Summary
Het combineren van virale vectortransductie en hersenzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd een groot aantal neuronen en astrocyten te onderzoeken.
Abstract
Het combineren van virale vectortransductie en weefselzuivering met behulp van de CLARITY-methode maakt het mogelijk om tegelijkertijd verschillende soorten hersencellen en hun interacties te onderzoeken. Virale vectortransductie maakt het mogelijk om verschillende celtypen in verschillende fluorescentiekleuren binnen hetzelfde weefsel te markeren. Cellen kunnen genetisch worden geïdentificeerd door activiteit of projectie. Met behulp van een aangepast CLARITY-protocol is de potentiële steekproefomvang van astrocyten en neuronen met 2-3 ordes van grootte gegroeid. Het gebruik van CLARITY maakt het mogelijk om volledige astrocyten, die te groot zijn om in hun geheel in plakjes te passen, en het onderzoek van de somata met al hun processen mogelijk. Daarnaast biedt het de mogelijkheid om de ruimtelijke interactie tussen astrocyten en verschillende neuronale celtypen te onderzoeken, namelijk het aantal piramidale neuronen in elk astrocytisch domein of de nabijheid tussen astrocyten en specifieke remmende neuronpopulaties. Dit artikel beschrijft in detail hoe deze methoden moeten worden toegepast.
Introduction
In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteitbeïnvloeden 1,2, helpen bij neuronaal postinjuryherstel 3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies 5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in astrocytenonderzoek is de ruimtelijke ordening van de cellen, die unieke ruimtelijke organisaties in de hippocampus en andere hersenstructuren behouden 8,9,10. In tegenstelling tot de neuronale dendrieten die zich verstrengelen tussen cel somata, bewonen hippocampale astrocyten visueel te onderscheiden gebieden met lichte overlap tussen hun processen, waardoor verschillende domeinenontstaan 8,11,12,13. Het bewijs dat de deelname van astrocyten aan neuronale circuits ondersteunt niet het gebrek aan gedetailleerde anatomische beschrijving van dergelijke populaties en de neuronen in hun domeinen14.
Virale vectortransductieprocedures, samen met transgene dieren (TG), zijn gepopulariseerd als een toolset om hersenstructuren, functies en celinteracties te onderzoeken15,16. Het gebruik van verschillende promotors maakt het mogelijk om specifieke cellen te richten op basis van hun genetische eigenschappen, activeringsniveaus17,18 of projectiedoelen. Verschillende virussen kunnen verschillende gekleurde fluoroforen uitdrukken in verschillende populaties. Een virus kan worden gecombineerd met de endogene expressie van fluoroforen in TG, of TG-dieren kunnen worden gebruikt zonder dat er virussen nodig zijn. Deze technieken worden veel gebruikt voor neuronale markering en sommige laboratoria zijn ze gaan gebruiken met modificaties die gespecialiseerd zijn voor het richten op andere celtypen, zoals astrocyten 5,9,19.
De CLARITY-techniek, voor het eerst beschreven in 201320,21, maakt de studie van dikke hersenplakken mogelijk door de hele hersenen transparant te maken terwijl de microscopische structuren intact blijven. Door de combinatie van de twee methoden - virale vectortransductie en weefselverwijdering - is nu de mogelijkheid beschikbaar om de ruimtelijke interacties tussen verschillende celtypepopulaties te onderzoeken. De meeste astrocyten-neuron interactiestudies werden uitgevoerd op dunne hersenplakken, wat resulteerde in afbeeldingen van onvolledige astrocyten vanwege hun grote domeinen, waardoor het aantal geanalyseerde cellen radicaal werd beperkt. Het gebruik van de CLARITY-techniek maakt eencellige resolutiekarakterisering van celpopulaties in grootschalige volumes tegelijkertijd mogelijk. Het afbeelden van fluorescerend gelabelde celpopulaties in heldere hersenen levert geen synaptische resolutie op, maar maakt een grondige karakterisering van de ruimtelijke interacties tussen astrocyten en een verscheidenheid aan neuronale celtypen mogelijk.
Om die reden hebben we deze state-of-the-art technieken gebruikt om de eigenschappen van astrocyten in de dorsale CA1 te onderzoeken, waarbij we alle lamina (Stratum Radiatum, piramidale laag en Stratum Oriens) in beeld brengen. We hebben tienduizenden astrocyten gemeten (met virale penetrantie van >96%5), waarbij we de informatie van de hele astrocytische populatie rond CA1 hebben geanalyseerd. Met efficiënte penetrantie van de neuronale markers konden we de interacties registreren tussen de hele populatie van CA1-astrocyten en de vier soorten neuronale cellen- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), VIP-remmende neuronen en exciterende piramidale cellen9.
