~20 мин с помощью E/IFWS при четырех значениях передачи энергии5.

В представленном примере мы исследовали перенос энергии 0, 0,6, 1,5 и 3 мкВ. Сканирование E/IFWS производится непрерывно в процессе агрегации, и был получен спектр QENS для конечного состояния при 90 °C. Данные E/IFWS были скорректированы на поглощение с использованием E/IFWS пустой ячейки и нормализованы с использованием данных по ванадию.

Для лизоцима E / IFWS мы наблюдаем увеличение сигнала во времени при передаче низкого импульса и передаче низкой энергии, в то время как сигнал при передаче высокой энергии и передаче низкого импульса уменьшается (дополнительный рисунок 10). Это качественное наблюдение указывает на образование более крупных объектов, диффундирующих медленнее и подтверждающих, что процесс агрегации имел место. Анализ, согласно уравнению (4), приводит к начальному коэффициенту диффузии центра масс, равному 15 Å2 / нс, в соответствии с присутствием небольших белковых кластеров (подтвержденных динамическим рассеянием света и расчетами HYDROPRO 5,41), который затем экспоненциально уменьшается с течением времени (рис. 5). Кажущийся коэффициент диффузии для внутренней динамики остается постоянным на протяжении всего процесса агрегации. Следовательно, образование частиц лизоцима, по-видимому, происходит в одной фазе агрегации. Отсутствие изменений во внутренней динамике белка предполагает, что либо превращение в перекрестную β и возможное связанное с этим изменение энергии происходит слишком быстро, либо что другие движущие эффекты, такие как увеличение энтропии растворителя, могут полностью доминировать в исследуемом энергетическом диапазоне.

Исследование динамики гидратационной воды вокруг мономеров и волокон тау проводилось на SPHERES в Центре Майера-Лейбница (MLZ) в Гархинге, Германия, с использованием протокола, описанного выше для образцов порошка. Использовали приблизительно 100 мг дейтерированного порошка тау-белка, гидратированного до 0,4 г H2O на г белка. EFWS были получены во время температурного скачка, а спектры QENS - при постоянной температуре. EFWS регистрировались, начиная с 20 К и повышая температуру до 300 К со скоростью 0,2 К/мин при непрерывном сборе данных в течение 5 минут сканирования.

Спектры QENS регистрировались при 20 и 280 К. Данные EFWS были сопоставлены с использованием простого гаусса в диапазоне q передачи импульса 0,2 Å-1 < q < 0,8 Å-1 для извлечения MSD (дополнительный рисунок S11A). Значения MSD превышают допустимый предел для гауссовской модели. Следовательно, в этом случае рекомендуется исследовать другие модели за пределами гауссовского приближения37,38,39. При температурах выше 220 К гидратационная вода вокруг волокон тау значительно более подвижна, чем гидратационная вода вокруг тау-мономеров (рис. 6). Подгонка данных QENS позволяет пользователям получить ширину линии и относительный вклад упругих, вращательных и поступательных движений гидратационной воды в образце (дополнительный рисунок S11B). По-видимому, доля молекул воды, претерпевающих поступательное движение, увеличивается вокруг волокон, а коэффициенты поступательной и вращательной диффузии молекул воды увеличиваются вокруг волокон17,31. Напротив, внутренняя динамика ps-ns белка тау, отражающая движения позвоночника и боковой цепи, не изменялась при фибрилляции.

