Summary
Ved å kombinere viral vektortransduksjon og hjernerydding ved hjelp av CLARITY-metoden kan du undersøke et stort antall nevroner og astrocytter samtidig.
Abstract
Ved å kombinere viral vektortransduksjon og vevsrydding ved hjelp av CLARITY-metoden, kan du samtidig undersøke flere typer hjerneceller og deres interaksjoner. Viral vektortransduksjon muliggjør merking av forskjellige celletyper i forskjellige fluorescensfarger i samme vev. Celler kan identifiseres genetisk ved aktivitet eller projeksjon. Ved hjelp av en modifisert CLARITY-protokoll har den potensielle prøvestørrelsen på astrocytter og nevroner vokst med 2-3 størrelsesordener. Bruken av CLARITY tillater avbildning av komplette astrocytter, som er for store til å passe i sin helhet i skiver, og undersøkelse av somata med alle sine prosesser. I tillegg gir det muligheten til å undersøke den romlige interaksjonen mellom astrocytter og forskjellige nevroncelletyper, nemlig antall pyramidale nevroner i hvert astrocytisk domene eller nærheten mellom astrocytter og spesifikke hemmende nevronpopulasjoner. Dette dokumentet beskriver i detalj hvordan disse metodene skal brukes.
Introduction
De siste årene har kunnskapen om astrocyttfunksjon og hvordan de samhandler med nevronkretser økt dramatisk. Astrocytter kan påvirke plastisitet 1,2, bistå i nevronal postinjury utvinning 3,4, og til og med indusere de novo nevronal potensiering, med nyere studier som viser betydningen av astrocytter i minneoppkjøp og belønning, tidligere ansett som rent nevronale funksjoner 5,6,7 . Et trekk ved spesiell interesse for astrocyttforskning er det romlige arrangementet av cellene, som opprettholder unike romlige organisasjoner i hippocampus og andre hjernestrukturer 8,9,10. I motsetning til de nevronale dendrittene som blander seg mellom celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skille territorier med liten overlapping mellom prosessene sine, og skaper forskjellige domener 8,11,12,13. Bevisene som støtter deltakelse av astrocytter i nevronkretser støtter ikke mangelen på detaljert anatomisk beskrivelse av slike populasjoner og nevronene i deres domener14.
Virale vektortransduksjonsprosedyrer, sammen med transgene dyr (TG), har blitt popularisert som et verktøysett for å undersøke hjernestrukturer, funksjoner og celleinteraksjoner15,16. Bruken av forskjellige promotorer tillater målretting av spesifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaper, aktiveringsnivåer17,18 eller projeksjonsmål. Ulike virus kan uttrykke forskjellige fargede fluoroforer i forskjellige populasjoner. Et virus kan kombineres med det endogene uttrykket av fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan brukes uten behov for virus. Disse teknikkene er mye brukt til nevronmarkering, og noen laboratorier har begynt å bruke dem med modifikasjoner spesialisert for å målrette mot andre celletyper, for eksempel astrocytter 5,9,19.
CLARITY-teknikken, først beskrevet i 201320,21, muliggjør studiet av tykke hjerneskiver ved å gjøre hele hjernen gjennomsiktig mens du lar de mikroskopiske strukturene være intakte. Ved å kombinere de to metodene-viral vektortransduksjon og vev clearing-muligheten til å undersøke romlige interaksjoner mellom ulike celle type populasjoner er nå tilgjengelig. De fleste astrocytt-neuron interaksjonsstudier ble utført på tynne hjerneskiver, noe som resulterte i bilder av ufullstendige astrocytter på grunn av deres store domener, og dermed radikalt begrense antall analyserte celler. Bruken av CLARITY-teknikken tillater encellet oppløsningskarakterisering av cellepopulasjoner i store volumer samtidig. Avbildning av fluorescerende merkede cellepopulasjoner i klare hjerner gir ikke synaptisk oppløsning, men tillater grundig karakterisering av de romlige interaksjonene mellom astrocytter og en rekke nevronale celletyper.
