Summary
La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione del cervello utilizzando il metodo CLARITY consente lo studio di un gran numero di neuroni e astrociti contemporaneamente.
Abstract
La combinazione della trasduzione del vettore virale e della compensazione dei tessuti utilizzando il metodo CLARITY consente di studiare contemporaneamente diversi tipi di cellule cerebrali e le loro interazioni. La trasduzione del vettore virale consente la marcatura di diversi tipi di cellule in diversi colori di fluorescenza all'interno dello stesso tessuto. Le cellule possono essere identificate geneticamente per attività o proiezione. Utilizzando un protocollo CLARITY modificato, la dimensione potenziale del campione di astrociti e neuroni è cresciuta di 2-3 ordini di grandezza. L'uso di CLARITY consente l'imaging di astrociti completi, che sono troppo grandi per adattarsi nella loro interezza a fette, e l'esame dei somata con tutti i loro processi. Inoltre, offre l'opportunità di studiare l'interazione spaziale tra astrociti e diversi tipi di cellule neuronali, vale a dire, il numero di neuroni piramidali in ciascun dominio astrocitico o la vicinanza tra astrociti e specifiche popolazioni di neuroni inibitori. Questo documento descrive, in dettaglio, come questi metodi devono essere applicati.
Introduction
Negli ultimi anni, la conoscenza della funzione degli astrociti e di come interagiscono con i circuiti neuronali è aumentata drasticamente. Gli astrociti possono influenzare la plasticità 1,2, aiutare nel recupero neuronale post-infortunio 3,4 e persino indurre un potenziamento neuronale de novo, con studi recenti che mostrano l'importanza degli astrociti nell'acquisizione e nella ricompensa della memoria, precedentemente considerate come funzioni puramente neuronali 5,6,7 . Una caratteristica di particolare interesse nella ricerca sugli astrociti è la disposizione spaziale delle cellule, che mantengono organizzazioni spaziali uniche nell'ippocampo e in altre strutture cerebrali 8,9,10. A differenza dei dendriti neuronali che si intrecciano tra i somata cellulari, gli astrociti ippocampali abitano territori visivamente distinguibili con una leggera sovrapposizione tra i loro processi, creando domini distinti 8,11,12,13. Le prove a sostegno della partecipazione degli astrociti nei circuiti neuronali non supportano la mancanza di una descrizione anatomica dettagliata di tali popolazioni e dei neuroni nei loro domini14.
Le procedure di trasduzione del vettore virale, insieme agli animali transgenici (TG), sono state rese popolari come set di strumenti per studiare le strutture cerebrali, le funzioni e le interazioni cellulari15,16. L'utilizzo di diversi promotori consente il targeting di cellule specifiche in base alle loro proprietà genetiche, ai livelli di attivazione17,18 o agli obiettivi di proiezione. Virus diversi possono esprimere fluorofori di colore diverso in diverse popolazioni. Un virus può essere combinato con l'espressione endogena di fluorofori in TG, oppure gli animali TG possono essere utilizzati senza la necessità di virus. Queste tecniche sono ampiamente utilizzate per la marcatura neuronale e alcuni laboratori hanno iniziato a utilizzarle con modifiche specializzate per il targeting di altri tipi di cellule, come gli astrociti 5,9,19.
La tecnica CLARITY, descritta per la prima volta nel 201320,21, consente lo studio di spesse fette di cervello rendendo trasparente l'intero cervello lasciando intatte le strutture microscopiche. Combinando i due metodi - trasduzione virale del vettore e pulizia dei tessuti - è ora disponibile l'opzione di esaminare le interazioni spaziali tra diverse popolazioni di tipi cellulari. La maggior parte degli studi di interazione astrociti-neuroni sono stati eseguiti su fette di cervello sottili, con conseguente immagine di astrociti incompleti a causa dei loro grandi domini, limitando così radicalmente il numero di cellule analizzate. L'uso della tecnica CLARITY consente la caratterizzazione simultanea della risoluzione di singole cellule di popolazioni cellulari in volumi su larga scala. L'imaging di popolazioni cellulari con tag fluorescenti in cervelli chiari non fornisce una risoluzione sinaptica, ma consente una caratterizzazione approfondita delle interazioni spaziali tra astrociti e una varietà di tipi di cellule neuronali.
