Summary
שילוב של התמרה וקטורית נגיפית וניקוי מוח בשיטת CLARITY מאפשר לחקור מספר רב של נוירונים ואסטרוציטים בו זמנית.
Abstract
שילוב של התמרה וקטורית נגיפית ופינוי רקמות בשיטת CLARITY מאפשר לחקור בו-זמנית מספר סוגים של תאי מוח ואת האינטראקציות ביניהם. התמרה וקטורית נגיפית מאפשרת סימון של סוגי תאים מגוונים בצבעים פלואורסצנטיים שונים בתוך אותה רקמה. ניתן לזהות תאים מבחינה גנטית על ידי פעילות או הקרנה. באמצעות פרוטוקול CLARITY שונה, גודל המדגם הפוטנציאלי של אסטרוציטים ותאי עצב גדל ב-2-3 סדרי גודל. השימוש ב- CLARITY מאפשר הדמיה של אסטרוציטים שלמים, שהם גדולים מכדי להתאים לשלמותם בפרוסות, ובדיקת הסומטה עם כל התהליכים שלהם. בנוסף, הוא מספק את ההזדמנות לחקור את האינטראקציה המרחבית בין אסטרוציטים לסוגי תאים עצביים שונים, כלומר, מספר הנוירונים הפירמידליים בכל תחום אסטרוציטי או הקרבה בין אסטרוציטים לאוכלוסיות נוירונים מעכבות ספציפיות. מאמר זה מתאר, בפירוט, כיצד יש ליישם שיטות אלה.
Introduction
בשנים האחרונות, הידע על תפקוד האסטרוציטים וכיצד הם מתקשרים עם מעגלים עצביים גדל באופן דרמטי. אסטרוציטים יכולים להשפיע על פלסטיות 1,2, לסייע בהתאוששות עצבית לאחר הלידה 3,4, ואפילו לגרום לפוטנציה עצבית דה נובו, כאשר מחקרים אחרונים מראים את החשיבות של אסטרוציטים ברכישה ותגמול של זיכרון, שנחשבו בעבר לתפקודים עצביים גרידא 5,6,7 . מאפיין שמעניין במיוחד בחקר האסטרוציטים הוא הסידור המרחבי של התאים, השומרים על ארגונים מרחביים ייחודיים בהיפוקמפוס ובמבני מוח אחרים 8,9,10. שלא כמו הדנדריטים העצביים המשתלבים בין סומטה של התאים, אסטרוציטים בהיפוקמפוס מאכלסים טריטוריות הניתנות להבחנה חזותית עם חפיפה קלה בין התהליכים שלהם, ויוצרים תחומים נפרדים 8,11,12,13. הראיות התומכות בהשתתפותם של אסטרוציטים במעגלים עצביים אינן תומכות בהיעדר תיאור אנטומי מפורט של אוכלוסיות כאלה ושל תאי העצב בתחומם14.
הליכי התמרה וקטורית נגיפית, יחד עם בעלי חיים מהונדסים (TG), זכו לפופולריות כמערכת כלים לחקר מבנים מוחיים, תפקודים ואינטראקציות בין תאים15,16. השימוש במקדמים שונים מאפשר מיקוד של תאים ספציפיים על פי תכונותיהם הגנטיות, רמות ההפעלה17,18 או יעדי ההקרנה שלהם. וירוסים שונים יכולים לבטא פלואורופורים בצבעים שונים באוכלוסיות שונות. ניתן לשלב נגיף עם ביטוי אנדוגני של פלואורופורים ב- TG, או שניתן להשתמש בחיות TG ללא צורך בנגיפים. טכניקות אלה נמצאות בשימוש נרחב לסימון עצבי, וכמה מעבדות החלו להשתמש בהן עם שינויים המתמחים בהתמקדות בסוגי תאים אחרים, כגון אסטרוציטים 5,9,19.
טכניקת CLARITY, שתוארה לראשונה בשנת 2013 20,21, מאפשרת לחקור פרוסות מוח עבות על ידי הפיכת המוח כולו לשקוף תוך השארת המבנים המיקרוסקופיים שלמים. על ידי שילוב שתי השיטות - התמרה וקטורית נגיפית וניקוי רקמות - האפשרות לבחון את האינטראקציות המרחביות בין אוכלוסיות שונות של סוגי תאים זמינה כעת. רוב מחקרי האינטראקציה בין אסטרוציטים לנוירונים בוצעו על פרוסות מוח דקות, וכתוצאה מכך תמונות של אסטרוציטים לא שלמים בשל תחומיהם הגדולים, ובכך הגבילו באופן קיצוני את מספר התאים שנותחו. השימוש בטכניקת CLARITY מאפשר אפיון ברזולוציה של תא יחיד של אוכלוסיות תאים בכמויות גדולות בו-זמנית. הדמיה של אוכלוסיות תאים המתויגות באופן פלואורסצנטי במוחות צלולים אינה מספקת רזולוציה סינפטית, אלא מאפשרת אפיון יסודי של האינטראקציות המרחביות בין אסטרוציטים למגוון סוגי תאים עצביים.