Av den grunn utnyttet vi disse toppmoderne teknikkene for å undersøke egenskapene til astrocytter i hele dorsal CA1, og identifiserte alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusenvis av astrocytter (med viral penetrans på >96%5), og analyserte dermed informasjonen til hele den astrocytiske befolkningen rundt CA1. Med effektiv penetrans av nevronmarkørene kunne vi registrere interaksjonene mellom hele befolkningen i CA1 astrocytter og de fire typer nevronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hemmende nevroner og eksitatoriske pyramidale celler9.
Flere eksperimenter ble utført ved hjelp av en kombinasjon av fluorescens fra TG-dyr og forskjellige fargede virale vektorer (alle hemmende celler), mens andre (eksitatoriske) brukte to virale vektorer som uttrykte forskjellige fluoroforer under forskjellige promotorer9. Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll, inkludert merking av de ønskede cellene i hjernen, noe som gjør hjernen gjennomsiktig ved hjelp av en modifisert CLARITY-prosedyre, samt avbildning og analyse av komplette hjernestrukturer, ved hjelp av ulike prosedyrer og programvare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle protokoller ble godkjent av Det hebraiske universitetets dyrepleie- og brukskomité og oppfylte retningslinjene fra National Institute of Health Guide for care and use of Laboratory Animals.
1. Viral vektortransduksjon
MERK: Viral vektortransduksjon brukes til å uttrykke fluoroforer i hjernen.
- Bruk et atlas (f.eks. Allen Brain Atlas) for å finne relevant koordinering av målområdet.
MERK: 3D-atlas finner du på nettet (f.eks. http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Ved hjelp av stereotaktisk kirurgi, injiser virale vektorer i den aktuelle hjernestrukturen. Se9 for en detaljert protokoll.
- Vent i 3-6 uker for fluoroforuttrykk.
MERK: En kort periode er nok hvis bare cellelegemer må merkes. En lang periode vil være nødvendig hvis axonale fremskrivninger er relevante for spørsmålet, da det tar lengre tid for fluoroforene å uttrykke seg i axoner, som kan være flere millimeter lange. - Valider spesifisiteten og penetransen til fluoroforuttrykk (både av viralt uttrykk og TG-dyr) på forhånd (figur 1A). Før du fortsetter med CLARITY-prosedyren, utpek minst en hjerne for tynne skiver og sørg for at fluoroforuttrykket er både sterkt og spesifikt for målcellefunksjonen.
2. KLARHET
MERK: Denne metoden gjør hjernen gjennomsiktig innen 2-6 uker.
- Utfør transkraniell perfusjon på dyr ved hjelp av kald fosfatbufret saltvann (PBS) etterfulgt av 4% paraformaldehyd (PFA) i PBS. Fjern hjernen og oppbevar den i PFA over natten ved 4 °C i et 50 ml rør eller en lignende beholder.
MERK: Før transkraniell perfusjon utføres, må dyret bedøves dypt. I eksemplene som presenteres i denne protokollen, ble alle dyr bedøvet ved hjelp av henholdsvis Ketamin og Xylazine (henholdsvis 90% og 10%). - Bytt ut PFA med Hydrogel Solution (HS; se tabell 1) i 48 timer ved 4 °C.
MERK: Ikke la materialene bli varmere enn kjøletemperaturen (4-8 °C) på dette stadiet, ellers polymeriseres Hydrogel. HS som brukes i denne protokollen inneholder 2 % akrylamid, i motsetning til tidligere protokoller som antyder 4%22 eller 1%17. Fordelen med 2% er detaljert i diskusjonsdelen. Når du forbereder HS, arbeid på en iskald overflate. Oppbevar den ved -20 °C. - Avgassing
MERK: Hensikten med dette stadiet er å fjerne alt fritt oksygen fra vevet da O2 forstyrrer polymerisasjonsprosessen. All nonO2-gass kan brukes (f.eks. N2 anbefales.- Overfør N2 fra tanken via en 5 mm (innvendig) fleksibel slange, koblet til en 19 G nål i enden (figur 1B).
- Lag to små hull (nål-bred) i rørets hette: den ene for å introdusere gassen og den andre for å la luften forlate røret (figur 1C).