Per questo motivo, abbiamo sfruttato queste tecniche all'avanguardia per studiare le proprietà degli astrociti in tutto il CA1 dorsale, immaginando tutte le lamina (Stratum Radiatum, strato piramidale e Stratum Oriens). Abbiamo misurato decine di migliaia di astrociti (con penetranza virale di >96%5), analizzando così le informazioni dell'intera popolazione astrocitica intorno a CA1. Con un'efficace penetranza dei marcatori neuronali, abbiamo potuto registrare le interazioni tra l'intera popolazione di astrociti CA1 e i quattro tipi di cellule neuronali: parvalbumina (PV), somatostatina (SST), neuroni inibitori VIP e cellule piramidali eccitatorie9.
Diversi esperimenti sono stati eseguiti utilizzando una combinazione di fluorescenza da animali TG e vettori virali di colore diverso (tutte le cellule inibitorie), mentre altri (eccitatori) hanno utilizzato due vettori virali che esprimono diversi fluorofori sotto diversi promotori9. Questo documento presenta un protocollo dettagliato, che include l'etichettatura delle cellule desiderate nel cervello, rendendo il cervello trasparente utilizzando una procedura CLARITY modificata, nonché l'imaging e l'analisi di strutture cerebrali complete, utilizzando varie procedure e software.
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Protocol
I protocolli sperimentali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università ebraica e hanno soddisfatto le linee guida della Guida dell'Istituto Nazionale di Salute per la cura e l'uso degli animali da laboratorio.
1. Trasduzione del vettore virale
NOTA: La trasduzione del vettore virale viene utilizzata per esprimere fluorofori nel cervello.
- Utilizzare un atlante (ad esempio, Allen Brain Atlas) per individuare il coordinamento pertinente dell'area target.
NOTA: gli atlanti 3D possono essere trovati online (ad esempio, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - Utilizzando la chirurgia stereotassica, iniettare i vettori virali nella struttura cerebrale pertinente. Vedere9 per un protocollo dettagliato.
- Attendere 3-6 settimane per l'espressione del fluoroforo.
NOTA: un breve periodo di tempo è sufficiente se è necessario contrassegnare solo i corpi cellulari. Sarà necessario un lungo periodo di tempo se le proiezioni assonali sono rilevanti per la domanda, poiché ci vuole più tempo perché i fluorofori si esprimano negli assoni, che possono essere lunghi diversi millimetri. - Convalidare in anticipo la specificità e la penetranza dell'espressione del fluoroforo (sia di espressione virale che di animali TG) (Figura 1A). Prima di procedere con la procedura CLARITY, designare almeno un cervello per fette sottili e assicurarsi che l'espressione del fluoroforo sia forte e specifica per la caratteristica della cellula bersaglio.
2. CHIAREZZA
NOTA: Questo metodo rende il cervello trasparente entro 2-6 settimane.
- Eseguire la perfusione transcranica su animali utilizzando soluzione salina fredda tamponata con fosfato (PBS) seguita da paraformaldeide al 4% (PFA) in PBS. Rimuovere il cervello e tenerlo in PFA durante la notte a 4 °C in un tubo da 50 ml o in un contenitore simile.
NOTA: Prima di eseguire la perfusione transcranica, l'animale deve essere profondamente anestetizzato. Negli esempi presentati in questo protocollo, tutti gli animali sono stati anestetizzati usando ketamina e xilazina (rispettivamente 90% e 10%). - Sostituire pfa con soluzione di idrogel (HS; vedere Tabella 1) per 48 ore a 4 °C.
NOTA: Non lasciare che i materiali diventino più caldi della temperatura di refrigerazione (4-8 °C) in questa fase, altrimenti l'idrogel polimerizzerà. L'HS utilizzato in questo protocollo contiene il 2% di acrilammide, a differenza dei protocolli precedenti che suggerivano il 4% 22 o l'1% 17. Il vantaggio del 2% è dettagliato nella sezione di discussione. Quando si prepara l'HS, lavorare su una superficie ghiacciata. Conservare a -20 °C. - Degasaggio
NOTA: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere tutto l'ossigeno libero dal tessuto poiché O2 interferisce con il processo di polimerizzazione. È possibile utilizzare qualsiasi gas diverso da O2 (ad esempio, N2, CO2); N2 è raccomandato.- Trasferire l'N2 dal serbatoio tramite un tubo flessibile (interno) da 5 mm, collegato a un ago da 19 G alla sua estremità (Figura 1B).