מסיבה זו, רתמנו את הטכניקות המתקדמות האלה כדי לחקור את התכונות של אסטרוציטים לאורך CA1 הגבי, תוך הדמיה של כל הלמינה (Stratum Radiatum, שכבת הפירמידה ו-Stratum Oriens). מדדנו עשרות אלפי אסטרוציטים (עם חדירה נגיפית של >96%5), ובכך ניתחנו את המידע של כל האוכלוסייה האסטרוציטית סביב CA1. בעזרת חדירה יעילה של הסמנים העצביים, נוכל לתעד את האינטראקציות בין כל האוכלוסייה של אסטרוציטים CA1 לבין ארבעת הסוגים של תאים עצביים-פרוואלבומין (PV), סומטוסטטין (SST), נוירונים מעכבי VIP ותאים פירמידליים מעוררים9.
מספר ניסויים בוצעו באמצעות שילוב של פלואורסצנציה מחיות TG וווקטורים נגיפיים בצבעים שונים (כולם תאים מעכבים), בעוד שאחרים (מעוררים) השתמשו בשני וקטורים ויראליים המבטאים פלואורופורים שונים תחת מקדמים שונים9. מאמר זה מציג פרוטוקול מפורט, הכולל תיוג של התאים הרצויים במוח, מה שהופך את המוח לשקוף באמצעות הליך CLARITY שונה, כמו גם הדמיה וניתוח של מבנים מוחיים שלמים, באמצעות נהלים ותוכנות שונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקולי הניסוי אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה העברית ועמדו בהנחיות המכון הלאומי לבריאות מדריך לטיפול בחיות מעבדה ולשימוש בהן.
1. התמרה וקטורית ויראלית
הערה: התמרה וקטורית נגיפית משמשת לביטוי פלואורופורים במוח.
- השתמש באטלס (למשל, אטלס המוח של אלן) כדי לאתר את התיאום הרלוונטי של אזור המטרה.
הערה: אטלסים תלת-ממדיים ניתן למצוא באינטרנט (למשל, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer). - באמצעות ניתוח סטריאוטקטי, להזריק את הווקטורים הנגיפיים למבנה המוח הרלוונטי. ראה9 לפרוטוקול מפורט.
- יש להמתין 3-6 שבועות לביטוי פלואורופור.
הערה: פרק זמן קצר מספיק אם יש לסמן רק את גופי התאים. יהיה צורך בפרק זמן ארוך אם התחזיות האקסונאליות רלוונטיות לשאלה, שכן לוקח זמן רב יותר לפלואורופורים להתבטא באקסונים, שיכולים להיות באורך של כמה מילימטרים. - אמתו את הספציפיות והחדירה של ביטוי פלואורופור (הן של ביטוי נגיפי והן של חיות TG) לפני כן (איור 1A). לפני שתמשיכו בהליך CLARITY, ייעדו לפחות מוח אחד לפרוסות דקות וודאו שהביטוי הפלואורופור הוא גם חזק וגם ספציפי לתכונת תא המטרה.
2. בהירות
הערה: שיטה זו הופכת את המוח לשקוף תוך 2-6 שבועות.
- בצעו זלוף טרנס-גולגולתי על בעלי חיים באמצעות מי מלח קרים עם תפרחת פוספט (PBS) ואחריה 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS. הסר את המוח ושמור אותו ב- PFA למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס בצינור 50 מ"ל או במיכל דומה.
הערה: לפני ביצוע זלוף טרנס-גולגולתי, החיה חייבת להיות מורדמת עמוקות. בדוגמאות שהוצגו בפרוטוקול זה, כל בעלי החיים הורדו באמצעות קטמין וקסילאזין (90% ו -10%, בהתאמה). - החלף את ה-PFA בתמיסת הידרוג'ל (HS; ראה טבלה 1) למשך 48 שעות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: אין לאפשר לחומרים להתחמם יותר מטמפרטורת הקירור (4-8 מעלות צלזיוס) בשלב זה, אחרת ההידרוג'ל יתפלמר. HS המשמש בפרוטוקול זה מכיל 2% אקרילאמיד, בניגוד לפרוטוקולים קודמים המציעים 4%22 או 1%17. היתרון של 2% מפורט בסעיף הדיון. בעת הכנת HS, לעבוד על משטח קר כקרח. אחסנו אותו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. - דגה
הערה: מטרת שלב זה היא להסיר את כל החמצן החופשי מהרקמה מכיוון ש- O2 מפריע לתהליך הפילמור. ניתן להשתמש בכל גז שאינוO2 (למשל, N2, CO2); N2 מומלץ.- העבר את ה-N2 מהמיכל באמצעות צינור גמיש בקוטר 5 מ"מ (פנימי), המחובר למחט של 19 גרם בקצהו (איור 1B).