- Fest røret fra gassen N2 til røret og skift ut gassene i ca. 30 min ved romtemperatur (RT).
- Fjern røret og forsegle umiddelbart hullene med modelleringsleire på hvert rør (figur 1D).
- Overfør avgassede forseglede rør til et 37 °C bad i 3,5 timer for å polymerisere HS, som blir en gel. Pass på at du ikke rister rørene (figur 1E).
- Trekk ut hjernen fra røret og fjern forsiktig den polymeriserte gelen fra rundt den ved hjelp av laboratorieservietter. Pass på at ingen gjenværende gel forblir festet til overflaten av vevet, da det kan reagere med løsningen i følgende trinn, og hemme vevsryddingsprosessen (figur 1F).
MERK: Fordi gelen inneholdt PFA, bør ekstraksjonen gjøres under en avtrekkshette. - Skjær hjernen hvis spørsmålet bare krever en del av den. Del den i to eller svært tykke skiver som inneholder alle interesseområder (figur 1G).
- Plasser skivene i den første avregningsløsningen (CS1, se tabell 2) i en ny beholder og rist ved 70 o/min i 24 timer ved 37 °C.
- Følg trinnene beskrevet nedenfor for å overføre hjernen fra CS1 til den andre Clearing Solution (CS2, se tabell 2).
- Forbered et perforert rør for hjernen på forhånd (figur 1H).
- Forvarm CS2 til 40-45 °C i et beger som er stort nok til å inneholde røret. Gjør dette på en kokeplate med omrører. Sørg for at temperaturen ikke når 55 °C for å forhindre bleking av de uttrykte proteinene.
- Plasser begeret fylt med CS2 og det perforerte røret på en røreenhet (et 2 l beger i figur 1I). Still inn en moderat omrøringshastighet som vil føre til at væsken strømmer uten å forvrenge vevet.
MERK: Innen 2-6 uker blir vevet gjennomsiktig (prosessen starter i periferien og beveger seg innover mot de sentrale hjernestrukturene). Beslutningen om når vevet er "klart nok" er opp til personlig dømmekraft. Hjernen skal være tilstrekkelig gjennomsiktig for avbildning under mikroskopet uten forstyrrelser (figur 1J er ikke klar nok; Figur 1K klar nok). Å overgå punktet der vevet er klart nok, kan føre til tap av vevstivhet.
- Overføring fra CS2 til PBST (0,5 % Triton X-100 i PBS, se tabell 2) i en ny beholder ved 37 °C med mild risting (70 o/min) i 24 timer.
MERK: I PBST blir vevet hvitt (figur 1L). Klarheten vil komme tilbake (og forbedres) når den er innebygd i Refractive Index Matching Solution (RIMS, se trinn 2.14). - Bytt ut PBST med ny PBST. Oppbevars under samme forhold (37 °C med mild risting) i ytterligere 24 timer.
- Bytt ut PBST igjen med ny PBST og hold på RT i 24 timer.
- Overføring til PBS ved RT i 24 timer.
- Bytt ut PBS og la den stå på RT i ytterligere 24 timer.
- Fjern hjernen fra PBS og overfør den til RIMS ved 37 °C over natten.
MERK: I utgangspunktet kan krusninger i RIMS omgi hjernen. Denne protokollen ble utformet og validert ved hjelp av to spesifikke kommersielle RIMS (se tabell 3). Protokollen bør imidlertid ikke variere ved bruk av andre RIMS (kommersiell eller selvfremstilt). - Hold vevet i RT i ytterligere 24 timer eller til oppløsningen når full likevekt, det vil si når vevet blir gjennomsiktig, og løsningen ikke lenger inneholder synlige krusninger (figur 1M).
- Hvis vevet er gjennomsiktig, fortsett til kammerpreparatet. Hvis vevet på dette tidspunktet blir hvitt i stedet for gjennomsiktig (på grunn av aggregater av gjenværende SDS-molekyler), rengjør prøven igjen ved å gjenta trinn 2,9 og 2,10, og overfør vevet til CS2 (trinn 2.8) i noen dager, etterfulgt av alle trinnene til trinn 2.15.