Verschillende experimenten werden uitgevoerd met behulp van een combinatie van fluorescentie van TG-dieren en verschillend gekleurde virale vectoren (alle remmende cellen), terwijl anderen (exciterend) twee virale vectoren gebruikten die verschillende fluoroforen onder verschillende promotors tot expressie brachten9. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol, inclusief het taggen van de gewenste cellen in de hersenen, het transparant maken van de hersenen met behulp van een aangepaste CLARITY-procedure, evenals beeldvorming en analyse van volledige hersenstructuren, met behulp van verschillende procedures en software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Experimentele protocollen werden goedgekeurd door de Hebrew University Animal Care and Use Committee en voldeden aan de richtlijnen van het National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.
1. Virale vectortransductie
OPMERKING: Virale vectortransductie wordt gebruikt om fluoroforen in de hersenen tot expressie te brengen.
- Gebruik een atlas (bijv. Allen Brain Atlas) om de relevante coördinatie van het doelgebied te lokaliseren.
OPMERKING: 3D-atlassen zijn online te vinden (bijv. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Injecteer met behulp van stereotactische chirurgie de virale vectoren in de relevante hersenstructuur. Zie9 voor een gedetailleerd protocol.
- Wacht 3-6 weken op fluorofoorexpressie.
OPMERKING: Een korte periode is voldoende als alleen cellichamen moeten worden gemarkeerd. Een lange periode van tijd zal nodig zijn als de axonale projecties relevant zijn voor de vraag, omdat het langer duurt voordat de fluoroforen zich uitdrukken in axonen, die enkele millimeters lang kunnen zijn. - Valideer vooraf de specificiteit en penetrantie van fluorofoorexpressie (zowel van virale expressie als van TG-dieren) (figuur 1A). Voordat u doorgaat met de CLARITY-procedure, wijst u ten minste één brein aan voor dunne plakjes en zorgt u ervoor dat de fluorofoorexpressie zowel sterk als specifiek is voor het doelcelkenmerk.
2. DUIDELIJKHEID
OPMERKING: Deze methode maakt de hersenen binnen 2-6 weken transparant.
- Voer transcraniële perfusie uit op dieren met behulp van koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS. Verwijder de hersenen en bewaar het in PFA 's nachts bij 4 ° C in een buis van 50 ml of een vergelijkbare container.
OPMERKING: Voordat transcraniële perfusie wordt uitgevoerd, moet het dier diep worden verdoofd. In de voorbeelden in dit protocol werden alle dieren verdoofd met Ketamine en Xylazine (respectievelijk 90% en 10%). - Vervang PFA door Hydrogel Solution (HS; zie tabel 1) gedurende 48 uur bij 4 °C.
OPMERKING: Laat de materialen in dit stadium niet warmer worden dan de koeltemperatuur (4-8 °C), anders zal de Hydrogel polymeriseren. Het GS dat in dit protocol wordt gebruikt, bevat 2% acrylamide, in tegenstelling tot eerdere protocollen die 4% 22 of 1% 17 suggereren. Het voordeel van 2% wordt gedetailleerd beschreven in de discussiesectie. Werk bij het voorbereiden van de HS op een ijskoud oppervlak. Bewaren bij -20 °C. - Ontgassing
OPMERKING: Het doel van deze fase is om alle vrije zuurstof uit het weefsel te verwijderen, omdat O2 het polymerisatieproces verstoort. Elkniet-O 2-gas kan worden gebruikt (bijv. N2, CO2); N2 wordt aanbevolen.- Breng de N2 uit de tank over via een 5 mm (interne) flexibele buis, aangesloten op een naald van 19 G aan het uiteinde (figuur 1B).
- Maak twee kleine gaatjes (naaldbreed) in de dop van de buis: een om het gas in te brengen en de andere om de lucht de buis te laten verlaten (figuur 1C).
- Bevestig de buis van het N2-gas aan de buis en vervang de gassen gedurende ongeveer 30 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder de buis en sluit de gaten onmiddellijk af met modelleerklei op elke buis (figuur 1D).