- צרו שני חורים קטנים (ברוחב המחט) בפקק של הצינור: האחד כדי להכניס את הגז והשני כדי לאפשר לאוויר לצאת מהצינור (איור 1C).
- חברו את הצינור מגז N2 לצינור והחליפו את הגזים למשך כ-30 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
- הסירו את הצינור ואטמו מיד את החורים בחימר מידול על כל צינור (איור 1D).
- מעבירים את הצינורות האטומים הפגועים לאמבטיה של 37 מעלות צלזיוס למשך 3.5 שעות כדי לפלמל את ה-HS, שיהפוך לג'ל. היזהרו לא לנער את הצינורות (איור 1E).
- הוציאו את המוח מהצינור והסירו בעדינות את הג'ל הפולימרי מסביבו באמצעות מגבוני מעבדה. וודאו שלא יישארו שאריות ג'ל מחוברות לפני השטח של הרקמה, שכן היא עלולה להגיב עם התמיסה בשלבים הבאים, ולעכב את תהליך ניקוי הרקמה (איור 1F).
הערה: מכיוון שהג'ל הכיל PFA, המיצוי צריך להיעשות מתחת למכסה אדים. - פרוסים את המוח אם השאלה העומדת על הפרק דורשת רק חלק ממנו. מחלקים אותו לחצי או לפרוסות עבות מאוד שמכילות את כל תחומי העניין (איור 1G).
- מניחים את הפרוסות בפתרון הניקוי הראשון (CS1, ראו טבלה 2) במיכל חדש ומנערים ב-70 סל"ד למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.
- בצע את השלבים המתוארים להלן כדי להעביר את המוח מ- CS1 לפתרון הסליקה השני (CS2, ראה טבלה 2).
- הכינו מראש צינור מחורר למוח (איור 1H).
- מחממים מראש את CS2 ל-40-45 מעלות צלזיוס בכוס גדולה מספיק כדי להכיל את הצינור. עשו זאת על פלטה חמה עם מערבל. ודא שהטמפרטורה אינה מגיעה ל -55 מעלות צלזיוס כדי למנוע הלבנה של החלבונים המבוטאים.
- הניחו את הכוס המלאה ב-CS2 ואת הצינור המחורר על מכשיר ערבוב (כוס 2 ליטר באיור 1I). קבעו קצב ערבוב מתון שיגרום לנוזל לזרום מבלי לעוות את הרקמה.
הערה: תוך 2-6 שבועות, הרקמה תהפוך לשקופה (התהליך מתחיל בפריפריה ונע פנימה לכיוון מבני המוח המרכזיים). ההחלטה מתי הרקמה "ברורה מספיק" תלויה בשיקול דעת אישי. המוח צריך להיות שקוף מספיק להדמיה מתחת למיקרוסקופ ללא הפרעה (איור 1J לא מספיק ברור; איור 1K ברור מספיק). מעבר לנקודה שבה הרקמה ברורה מספיק עלול לגרום לאובדן קשיחות הרקמה.
- העברה מ-CS2 ל-PBST (0.5% טריטון X-100 ב-PBS, ראו טבלה 2) במיכל חדש ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות (70 סל"ד) למשך 24 שעות.
הערה: ב-PBST, הרקמה תהפוך ללבנה (איור 1L). הבהירות תחזור (ותשתפר) כאשר תוטמע בפתרון התאמת מקדם השבירה (RIMS, ראה שלב 2.14). - החלף את ה- PBST ב- PBST חדש. יש לשמור באותם תנאים (37 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות) במשך 24 שעות נוספות.
- החלף שוב את PBST ב- PBST חדש ושמור על RT למשך 24 שעות.
- העבר ל- PBS ב- RT למשך 24 שעות.
- החלף את ה- PBS והשאר ב- RT למשך 24 שעות נוספות.
- הסר את המוח מ- PBS והעביר אותו ל- RIMS ב- 37 °C ב- 37 °C במשך הלילה.
הערה: בתחילה, אדוות ב- RIMS עשויות להקיף את המוח. פרוטוקול זה תוכנן ואומת באמצעות שני RIMS מסחריים ספציפיים (ראה טבלה 3). עם זאת, הפרוטוקול לא צריך להיות שונה בעת שימוש ב- RIMS אחרים (מסחריים או מתוצרת עצמית). - שמור את הרקמה ב-RT למשך 24 שעות נוספות או עד שהתמיסה תגיע לשיווי משקל מלא, כלומר כאשר הרקמה הופכת שקופה, והתמיסה אינה מכילה עוד אדוות נראות לעין (איור 1M).