3. Kammer forberedelse
MERK: Hver prøve krever et lysbilde med et bildekammer der prøven skal plasseres.
- Plasser prøven midt i lysbildet.
- Bruk en varm limpistol, lag vegger på kantene av lysbildet, nesten like høyt som vevet. Pass på at du etterlater et lite mellomrom (ca. 5 mm) i et av hjørnene (figur 2A, B).
- Påfør 1-2 dråper rims på prøven for å holde den øvre overflaten fuktig og forhindre bobler som dannes mellom dekslene og vevet.
- Umiddelbart etter påføring av RIMS-dråper, legg til det siste laget av varmt lim på veggene (slik at de når høyden på hjernen / skive) og fremgang umiddelbart (mens det varme limet fortsatt er flytende) til trinn 3,5.
- Forsegle toppen med en deksleslip, plasser den så jevnt som mulig på toppen av det fortsatt varme varme limlaget (figur 2C).
- Fyll kammeret med FELGENE gjennom åpningen som er igjen i de varme limveggene (figur 2D,E).
- Lukk gapet med varmt lim. Ikke la det være luft inni (figur 2F).
- Hvis de varme limveggene strekker seg utover lysbildets grenser, kutter du de forlengende kantene (figur 2G).
- Hvis målet som brukes til avbildning er nedsenket, tilsett ytterligere 2-3 mm lim til veggene over dekslene slik at nedsenkningsløsningen varer i en lengre periode (figur 2H).
4. Bildebehandling (konfikal eller to-foton)
- Kontroller om scenen kan holde kammeret, da tykkelsen på kammeret kan nå flere millimeter.
MERK: For eksempel er det konfokale mikroskopet (se materialtabellen) som brukes i denne protokollen utstyrt med flere stadier (f.eks. sirkulært, rektangulært). Uansett hvilket stadium som er valgt for å holde kammeret, er det irrelevant så lenge parametrene passer til kammerstørrelsene. - Arbeid med et mål med tilstrekkelig arbeidsavstand, det vil si en minimal arbeidsavstand ≥3 mm, da hjerneregionen av interesse kan være noen få millimeter i dybden, og dekslene kan ikke være helt rette da den ble plassert manuelt.
MERK: Som en demonstrasjon ble resultatene presentert i figur 1, video 1 og video 2 oppnådd under et tofotonmikroskop ved hjelp av et vanninnlevelsesmål på 16x med en 3 mm arbeidsavstand og forstørrelse på 2,4 for å oppnå et 652 x 483 μm synsfelt og en z-stabel med 0,937 μm intervaller mellom flyene. - Utfør flerområdeavbildning, som kan ta noen timer eller til og med dager. Forsikre deg om at det er rikelig med ledig lagringsplass i datamaskinen, da størrelsen på hvert bilde kan nå opptil titalls gigabit.
MERK: CLARITY-bildebehandling kan føre til betydelig flere bildedeler i dybden. Derfor bør intensitetene som brukes til å fange uttrykket, være relativt lave for å forhindre overtrykk under bildesummeringen. - For nedsenkingsmål, kontroller væsken rutinemessig mens du ser på og supplerer med ekstra væske om nødvendig.
MERK: Under bildet av dataene som presenteres i video 3, ble vann lagt til overflaten av kammeret hver 6-8 timer for å bekjempe fordampning. - Når bildet er anskaffet, kan du vise og analysere det ved hjelp av flere forskjellige programvarepakker.
MERK: Anbefalt programvare inkluderer Imaris og SyGlass for både visualisering og analyse. Den nøyaktige rørledningen for optimalisert rekonstruksjon av astrocytter ved hjelp av Imaris programvare har blitt beskrevet tidligere9. Kort sagt, Imaris-funksjonene som ble brukt i denne studien var Filaments for å rekonstruere cellestrukturer og spots for å trekke ut posisjonen i rommet til alle somata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket rydding av tykke hjernevevsskiver resulterer i et nytt utvalg av spørsmål som kan stilles om egenskapene til store cellepopulasjoner i motsetning til egenskapene til enkeltceller eller nærliggende grupper av celler. For å oppnå vellykkede resultater, bør man strengt følge CLARITY-protokollen, da det er et bredt spekter av parametere som må vurderes for å redusere variansen mellom prøver (f.eks. prosentandel av klarhet, fluorescensinformasjon, hovne parametere).