Figure 2
Рисунок 2: Основание плоского алюминиевого держателя образца. (A) Плоский алюминиевый держатель образца представляет собой центральную часть, подверженную воздействию нейтронов, где протеиновый порошок находится в небольшом зазоре - обычно ~ 0,3 мм - между основанием и крышкой. Для герметизации можно использовать индиевую проволоку, так как она устойчива к повышению температуры до 90 °C. В случае более высоких температур можно использовать тефлоновое уплотнение. (B) Протеиновый порошок помещают в основание держателя образца с установленной индиевой проволокой. Держатель образца помещают в эксикатор в присутствии либо P 2 O5 для сушки, либо H 2 O/D2Oдля гидратации. Вакуумная смазка добавляется, чтобы избежать утечки между дном и крышкой эксикатора. Вакуум можно использовать с осторожностью для ускорения процесса сушки. Для образцов с высокой гидрофобностью может потребоваться нагрев нижней части эксикатора. (C) Белковый раствор помещают между внутренним и наружным цилиндрами. Следите за тем, чтобы не пипетировать слишком много жидкости (при закрытом держателе образца не должно быть переполнения). Индиевая проволока помещается в круглую канавку. (D) Палочка для отбора проб (на заднем плане) обеспечивает контроль высоты и ориентации образца и может включать в себя различные контроллеры и детекторы для среды отбора проб (температура, давление). Стержень для образца вставляется из верхней части криопечи (спереди), что обеспечивает контроль температуры во время эксперимента. Во время эксперимента нейтронный пучок обычно попадает на дно криопечи, на что указывает белый прямоугольник (размер пучка зависит от конфигурации прибора). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Коррекция и нормализация данных могут улучшить подгонку. Данные были импортированы с помощью nPDyn, как описано в протоколе. Слева набор данных был нормализован только с использованием данных монитора. Справа, сигнал пустой банки использовался вместе с коэффициентами Паалмана-Пинга43 для поправки на поглощение нейтронов из держателя образца. Впоследствии подогнанная модель для ванадиевого сигнала была интегрирована независимо для каждой передачи импульса q, и результат был использован для нормализации набора данных выборки. На обоих графиках S(q,ω) обозначает сигнал рассеяния, q — передачу импульса, а Equation 3 передачу энергии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Окно построения, сгенерированное nPDyn, показывающее результат подгонки. Данные QENS были подобраны с использованием nPDyn, как описано в протоколе. Окно печати позволяет пользователям наносить данные по различным осям - наблюдаемым (время, температура или давление), передача импульса q или передача энергии - и доступны селекторы для навигации по другим осям. Доступны различные типы графиков, с простым «Графиком», представленным в (A), и «Анализ - q-wise» в (B). Кнопка «График» показывает различные наборы данных в отдельных подграфиках, кнопка «Сравнить» показывает наборы данных на одном графике, «3D-график» показывает наборы данных в разных 3D-графиках, похожих на s, кнопка «Анализ - по q» показывает подходящие параметры как функцию передачи импульса q, а «Анализ - наблюдаемый»' показывает подогнанные параметры как функцию наблюдаемых (время, температура или давление). Аббревиатура: QENS = квазиупругое рассеяние нейтронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Агрегация лизоцима происходит в одностадийном процессе с постоянной внутренней динамикой. Лизоцим растворяли в буфере агрегации (описанном в другом месте5), а E/IFWS приобретали во время агрегации, которая вызывалась повышением температуры до 90 °C. После коррекции поглощения пустой ячейкой и нормализации с помощью ванадиевого сигнала данные были проанализированы с использованием модели скачкообразной диффузии, как описано в протоколе. Подогнанный коэффициент самодиффузии центра масс строится как функция времени (синие треугольники) вместе с кажущимся коэффициентом диффузии для внутренней динамики (оранжевые квадраты). Эта цифра от 5. Аббревиатура: E/IFWS = эластичные и неэластичные сканы с фиксированным окном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Динамика гидратационной воды увеличивается вокруг тау-волокон. H2O-гидратированные порошки дейтерированных тау-волокон и мономеров были запечатаны в плоский алюминиевый держатель образца, и данные EFWS были получены во время температурного скачка от 20 до 300 К. После коррекции поглощения пустой ячейкой и нормализации с помощью ванадиевого сигнала данные были проанализированы с использованием модели скачкообразной диффузии, как описано в протоколе. Это изображение было перерисовано с использованием меньшего диапазона добротности (0,2 < q < 0,8 Å-1) из данных 31. Аббревиатура: EFWS = эластичное сканирование с фиксированным окном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный рисунок S1: Фотографии прибора IN16B в ILL. (вверху) Прибор IN16B виден из радиационно-контролируемой зоны, предназначенной для прибора. Входящий пучок проходит внутри нейтроновода в вакуумную камеру, в которой находится большинство элементов прибора (измельчитель PST, анализаторы, образец, детекторы). (внизу) Интерьер вакуумной камеры. Виден измельчитель PST, а также анализаторы, окружающие криопечь, содержащую образец. Детекторы расположены за криопечью. Предоставлено Лораном Тионом, эклиптика. Аббревиатура: PST = преобразование фазового пространства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S2: Эскиз IN16B в классическом (с доплеровским приводом) и режимах BATS. (A) Нейтронный пучок частично монохроматизирован селектором скорости. Впоследствии фоновый и PST измельчители будут производить нейтронный импульс, из которого доплеровский монохроматор будет выбирать энергетический профиль (режим E/IFWS или QENS). Затем нейтроны рассеиваются образцом, и анализаторы отражают одну энергию в сторону детекторов. Предоставлено ILL. (B) Измельчители BATS используются для определения одиночного нейтронного импульса с определенным диапазоном энергий. Нейтронный пучок частично монохроматизирован селектором скорости. Впоследствии фоновый измельчитель удалит нежелательные нейтроны, не относящиеся к выбранному импульсу. Затем нейтроны рассеиваются образцом, и анализаторы отражают одну энергию в сторону детекторов. Предоставлено ILL. Сокращения: BATS = спектрометр обратного рассеяния и времяпролетного спектрометра; PST = преобразование фазового пространства; E/IFWS = эластичное и неэластичное сканирование с фиксированным окном; QENS = квазиупругое рассеяние нейтронов; PG = пиролитический графит. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Держатель образца быстро закрывается после того, как порошок достигает желаемой гидратации, и запечатывается. (A) Плоский держатель образца быстро закрывается четырьмя винтами. Небольшой зазор останется из-за индиевой проволоки. Затем добавляются другие винты, и держатель образца медленно герметизируется, осторожно затягивая каждый винт несколько раз, чтобы позволить индию расслабиться. (B) Плоский держатель образца надлежащим образом герметизирован, когда между основанием держателя и крышкой больше не видно зазора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Держатель образца центрирован по отношению к нейтронному пучку. Цилиндрический держатель образца был помещен на стержень для образца. Положение держателя образца проверяется таким образом, чтобы луч попадал в нижнюю часть держателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S5: Приобретение EFWS с последующим QENS на IN16B с NOMAD. (A) Соответствующие контроллеры перетаскиваются на стартовую площадку , как описано в протоколе (этапы 3.4.1 - 3.4.3). Возможно, потребуется нажать на замок (зеленый значок в правом верхнем углу - вертикальная панель), чтобы получить контроль над интерфейсом. (B) Соответствующие контроллеры перетаскиваются и сбрасываются на стартовую площадку , как описано в протоколе (этапы 3.4.4 - 3.4.5). Здесь последние два контроллера называются IN16DopplerSettings и Count. Сокращения: QENS = квазиупругое рассеяние нейтронов, EFWS = упругое сканирование с неподвижным окном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S6: Настройка температурного пандуса и E/IFWS на IN16B с помощью NOMAD. (A) Контроллер FurnaceCryostat добавляется на стартовую площадку и настраивается в соответствии с описанием протокола (этап 3.4.6). (B) Контроллер петли For добавляется на стартовую площадку , и соответствующие контроллеры вставляются в него и настраиваются в соответствии с описанием протокола (этап 3.4.7). Аббревиатура: E/IFWS = эластичные и неэластичные сканы с фиксированным окном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S7: Первые пять сферических функций Бесселя объясняют большую часть вращательного вклада гидратационной воды. Первые восемь сферических функций Бесселя построены с использованием значения d = 0,98 Å и значений передачи импульса q от 0 до 3 Å (сплошные цветные линии). Диапазон передачи импульса 0,3 Å < q < 1,8 Å ограничен синими пунктирными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S8: Лизоцим воспроизводимо образует твердые частицы. Лизоцим растворяли в буфере агрегации (готовили, как описано в протоколе, шаг 1), и ThT добавляли к конечной концентрации 2 мкМ для мониторинга образования структуры перекрестного β с использованием флуоресценции. График представляет собой среднее значение трех независимых измерений, а полосы погрешности представляют собой стандартное отклонение. На врезке показана фотография флуоресцентной микроскопии частиц, образовавшихся после 6 ч агрегации. Масштабная линейка = 20 мкм. Эта цифра от 5. Аббревиатура: ThT = тиофлавин T. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S9: Быстрое изменение температуры, доступное на IN16B. В быстром режиме на IN16B температуру можно повысить с 280 К до 363 К примерно за 30 минут. Эта цифра от 5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S10: Данные E/IFWS о лизоциме во время агрегации в твердые частицы. Лизоцим растворяли в буфере агрегации (описанном в другом месте5), а E/IFWS приобретали во время агрегации, которая вызывалась повышением температуры до 90 °C. Данные после коррекции поглощения с пустой ячейкой и нормализации с использованием сигнала ванадия строятся в зависимости от передачи импульса q и времени для различной измеренной передачи энергии: 0 мкэВ (вверху слева), 0,6 мкэВ (вверху справа), 1,5 мкэВ (внизу слева) и 3 мкэВ (внизу справа). Для каждого подграфика вертикальная ось соответствует сигналу рассеяния S(q, ΔE), построенному в зависимости от времени эксперимента в часах и передачи импульса q. Эта цифра от 5. Аббревиатура: E/IFWS = эластичные и неэластичные сканы с фиксированным окном. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок S11: Подгонка данных о гидратационной воде тау. (A) Подгонка данных EFWS с использованием гаусса. Н2O-гидратированный порошок дейтерированных тау-мономеров был запечатан в плоском алюминиевом держателе для образцов, и EFWS были получены во время температурного скачка от 20 до 300 К. Экспериментальные данные (упругий сигнал S(q, 0) на вертикальной оси - синяя линия с полосами погрешностей) построены для диапазона передачи импульса q 0,2 < q < 0,6 Å-1 вместе с подогнанным гауссовским уравнением, используемым для извлечения MSD. (B) Поступательные и вращательные движения гидратационной воды, полученные из фитинга QENS. H2O-гидратированные порошки дейтерированных тау-волокон (слева) и мономеров (справа) были запечатаны в плоский алюминиевый держатель образца, и данные QENS были получены при 280 К. Экспериментальные данные (интенсивность S(q,ω) как функция переноса энергии) для волокон (синие треугольники) и мономеров (зеленые точки) построены вместе с подогнанной моделью (черная сплошная линия) и ее компонентами, фоном (синий), функцией разрешения (зеленый), вращениями (красный) и перемещениями (голубой) для передачи импульса q = 0,783 Å-1. Эта цифра от 31. Сокращения: QENS = квазиупругое рассеяние нейтронов, EFWS = упругое сканирование с фиксированным окном; MSD = среднее квадратичное смещение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Нейтронная спектроскопия является единственным методом, позволяющим зондировать усредненную по ансамблю ps-ns динамику образцов белка независимо от размера белка или сложности раствора при использовании дейтерации6. В частности, исследуя самодиффузию белковых сборок в растворе, можно однозначно определить гидродинамический размер таких сборок. Тем не менее, метод обычно ограничен низким потоком нейтронов, что подразумевает длительное время сбора и требование большого количества образца (обычно 100 мг белка) для получения хорошего отношения сигнал/шум в течение выделенного времени пучка.