- Praticare due piccoli fori (larghi un ago) nel cappuccio del tubo: uno per introdurre il gas e l'altro per consentire all'aria di lasciare il tubo (Figura 1C).
- Collegare il tubo dal gas N2 al tubo e sostituire i gas per circa 30 minuti a temperatura ambiente (RT).
- Rimuovere il tubo e sigillare immediatamente i fori con argilla modellante su ogni tubo (Figura 1D).
- Trasferire i tubi sigillati degassati in un bagno a 37 °C per 3,5 ore per polimerizzare l'HS, che diventerà un gel. Fare attenzione a non scuotere i tubi (Figura 1E).
- Estrarre il cervello dal tubo e rimuovere delicatamente il gel polimerizzato da intorno ad esso usando salviette da laboratorio. Assicurarsi che nessun gel residuo rimanga attaccato alla superficie del tessuto, in quanto potrebbe reagire con la soluzione nei passaggi seguenti, inibendo il processo di pulizia dei tessuti (Figura 1F).
NOTA: Poiché il gel conteneva PFA, l'estrazione deve essere effettuata sotto una cappa aspirante. - Taglia il cervello se la domanda a portata di mano richiede solo una parte di esso. Dividerlo a metà o in fette molto spesse che contengono tutte le aree di interesse (Figura 1G).
- Introdurre le fette nella prima soluzione di compensazione (CS1, vedere tabella 2) in un nuovo contenitore e agitare a 70 giri/min per 24 ore a 37 °C.
- Seguire i passaggi descritti di seguito per trasferire il cervello da CS1 alla seconda soluzione di compensazione (CS2, vedere Tabella 2).
- Preparare un tubo perforato per il cervello in anticipo (Figura 1H).
- Preriscaldare CS2 a 40-45 °C in un becher abbastanza grande da contenere il tubo. Fallo su una piastra elettrica con un agitatore. Assicurarsi che la temperatura non raggiunga i 55 °C per evitare lo sbiancamento delle proteine espresse.
- Posizionare il becher riempito con CS2 e il tubo perforato su un dispositivo di agitazione (un becher da 2 L nella Figura 1I). Impostare una velocità di agitazione moderata che causerà il flusso del liquido senza distorcere il tessuto.
NOTA: Entro 2-6 settimane, il tessuto diventerà trasparente (il processo inizia alla periferia e si muove verso l'interno verso le strutture cerebrali centrali). La decisione su quando il tessuto è "abbastanza chiaro" dipende dal giudizio personale. Il cervello dovrebbe essere sufficientemente trasparente per l'imaging al microscopio senza interferenze (Figura 1J non abbastanza chiara; Figura 1K abbastanza chiaro). Superare il punto in cui il tessuto è abbastanza chiaro può causare la perdita di rigidità del tessuto.
- Trasferimento da CS2 a PBST (0,5% Triton X-100 in PBS, vedere Tabella 2) in un nuovo contenitore a 37 °C con lieve agitazione (70 giri/min) per 24 ore.
NOTA: Nel PBST, il tessuto diventerà biancastro (Figura 1L). La chiarezza tornerà (e migliorerà) quando incorporata nella soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione (RIMS, vedere il passaggio 2.14). - Sostituire il PBST con il nuovo PBST. Conservare nelle stesse condizioni (37 °C con lieve agitazione) per altre 24 ore.
- Sostituire nuovamente PBST con il nuovo PBST e mantenere a RT per 24 ore.
- Trasferimento a PBS a RT per 24 ore.
- Sostituire il PBS e partire a RT per ulteriori 24 ore.
- Rimuovere il cervello da PBS e trasferirlo a RIMS a 37 °C durante la notte.
NOTA: Inizialmente, le increspature nei RIMS possono circondare il cervello. Questo protocollo è stato progettato e convalidato utilizzando due SPECIFICI RIMS commerciali (vedi Tabella 3). Tuttavia, il protocollo non dovrebbe differire quando si utilizzano altri RIMS (commerciali o autoprodotti). - Mantenere il tessuto a RT per altre 24 ore o fino a quando la soluzione raggiunge il pieno equilibrio, cioè quando il tessuto diventa trasparente e la soluzione non contiene più increspature visibili (Figura 1M).
- Se il tessuto è trasparente, procedere alla preparazione della camera. Se a questo punto, il tessuto diventa bianco anziché trasparente (a causa di aggregati di molecole SDS residue), pulire nuovamente il campione ripetendo i passaggi 2.9 e 2.10 e trasferire il tessuto a CS2 (passaggio 2.8) per alcuni giorni, seguiti da tutti i passaggi fino al passaggio 2.15.