Figur 1 beskriver hele avregningsprosessen fra fluorescerende proteinuttrykksvalidering gjennom alle stadier av clearingmetoden. Figur 2 beskriver hvordan du klargjør et kammer for det avklarte vevet, optimalt for avbildning under et to-foton eller konfokalt mikroskop. Materialene som kreves i denne protokollen er ekstremt billige i forhold til andre protokoller for kammerforberedelse.
Figur 3 presenterer kuben som er beskrevet i Video 1, der over 300 astrocytter vises i en ryddet del av CA1-delen av en mus hippocampus. Figur 4 presenterer kuben som er beskrevet i video 2, der både astrocytter og eksitatorisk nevronal somata er vist i tykt gjennomsiktig vev. Figur 5 presenterer en hel halvkule, som beskrevet i video 3. Hjerneomfattende nevronprojeksjoner vises fra dorsal CA1 (grønn, GFP) og ventral CA1 (rød, TdTomato).
Video 1 presenterer et tykt bilde av hippocampal astrocytter (>300) anskaffet med et to-foton mikroskop etter en CLARITY-prosedyre. Fluorescens ble gitt av viral vektortransduksjon spesifikk for astrocytter. Video 2 presenterer den romlige nærheten mellom astrocytter og kjernen av hippocampale pyramideceller. Video 3 sporer axonale bunter over en hel halvkule; axons prosjekt fra primærmotor cortex og spores tilbake fra ryggmargen. En annen bunt spores fra dorsal hippocampus mot Supra Mammillary kroppene. Til slutt sporer den en rød bunt av axoner fra Mammillary kroppene mot deres opprinnelse på ventral hippocampus. Alle merkede celler er utelukkende spennende.
Figur 1: Detaljert beskrivelse av avregningsprosessen. (A) Validering av fluoroforuttrykk. I dette eksemplet uttrykker alle astrocytter i CA1-delen av en mus hippocampus et rødt protein (TdTomato, avbildet i magenta), og alle eksitatoriske nevroner uttrykker et grønt protein i kjernen (H2B-GFP). Dette bildet ble anskaffet ved hjelp av et 2-fotonmikroskop. Bildet ble tatt ved hjelp av et vanninnlevelsesmål på 16x (0,8 NA) med forstørrelse på 2,4 for å oppnå et synsfelt på 652 x 483 μm, ved 15,5 bilder/s og en z-stabel med intervaller på 0,937 μm mellom planene. Spesifisiteten og penetransen ble verifisert av immunhiistokjemi9. (B) Overføring av N2-gassen fra tanken inn i røret som holder hjernen krever et rør med en nål på enden. (C) Luft inne i røret erstattes med N2 ved å lage to hull, en (øvre pil) for tilstrømningen av N2via nålen som er koblet til rørene fra bensintanken og en annen (bunnpil) for utstrømning. (D) Å dekke hullene med modellering av leire umiddelbart etter avgassing forhindrer at N2 går ut av røret. (E) Oppvarming av avgasset oppløsning i 3,5 timer i et varmt bad. (F) Vellykket polymerisasjon resulterer i en hjerne innebygd i gelled HS. Gassbobler kan være fanget i polymeren. (G) Umiddelbart etter ekstraksjon fra gelen er det beste punktet for hjernen å bli kuttet i ønsket tykkelse. (H) Perforerte rør gjør at strømmen av oppløsningen på røreren når prøven. (I) Hjerner inne i perforerte rør holdes vertikalt av en selvfremstillet holder av en størrelse laget for å passe til et 2 L beger, som står på en kokeplaterører. (J) Eksempel på en hjerne som ikke er klar nok. Prøven skal røres i CS2 i omtrent en uke til. (K) Eksempel på en tilstrekkelig klar hjerne. (L) Når du setter inn den klare hjernen i PBST, blir vevet hvitere enn før. Denne fargeendringen skyldes Triton og vil forsvinne når den flyttes fra denne løsningen til den neste. (M) Etter >24 timer i RIMS, vil hjernen bli helt gjennomsiktig igjen. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; IT = numerisk blenderåpning. HS = hydrogeloppløsning; CS2 = Tømme løsning 2; PBST = Fosfatbufret saltvann som inneholder 0,5% Triton X-100; RIMS = Refraktiv indeksmatchingsløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Kammerforberedelse. (A) Det første laget av varme limvegger dekker kantene på et lysbilde og etterlater et rom bredt nok til å inneholde hjernen uten å berøre veggene. Ett hull er igjen i øvre venstre hjørne av lysbildet. (B) Legge til lag etter lag for å nå vevets høyde. (C) Rette deksler (hvit pil) forsegler kammeret. (D) Kammer fylt med RIMS gjennom hullet i kammerveggene. (E) Kammeret er fylt med RIMS uten luftbobler. (F) Tett hullet i kammeret med varmt lim for å forhindre lekkasje. Sett fra siden. (G) På dette stadiet skal enhver varm limrester som strekker seg over kantene på lysbildet kuttes av kammeret. (H) Fullt forberedt kammer, klar for avbildning under mikroskopet. Forkortelse: RIMS = Brytningsindeksavstemmingsløsning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Alle avbildet astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) i en ryddet hippocampus. En enkelt ramme fra Video 1 som fanger alle avbildede astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) i en ryddet hippocampus. Alle detaljer om bildeegenskapene er beskrevet under Video 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) og hippocampal pyramideceller nuclei (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grønn) i tykt gjennomsiktig vev. En enkelt ramme fra Video 2 som viser både astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) og hippocampal pyramideceller kjerner (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grønn) i tykt gjennomsiktig vev. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Grønne axoner (AAV5-CaMKII::eGFP, grønn) og røde axoner (AAV5-CaMKII::TdTomato). En enkelt ramme fra Video 3 som viser begge typer aksoner avledet fra flere steder i en musehjerne som kan spores over en hel halvkule. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Opptak av >1 mm tykk skive hippocampal dorsal CA1 astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød). Videoen ble anskaffet med et tofotonmikroskop ved hjelp av et 16x objektiv (0,8 NA) med forstørrelse på 2,4 etter en CLARITY-prosedyre. I likhet med figur 1A ble z-stack-intervallet satt til 0,937 μm. Fluorescens ble gitt av viral vektortransduksjon spesifikk for astrocytter. Antall astrocytter i denne kuben er >300, og de fleste prosesser er tilgjengelige for analyse i de fleste celler. Forkortelser: NA = numerisk blenderåpning; AAV = adeno-assosiert virus; GFAP = glial fibrillært surt protein. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Astrocytter og eksitatoriske nevroner kjerner i en 3D-kube. Kuben inneholder all lamina av dCA1 under de optiske forholdene som er nevnt for figur 1A og video 1. Denne kuben viser den romlige nærheten mellom astrocytter (AAV1-GFAP::TdTomato, rød) og kjernen av hippocampale pyramidale celler (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, grønn). Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; GFAP = glial fibrillært surt protein; CAMKII = kalsium/calmodulin-avhengig protein kinase II; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; H2B = histone 2B. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Spore axonalbunter over en hel halvkule. Grønne axoner (AAV5-CaMKII::eGFP, grønn) som slutter ved ryggmargen, spores lett tilbake til primærmotor cortex (mer enn 7 mm fra hverandre). Fra hippocampus (dorsal side) spores en annen bunt mot Supra Mammillary-kroppene (de fleste ventrale sider av hjernen), et spor på nesten 3 mm lang. Den andre halvdelen av videoen sporer en rød bunt aksoner (AAV5-CaMKII::tdTomato) som stammer fra den ventrale hippocampus tilbake fra deres målplassering ved Mammillary kroppene. Bildet ble tatt under en Olympus skanning laser konfokal mikroskop FV1000 ved hjelp av en 4x mål (0.16 NA), og flere ROIer ble kombinert ved hjelp av MATL FluoView-funksjonen for å presentere hele halvkule. Forkortelser: AAV = adeno-assosiert virus; CAMKII = kalsium/calmodulin-avhengig protein kinase II; eGFP = forbedret grønt fluorescerende protein; IT = numerisk blenderåpning. MATL = tidsforløp for flere områder. Klikk her for å laste ned denne videoen.