Пробоподготовка (этапы протокола 1 и 2). Для образцов в жидком состоянии минимальная концентрация, которая может быть использована, составляет ~ 50 мг / мл (более низкие концентрации могут использоваться за счет увеличения времени сбора). Высокая концентрация белка связана с более высокой скоростью фибрилляции, что помогает уместить измерение в выделенное время луча, но также может повлиять на путь агрегации44. Следовательно, необходима тщательная характеристика образцов с помощью дополнительных методов, таких как атомно-силовая или электронная микроскопия.

Материал держателя образца также является моментом, на который следует обратить внимание при подготовке образцов, поскольку алюминиевые сплавы подвержены коррозии45. Типичным алюминиевым сплавом, который обладает хорошей устойчивостью к коррозии и имеет низкую поглощенность нейтронов, является европейская норма (EN) AW-6060 [AlMgSi], изготовленная из 98% -98,75% Al, 0,1% Ti, 0,15% Zn, 0,05% Cr, 0,35% -0,6% Mg, 0,1% Mn, 0,1% Cu, 0,1% -0,3% Fe и 0,3% -0,6% Si. Коррозия может быть сведена к минимуму, например, за счет сокращения времени нахождения в держателе образца или использования защитного покрытия (которое может добавить к фоновому сигналу), такого как никель или золото.

Было показано, что для порошковых образцов гидрогенизированных белков процедура сублимационной сушки эффективно завершается этапом в эксикаторе в присутствии порошка P2O5 для удаления как можно большего количества остаточной легкой воды35. Для порошковых образцов также рекомендуется охарактеризовать (используя атомно-силовую микроскопию и рентгеновскую порошковую дифракцию) порошок в его конечном гидратированном состоянии и оценить влияние дейтерации, сублимационной сушки и диффузии пара как на мономерное, так и на волокнистое состояния. В частности, сублимационная сушка может привести к разрыву волокон, в результате чего сегменты будут укорочены, не влияя на морфологию. Более того, с помощью дифракции мощности рентгеновского излучения было замечено, что медленное охлаждение вместо мгновенного охлаждения жидким азотом может вызвать присутствие амилоидных структур (неопубликованный результат).

Сбор данных (шаг 3 протокола). Рекомендуется планировать сбор данных с местным контактным лицом до начала эксперимента (даже если это обсуждалось в процессе написания предложения). План сбора данных может быть изменен после первых сканирований в зависимости от полученного отношения сигнал/шум. В частности, для экспериментов с временным разрешением использование E/IFWS позволяет быстро собирать данные - от 30 с до 1 мин для упругой линии, 4-5 мин для точки данных при 3 мкэВ5 - но диапазон доступных передач энергии по своей сути ограничен. В качестве альтернативы можно использовать скользящее среднее значение данных QENS46. С этой целью новая опция обратного рассеяния и времяпролетной спектроскопии (BATS) на IN16B предлагает более высокий поток, чем классический IN16B, с диапазоном энергий ±150 мкэВ (или выше в зависимости от используемой конфигурации) за счет более низкого разрешения в энергии11. Поэтому вариант BATS рекомендуется для исследований с временным разрешением, особенно для таких процессов, как агрегация амилоида, которая происходит в течение нескольких часов.

Анализ данных (шаги 4, 5 и 6 протокола). Функция рассеяния S(q,ω) включает в себя все типы движений в образце, а модели, описанные в приведенном выше протоколе, являются приближениями. В частности, для IDP в жидком состоянии крупномасштабные движения неупорядоченной цепи могут происходить в течение той же длины и времени, что и диффузия всего белка в центре масс. Следовательно, пользователь должен иметь в виду, что разделение диффузии центра масс и внутренней динамики белка не всегда просто. Процедура подгонки может извлечь выгоду из информации о диффузии центра масс, полученной с помощью дополнительных методов, так что этот параметр может быть зафиксирован (имея в виду, что другие методы могут обеспечить коллективный коэффициент диффузии, связанный с различными масштабами времени и длины) для получения более надежного результата для внутренней динамики.