- אם הרקמה שקופה, המשך להכנת התא. אם בשלב זה, הרקמה הופכת לבנה במקום שקופה (עקב אגרגטים של מולקולות SDS שיוריות), נקו את הדגימה שוב על ידי חזרה על שלבים 2.9 ו-2.10, והעבירו את הרקמה ל-CS2 (שלב 2.8) למשך מספר ימים, ולאחר מכן את כל השלבים עד שלב 2.15.
3. הכנה קאמרית
הערה: כל דגימה דורשת שקופית עם תא הדמיה שבו תוצב הדגימה.
- מקם את הדגימה באמצע השקופית.
- באמצעות אקדח דבק חם, ליצור קירות בשולי המגלשה, כמעט כמו הרקמה. הקפידו להשאיר רווח קטן (כ-5 מ"מ) באחת הפינות (איור 2A,B).
- יש למרוח 1-2 טיפות של ה-RIMS על הדגימה כדי לשמור על המשטח העליון לח ולמנוע היווצרות בועות בין הכיסוי לרקמה.
- מיד לאחר מריחת טיפות ה-RIMS, הוסיפו את השכבה האחרונה של הדבק החם לדפנות (כך שיגיעו לגובה המוח/פרוסה) והתקדמו מיד (בזמן שהדבק החם עדיין נוזלי) לשלב 3.5.
- אטמו את החלק העליון בכיסוי, והניחו אותו באופן שווה ככל האפשר בחלק העליון של שכבת הדבק החם שעדיין חמה (איור 2C).
- מלאו את התא ב-RIMS דרך הרווח שנותר בדפנות הדבק החמות (איור 2D,E).
- סגרו את הפער בדבק חם. אל תשאירו אוויר בפנים (איור 2F).
- אם דפנות הדבק החמות חורגות מגבולות המגלשה, חתכו את הקצוות המתרחבים (איור 2G).
- אם המטרה המשמשת להדמיה שקועה, הוסיפו עוד 2-3 מ"מ של דבק לקירות שמעל הכיסוי, כך שפתרון הטבילה יחזיק מעמד תקופה ארוכה יותר (איור 2H).
4. הדמיה (קונפוקלית או דו-פוטונית)
- בדוק אם הבמה יכולה להחזיק את התא, שכן עובי התא יכול להגיע למספר מילימטרים.
הערה: לדוגמה, המיקרוסקופ הקונפוקלי (ראה טבלת החומרים) המשמש בפרוטוקול זה מצויד במספר שלבים (למשל, עגול, מלבני). כל שלב שייבחר להחזיק את התא אינו רלוונטי כל עוד הפרמטרים שלו מתאימים לגדלים של התא. - עבודה עם מטרה עם מרחק עבודה מספיק, כלומר, מרחק עבודה מינימלי ≥3 מ"מ, מכיוון שאזור העניין במוח עשוי להיות בעומק של כמה מילימטרים, וייתכן שהכיסוי אינו ישר לחלוטין כפי שהוא הונח באופן ידני.
הערה: כהדגמה, התוצאות שהוצגו באיור 1, וידאו 1 ווידאו 2 התקבלו תחת מיקרוסקופ של שני פוטונים באמצעות מטרת טבילת מים 16x עם מרחק עבודה של 3 מ"מ והגדלה של 2.4 כדי להשיג שדה ראייה של 652 x 483 מיקרומטר וערימה z עם מרווחי 0.937 מיקרומטר בין המישורים. - בצע הדמיה מרובת אזורים, שעשויה להימשך מספר שעות ואף ימים. ודא שיש מספיק אחסון פנוי במחשב מכיוון שגודלה של כל תמונה יכול להגיע לעשרות ג'יגה-ביטים עד עשרות ג'יגה-ביט.
הערה: הדמיית CLARITY עשויה לגרום לעומק משמעותי יותר של קטעי תמונה. לכן, העוצמות המשמשות ללכידת הביטוי צריכות להיות נמוכות יחסית כדי למנוע ביטוי יתר במהלך סיכום התמונה. - למטרות טבילה, בדקו את הנוזל באופן שגרתי בזמן ההדמיה והוסיפו תוסף עם נוזל נוסף במידת הצורך.
הערה: במהלך ההדמיה של הנתונים שהוצגו בסרטון 3, נוספו מים לפני השטח של התא כל 6-8 שעות כדי להילחם בהתאדות. - לאחר רכישת התמונה, הצג ונתח אותה באמצעות מספר חבילות תוכנה שונות.
הערה: התוכנה המומלצת כוללת את Imaris ו- SyGlass הן להדמיה והן לניתוח. הצינור המדויק לשחזור אופטימלי של אסטרוציטים באמצעות תוכנת אימריס תואר בעבר9. בקיצור, תכונות האימאריס ששימשו במחקר זה היו פילמנטים לשחזור מלא של מבני תאים ונקודות כדי לחלץ את המיקום בחלל של כל הסומטה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ניקוי מוצלח של פרוסות רקמת מוח עבות מביא למגוון חדש של שאלות שניתן לשאול לגבי התכונות של אוכלוסיות תאים גדולות, בניגוד לתכונות של תאים בודדים או קבוצות תאים שכנות. כדי להשיג תוצאות מוצלחות, יש להקפיד על פרוטוקול CLARITY, שכן יש מגוון רחב של פרמטרים שיש לקחת בחשבון כדי להפחית את השונות בין הדגימות (למשל, אחוז הבהירות, מידע פלואורסצנטי, פרמטרים של נפיחות).
איור 1 מתאר את כל תהליך הסליקה מאימות ביטוי חלבונים פלואורסצנטי דרך כל שלבי שיטת הסליקה. איור 2 מתאר כיצד להכין תא לרקמה המובהקת, אופטימלי להדמיה תחת מיקרוסקופ דו-פוטוני או קונפוקלי. החומרים הנדרשים בפרוטוקול זה הם זולים ביותר ביחס לפרוטוקולים אחרים של הכנת תאים.
איור 3 מציג את הקובייה המתוארת בווידאו 1, שבה יותר מ-300 אסטרוציטים מוצגים בחלק מנוקה של החלק CA1 של היפוקמפוס עכבר. איור 4 מציג את הקובייה המתוארת בסרטון 2, שבה גם האסטרוציטים וגם הסומטה העצבית המתעוררת מוצגים ברקמה שקופה עבה. איור 5 מציג חצי כדור שלם, כפי שמתואר בסרטון 3. הקרנות עצביות כלל-מוחיות מוצגות מה-CA1 הגבי (ירוק, GFP) ומה-CA1 הגחוני (אדום, TdTomato).
וידאו 1 מציג תמונה עבה של אסטרוציטים בהיפוקמפוס (>300) שנרכשו באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטונים לאחר הליך CLARITY. פלואורסצנציה סופקה על ידי התמרה וקטורית ויראלית ספציפית לאסטרוציטים. סרטון 2 מציג את הקרבה המרחבית בין אסטרוציטים לבין גרעיני התאים הפירמידליים של ההיפוקמפוס. וידאו 3 עוקב אחר צרורות אקסונאליים על פני חצי כדור שלם; אקסונים מוקרנים מקליפת המוח המוטורית הראשונית ונלקחים בחזרה מחוט השדרה. צרור נוסף נמתח מההיפוקמפוס הגבי לעבר הגופים של סופרה ממילרי. לבסוף, הוא מתחקה אחר צרור אדום של אקסונים מגופי היונקים לעבר מקורם בהיפוקמפוס הגחוני. כל התאים המסומנים מעוררים באופן בלעדי.
איור 1: תיאור מפורט של תהליך הסליקה. בדוגמה זו, כל האסטרוציטים בחלק CA1 של היפוקמפוס עכבר מבטאים חלבון אדום (TdTomato, בתמונה במג'נטה), וכל תאי העצב המתעוררים מבטאים חלבון ירוק בגרעינים שלהם (H2B-GFP). תמונה זו נרכשה באמצעות מיקרוסקופ של 2 פוטונים. התמונה צולמה באמצעות טבילה במים 16x מטרה (0.8 NA) עם הגדלה של 2.4 כדי לקבל שדה ראייה של 652 x 483 מיקרומטר, ב-15.5 פריימים לשנייה וערימה z עם מרווחים של 0.937 מיקרומטר בין המישורים. הספציפיות והחדירה אומתו על ידי אימונוהיסטוכימיה9. (B) העברת גז N2 מהמיכל לתוך הצינור המחזיק את המוח דורשת צינור עם מחט בקצהו. (C) האוויר בתוך הצינור מוחלף ב-N2 על ידי יצירת שני חורים, אחד (חץ עליון) לזרימה של N2דרך המחט המחוברת לצנרת ממיכל הדלק והשני (חץ תחתון) ליציאה. (D) כיסוי החורים בחימר דוגמנות מיד לאחר הדה-גז מונע מה-N2 לצאת מהצינור. (E) חימום תמיסת הגז במשך 3.5 שעות באמבטיה חמה. (F) פילמור מוצלח גורם למוח המוטמע ב-HS ג'ל. בועות גז עשויות להיות לכודות בפולימר. (ז) מיד לאחר החילוץ מהג'ל הוא הנקודה הטובה ביותר עבור המוח להיחתך לעובי הרצוי. (H) צינורות מחוררים מאפשרים לזרימת התמיסה על המערבל להגיע לדגימה. (I) מוחות בתוך צינורות מחוררים מוחזקים אנכית על ידי מחזיק מתוצרת עצמית בגודל שנועד להתאים לכוס 2 ליטר, העומד על מערבל לוחית חמה. (J) דוגמה למוח שאינו ברור מספיק. יש לערבב את הדגימה ב- CS2 במשך כשבוע נוסף. (K) דוגמה למוח צלול מספיק. (L) כאשר מחדירים את המוח השקוף לתוך PBST, הרקמה הופכת לבנה יותר מבעבר. שינוי צבע זה נובע מהטריטון והוא ייעלם כאשר יעבור מפתרון זה לפתרון הבא. (M) לאחר >24 שעות ב-RIMS, המוח יהפוך שוב לשקוף לחלוטין. קיצורים: GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; NA = מפתח צמצם מספרי; HS = תמיסת הידרוג'ל; CS2 = פתרון סליקה 2; PBST = מלח בעל מאגר פוספט המכיל 0.5% טריטון X-100; RIMS = פתרון התאמת מקדם שבירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הכנה קאמרית. (A) השכבה הראשונה של דפנות הדבק החם מכסה את קצוות המגלשה ומשאירה חלל רחב מספיק כדי להכיל את המוח מבלי לגעת בקירות. חור אחד נותר בפינה השמאלית העליונה של המגלשה. (B) הוספת שכבה אחר שכבה כדי להגיע לגובה הרקמה. (C) כיסוי ישר (חץ לבן) אוטם את החדר. (ד) תא מלא ב-RIMS דרך החור בקירות התא. (E) התא מלא ב-RIMS ואינו מותיר בועות אוויר. (F) איטום החור בתא בדבק חם כדי למנוע דליפה. מבט מהצד. (ז) בשלב זה, כל שארית דבק חם המשתרעת על קצות המגלשה צריכה להיחתך מהתא. (H) תא מוכן במלואו, מוכן להדמיה מתחת למיקרוסקופ. קיצור: RIMS = פתרון התאמת מקדם שבירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: כל האסטרוציטים המצולמים (AAV1-GFAP::TdTomato, אדום) בהיפוקמפוס מנוקה. פריים יחיד מווידאו 1 הלוכד את כל האסטרוציטים המצולמים (AAV1-GFAP::TdTomato, אדום) בהיפוקמפוס מנוקה. כל הפרטים של מאפייני התמונה מתוארים תחת וידאו 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: אסטרוציטים (AAV1-GFAP::TdTomato, אדום) וגרעיני תאים פירמידליים בהיפוקמפוס (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, ירוק) ברקמה שקופה עבה. פריים יחיד מסרטון 2 המציג הן את האסטרוציטים (AAV1-GFAP::TdTomato, אדום) והן את גרעיני התאים הפירמידליים ההיפוקמפוסיים (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, ירוק) ברקמה שקופה עבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: אקסונים ירוקים (AAV5-CaMKII::eGFP, ירוק) ואקסונים אדומים (AAV5-CaMKII::TdTomato). פריים יחיד מסרטון 3 המציג את שני סוגי האקסונים הנגזרים מכמה מקומות במוח של עכבר שניתן לעקוב אחריהם לאורך חצי כדור שלם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
וידאו 1: צילומים של פרוסה בעובי >1 מ"מ של אסטרוציטים גביים של CA1 בהיפוקמפוס (AAV1-GFAP::TdTomato, אדום). הסרטון נרכש במיקרוסקופ דו-פוטונים באמצעות מטרה של פי 16 (0.8 NA) עם הגדלה של 2.4 בעקבות הליך CLARITY. בדומה לאיור 1A, מרווח הערימה z הוגדר על 0.937 מיקרומטר. פלואורסצנציה סופקה על ידי התמרה וקטורית ויראלית ספציפית לאסטרוציטים. מספר האסטרוציטים בקובייה זו הוא >300, ורוב התהליכים זמינים לניתוח ברוב התאים. קיצורים: NA = צמצם מספרי; AAV = וירוס הקשור לאדנו; GFAP = חלבון חומצי מפרבר גליה. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
וידאו 2: אסטרוציטים ותאי עצב מעוררים גרעינים בקובייה תלת-ממדית. הקובייה מכילה את כל הלמינה של ה-dCA1 בתנאים האופטיים שהוזכרו עבור איור 1A ווידאו 1. קובייה זו מציגה את הקרבה המרחבית בין אסטרוציטים (AAV1-GFAP::TdTomato, אדום) לבין גרעינים של תאים פירמידליים בהיפוקמפוס (AAV5-CaMKII::H2B-eGFP, ירוק). קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; GFAP = חלבון חומצי מפרבר גליה; CAMKII = חלבון קינאז II תלוי סידן/קלמודולין; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; H2B = histone 2B. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.
סרטון 3: מעקב אחר צרורות אקסונאליים על פני חצי כדור שלם. אקסונים ירוקים (AAV5-CaMKII::eGFP, ירוק) המסתיימים בחוט השדרה נקשרים בקלות לקליפת המוח המוטורית הראשונית (במרחק של יותר מ-7 מ"מ זה מזה). מההיפוקמפוס (הצד הגבי), צרור נוסף נמצא במעקב אחר גופי הסופרה מאמיריים (רוב הצד הגחוני של המוח), עקבות באורך של כמעט 3 מ"מ. המחצית השנייה של הסרטון עוקבת אחר צרור אדום של אקסונים (AAV5-CaMKII::tdTomato) שמקורם בהיפוקמפוס הגחוני בחזרה ממיקום היעד שלהם בגופי החלב. התמונה צולמה תחת מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי סורק אולימפוס FV1000 באמצעות מטרה של 4x (0.16 NA), ומספר ROIs שולבו באמצעות תכונת MATL FluoView כדי להציג את כל חצי הכדור. קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; CAMKII = חלבון קינאז II תלוי סידן/קלמודולין; eGFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר; NA = מפתח צמצם מספרי; MATL = קיטועי זמן מרובים באזורים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרטון הזה.
| תמיסת הידרוג'ל (1 ליטר) | |
| חומר | כמות |
| VA-044 יוזם | 2.5 גרם |
| PFA 4% | 900 מ"ל |
| אקרילאמיד (40%) | 50 מ"ל |
| ביסאקרילמיד (2%) | 50 מ"ל |
טבלה 1: הכנת תמיסת הידרוג'ל (1 L). תמיסת הידרוג'ל חייבת להיות מוכנה על משטח קר כקרח. הסדר שבו המרכיבים מעורבבים אינו חשוב. שים לב שהאחוז הכולל של אקרילאמיד הוא 2% בניגוד לפרוטוקולים דומים המשתמשים ב-1%17 או 4%22.
| פתרונות סליקה (1 L) | ||
| חומר | כמות | |
| CS1 | CS2 | |
| חומצה בורית (M.W. = 61.83 גרם/מול) | 12.366 גרם | 3.4 גרם |
| SDS | 80 גרם | 80 גרם |
| בסיס טריס (M.W. = 121.14 גרם/מול) | 0 | 12.1 גרם |
| מים מזוקקים (DW) | מילוי עד 1 ליטר | מילוי עד 1 ליטר |
| נאוה | עמ' 8.5 | |
| 1 ליטר של מלוחים עם מאגר פוספט עם 0.5% טריטון X-100 | ||
| חומר | כמות | |
| PBS | 995 מ"ל | |
| טריטון X-100 | 5 מ"ל | |
טבלה 2: הכנת פתרונות סליקה 1 ו-2 (1 ליטר) ו-1 ליטר של תמיסת מלח עם 0.5% טריטון X-100. ניתן להכין את פתרונות הסליקה מראש ולשמור אותם בטמפרטורת החדר למשך תקופה ארוכה. כל תמיסה המכילה חומצה בורית ו-SDS צריכה להיות מטופלת מתחת למכסה אדים כדי למנוע שאיפה או מגע עם העור עם SDS או חומצה בורית. יש להוסיף את ה-NaOH ב-CS1 אחרון כדי להגדיר את ה-pH על 8.5. כל דגימת מוח צריכה להיות ממוקמת בלפחות 5-25 מ"ל של CS1 ולשמור אותה למשך הלילה לצורך דיפוזיה מספקת. קיצורים: CS1 = פתרון ניקוי 1; SDS = נתרן דודציל סולפט; M.W. = משקל מולקולרי.
| שם המוצר | יתרון עיקרי | החיסרון העיקרי |
| RapiClear | הדוגמה נשארת שקופה | נפיחות ברקמות |
| RapiClear CS | המדגם מתכווץ בחזרה לגודל רגיל | המדגם עלול לאבד את השקיפות |
טבלה 3: אפשרויות RIMS עם יתרונות וחסרונות. Rapiclear (RC, RI = 1.47) או Rapiclear ספציפי ל- CLARITY (CSRC, RI = 1.45). ההבדל העיקרי בין שני הפתרונות הללו הוא שבעוד שה-CSRC מכווץ את המוח השקוף בחזרה לגודלו המקורי, תמיסת ה-RC לא עושה זאת, מה שמשאיר את הדגימה המנוקה מעט נפוחה. קיצור: RI = מקדם שבירה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטות לניקוי רקמות מהוות כלי מהפכני בחקר המוח, ומזמינות שאלות שלא ניתן היה לשאול קודם לכן. מהתמקדות בתכונות של קבוצה קטנה של תאים, תא בודד או אפילו סינפסה בודדת, CLARITY מאפשרת כעת מיקוד של אוכלוסיות תאים כוללות או תכונות קישוריות ארוכות טווח באמצעות פלואורופורים רלוונטיים.
התוצאה של ביטוי הפלואורופור ושילוב הליך CLARITY אינה בינארית; גורמים רבים עלולים להפריע להליך ולהוביל לתוצאות לא אופטימליות. ראשית, יש לאמת מראש את ביטוי הפלואורופור. מכיוון שהליך CLARITY גורם לאובדן מידע מסוים, ביטוי מספיק של חלבון פלואורופור הוא חיוני לתוקף התמונה בסוף תהליך CLARITY. שנית, יש לטפל בזהירות בזלוף הטרנס-גולגולתי, ולהבטיח שכל הדם יוצא מהמוח, משום שהשפעת הדם האוטומטית תוביל לנתונים לא אמינים בפרוסות עבות. שלישית, יש לטפל בכל הפרמטרים הנדונים בפרוטוקול בכל שלב בתהליך הסליקה בדייקנות, למשל, שאריות O2 ב-HS לפני הפילמור או חוסר הדיוק בטמפרטורה בכל שלב שימנעו את התגובה הכימית בין החומרים הפעילים.
פרוטוקולים קודמים17,22 ממליצים על ריכוזים שונים של אקרילאמיד ב-HS. המטרה העיקרית של אקרילאמיד היא לקבע טוב יותר את המולקולות עם שאריות אמין (חלבונים וחומצות גרעין). שינויים קלים בריכוז משפיעים מאוד על כל תהליך הסליקה: אם הקיבעון קומפקטי מדי, מולקולות השומנים לא יתנתקו מהרקמה, ותהליך הסליקה יהיה ממושך שלא לצורך או יגרום למוחות אטומים. עם זאת, ריכוזים נמוכים יותר של אקרילאמיד לא ישמרו כראוי על מבנה המוח לאחר שהיה נטול שומנים. בפרוטוקול זה, אחוז האקרילאמיד מוגדר כדי לספק את האיזון העדין של רקמה מקובעת אך שקופה.
רוב תהליך הסליקה מתרחש ב- CS2, ורמת בהירות הרקמה צריכה להיבדק מדי יום. ניקוי PBST הוא שלב חיוני בין פתרונות הסליקה לבין פתרונות התאמת מקדם השבירה מכיוון שהוא מנקה את מולקולות ה-SDS השיוריות, שעשויות לקיים אינטראקציה עם ה-RIMS. ניתן גם לשמור על הרקמה השקופה ב- PBST (0.5%) ללא הגבלת זמן אם עדיין אין צורך בהכנת החדר.
כאשר ממקמים את המוח ב- RIMS, יש להכיר את היתרונות והמגבלות של הפתרונות. לדוגמה, RapiClear יגרום לשקיפות מלאה גם ברקמות כמעט מנוקות, אך גם יגרום לנפיחות מסוימת, שאין להזניח אותה בעת ניתוח הנתונים. מדידות קודמות9 מציעות הרחבה שווה לאורך כל הצירים (כלומר, צירים דורסו-ונטרליים, קדמיים-אחוריים וצירים לרוחב-מדיאליים), מה שמאפשר לחשב את מדד הנפיחות בהשוואה לפרוסות דקות מאותו אזור במוח. שימוש ב-RapiClear ספציפי ל-CLARITY מבטל את הנפיחות; עם זאת, אם שאריות SDS כלשהן יישארו ברקמה, הן יצטברו למסות לא שקופות.
יתרון נוסף של פרוטוקול שונה זה הוא עלותו. פרוטוקולים קודמים מציעים סוגי דבק שונים כדי ליצור תא שיכול להחזיק את המוח ב-RIMS. בפרוטוקול זה, אנו פשוט משתמשים בדבק חם. הוא אינו מגיב עם הפתרונות, זמין לרכישה בכל מקום, קל לשימוש וזול משמעותית מהדבקים שהוצעו בעבר.
נתונים המתקבלים מהדמיה של דגימות מוח עבות יכולים לתאר אוכלוסיות תאים שלמות, קישוריות בין מבני מוח או מעקב אחר אקסון יחיד על פני מרחקים גדולים (וידאו 3). למרות ששאלות בנוגע למאפיינים אלה נשאלו בעבר, תקפות הנתונים הניתנים כיום להשגה באמצעות פרוסות מוח עבות משפרת מאוד את השיטות הקודמות, המועדות לטעויות, של שכבת-על של תמונה פרוסה דקה.
תהליך CLARITY מעניק ניקוי מוצלח ואחיד של פרוסות עבות - מכמה מילימטרים להדמיה מוחית מלאה. הסליקה הפסיבית (כלומר, אי שימוש ב-ETC) מפחיתה את הסיכון לפגיעה ברקמה, ואת הזמן שבו הדגימות שקועות בתמיסות ניקוי כך שלא ישפיעו על היעילות הגבוהה של שימור החלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
פרויקט זה קיבל מימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) במסגרת תוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי (הסכם מענק מס' 803589), מהקרן הישראלית למדע (מענק ISF מס' 1815/18) ומענקי קנדה-ישראל (CIHR-ISF, מענק מס' 2591/18). אנו מודים לנחמה נוביק על ההערה על כתב היד כולו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight - 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight - 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
References
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neuroscience. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