| Hydrogel oppløsning (1 L) | |
| Materiale | Beløp |
| VA-044 Initiator | 2,5 g |
| PFA 4% | 900 ml |
| Akrylamid (40 %) | 50 ml |
| Bisacrylamid (2 %) | 50 ml |
Tabell 1: Tilberedning av hydrogeloppløsning (1 L). Hydrogelløsning må fremstilles på en iskald overflate. Rekkefølgen som ingrediensene blandes i, er ikke viktig. Legg merke til at den totale prosentandelen akrylamid er 2 % ulikt lignende protokoller som bruker enten 1%17 eller 4%22.
| Rydding løsninger (1 L) | ||
| Materiale | Beløp | |
| CS1 | CS2 | |
| Borsyre (M.W. = 61,83 g/mol) | 12.366 g | 3,4 g |
| SDS | 80 g | 80 g |
| Tris base (M.W. = 121,14 g/mol) | 0 | 12,1 g |
| Destillert vann (DW) | Fyll til 1 L | Fyll til 1 L |
| NaOH | pH 8,5 | |
| 1 L fosfatbufret saltvann med 0,5 % Triton X-100 | ||
| Materiale | Beløp | |
| PBS | 995 ml | |
| Triton X-100 | 5 ml | |
Tabell 2: Utarbeidelse av avregningsløsninger 1 og 2 (1 L) og 1 L fosfatbufret saltvann med 0,5 % Triton X-100. Avregningsløsningene kan tilberedes på forhånd og holdes ved romtemperatur i lang tid. Enhver oppløsning som inneholder borsyre og SDS bør håndteres under en avtrekkshette for å unngå innånding eller hudkontakt med enten SDS eller borsyre. NaOH i CS1 bør legges til sist for å stille pH på 8,5. Hver hjerneprøve bør plasseres i minst 5-25 ml CS1 og holdes over natten for tilstrekkelig diffusjon. Forkortelser: CS1 = clearing løsning 1; SDS = natrium dodecylsulfat; M.W. = molekylvekt.
| Navn på produkt | Hovedfordel | Primær ulempe |
| RapiClear | Eksemplet forblir gjennomsiktig | Hevelse i vev |
| RapiClear CS | Prøven krymper tilbake til normal størrelse | Utvalget kan miste gjennomsiktighet |
Tabell 3: RIMS-alternativer med fordeler og ulemper. Rapiclear (RC, RI = 1,47) eller CLARITY-spesifikk Rapiclear (CSRC, RI = 1,45). Den primære forskjellen mellom disse to løsningene er at mens CSRC krymper den klare hjernen tilbake til sin opprinnelige størrelse, gjør rc-løsningen ikke det, slik at den ryddede prøven blir litt hovent. Forkortelse: RI = brytningsindeks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vevsryddingsmetoder presenterer et revolusjonerende verktøy i hjerneforskning, og inviterer spørsmål som ikke tidligere kunne ha blitt stilt. Fra å målrette egenskapene til en liten gruppe celler, en enkelt celle eller til og med en enkelt synapse, gjør CLARITY nå det mulig å målrette mot totale cellepopulasjoner eller langtrekkende tilkoblingsfunksjoner ved hjelp av relevante fluoroforer.