Помимо рассеяния нейтронов, динамика молекулярной системы может быть охарактеризована ядерным магнитным резонансом (ЯМР), который дает локальную информацию о меченных изотопами белках и в широком диапазоне временных масштабов47,48,49. Метод был успешно использован для изучения амилоидных систем 48,50,51,52,53, но не позволяет пользователям просто изучать гидратационную воду или следить за процессом агрегации амилоида в режиме реального времени из-за присущего ему ограничения на размер белка. Последние разработки в области спектроскопии электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и метода динамической ядерной поляризации Оверхаузера (ODNP), основанного на ЭПР, предлагают хорошую перспективу в сочетании с рассеянием нейтронов. Действительно, несмотря на сайт-направленную спиновую маркировку (SDSL), EPR и ODNP могут зондировать белок54 и динамикугидратации 55, соответственно, на временной шкале ps-ns вокруг введенной спиновой метки.

Эти методы были использованы для изучения агрегации белка тау56,57 и обеспечат большую комплементарность с рассеянием нейтронов, которые могут получить аналогичную информацию, но усредненную по всему образцу. Кроме того, инфракрасная спектроскопия может предоставить динамическую информацию о движениях высоких энергий, связанных с конкретными структурными паттернами, но сложность белковой среды (используемый буфер) может повлиять на интерпретацию данных58,59. Методы обратного рассеяния нейтронов обеспечивают уникальный и взаимодополняющий взгляд на динамику белка и гидратационной воды на временной шкале ps-ns наряду с результатами вышеупомянутых методов. Они не требуют специфической маркировки образца, качество сигнала не чувствительно к размеру белка, и измерения могут проводиться in vivo или в очень сложных дейтерированных средах, таких как дейтерированный бактериальный лизат 3,6,7. Поскольку этот метод обеспечивает усредненный по ансамблю результат, он хорошо дополняется моделированием молекулярной динамики для получения детальной информации об исследуемой системе. Моделирование может быть легко проверено путем прямого сравнения между экспериментальным набором данных и теоретическими спектрами QENS, вычисленными на основе траектории моделирования с использованием программного обеспечения, такого как mdanse60.

Что касается амилоидных систем, обратное рассеяние нейтронов оказалось полезным для характеристики динамики белка ps-ns и воды для различных систем и условий 5,31,61,62,63,64. В частности, с помощью обратного рассеяния нейтронов была выявлена корреляция между долей белковой последовательности, участвующей в структуре перекрестных β, и амплитудой усиления энтропии воды при фибрилляции (неопубликованные результаты). Кроме того, разработка сред образцов позволяет одновременно получать спектры нейтронов и либо данные65 диэлектрической релаксации, либо данные66 комбинационного рассеяния. Кроме того, на IN16B присутствуют дифракционные детекторы для получения структурных данных наряду с динамическими данными. Кроме того, ожидается, что в ближайшем будущем входящий поток нейтронов будет улучшен для режима BATS IN16B благодаря использованию так называемой переменной направляющей фокусировки, геометрия которой может быть адаптирована по требованию к используемой инструментальной установке. Дальнейшее развитие сложной среды образцов и приборов позволит проводить еще более сложные эксперименты в будущем, возможно, одновременно предоставляя дополнительную динамическую и структурную информацию.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Acknowledgments