3. Preparazione della camera
NOTA: Ogni campione richiede un vetrino con una camera di imaging in cui verrà posizionato il campione.
- Posizionare il campione al centro della diapositiva.
- Usando una pistola per colla a caldo, crea pareti ai bordi della diapositiva, alte quasi quanto il tessuto. Assicurarsi di lasciare un piccolo spazio (circa 5 mm) in uno degli angoli (Figura 2A,B).
- Applicare 1-2 gocce di RIMS sul campione per mantenere umida la superficie superiore ed evitare la formazione di bolle tra il coverslip e il tessuto.
- Subito dopo aver applicato le gocce RIMS, aggiungere l'ultimo strato di colla a caldo alle pareti (in modo che raggiungano l'altezza del cervello / fetta) e procedere immediatamente (mentre la colla a caldo è ancora liquida) al punto 3.5.
- Sigillare la parte superiore con una cartella, posizionandola nel modo più uniforme possibile sulla parte superiore dello strato di colla a caldo ancora caldo (Figura 2C).
- Riempire la camera con il RIMS attraverso lo spazio lasciato nelle pareti della colla a caldo (Figura 2D,E).
- Chiudere lo spazio con la colla a caldo. Non lasciare aria all'interno (Figura 2F).
- Se le pareti di colla a caldo si estendono oltre i bordi della diapositiva, tagliare i bordi di estensione (Figura 2G).
- Se l'obiettivo utilizzato per l'imaging è immerso, aggiungere altri 2-3 mm di colla alle pareti sopra il coperchio in modo che la soluzione di immersione duri per un periodo più lungo (Figura 2H).
4. Imaging (confocale o a due fotoni)
- Verificare se il palco può contenere la camera, poiché lo spessore della camera può raggiungere diversi millimetri.
NOTA: Ad esempio, il microscopio confocale (vedi la Tabella dei materiali) utilizzato in questo protocollo è dotato di diversi stadi (ad esempio, circolare, rettangolare). Qualunque stadio venga scelto per contenere la camera è irrilevante fintanto che i suoi parametri si adattano alle dimensioni della camera. - Lavora con un obiettivo con una distanza di lavoro sufficiente, cioè una distanza di lavoro minima ≥3 mm, poiché la regione del cervello di interesse può essere profonda pochi millimetri e il coverslip potrebbe non essere completamente dritto poiché è stato posizionato manualmente.
NOTA: A titolo dimostrativo, i risultati presentati in Figura 1, Video 1 e Video 2 sono stati ottenuti al microscopio a due fotoni utilizzando un obiettivo 16x ad immersione in acqua con una distanza di lavoro di 3 mm e un ingrandimento di 2,4 per ottenere un campo visivo di 652 x 483 μm e una pila z con intervalli di 0,937 μm tra i piani. - Eseguire l'imaging multi-area, che potrebbe richiedere alcune ore o addirittura giorni. Assicurati che ci sia un ampio spazio di archiviazione libero nel computer poiché la dimensione di ogni immagine può raggiungere fino a decine di gigabit.
NOTA: l'imaging CLARITY può comportare un numero significativamente maggiore di sezioni di immagine in profondità. Pertanto, le intensità utilizzate per acquisire l'espressione dovrebbero essere relativamente basse per evitare la sovraespressione durante la sommatoria dell'immagine. - Per gli obiettivi di immersione, controllare il liquido di routine durante l'imaging e integrare con liquido aggiuntivo, se necessario.
NOTA: Durante l'imaging dei dati presentati nel Video 3, l'acqua è stata aggiunta alla superficie della camera ogni 6-8 ore per combattere l'evaporazione. - Dopo che l'immagine è stata acquisita, visualizzala e analizzala utilizzando diversi pacchetti software.
NOTA: il software consigliato include Imaris e SyGlass sia per la visualizzazione che per l'analisi. La pipeline precisa per la ricostruzione ottimizzata degli astrociti utilizzando il software Imaris è stata descritta in precedenza9. In breve, le caratteristiche di Imaris utilizzate in questo studio erano Filamenti per ricostruire completamente le strutture cellulari e Macchie per estrarre la posizione nello spazio di tutti i somata.
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Representative Results
La corretta eliminazione di spesse fette di tessuto cerebrale si traduce in una nuova gamma di domande che possono essere poste riguardo alle proprietà di grandi popolazioni cellulari rispetto alle proprietà di singole cellule o gruppi vicini di cellule. Per ottenere risultati di successo, si dovrebbe rispettare rigorosamente il protocollo CLARITY, in quanto esiste una vasta gamma di parametri che devono essere considerati per ridurre la varianza tra i campioni (ad esempio, percentuale di chiarezza, informazioni sulla fluorescenza, parametri di gonfiaggio).
La Figura 1 descrive l'intero processo di compensazione dalla convalida dell'espressione proteica fluorescente attraverso tutte le fasi del metodo di compensazione. La Figura 2 descrive come preparare una camera per il tessuto chiarificato, ottimale per l'imaging al microscopio a due fotoni o confocale. I materiali richiesti in questo protocollo sono estremamente economici rispetto ad altri protocolli di preparazione della camera.
La Figura 3 presenta il cubo descritto nel Video 1, dove oltre 300 astrociti sono mostrati in una sezione ripulita della parte CA1 di un ippocampo di topo. La Figura 4 presenta il cubo descritto nel Video 2, dove sia gli astrociti che i somata neuronali eccitatori sono mostrati in uno spesso tessuto trasparente. La Figura 5 presenta un intero emisfero, come descritto nel Video 3. Le proiezioni neuronali a livello cerebrale vengono visualizzate dal CA1 dorsale (verde, GFP) e dal CA1 ventrale (rosso, TdTomato).
Il video 1 presenta un'immagine spessa di astrociti ippocampali (>300) acquisiti con un microscopio a due fotoni dopo una procedura CLARITY. La fluorescenza è stata fornita dalla trasduzione del vettore virale specifica per gli astrociti. Il video 2 presenta la vicinanza spaziale tra gli astrociti e i nuclei delle cellule piramidali ippocampali. Video 3 traccia fasci assonali su un intero emisfero; gli assoni proiettano dalla corteccia motoria primaria e sono rintracciati dal midollo spinale. Un altro fascio è tracciato dall'ippocampo dorsale verso i corpi supra mammillari. Infine, traccia un fascio rosso di assoni dai corpi mammillari verso la loro origine nell'ippocampo ventrale. Tutte le cellule marcate sono esclusivamente eccitatorie.
Figura 1: Descrizione dettagliata del processo di compensazione. (A) Validazione dell'espressione del fluoroforo. In questo esempio, tutti gli astrociti nella parte CA1 di un ippocampo di topo esprimono una proteina rossa (TdTomato, immagine in magenta), e tutti i neuroni eccitatori esprimono una proteina verde nei loro nuclei (H2B-GFP). Questa immagine è stata acquisita utilizzando un microscopio a 2 fotoni. L'immagine è stata scattata utilizzando un obiettivo ad immersione in acqua 16x (0,8 NA) con ingrandimento di 2,4 per ottenere un campo visivo di 652 x 483 μm, a 15,5 fotogrammi/s e uno z-stack con intervalli di 0,937 μm tra i piani. La specificità e la penetranza sono state verificate mediante immunoistochimica9. (B) Il trasferimento del gas N2 dal serbatoio al tubo che contiene il cervello richiede un tubo con un ago alla sua estremità. (C) L'aria all'interno del tubo viene sostituita con N2 creando due fori, uno (freccia superiore) per l'afflusso di N2tramite l'ago collegato alla tubazione dal serbatoio del gas e un altro (freccia inferiore) per il deflusso. (D) Coprire i fori con argilla modellante immediatamente dopo il degasaggio impedisce all'N2 di uscire dal tubo. E) Riscaldare la soluzione degassata per 3,5 ore in un bagno caldo. (F) La polimerizzazione di successo si traduce in un cervello incorporato in HS gelificato. Le bolle di gas potrebbero essere intrappolate nel polimero. (G) Immediatamente dopo l'estrazione dal gel è il punto migliore per il cervello da tagliare nello spessore desiderato. H) Le provette perforate consentono al flusso della soluzione sull'agitatore di raggiungere il campione. (I) I cervelli all'interno di tubi perforati sono tenuti verticalmente da un supporto fatto da sé di una dimensione fatta per adattarsi a un becher da 2 L, in piedi su un agitatore a piastra. (J) Esempio di un cervello che non è abbastanza chiaro. Il campione deve essere mescolato nel CS2 per circa un'altra settimana. (K) Esempio di cervello sufficientemente chiaro. (L) Quando si inserisce il cervello chiaro in PBST, il tessuto diventa più bianco di prima. Questo cambiamento di colore è dovuto al Tritone e scomparirà quando spostato da questa soluzione alla successiva. (M) Dopo >24 ore nel RIMS, il cervello diventerà di nuovo completamente trasparente. Abbreviazioni: GFP = proteina fluorescente verde; NA = apertura numerica; HS = soluzione di idrogel; CS2 = Soluzione di compensazione 2; PBST = soluzione salina tamponata con fosfato contenente lo 0,5% di Triton X-100; RIMS = Soluzione di corrispondenza dell'indice di rifrazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Preparazione della camera. (A) Il primo strato di pareti di colla a caldo copre i bordi di una diapositiva e lascia uno spazio abbastanza ampio da contenere il cervello senza toccare le pareti. Un foro è lasciato nell'angolo superiore sinistro della diapositiva. (B) Aggiunta strato dopo strato per raggiungere l'altezza del tessuto. (C) Il coperchio dritto (freccia bianca) sigilla la camera. (D) Camera riempita con RIMS attraverso il foro nelle pareti della camera. (E) La camera è riempita con RIMS senza lasciare bolle d'aria. (F) Sigillare il foro nella camera con colla a caldo per evitare perdite. Vista laterale. (G) In questa fase, qualsiasi residuo di colla a caldo che si estende sui bordi del vetrino deve essere tagliato dalla camera. (H) Camera completamente preparata, pronta per l'imaging al microscopio. Abbreviazione: RIMS = Refractive Index Matching Solution. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Tutti gli astrociti ripresi (AAV1-GFAP::TdTomato, rosso) in un ippocampo eliminato. Un singolo fotogramma del Video 1 che cattura tutti gli astrociti ripresi (AAV1-GFAP::TdTomato, rosso) in un ippocampo cancellato. Tutti i dettagli delle proprietà dell'immagine sono descritti in Video 1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Astrociti (AAV1-GFAP::TdTomato, rosso) e nuclei di cellule piramidali ippocampali (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, verde) in tessuto trasparente spesso. Un singolo fotogramma del Video 2 mostra sia gli astrociti (AAV1-GFAP::TdTomato, rosso) che i nuclei delle cellule piramidali ippocampali (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, verde) in uno spesso tessuto trasparente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Assoni verdi (AAV5-CaMKII::eGFP, verde) e assoni rossi (AAV5-CaMKII::TdTomato). Un singolo fotogramma del Video 3 che mostra entrambi i tipi di assoni derivati da diverse posizioni in un cervello di topo che possono essere rintracciati in un intero emisfero. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: Riprese di >1 mm di spessore di astrociti CA1 dorsali ippocampali (AAV1-GFAP::TdTomato, rosso). Il video è stato acquisito con un microscopio a due fotoni utilizzando un obiettivo 16x (0,8 NA) con ingrandimento di 2,4 seguendo una procedura CLARITY. Simile alla Figura 1A, l'intervallo z-stack è stato impostato su 0,937 μm. La fluorescenza è stata fornita dalla trasduzione del vettore virale specifica per gli astrociti. Il numero di astrociti in questo cubo è >300 e la maggior parte dei processi sono disponibili per l'analisi nella maggior parte delle cellule. Abbreviazioni: NA = apertura numerica; AAV = virus adeno-associato; GFAP = proteina acida fibrillare gliale. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 2: Astrociti e nuclei di neuroni eccitatori in un cubo 3D. Il cubo contiene tutta la lamina del dCA1 nelle condizioni ottiche menzionate per la Figura 1A e il Video 1. Questo cubo mostra la vicinanza spaziale tra gli astrociti (AAV1-GFAP::TdTomato, rosso) e i nuclei delle cellule piramidali ippocampali (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, verde). Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; GFAP = proteina acida fibrillare gliale; CAMKII = proteina chinasi II calcio/calmodulina-dipendente; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata; H2B = istone 2B. Clicca qui per scaricare questo video.
Video 3: Tracciare fasci assonali su un intero emisfero. Gli assoni verdi (AAV5-CaMKII::eGFP, verde) che terminano al midollo spinale sono facilmente riconducibili alla corteccia motoria primaria (a più di 7 mm di distanza). Dall'ippocampo (lato dorsale), un altro fascio viene tracciato verso i corpi suprammillari (lato più ventrale del cervello), una traccia di quasi 3 mm di lunghezza. La seconda metà del video traccia un fascio rosso di assoni (AAV5-CaMKII::tdTomato) provenienti dall'ippocampo ventrale dalla loro posizione target nei corpi mammillari. L'immagine è stata scattata sotto un microscopio laser confocale a scansione Olympus FV1000 utilizzando un obiettivo 4x (0,16 NA) e più ROI sono stati combinati utilizzando la funzione MATL FluoView per presentare l'intero emisfero. Abbreviazioni: AAV = virus adeno-associato; CAMKII = proteina chinasi II calcio/calmodulina-dipendente; eGFP = proteina fluorescente verde potenziata; NA = apertura numerica; MATL = time-lapse a più aree. Clicca qui per scaricare questo video.
| Soluzione di idrogel (1 L) | |
| Materiale | Importo |
| VA-044 Iniziatore | 2,5 g |
| PFA 4% | 900 ml |
| Acrilammide (40%) | 50 ml |
| Bisacrilammide (2%) | 50 ml |
Tabella 1: Preparazione della soluzione di idrogel (1 L). La soluzione di idrogel deve essere preparata su una superficie ghiacciata. L'ordine in cui gli ingredienti sono mescolati non è importante. Si noti che la percentuale totale di acrilammide è del 2% a differenza di protocolli simili che utilizzano l'1% 17 o il 4% 22.
| Soluzioni di compensazione (1 L) | ||
| Materiale | Importo | |
| CS1 · | CS2 · | |
| Acido borico (M.W. = 61,83 g/mol) | 12,366 g | 3,4 g |
| SDS | 80 gr | 80 gr |
| Base di Tris (M.W. = 121,14 g/mol) | 0 | 12,1 g |
| Acqua distillata (DW) | Riempimento a 1 L | Riempimento a 1 L |
| NaOH · | pH 8,5 | |
| 1 L di Soluzione Salina Tamponata con Fosfato con Triton x-100 allo 0,5% | ||
| Materiale | Importo | |
| PBS | 995 ml | |
| Triton X-100 | 5 ml | |
Tabella 2: Preparazione di soluzioni di compensazione 1 e 2 (1 L) e 1 L di soluzione salina tamponata con fosfato con Triton X-100 allo 0,5%. Le soluzioni di compensazione possono essere preparate in anticipo e mantenute a temperatura ambiente per un lungo periodo. Qualsiasi soluzione contenente acido borico e SDS deve essere maneggiata sotto una cappa aspirante per evitare l'inalazione o il contatto cutaneo con SDS o acido borico. Il NaOH in CS1 deve essere aggiunto per ultimo per impostare il pH a 8,5. Ogni campione di cervello deve essere posto in almeno 5-25 ml di CS1 e conservato durante la notte per una diffusione sufficiente. Abbreviazioni: CS1 = soluzione di compensazione 1; SDS = sodio dodecil solfato; M.W. = peso molecolare.
| Nome del prodotto | Vantaggio principale | Svantaggio principale |
| RapiClear | Il campione rimane trasparente | Gonfiore dei tessuti |
| RapiClear CS | Il campione si restringe alle dimensioni normali | Il campione potrebbe perdere la trasparenza |
Tabella 3: Opzioni RIMS con vantaggi e svantaggi. Rapiclear (RC, RI = 1,47) o Rapiclear specifico per CLARITY (CSRC, RI = 1,45). La differenza principale tra queste due soluzioni è che mentre il CSRC riduce il cervello chiaro alle sue dimensioni originali, la soluzione RC no, lasciando il campione eliminato leggermente gonfio. Abbreviazione: RI = indice di rifrazione.
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Discussion
I metodi di compensazione dei tessuti rappresentano uno strumento rivoluzionario nella ricerca sul cervello, invitando a domande che in precedenza non avrebbero potuto essere poste. Dal targeting delle proprietà di un piccolo gruppo di cellule, una singola cellula o anche una singola sinapsi, CLARITY ora consente il targeting di popolazioni cellulari totali o funzionalità di connettività a lungo raggio utilizzando fluorofori pertinenti.
Il risultato dell'espressione del fluoroforo e della combinazione di procedure CLARITY non è binario; molti fattori possono interferire con la procedura portando a risultati non ottimali. In primo luogo, l'espressione del fluoroforo deve essere verificata in anticipo. Poiché la procedura CLARITY causa una perdita di informazioni, una sufficiente espressione della proteina fluorofora è fondamentale per la validità dell'immagine alla fine del processo CLARITY. In secondo luogo, la perfusione transcranica deve essere gestita con attenzione, assicurando che tutto il sangue esca dal cervello, perché l'autofluorescenza del sangue porterà a dati inaffidabili in fette spesse. In terzo luogo, tutti i parametri discussi nel protocollo devono essere gestiti in ogni fase del processo di compensazione con precisione, ad esempio, il residuo di O2 nell'HS prima della polimerizzazione o l'imprecisione della temperatura in ogni fase impedirà la reazione chimica tra i materiali attivi.
I protocolli precedenti17,22 raccomandano diverse concentrazioni di acrilammide nell'HS. Lo scopo principale dell'acrilammide è quello di fissare meglio le molecole con residui di ammine (proteine e acidi nucleici). Lievi alterazioni della concentrazione hanno un grande impatto sull'intero processo di compensazione: se la fissazione è troppo compatta, le molecole lipidiche non si disconnetteranno dal tessuto e il processo di compensazione sarà inutilmente prolungato o si tradurrà in cervelli opachi. Concentrazioni più basse di acrilammide, tuttavia, non manterranno adeguatamente la struttura cerebrale una volta priva di lipidi. In questo protocollo, la percentuale di acrilammide è impostata per fornire il delicato equilibrio del tessuto fissato ma chiaro.
La maggior parte del processo di compensazione avviene in CS2 e il livello di chiarezza dei tessuti deve essere testato quotidianamente. La pulizia PBST è un passaggio essenziale tra le soluzioni di Clearing e le soluzioni di corrispondenza dell'indice di rifrazione perché pulisce le molecole SDS residue, che possono interagire con il RIMS. È anche possibile mantenere il tessuto chiaro in PBST (0,5%) a tempo indeterminato se la preparazione della camera non è ancora necessaria.
Quando si posiziona il cervello nel RIMS, si dovrebbe acquisire familiarità con i benefici e i limiti delle soluzioni. Ad esempio, RapiClear causerà una completa trasparenza anche nei tessuti quasi eliminati, ma causerà anche un certo gonfiore, che non dovrebbe essere trascurato durante l'analisi dei dati. Le misurazioni precedenti9 suggeriscono un'espansione uguale lungo tutti gli assi (cioè gli assi dorsoventrale, anteriore-posteriore e laterale-mediale), rendendo possibile calcolare l'indice di gonfiore rispetto alle fette sottili della stessa regione del cervello. L'utilizzo di Clarity-Specific RapiClear elimina il gonfiore; tuttavia, se gli avanzi di SDS rimangono nel tessuto, si aggregano in masse non trasparenti.
Un altro vantaggio di questo protocollo modificato è il suo costo. I protocolli precedenti suggeriscono diversi tipi di colla per creare una camera in grado di contenere il cervello in RIMS. In questo protocollo, usiamo semplicemente la colla a caldo. Non reagisce con le soluzioni, è disponibile per l'acquisto ovunque, è facile da usare ed è significativamente più economico delle colle suggerite in precedenza.
I dati acquisiti dall'imaging di campioni di cervello spessi possono descrivere intere popolazioni cellulari, la connettività tra le strutture cerebrali o il tracciamento di un singolo assone su grandi distanze (Video 3). Sebbene siano già state poste domande su queste caratteristiche, la validità dei dati ora ottenibili utilizzando spesse fette di cervello migliora notevolmente i precedenti metodi di sovrapposizione dell'immagine a fetta sottile, soggetti a errori.
Il processo CLARITY garantisce una pulizia efficace e uniforme di fette spesse, da diversi millimetri all'imaging cerebrale completo. La compensazione passiva (cioè non utilizzando ETC) diminuisce il rischio di danni al tessuto e il tempo per il quale i campioni vengono immersi in soluzioni di compensazione in modo che non influisca sull'elevata efficienza della conservazione delle proteine.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Horizon 2020 dell'Unione europea (convenzione di sovvenzione n. 803589), dalla Israel Science Foundation (sovvenzione ISF n. 1815/18) e dalle sovvenzioni Canada-Israele (CIHR-ISF, sovvenzione n. 2591/18). Ringraziamo Nechama Novick per aver commentato l'intero manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
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