Utfallet av fluoroforuttrykket og CLARITY-prosedyrekombinasjonen er ikke binært; mange faktorer kan forstyrre prosedyren som fører til suboptimale resultater. For det første må fluoroforuttrykket verifiseres på forhånd. Ettersom CLARITY-prosedyren forårsaker noe informasjonstap, er tilstrekkelig fluoroforproteinuttrykk avgjørende for bildets gyldighet på slutten av CLARITY-prosessen. For det andre må den transkranielle perfusjonen håndteres nøye, og sikre at alt blod kommer ut av hjernen, fordi autofluorescence av blod vil føre til upålitelige data i tykke skiver. For det tredje må alle parametere som er omtalt i protokollen håndteres i hvert trinn av avregningsprosessen med presisjon, for eksempel O2-rester i HS før polymerisasjon eller temperaturforutselegg i hvert trinn vil forhindre at den kjemiske reaksjonen mellom de aktive materialene oppstår.
Tidligere protokoller 17,22 anbefaler forskjellige konsentrasjoner av akrylamid i HS. Hovedformålet med akrylamid er å bedre fikse molekylene med aminrester (proteiner og nukleinsyrer). Små endringer i konsentrasjonen påvirker i stor grad hele clearingprosessen: Hvis fikseringen er for kompakt, vil lipidmolekylene ikke koble fra vevet, og clearingprosessen vil bli unødvendig langvarig eller resultere i ugjennomsiktige hjerner. Lavere konsentrasjoner av akrylamid vil imidlertid ikke tilstrekkelig opprettholde hjernestrukturen når den er blottet for lipider. I denne protokollen er akrylamidprosenten satt til å gi den delikate balansen mellom fiksert, men klart vev.
Det meste av clearingprosessen foregår i CS2, og vevsklarhetsnivået bør testes daglig. PBST-opprydding er et viktig skritt mellom Clearing-løsningene og brytningsindeksmatchingsløsningene fordi den renser de gjenværende SDS-molekylene, som kan samhandle med RIMS. Det er også mulig å holde det klare vevet i PBST (0,5%) på ubestemt tid hvis kammerforberedelse ennå ikke er nødvendig.
Når man plasserer hjernen i RIMS, bør man bli kjent med fordelene og begrensningene ved løsningene. For eksempel vil RapiClear forårsake fullstendig gjennomsiktighet selv i nesten ryddet vev, men vil også forårsake noe hevelse, som ikke bør overses når du analyserer dataene. Tidligere målinger9 antyder lik ekspansjon langs alle akser (dvs. dorsoventral, fremre-posterior og laterale-mediale akser), noe som gjør det mulig å beregne indeksen for hevelse sammenlignet med tynne skiver fra samme hjerneregion. Bruk av CLARITY-spesifikk RapiClear eliminerer hevelsen; Men hvis noen SDS-rester forblir i vevet, vil de aggregere seg i ikke-gjennomsiktige masser.
En annen fordel med denne modifiserte protokollen er kostnaden. Tidligere protokoller foreslår forskjellige limtyper for å skape et kammer som kan holde hjernen i RIMS. I denne protokollen bruker vi bare varmt lim. Det reagerer ikke med løsningene, er tilgjengelig for kjøp overalt, er enkel å bruke, og er betydelig billigere enn limene foreslått før.
Data innhentet fra avbildning av tykke hjerneprøver kan beskrive hele cellepopulasjoner, tilkobling på tvers av hjernestrukturer eller sporing av en enkelt axon over store avstander (video 3). Selv om spørsmål om disse egenskapene har blitt stilt før, forbedrer gyldigheten av dataene som nå kan oppnås ved hjelp av tykke hjerneskiver, betydelig på tidligere, feilutsatte metoder for tynnskivebildeoverlegg.
CLARITY-prosessen gir vellykket og jevn rydding av tykke skiver - fra flere millimeter til full hjerneavbildning. Den passive ryddingen (dvs. ikke bruk av ETC) reduserer risikoen for skade på vevet, og tiden som prøver er nedsenket i clearingløsninger slik at det ikke påvirker den høye effektiviteten av proteinbevaring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet har fått støtte fra Det europeiske forskningsrådet (ERC) under EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale Nr. 803589), Israel Science Foundation (ISF grant No. 1815/18) og Canada-Israel grants (CIHR-ISF, grant No. 2591/18). Vi takker Nechama Novick for å ha kommentert hele manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