Авторы выражают благодарность Микаэле Зампони из Центра нейтронной науки им. Юлиха в центре им. Хайнца Майера-Лейбница, Гархинг, Германия, за часть экспериментов по рассеянию нейтронов, проведенных на приборе SPHERES. Эта работа опиралась на деятельность консорциума Лаборатории дейтерации (DLAB), финансируемого Европейским союзом по контрактам HPRI-2001-50065 и RII3-CT-2003-505925, а также на деятельность, финансируемую Исследовательским советом по инженерным и физическим наукам Соединенного Королевства (EPSRC) в рамках Института Лауэ Ланжевена EMBL DLAB в рамках грантов GR/R99393/01 и EP/C015452/1. Признана поддержка со стороны Европейской комиссии в рамках 7-й Рамочной программы в рамках Ключевого действия: укрепление европейского исследовательского пространства, исследовательских инфраструктур [Контракт 226507 (NMI3)]. Кевин Пуно и Кристиан Бек благодарят Федеральное министерство образования и научных исследований (BMBF, грант No 05K19VTB) за финансирование их постдокторских стипендий.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Aluminum sample holder Not commercially available. Either the local contact on the instrument can provide them or they can be manufactured based on a technical drawing that can be provided by the local contact.
Deuterium chloride, 35 wt. % in D2O, ≥99 atom % D Sigma-Aldrich
543047
Deuterium oxide (D, 99.9%) Eurisotop DLM-4DR-PK
Dow Corning high-vacuum silicone grease Sigma-Aldrich Z273554-1EA
Ethanol 96%, EMSURE Reag. Ph Eur Sigma-Aldrich 1.5901
Glass dessicator VWR   75871-660
Glass dessicator plate, 140 mm VWR 89038-068
Indium wire, 1.0 mm (0.04 in) dia, Puratronic, 99.999% Alfa Aesar 00470.G1
Lysozyme from chicken egg white dialyzed, lyophilized, powder, ~100,000 U/mg Sigma-Aldrich 62970
nPDyn v3.x see github.com/kpounot/nPDyn, model functions fot fitting also included in the software
OHAUS AX324 Adventurer balance, internal calibration Dutscher 92641
Phosphorus pentoxide, ReagentPlus, 99% Sigma-Aldrich 214701
Pipette ErgoOne 0.5-10 μL Starlab S7100-0510
Pipette ErgoOne 100-1,000 μL Starlab S7100-1000
Pipette ErgoOne 20-200 μL Starlab S7100-2200
Pipette tip TipOne 1,000 μL Starlab S1111-6001
Pipette tip TipOne 10 μL Starlab S1111-3200
Pipette tip TipOne 200 μL Starlab S1111-0206
Sodium deuteroxide solution, 40 wt. % in D2O, 99.5 atom % D Sigma-Aldrich 372072