- Breng de ontgaste verzegelde buizen gedurende 3,5 uur over in een bad van 37 °C om het HS te polymeriseren, dat een gel wordt. Zorg ervoor dat u de buizen niet schudt (figuur 1E).
- Haal de hersenen uit de buis en verwijder voorzichtig de gepolymeriseerde gel eromheen met behulp van laboratoriumdoekjes. Zorg ervoor dat er geen resterende gel aan het oppervlak van het weefsel vastzit, omdat deze in de volgende stappen met de oplossing kan reageren, waardoor het weefselverwijderingsproces wordt geremd (figuur 1F).
OPMERKING: Omdat de gel PFA bevatte, moet de extractie onder een zuurkast worden gedaan. - Snijd de hersenen als de vraag bij de hand slechts een deel ervan vereist. Verdeel het in tweeën of in zeer dikke plakken die alle interessegebieden bevatten (figuur 1G).
- Plaats de plakjes in de First Clearing Solution (CS1, zie tabel 2) in een nieuwe container en schud gedurende 24 uur bij 37 °C bij 70 tpm.
- Volg de hieronder beschreven stappen om de hersenen over te brengen van CS1 naar de tweede Clearing Solution (CS2, zie tabel 2).
- Bereid van tevoren een geperforeerde buis voor de hersenen voor (figuur 1H).
- Verwarm CS2 voor op 40-45 °C in een bekerglas dat groot genoeg is om de buis te bevatten. Doe dit op een kookplaat met een roerstaaf. Zorg ervoor dat de temperatuur niet 55 °C bereikt om het bleken van de tot expressie gebrachte eiwitten te voorkomen.
- Plaats het met CS2 gevulde bekerglas en de geperforeerde buis op een roerinrichting (een bekerglas van 2 L in figuur 1I). Stel een gematigde roersnelheid in die ervoor zorgt dat de vloeistof stroomt zonder het weefsel te vervormen.
OPMERKING: Binnen 2-6 weken wordt het weefsel transparant (het proces begint aan de periferie en beweegt naar binnen in de richting van de centrale hersenstructuren). De beslissing wanneer het weefsel "helder genoeg" is, is aan persoonlijk oordeel. De hersenen moeten voldoende transparant zijn voor beeldvorming onder de microscoop zonder interferentie (figuur 1J niet duidelijk genoeg; Figuur 1K duidelijk genoeg). Het overschrijden van het punt waarop het weefsel helder genoeg is, kan verlies van weefselstijfheid veroorzaken.
- Overdracht van CS2 naar PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, zie tabel 2) in een nieuwe container bij 37 °C met licht schudden (70 rpm) gedurende 24 uur.
OPMERKING: In de PBST wordt het weefsel witachtig (figuur 1L). De helderheid zal terugkeren (en verbeteren) wanneer deze is ingebed in de refractieve indexvergelijkingsoplossing (RIMS, zie stap 2.14). - Vervang de PBST door de nieuwe PBST. Nog 24 uur onder dezelfde omstandigheden (37 °C met licht schudden) bewaren.
- Vervang PBST opnieuw door nieuwe PBST en houd 24 uur op RT.
- Transfer naar PBS bij RT gedurende 24 uur.
- Vervang de PBS en vertrek bij RT voor nog eens 24 uur.
- Verwijder de hersenen van PBS en breng het 's nachts over naar RIMS bij 37 °C.
OPMERKING: Aanvankelijk kunnen rimpelingen in de RIMS de hersenen omringen. Dit protocol is ontworpen en gevalideerd met behulp van twee specifieke commerciële RIMS (zie tabel 3). Het protocol mag echter niet verschillen bij het gebruik van andere RIMS (commercieel of zelfgemaakt). - Houd het weefsel nog 24 uur op RT of totdat de oplossing volledig in evenwicht is, d.w.z. wanneer het weefsel transparant wordt en de oplossing geen zichtbare rimpelingen meer bevat (figuur 1M).
- Als het weefsel transparant is, gaat u verder met de kamervoorbereiding. Als het weefsel op dit punt wit wordt in plaats van transparant (als gevolg van aggregaten van resterende SDS-moleculen), reinigt u het monster opnieuw door stap 2.9 en 2.10 te herhalen en brengt u het weefsel gedurende enkele dagen over naar CS2 (stap 2.8), gevolgd door alle stappen tot stap 2.15.
3. Kamervoorbereiding
OPMERKING: Elk monster vereist een dia met een beeldvormingskamer waarin het monster zal worden geplaatst.
- Plaats het monster in het midden van de dia.
- Maak met behulp van een heet lijmpistool muren aan de randen van de dia, bijna net zo hoog als het weefsel. Zorg ervoor dat u een kleine opening (ongeveer 5 mm) laat op een van de hoeken (figuur 2A,B).
- Breng 1-2 druppels van de RIMS aan op het monster om het bovenoppervlak vochtig te houden en te voorkomen dat er bubbels ontstaan tussen de coverslip en het weefsel.
- Voeg onmiddellijk na het aanbrengen van de RIMS-druppels de laatste laag hete lijm toe aan de wanden (zodat ze de hoogte van de hersenen / plak bereiken) en ga onmiddellijk (terwijl de hete lijm nog vloeibaar is) naar stap 3.5.
- Sluit de bovenkant af met een afdekplaat en plaats deze zo gelijkmatig mogelijk op de bovenkant van de nog warme hete lijmlaag (figuur 2C).
- Vul de kamer met de RIMS door de opening in de hete lijmwanden (figuur 2D,E).
- Sluit de opening met hete lijm. Laat geen lucht binnen (figuur 2F).
- Als de hete lijmwanden verder reiken dan de randen van de dia, snijdt u de uitschuivende randen (figuur 2G).
- Als het doel dat wordt gebruikt voor beeldvorming is ondergedompeld, voegt u nog eens 2-3 mm lijm toe aan de wanden boven de afdekplaat, zodat de onderdompelingsoplossing langer meegaat (figuur 2H).
4. Beeldvorming (confocaal of twee-foton)
- Controleer of het podium de kamer kan vasthouden, omdat de dikte van de kamer enkele millimeters kan bereiken.
OPMERKING: De confocale microscoop (zie de tabel met materialen) die in dit protocol wordt gebruikt, is bijvoorbeeld uitgerust met verschillende fasen (bijvoorbeeld cirkelvormig, rechthoekig). Welke fase ook wordt gekozen om de kamer vast te houden, is niet relevant zolang de parameters overeenkomen met de kamergroottes. - Werk met een doel met een voldoende werkafstand, d.w.z. een minimale werkafstand ≥3 mm, omdat het hersengebied van belang een paar millimeter diep kan zijn en de coverslip mogelijk niet volledig recht is zoals deze handmatig is geplaatst.
OPMERKING: Als demonstratie werden de resultaten in figuur 1, video 1 en video 2 verkregen onder een microscoop met twee fotonen met behulp van een wateronderdompelingsobjectief van 16x met een werkafstand van 3 mm en een vergroting van 2,4 om een gezichtsveld van 652 x 483 μm en een z-stack met intervallen van 0,937 μm tussen de vlakken te verkrijgen. - Voer beeldvorming met meerdere gebieden uit, wat enkele uren of zelfs dagen kan duren. Zorg ervoor dat er voldoende vrije opslagruimte op de computer is, omdat de grootte van elk beeld kan oplopen tot tientallen gigabits.
OPMERKING: CLARITY-beeldvorming kan resulteren in aanzienlijk meer beeldsecties in de diepte. Daarom moeten de intensiteiten die worden gebruikt om de expressie vast te leggen relatief laag zijn om overexpressie tijdens de beeldsomming te voorkomen. - Voor onderdompelingsdoeleinden controleert u de vloeistof routinematig tijdens het afbeelden en vult u deze indien nodig aan met extra vloeistof.
OPMERKING: Tijdens de beeldvorming van de gegevens in video 3 werd elke 6-8 uur water aan het oppervlak van de kamer toegevoegd om verdamping tegen te gaan. - Nadat het beeld is verkregen, bekijkt en analyseert u het met behulp van verschillende softwarepakketten.
OPMERKING: Aanbevolen software omvat Imaris en SyGlass voor zowel visualisatie als analyse. De precieze pijplijn voor geoptimaliseerde reconstructie van astrocyten met behulp van Imaris-software is eerder beschreven9. Kortom, de Imaris-kenmerken die in deze studie werden gebruikt, waren filamenten om celstructuren volledig te reconstrueren en vlekken om de positie in de ruimte van alle somata te extraheren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle opruiming van dikke hersenweefselplakken resulteert in een nieuwe reeks vragen die kunnen worden gesteld met betrekking tot de eigenschappen van grote celpopulaties in tegenstelling tot de eigenschappen van afzonderlijke cellen of naburige groepen cellen. Om succesvolle resultaten te bereiken, moet men zich strikt houden aan het CLARITY-protocol, omdat er een breed scala aan parameters is waarmee rekening moet worden gehouden om de variantie tussen monsters te verminderen (bijv. Percentage van de helderheid, fluorescentie-informatie, gezwollen parameters).
Figuur 1 beschrijft het volledige clearingproces van fluorescerende eiwitexpressievalidatie tot en met alle stadia van de clearingmethode. Figuur 2 beschrijft hoe een kamer wordt voorbereid op het geklaarde weefsel, optimaal voor beeldvorming onder een twee-foton of confocale microscoop. De materialen die in dit protocol worden vereist, zijn uiterst goedkoop in vergelijking met andere protocollen voor kamervoorbereiding.
Figuur 3 toont de kubus beschreven in video 1, waar meer dan 300 astrocyten worden getoond in een gewist gedeelte van het CA1-deel van een hippocampus van een muis. Figuur 4 toont de kubus beschreven in Video 2, waar zowel astrocyten als exciterende neuronale somata worden getoond in dik transparant weefsel. Figuur 5 toont een heel halfrond, zoals beschreven in Video 3. Hersenbrede neuronale projecties worden weergegeven van de dorsale CA1 (groen, GFP) en de ventrale CA1 (rood, TdTomato).
Video 1 toont een dik beeld van hippocampale astrocyten (>300) verkregen met een microscoop met twee fotonen na een CLARITY-procedure. Fluorescentie werd geleverd door virale vectortransductie specifiek voor astrocyten. Video 2 toont de ruimtelijke nabijheid tussen astrocyten en de kernen van hippocampale piramidale cellen. Video 3 traceert axonale bundels over een hele hemisfeer; axonen projecteren vanuit de primaire motorische cortex en worden getraceerd vanuit het ruggenmerg. Een andere bundel wordt getraceerd van de dorsale hippocampus naar de Supra Mammillary-lichamen. Ten slotte traceert het een rode bundel axonen van de Mammillaire lichamen naar hun oorsprong bij de ventrale hippocampus. Alle gemarkeerde cellen zijn uitsluitend exciterend.
Figuur 1: Gedetailleerde beschrijving van het clearingproces. (A) Validatie van fluorofoorexpressie. In dit voorbeeld drukken alle astrocyten in het CA1-deel van een hippocampus van een muis een rood eiwit uit (TdTomato, afgebeeld in magenta) en alle exciterende neuronen drukken een groen eiwit uit in hun kernen (H2B-GFP). Dit beeld is verkregen met behulp van een 2-fotonenmicroscoop. De foto is gemaakt met behulp van een waterdompeling 16x objectief (0,8 NA) met een vergroting van 2,4 om een gezichtsveld van 652 x 483 μm te verkrijgen, bij 15,5 frames / s en een z-stack met intervallen van 0,937 μm tussen de vlakken. De specificiteit en penetrantie werden geverifieerd door immunohistochemie9. (B) Het overbrengen van het N2-gas van de tank naar de buis met de hersenen vereist een pijp met een naald aan het uiteinde. (C) Lucht in de buis wordt vervangen door N2 door twee gaten te maken, één (bovenste pijl) voor de instroom van N2via de naald die is aangesloten op de leidingen van de gastank en een andere (onderste pijl) voor uitstroom. (D) Het afdekken van de gaten met modelleerklei onmiddellijk na het ontgassen voorkomt dat de N2 de buis verlaat. (E) Verwarming van de ontgaste oplossing gedurende 3,5 uur in een warm bad. (F) Succesvolle polymerisatie resulteert in een brein ingebed in gelled HS. Gasbellen kunnen vastzitten in het polymeer. (G) Onmiddellijk na extractie uit de gel is het beste punt voor de hersenen om in de gewenste dikte te worden gesneden. (H) Geperforeerde buizen zorgen ervoor dat de stroom van de oplossing op de roerder het monster bereikt. (I) Hersenen in geperforeerde buizen worden verticaal vastgehouden door een zelfgemaakte houder van een maat die is gemaakt om te passen op een bekerglas van 2 liter, staande op een kookplaatroerder. (J) Voorbeeld van een brein dat niet duidelijk genoeg is. Het monster moet nog ongeveer een week in de CS2 worden geroerd. (K) Voorbeeld van een voldoende helder brein. (L) Bij het inbrengen van de heldere hersenen in PBST wordt het weefsel witter dan voorheen. Deze verandering van kleur is te wijten aan de Triton en zal verdwijnen wanneer deze van deze oplossing naar de volgende wordt verplaatst. (M) Na >24 uur in de RIMS worden de hersenen weer volledig transparant. Afkortingen: GFP = groen fluorescerend eiwit; NA = numeriek diafragma; HS = hydrogeloplossing; CS2 = Clearing Oplossing 2; PBST = Fosfaat-gebufferde zoutoplossing met 0,5% Triton X-100; RIMS = refractieve index matching oplossing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Kamervoorbereiding. (A) De eerste laag hete lijmwanden bedekt de randen van een dia en laat een ruimte over die breed genoeg is om de hersenen te bevatten zonder de muren aan te raken. Er is nog één gat in de linkerbovenhoek van de dia. (B) Laag na laag toevoegen om de hoogte van het weefsel te bereiken. (C) Rechte coverslip (witte pijl) sluit de kamer af. (D) Kamer gevuld met RIMS door het gat in de kamerwanden. (E) De kamer is gevuld met RIMS waardoor er geen luchtbellen overblijven. (F) Het gat in de kamer afdichten met hete lijm om lekkage te voorkomen. Zijaanzicht. (G) In dit stadium moet elk heet lijmrest dat zich over de randen van de dia uitstrekt, van de kamer worden afgesneden. (H) Volledig voorbereide kamer, klaar voor beeldvorming onder de microscoop. Afkorting: RIMS = Refractive Index Matching Solution. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Alle afgebeelde astrocyten (AAV1-GFAP::TdTomato, rood) in een opgeruimde hippocampus. Een enkel frame uit Video 1 legt alle afgebeelde astrocyten (AAV1-GFAP::TdTomato, rood) vast in een vrijgemaakte hippocampus. Alle details van de afbeeldingseigenschappen worden beschreven onder Video 1. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Astrocyten (AAV1-GFAP::TdTomato, rood) en hippocampale piramidale cellen kernen (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, groen) in dik transparant weefsel. Een enkel frame uit Video 2 toont zowel astrocyten (AAV1-GFAP::TdTomato, rood) als hippocampale piramidale cellen kernen (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, groen) in dik transparant weefsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Groene axonen (AAV5-CaMKII::eGFP, groen) en rode axonen (AAV5-CaMKII::TdTomato). Een enkel frame uit video 3 toont beide soorten axonen afgeleid van verschillende locaties in een muizenbrein die over een hele hemisfeer kunnen worden getraceerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Beelden van >1 mm dikke plak hippocampale dorsale CA1 astrocyten (AAV1-GFAP::TdTomato, rood). De video werd verkregen met een microscoop met twee fotonen met behulp van een 16x objectief (0,8 NA) met een vergroting van 2,4 na een CLARITY-procedure. Net als bij figuur 1A werd het z-stack-interval ingesteld op 0,937 μm. Fluorescentie werd geleverd door virale vectortransductie specifiek voor astrocyten. Het aantal astrocyten in deze kubus is >300 en de meeste processen zijn beschikbaar voor analyse in de meeste cellen. Afkortingen: NA = numeriek diafragma; AAV = adeno-geassocieerd virus; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Astrocyten en exciterende neuronen kernen in een 3D kubus. De kubus bevat alle lamina van de dCA1 onder de optische omstandigheden vermeld voor figuur 1A en video 1. Deze kubus toont de ruimtelijke nabijheid tussen astrocyten (AAV1-GFAP::TdTomato, rood) en de kernen van hippocampale piramidale cellen (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, groen). Afkortingen: AAV = adeno-associated virus; GFAP = gliaal fibrillair zuur eiwit; CAMKII = calcium/calmodulin-afhankelijk eiwitkinase II; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; H2B = histone 2B. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: Axonale bundels over een heel halfrond traceren. Groene axonen (AAV5-CaMKII::eGFP, groen) die eindigen bij het ruggenmerg zijn gemakkelijk terug te voeren op de primaire motorische cortex (meer dan 7 mm uit elkaar). Van de hippocampus (dorsale zijde) wordt een andere bundel getraceerd naar de Supra Mammillary lichamen (meest ventrale kant van de hersenen), een spoor van bijna 3 mm lang. De tweede helft van de video volgt een rode bundel axonen (AAV5-CaMKII::tdTomato) afkomstig van de ventrale hippocampus terug van hun doellocatie bij de Mammillary-lichamen. De opname werd gemaakt onder een Olympus scanning laser confocale microscoop FV1000 met behulp van een 4x objectief (0,16 NA), en meerdere ROI's werden gecombineerd met behulp van MATL FluoView-functie om het hele halfrond te presenteren. Afkortingen: AAV = adeno-associated virus; CAMKII = calcium/calmodulin-afhankelijk eiwitkinase II; eGFP = verbeterd groen fluorescerend eiwit; NA = numeriek diafragma; MATL = time-lapse met meerdere gebieden. Klik hier om deze video te downloaden.
| Hydrogel Oplossing (1 L) | |
| Materiaal | Aantal |
| VA-044 Initiatiefnemer | 2,5 g |
| PFA 4% | 900 ml |
| Acrylamide (40%) | 50 ml |
| Bisacrylamide (2%) | 50 ml |
Tabel 1: Bereiding van hydrogeloplossing (1 L). Hydrogel-oplossing moet worden bereid op een ijskoud oppervlak. De volgorde waarin de ingrediënten worden gemengd is niet belangrijk. Merk op dat het totale percentage acrylamide 2% is in tegenstelling tot vergelijkbare protocollen die 1%17 of 4%22 gebruiken.
| Clearing Oplossingen (1 L) | ||
| Materiaal | Aantal | |
| Cs1 | Cs2 | |
| Boorzuur (M.W. = 61,83 g/mol) | 12,366 g | 3,4 g |
| SDS | 80 gr | 80 gr |
| Tris basis (M.W. = 121,14 g/mol) | 0 | 12.1 gr |
| Gedestilleerd water (DW) | Vul tot 1 L | Vul tot 1 L |
| Naoh | pH 8,5 | |
| 1 L fosfaat gebufferde zoutoplossing met 0,5% Triton X-100 | ||
| Materiaal | Aantal | |
| PBS | 995 ml | |
| Triton X-100 | 5 ml | |
Tabel 2: Bereiding van clearingoplossingen 1 en 2 (1 L) en 1 L fosfaatgebuufferde zoutoplossing met 0,5% Triton X-100. De opruimoplossingen kunnen van tevoren worden bereid en gedurende een lange periode op kamertemperatuur worden bewaard. Elke oplossing die boorzuur en SDS bevat, moet onder een zuurkast worden gehanteerd om inademing of huidcontact met SDS of boorzuur te voorkomen. De NaOH in CS1 moet als laatste worden toegevoegd om de pH op 8,5 te zetten. Elk hersenmonster moet in ten minste 5-25 ml CS1 worden geplaatst en 's nachts worden bewaard voor voldoende diffusie. Afkortingen: CS1 = clearing solution 1; SDS = natriumdodecylsulfaat; M.W. = molecuulgewicht.
| Productnaam | Primair voordeel | Primair nadeel |
| RapiClear | Voorbeeld blijft transparant | Zwelling van het weefsel |
| RapiClear CS | Monster krimpt terug tot normale grootte | Voorbeeld kan transparantie verliezen |
Tabel 3: RIMS-opties met voor- en nadelen. Rapiclear (RC, RI = 1,47) of CLARITY-specifieke Rapiclear (CSRC, RI = 1,45). Het belangrijkste verschil tussen deze twee oplossingen is dat terwijl de CSRC de heldere hersenen terugbrengt tot zijn oorspronkelijke grootte, de RC-oplossing dat niet doet, waardoor het gewiste monster enigszins gezwollen blijft. Afkorting: RI = brekingsindex.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Weefselverwijderingsmethoden vormen een revolutionair hulpmiddel in hersenonderzoek en nodigen vragen uit die voorheen niet konden worden gesteld. Van het richten op de eigenschappen van een kleine groep cellen, een enkele cel of zelfs een enkele synaps, maakt CLARITY nu het richten van totale celpopulaties of connectiviteitsfuncties op lange afstand mogelijk door relevante fluoroforen te gebruiken.
De uitkomst van de combinatie fluorofoorexpressie en CLARITY-procedure is niet binair; veel factoren kunnen de procedure verstoren, wat leidt tot suboptimale resultaten. Eerst moet de fluorofoorexpressie vooraf worden geverifieerd. Omdat de CLARITY-procedure enig informatieverlies veroorzaakt, is voldoende fluorofooreiwitexpressie cruciaal voor de validiteit van het beeld aan het einde van het CLARITY-proces. Ten tweede moet de transcraniële perfusie zorgvuldig worden behandeld, zodat al het bloed de hersenen verlaat, omdat de autofluorescentie van bloed zal leiden tot onbetrouwbare gegevens in dikke plakken. Ten derde moeten alle parameters die in het protocol worden besproken in elke stap van het clearingproces met precisie worden behandeld, bijvoorbeeld O2-residu in het GS voordat polymerisatie of temperatuuronnauwdring in elke fase de chemische reactie tussen de actieve materialen zal voorkomen.
Eerdere protocollen 17,22 bevelen verschillende concentraties acrylamide in het HS aan. Het primaire doel van acrylamide is om de moleculen beter te fixeren met amineresiduen (eiwitten en nucleïnezuren). Kleine veranderingen in de concentratie hebben een grote invloed op het hele clearingproces: als de fixatie te compact is, zullen de lipidemoleculen zich niet loskoppelen van het weefsel en zal het clearingproces onnodig lang duren of resulteren in ondoorzichtige hersenen. Lagere concentraties acrylamide zullen echter de hersenstructuur niet voldoende handhaven als ze eenmaal verstoken zijn van lipiden. In dit protocol is het acrylamidepercentage ingesteld om de delicate balans van gefixeerd maar helder weefsel te bieden.
Het grootste deel van het clearingproces vindt plaats in CS2 en het helderheidsniveau van het weefsel moet dagelijks worden getest. PBST-opschoning is een essentiële stap tussen de Clearing-oplossingen en de refractieve index-matchingoplossingen, omdat het de resterende SDS-moleculen reinigt, die kunnen interageren met de RIMS. Het is ook mogelijk om het heldere weefsel voor onbepaalde tijd in PBST (0,5%) te houden als kamervoorbereiding nog niet nodig is.
Bij het plaatsen van de hersenen in de RIMS, moet men vertrouwd raken met de voordelen en beperkingen van de oplossingen. RapiClear zal bijvoorbeeld volledige transparantie veroorzaken, zelfs in bijna-gewiste weefsels, maar zal ook enige zwelling veroorzaken, die niet mag worden verwaarloosd bij het analyseren van de gegevens. Eerdere metingen9 suggereren gelijke expansie langs alle assen (d.w.z. dorsoventrale, voorste-posterieure en lateraal-mediale assen), waardoor het mogelijk is om de zwellingsindex te berekenen in vergelijking met dunne plakjes uit hetzelfde hersengebied. Het gebruik van CLARITY-Specific RapiClear elimineert de zwelling; als er echter SDS-restjes in het weefsel achterblijven, zullen ze aggregeren tot niet-transparante massa's.
Een ander voordeel van dit aangepaste protocol zijn de kosten. Eerdere protocollen suggereren verschillende lijmtypen om een kamer te creëren die de hersenen in RIMS kan vasthouden. In dit protocol gebruiken we gewoon hete lijm. Het reageert niet met de oplossingen, is overal te koop, is gemakkelijk te gebruiken en is aanzienlijk goedkoper dan de eerder voorgestelde lijmen.
Gegevens verkregen uit de beeldvorming van dikke hersenmonsters kunnen hele celpopulaties, connectiviteit tussen hersenstructuren of het volgen van een enkel axon over grote afstanden beschrijven (video 3). Hoewel er al eerder vragen over deze kenmerken zijn gesteld, verbetert de validiteit van de gegevens die nu haalbaar zijn met behulp van dikke hersenplakken aanzienlijk op eerdere, foutgevoelige methoden voor dunne plakjes beeldoverlay.
Het CLARITY-proces zorgt voor een succesvolle en uniforme opruiming van dikke plakken - van enkele millimeters tot volledige beeldvorming van de hersenen. De passieve clearing (d.w.z. het niet gebruiken van ETC) vermindert het risico op schade aan het weefsel en de tijd gedurende welke monsters worden ondergedompeld in clearingoplossingen, zodat dit de hoge efficiëntie van eiwitconservering niet beïnvloedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Acknowledgments
Dit project heeft financiering ontvangen van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 803589), de Israel Science Foundation (ISF-subsidie nr. 1815/18) en de Canada-Israël-subsidies (CIHR-ISF, subsidie nr. 2591/18). We bedanken Nechama Novick voor het becommentariëren van het hele manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