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacrot, B. Des neutrons pour la science: Histoire de l'Institut Laue-Langevin. Des neutrons pour la science. EDP Sciences. , (2021).
  2. Mahieu, E., Gabel, F. Biological small-angle neutron scattering: recent results and development. Acta Crystallographica Section D. 74 (8), 715-726 (2018).
  3. Grimaldo, M., Roosen-Runge, F., Zhang, F., Schreiber, F., Seydel, T. Dynamics of proteins in solution. Quarterly Reviews of Biophysics. 52, 7 (2019).
  4. Martel, A., et al. Membrane permeation versus amyloidogenicity: A multitechnique study of islet amyloid polypeptide interaction with model membranes. Journal of the American Chemical Society. 139 (1), 137-148 (2017).
  5. Pounot, K., et al. Tracking internal and global diffusive dynamics during protein aggregation by high-resolution neutron spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (15), 6299-6304 (2020).
  6. Grimaldo, M., et al. Protein short-time diffusion in a naturally crowded environment. The Journal of Physical Chemistry Letters. 10 (8), 1709-1715 (2019).
  7. Jasnin, M., Stadler, A., Tehei, M., Zaccai, G. Specific cellular water dynamics observed in vivo by neutron scattering and NMR. Physical Chemistry Chemical Physics. 12 (35), 10154-10160 (2010).
  8. Frick, B. The neutron backscattering spectrometer IN16 at ILL-high energy resolution with high intensity and excellent signal-to-noise ratio. Neutron News. 13 (2), 15-22 (2002).
  9. Frick, B., Mamontov, E., van Eijck, L., Seydel, T. Recent backscattering instrument developments at the ILL and SNS. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 224 (1-2), 33-60 (2010).
  10. Frick, B., Combet, J., van Eijck, L. New possibilities with inelastic fixed window scans and linear motor Doppler drives on high resolution neutron backscattering spectrometers. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 669, 7-13 (2012).
  11. Appel, M., Frick, B., Magerl, A. A flexible high speed pulse chopper system for an inverted neutron time-of-flight option on backscattering spectrometers. Scientific Reports. 8 (1), 13580 (2018).
  12. Squires, G. L. Introduction to the theory of thermal neutron scattering. , Dover Publications. Mineola N.Y. (1996).
  13. Bee, M. Quasielastic neutron scattering. , Available from: http://inis.iaea.org/Search/search.aspx?orig_q=RN:20038756 (1988).
  14. Singwi, K. S., Sjölander, A. Diffusive motions in water and cold neutron scattering. Physical Review. 119 (3), 863-871 (1960).
  15. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear diatomic liquids: i. free rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1279-1297 (1966).
  16. Sears, V. F. Theory of cold neutron scattering by homonuclear liquid: ii. hindered rotation. Canadian Journal of Physics. 44 (6), 1299-1311 (1966).
  17. Schirò, G., et al. Translational diffusion of hydration water correlates with functional motions in folded and intrinsically disordered proteins. Nature Communications. 6, 6490 (2015).
  18. Grimaldo, M., et al. Hierarchical molecular dynamics of bovine serum albumin in concentrated aqueous solution below and above thermal denaturation. Physical Chemistry Chemical Physics. 17 (6), 4645-4655 (2015).
  19. Eanes, E. D., Glenner, G. G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 16 (11), 673-677 (1968).
  20. Bonar, L., Cohen, A. S., Skinner, M. M. Characterization of the Amyloid Fibril as a Cross-β Protein. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 131 (4), 1373-1375 (1969).
  21. Chiti, F., Dobson, C. M. Protein Misfolding, Amyloid Formation, and Human Disease: A Summary of Progress Over the Last Decade. Annual Review of Biochemistry. 86 (1), 27-68 (2017).
  22. Knowles, T. P. J., Vendruscolo, M., Dobson, C. M. The amyloid state and its association with protein misfolding diseases. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (6), 384-396 (2014).
  23. Maji, S. K., et al. Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science. 325 (5938), 328-332 (2009).
  24. Li, J., et al. The RIP1/RIP3 necrosome forms a functional amyloid signaling complex required for programmed necrosis. Cell. 150 (2), 339-350 (2012).
  25. Knowles, T. P. J., Mezzenga, R. Amyloid fibrils as building blocks for natural and artificial functional materials. Advanced Materials. 28 (31), 6546-6561 (2016).
  26. Stephens, A. D., Kaminski Schierle, G. S. The role of water in amyloid aggregation kinetics. Current Opinion in Structural Biology. 58, 115-123 (2019).
  27. Adamcik, J., Mezzenga, R. Amyloid polymorphism in the protein folding and aggregation energy landscape. Angewandte Chemie International Edition. 57 (28), 8370-8382 (2018).
  28. Liu, Z., et al. Entropic contribution to enhanced thermal stability in the thermostable P450 CYP119. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (43), 10049-10058 (2018).
  29. Coquelle, N., et al. Chromophore twisting in the excited state of a photoswitchable fluorescent protein captured by time-resolved serial femtosecond crystallography. Nature Chemistry. 10 (1), 31-37 (2018).
  30. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-916 (2007).
  31. Fichou, Y., et al. Hydration water mobility is enhanced around tau amyloid fibers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (20), 6365-6370 (2015).
  32. Burns, J., Pennock, C. A., Stoward, P. J. The specificity of the staining of amyloid deposits with thioflavine T. The Journal of Pathology and Bacteriology. 94 (2), 337-344 (1967).
  33. Iqbal, K., Liu, F., Gong, C. -X., Grundke-Iqbal, I. Tau in Alzheimer disease and related tauopathies. Current Alzheimer Research. 7 (8), 656-664 (2010).
  34. Krȩżel, A., Bal, W. A formula for correlating pKa values determined in D2O and H2O. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (1), 161-166 (2004).
  35. Dolman, M., Halling, P. J., Moore, B. D., Waldron, S. How dry are anhydrous enzymes? Measurement of residual and buried 18O-labeled water molecules using mass spectrometry. Biopolymers. 41 (3), 313-321 (1997).
  36. Pounot, K. kpounotnPDyn: v3.0.0. Zenodo. , (2021).
  37. Yi, Z., Miao, Y., Baudry, J., Jain, N., Smith, J. C. Derivation of mean-square displacements for protein dynamics from elastic incoherent neutron scattering. Journal of Physical Chemistry B. 116 (16), 5028-5036 (2012).
  38. Peters, J., Kneller, G. R. Motional heterogeneity in human acetylcholinesterase revealed by a non-Gaussian model for elastic incoherent neutron scattering. The Journal of Chemical Physics. 139 (16), 165102 (2013).
  39. Zeller, D., Telling, M. T. F., Zamponi, M., García Sakai, V., Peters, J. Analysis of elastic incoherent neutron scattering data beyond the Gaussian approximation. The Journal of Chemical Physics. 149 (23), 234908 (2018).
  40. Roosen-Runge, F., Seydel, T. A generalized mean-squared displacement from inelastic fixed window scans of incoherent neutron scattering as a model-free indicator of anomalous diffusion confinement. EPJ Web of Conferences. 83, 02015 (2015).
  41. Ortega, A., Amorós, D., García de la Torre, J. Prediction of hydrodynamic and other solution properties of rigid proteins from atomic- and residue-level models. Biophysical Journal. 101 (4), 892-898 (2011).
  42. Hennig, M., Frick, B., Seydel, T. IUCr Optimum velocity of a phase-space transformer for cold-neutron backscattering spectroscopy. Journal of Applied Crystallography. 44 (3), 467-472 (2011).
  43. Paalman, H. H., Pings, C. J. Numerical evaluation of X-ray absorption factors for cylindrical samples and annular sample cells. Journal of Applied Physics. 33 (8), 2635-2639 (1962).
  44. Ow, S. -Y., Dunstan, D. E. The effect of concentration, temperature and stirring on hen egg white lysozyme amyloid formation. Soft Matter. 9 (40), 9692-9701 (2013).
  45. Tominaga, T., Sahara, M., Kawakita, Y., Nakagawa, H., Yamada, T. Evaluation of sample cell materials for aqueous solutions used in quasi-elastic neutron scattering measurements. Journal of Applied Crystallography. 54 (6), 1631-1640 (2021).
  46. Beck, C., et al. Following protein dynamics in real time during crystallization. Crystal Growth & Design. 19 (12), 7036-7045 (2019).
  47. Smith, A. A., Testori, E., Cadalbert, R., Meier, B. H., Ernst, M. Characterization of fibril dynamics on three timescales by solid-state NMR. Journal of Biomolecular NMR. 65 (3-4), 171-191 (2016).
  48. Wang, T., Jo, H., DeGrado, W. F., Hong, M. Water distribution, dynamics, and interactions with Alzheimer's β-amyloid fibrils investigated by solid-state NMR. Journal of the American Chemical Society. 139 (17), 6242-6252 (2017).
  49. Rezaei-Ghaleh, N., Giller, K., Becker, S., Zweckstetter, M. Effect of zinc dinding on β-amyloid structure and dynamics: Implications for Aβ aggregation. Biophysical Journal. 101 (5), 1202-1211 (2011).
  50. Vugmeyster, L., et al. Fast motions of key methyl groups in amyloid-β fibrils. Biophysical Journal. 111 (10), 2135-2148 (2016).
  51. Yang, X., Wang, B., Hoop, C. L., Williams, J. K., Baum, J. NMR unveils an N-terminal interaction interface on acetylated-α-synuclein monomers for recruitment to fibrils. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (18), (2021).
  52. Tuttle, M. D., et al. Solid-state NMR structure of a pathogenic fibril of full-length human α-synuclein. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (5), 409-415 (2016).
  53. Karamanos, T. K., Kalverda, A. P., Thompson, G. S., Radford, S. E. Mechanisms of amyloid formation revealed by solution NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 88-89, 86-104 (2015).
  54. Lai, Y. -C., Kuo, Y. -H., Chiang, Y. -W. Identifying protein conformational dynamics using spin-label ESR. Chemistry - An Asian Journal. 14 (22), 3981-3991 (2019).
  55. Franck, J. M., Han, S. Overhauser dynamic nuclear polarization for the study of hydration dynamics, explained. Methods in Enzymology. 615, 131-175 (2019).
  56. Pavlova, A., et al. Protein structural and surface water rearrangement constitute major events in the earliest aggregation stages of tau. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 127-136 (2016).
  57. Lin, Y., et al. Liquid-liquid phase separation of tau driven by hydrophobic interaction facilitates fibrillization of tau. bioRxiv. , (2020).
  58. Decatur, S. M. Elucidation of residue-level structure and dynamics of polypeptides via isotope-edited infrared spectroscopy. Accounts of Chemical Research. 39 (3), 169-175 (2006).
  59. Chatani, E., Tsuchisaka, Y., Masuda, Y., Water Tsenkova, R. molecular system dynamics associated with amyloidogenic nucleation as revealed by real time near infrared spectroscopy and aquaphotomics. PLoS One. 9 (7), 101997 (2014).
  60. Goret, G., Aoun, B., Pellegrini, E. MDANSE: An interactive analysis environment for molecular dynamics simulations. Journal of Chemical Information and Modeling. 57 (1), 1-5 (2017).
  61. Fujiwara, S., et al. Internal dynamics of a protein that forms the amyloid fibrils observed by neutron scattering. Journal of the Physical Society of Japan. 82, Suppl A (2013).
  62. Schiró, G., et al. Neutron scattering reveals enhanced protein dynamics in concanavalin a amyloid fibrils. Journal of Physical Chemistry Letters. 3 (8), 992-996 (2012).
  63. Pounot, K., et al. Zinc determines dynamical properties and aggregation kinetics of human insulin. Biophysical Journal. 120 (5), 886-898 (2021).
  64. Fujiwara, S., et al. Dynamic properties of human α-synuclein related to propensity to amyloid fibril formation. Journal of Molecular Biology. 431 (17), 3229-3245 (2019).
  65. Sanz, A., et al. High-pressure cell for simultaneous dielectric and neutron spectroscopy. Review of Scientific Instruments. 89 (2), 023904 (2018).
  66. Adams, M. A., et al. Simultaneous neutron scattering and Raman scattering. Applied Spectroscopy. 63 (7), 727-732 (2009).

Tags

В этом месяце в JoVE выпуск 182
Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pounot, K., Appel, M., Beck, C.,… More

Pounot, K., Appel, M., Beck, C., Weik, M., Schirò, G., Fichou, Y., Seydel, T., Schreiber, F. High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water. J. Vis. Exp. (182), e63664, doi:10.3791/63664 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter