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Neuroscience

साफ दिमाग में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच स्थानिक बातचीत की जांच

Published: March 31, 2022 doi: 10.3791/63679
Automatic Translation
1, 1
1Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), The Hebrew University of Jerusalem

Summary

CLARITY विधि का उपयोग करके वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और मस्तिष्क समाशोधन के संयोजन से बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की जांच एक साथ हो सकती है।

Abstract

CLARITY विधि का उपयोग करके वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और ऊतक समाशोधन के संयोजन से मस्तिष्क कोशिकाओं के कई प्रकार और उनकी बातचीत की एक साथ जांच करना संभव हो जाता है। वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन एक ही ऊतक के भीतर विभिन्न प्रतिदीप्ति रंगों में विभिन्न सेल प्रकारों के अंकन को सक्षम बनाता है। कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से गतिविधि या प्रक्षेपण द्वारा पहचाना जा सकता है। एक संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स का संभावित नमूना आकार परिमाण के 2-3 आदेशों से बढ़ गया है। स्पष्टता का उपयोग पूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की इमेजिंग की अनुमति देता है, जो स्लाइस में अपनी संपूर्णता में फिट होने के लिए बहुत बड़े हैं, और उनकी सभी प्रक्रियाओं के साथ सोमाटा की परीक्षा। इसके अलावा, यह एस्ट्रोसाइट्स और विभिन्न न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच स्थानिक बातचीत की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, अर्थात्, प्रत्येक एस्ट्रोसाइटिक डोमेन में पिरामिड न्यूरॉन्स की संख्या या एस्ट्रोसाइट्स और विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन आबादी के बीच निकटता। यह पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि इन विधियों को कैसे लागू किया जाना है।

Introduction

हाल के वर्षों में, एस्ट्रोसाइट फ़ंक्शन का ज्ञान और वे न्यूरोनल सर्किट के साथ कैसे बातचीत करते हैं, नाटकीय रूप से बढ़ गया है। एस्ट्रोसाइट्स प्लास्टिसिटी 1,2 को प्रभावित कर सकते हैं, न्यूरोनल पोस्टइंजरी रिकवरी 3,4 में सहायता कर सकते हैं, और यहां तक कि डे नोवो न्यूरोनल potentiation को प्रेरित कर सकते हैं, हाल के अध्ययनों में स्मृति अधिग्रहण और इनाम में एस्ट्रोसाइट्स के महत्व को प्रदर्शित किया गया है, जिसे पहले विशुद्ध रूप से न्यूरोनल कार्यों के रूप में माना जाता है 5,6,7 . एस्ट्रोसाइट अनुसंधान में विशेष रुचि की एक विशेषता कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था है, जो हिप्पोकैम्पस और अन्य मस्तिष्क संरचनाओं में अद्वितीय स्थानिक संगठनों को बनाए रखतीहै 8,9,10। न्यूरोनल डेंड्राइट्स के विपरीत जो सेल सोमाटा के बीच इंटरटॉइन करते हैं, हिप्पोकैम्पल एस्ट्रोसाइट्स अपनी प्रक्रियाओं के बीच मामूली ओवरलैप के साथ नेत्रहीन रूप से अलग-अलग क्षेत्रों में निवास करते हैं, जिससे अलग-अलग डोमेन 8,11,12,13 बनते हैं। न्यूरोनल सर्किट में एस्ट्रोसाइट्स की भागीदारी का समर्थन करने वाले सबूत इस तरह की आबादी और उनके डोमेन में न्यूरॉन्स के विस्तृत शारीरिक विवरण की कमी का समर्थन नहीं करतेहैं।

वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं, ट्रांसजेनिक जानवरों (टीजी) के साथ, मस्तिष्क संरचनाओं, कार्यों और सेल इंटरैक्शन15,16 की जांच करने के लिए एक टूलसेट के रूप में लोकप्रिय किया गया है। विभिन्न प्रवर्तकों का उपयोग उनके आनुवंशिक गुणों, सक्रियण स्तर17,18, या प्रक्षेपण लक्ष्यों के अनुसार विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देता है। विभिन्न वायरस विभिन्न आबादी में अलग-अलग रंगीन फ्लोरोफोरस व्यक्त कर सकते हैं। एक वायरस को टीजी में फ्लोरोफोरस की अंतर्जात अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है, या टीजी जानवरों का उपयोग वायरस की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है। इन तकनीकों का व्यापक रूप से न्यूरोनल अंकन के लिए उपयोग किया जाता है, और कुछ प्रयोगशालाओं ने अन्य सेल प्रकारों को लक्षित करने के लिए विशेष संशोधनों के साथ उनका उपयोग करना शुरू कर दिया है, जैसे एस्ट्रोसाइट्स 5,9,19।

स्पष्टता तकनीक, पहली बार 201320,21 में वर्णित, माइक्रोस्कोपिक संरचनाओं को बरकरार रखते हुए पूरे मस्तिष्क को पारदर्शी बनाकर मोटे मस्तिष्क स्लाइस के अध्ययन को सक्षम बनाती है। दो तरीकों-वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और ऊतक समाशोधन के संयोजन से- विभिन्न सेल प्रकार की आबादी के बीच स्थानिक बातचीत की जांच करने का विकल्प अब उपलब्ध है। अधिकांश एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन अध्ययन पतले मस्तिष्क स्लाइस पर किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप उनके बड़े डोमेन के कारण अपूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की छवियां होती हैं, इस प्रकार विश्लेषण की गई कोशिकाओं की संख्या को मौलिक रूप से प्रतिबंधित किया जाता है। CLARITY तकनीक का उपयोग एक साथ बड़े पैमाने पर वॉल्यूम में सेल आबादी के एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। स्पष्ट दिमाग में इमेजिंग फ्लोरोसेंटली टैग की गई सेल आबादी सिनैप्टिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करती है, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स और विभिन्न प्रकार के न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच स्थानिक इंटरैक्शन के पूरी तरह से लक्षण वर्णन की अनुमति देती है।

इस कारण से, हमने पृष्ठीय CA1 में एस्ट्रोसाइट्स के गुणों की जांच करने के लिए इन अत्याधुनिक तकनीकों का उपयोग किया, सभी लामिना (स्ट्रैटम रेडिएटम, पिरामिडल लेयर और स्ट्रैटम ओरियन्स) को इमेजिंग किया। हमने हजारों एस्ट्रोसाइट्स (>96%5 के वायरल पेनेट्रेंस के साथ) को मापा, जिससे सीए 1 के आसपास की पूरी एस्ट्रोसाइटिक आबादी की जानकारी का विश्लेषण किया जा सके। न्यूरोनल मार्करों के कुशल पेनेट्रेंस के साथ, हम सीए 1 एस्ट्रोसाइट्स की पूरी आबादी और चार प्रकार के न्यूरोनल कोशिकाओं-परवलब्यूमिन (पीवी), सोमाटोस्टेटिन (एसएसटी), वीआईपी निरोधात्मक न्यूरॉन्स और उत्तेजक पिरामिड कोशिकाओं के बीच बातचीत को रिकॉर्ड कर सकतेहैं।

टीजी जानवरों और अलग-अलग रंगीन वायरल वैक्टर (सभी निरोधात्मक कोशिकाओं) से प्रतिदीप्ति के संयोजन का उपयोग करके कई प्रयोग किए गए थे, जबकि अन्य (उत्तेजक) ने विभिन्न प्रमोटरों के तहत अलग-अलग फ्लोरोफोर को व्यक्त करने वाले दो वायरल वैक्टरका उपयोग किया था। यह पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें मस्तिष्क में वांछित कोशिकाओं की टैगिंग शामिल है, जो मस्तिष्क को एक संशोधित स्पष्टता प्रक्रिया का उपयोग करके पारदर्शी बनाती है, साथ ही साथ विभिन्न प्रक्रियाओं और सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पूर्ण मस्तिष्क संरचनाओं की इमेजिंग और विश्लेषण करती है।

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Protocol

प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल हिब्रू विश्वविद्यालय पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे और प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए राष्ट्रीय स्वास्थ्य गाइड संस्थान के दिशानिर्देशों को पूरा किया गया था।

1. वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन

नोट: वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन का उपयोग मस्तिष्क में फ्लोरोफोरस को व्यक्त करने के लिए किया जाता है।

  1. लक्ष्य क्षेत्र के प्रासंगिक समन्वय का पता लगाने के लिए एक एटलस (जैसे, एलन ब्रेन एटलस) का उपयोग करें।
    नोट: 3 डी एटलस ऑनलाइन पाया जा सकता है (उदाहरण के लिए, http://connectivity.brain-map.org/3d-viewer)।
  2. स्टीरियोटैक्टिक सर्जरी का उपयोग करते हुए, संबंधित मस्तिष्क संरचना में वायरल वैक्टर इंजेक्ट करें। एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए9 देखें।
  3. फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति के लिए 3-6 सप्ताह तक प्रतीक्षा करें।
    नोट: समय की एक छोटी अवधि पर्याप्त है यदि केवल सेल निकायों को चिह्नित करने की आवश्यकता है। समय की एक लंबी अवधि की आवश्यकता होगी यदि चेताक्षीय अनुमान प्रश्न के लिए प्रासंगिक हैं, क्योंकि फ्लोरोफोर को अक्षतंतुओं में व्यक्त करने में अधिक समय लगता है, जो कई मिलीमीटर लंबा हो सकता है।
  4. फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति (वायरल अभिव्यक्ति और टीजी जानवरों दोनों) की विशिष्टता और पेनेट्रेंस को पहले से सत्यापित करें (चित्रा 1 ए)। स्पष्टता प्रक्रिया के साथ आगे बढ़ने से पहले, पतले स्लाइस के लिए कम से कम एक मस्तिष्क को नामित करें और सुनिश्चित करें कि फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति लक्ष्य सेल सुविधा के लिए मजबूत और विशिष्ट दोनों है।

2. स्पष्टता

नोट: यह विधि 2-6 सप्ताह के भीतर मस्तिष्क को पारदर्शी बनाती है।

  1. पीबीएस में 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के बाद ठंडे फॉस्फेट-बफ़र्ड सलाइन (पीबीएस) का उपयोग करके जानवरों पर ट्रांसक्रैनियल परफ्यूजन करें। मस्तिष्क को हटा दें और इसे पीएफए में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 50 एमएल ट्यूब या इसी तरह के कंटेनर में रखें।
    नोट: इससे पहले कि ट्रांसक्रैनियल परफ्यूजन किया जाता है, जानवर को गहराई से एनेस्थेटिक किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत उदाहरणों में, सभी जानवरों को केटामाइन और Xylazine (क्रमशः 90% और 10%) का उपयोग करके बेहोश किया गया था।
  2. पीएफए को हाइड्रोजेल सॉल्यूशन (एचएस; तालिका 1 देखें) के साथ 48 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बदलें।
    नोट: इस स्तर पर प्रशीतन तापमान (4-8 डिग्री सेल्सियस) की तुलना में सामग्री को गर्म होने की अनुमति न दें, या हाइड्रोजेल पॉलिमराइज़ करेगा। इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले एचएस में 2% एक्रिलामाइड होता है, जो पिछले प्रोटोकॉल के विपरीत 4%22 या 1%17 का सुझाव देता है। 2% का लाभ चर्चा अनुभाग में विस्तृत है। एचएस तैयार करते समय, बर्फ की ठंडी सतह पर काम करें। इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. Degassing
    नोट: इस चरण का उद्देश्य ऊतक से सभी मुक्त ऑक्सीजन को हटाना है क्योंकि ओ2 पोलीमराइजेशन प्रक्रिया में हस्तक्षेप करता है। किसी भी गैर-ओ2 गैस का उपयोग किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, एन2, सीओ2); एन2 की सिफारिश की जाती है।
    1. एक 5 मिमी (आंतरिक) लचीला टयूबिंग के माध्यम से टैंक से एन 2 को स्थानांतरित करें, जो इसके अंत में 19 जी सुई से जुड़ा हुआ है (चित्रा 1 बी)।
    2. ट्यूब की टोपी में दो छोटे छेद (सुई-चौड़े) बनाएं: एक गैस को पेश करने के लिए और दूसरा हवा को ट्यूब छोड़ने की अनुमति देने के लिए (चित्रा 1 सी)।
    3. एन2 गैस से पाइप को ट्यूब में संलग्न करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर लगभग 30 मिनट के लिए गैसों को बदलें।
    4. पाइप निकालें और तुरंत हर ट्यूब (चित्रा 1 डी) पर मॉडलिंग मिट्टी के साथ छेद सील।
  4. एचएस को पॉलिमराइज़ करने के लिए 3.5 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में degassed सील बंद ट्यूबों को स्थानांतरित करें, जो एक जेल बन जाएगा। सावधान रहें कि ट्यूबों को हिलाएं नहीं (चित्रा 1 ई)।
  5. ट्यूब से मस्तिष्क निकालें और धीरे से प्रयोगशाला पोंछे का उपयोग करके इसके चारों ओर से पॉलिमराइज्ड जेल को हटा दें। सुनिश्चित करें कि ऊतक की सतह से कोई अवशिष्ट जेल जुड़ा नहीं रहता है, क्योंकि यह निम्नलिखित चरणों में समाधान के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है, ऊतक समाशोधन प्रक्रिया को बाधित कर सकता है (चित्रा 1 एफ)।
    नोट: क्योंकि जेल में पीएफए शामिल था, निष्कर्षण को धुएं के हुड के तहत किया जाना चाहिए।
  6. मस्तिष्क को स्लाइस करें यदि हाथ में प्रश्न को इसके केवल एक हिस्से की आवश्यकता होती है। इसे आधे या बहुत मोटे स्लाइस में विभाजित करें जिसमें ब्याज के सभी क्षेत्र होते हैं (चित्रा 1 जी)।
  7. स्लाइस को पहले समाशोधन समाधान (CS1, तालिका 2 देखें) में एक नए कंटेनर में रखें और 37 °C पर 24 घंटे के लिए 70 rpm पर हिलाएं।
  8. CS1 से मस्तिष्क को दूसरे समाशोधन समाधान (CS2, तालिका 2 देखें) में स्थानांतरित करने के लिए नीचे वर्णित चरणों का पालन करें।
    1. पहले से ही मस्तिष्क के लिए एक छिद्रित ट्यूब तैयार करें (चित्रा 1 एच)।
    2. एक बीकर में CS2 को 40-45 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें जो ट्यूब को शामिल करने के लिए काफी बड़ा है। एक हलचल के साथ एक hotplate पर ऐसा करें। सुनिश्चित करें कि व्यक्त प्रोटीन के विरंजन को रोकने के लिए तापमान 55 डिग्री सेल्सियस तक नहीं पहुंचता है।
    3. CS2 और छिद्रित ट्यूब से भरे बीकर को एक सरगर्मी डिवाइस पर रखें ( चित्र1I में एक 2 एल बीकर)। एक मध्यम सरगर्मी दर सेट करें जो ऊतक को विकृत किए बिना तरल को प्रवाहित करने का कारण बनेगी।
      नोट: 2-6 सप्ताह के भीतर, ऊतक पारदर्शी हो जाएगा (प्रक्रिया परिधि से शुरू होती है और केंद्रीय मस्तिष्क संरचनाओं की ओर अंदर की ओर बढ़ जाती है)। जब ऊतक "पर्याप्त स्पष्ट" होता है, तो निर्णय व्यक्तिगत निर्णय पर निर्भर करता है। मस्तिष्क को हस्तक्षेप के बिना माइक्रोस्कोप के नीचे इमेजिंग के लिए पर्याप्त रूप से पारदर्शी होना चाहिए (चित्रा 1 जे पर्याप्त रूप से स्पष्ट नहीं है; चित्रा 1K पर्याप्त स्पष्ट है)। उस बिंदु को पार करना जिस पर ऊतक पर्याप्त रूप से स्पष्ट है, ऊतक कठोरता के नुकसान का कारण बन सकता है।
  9. CS2 से PBST में स्थानांतरण (PBS में 0.5% Triton X-100, तालिका 2 देखें) 37 °C पर एक नए कंटेनर में हल्के झटकों (70 rpm) के साथ 24 घंटे के लिए।
    नोट: PBST में, ऊतक सफेद हो जाएगा (चित्रा 1L)। अपवर्तक अनुक्रमणिका मिलान समाधान (RIMS, चरण 2.14 देखें) में एम्बेडेड होने पर स्पष्टता वापस आ जाएगी (और सुधार) होगी.
  10. PBST को नए PBST से बदलें। एक और 24 घंटे के लिए एक ही शर्तों (हल्के झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस) के तहत रखें।
  11. नए PBST के साथ PBST को फिर से बदलें और 24 घंटे के लिए RT पर रखें।
  12. 24 घंटे के लिए आरटी पर पीबीएस को स्थानांतरित करें।
  13. पीबीएस को बदलें और अतिरिक्त 24 घंटे के लिए आरटी पर छोड़ दें।
  14. पीबीएस से मस्तिष्क को हटा दें और इसे रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर रिम्स में स्थानांतरित करें।
    नोट: प्रारंभ में, रिम्स में लहरें मस्तिष्क को घेर सकती हैं। इस प्रोटोकॉल को दो विशिष्ट वाणिज्यिक रिम्स का उपयोग करके डिज़ाइन और मान्य किया गया था ( तालिका 3 देखें)। हालांकि, अन्य रिम्स (वाणिज्यिक या स्व-निर्मित) का उपयोग करते समय प्रोटोकॉल अलग नहीं होना चाहिए।
  15. ऊतक को एक और 24 घंटे के लिए आरटी पर रखें या जब तक कि समाधान पूर्ण संतुलन तक नहीं पहुंच जाता है, यानी, जब ऊतक पारदर्शी हो जाता है, और समाधान में अब कोई दृश्यमान तरंग नहीं होती है (चित्रा 1 एम)।
  16. यदि ऊतक पारदर्शी है, तो कक्ष की तैयारी के लिए आगे बढ़ें। यदि इस बिंदु पर, ऊतक पारदर्शी के बजाय सफेद हो जाता है (अवशिष्ट एसडीएस अणुओं के समुच्चय के कारण), चरण 2.9 और 2.10 को दोहराकर नमूने को फिर से साफ करें, और कुछ दिनों के लिए ऊतक को सीएस 2 (चरण 2.8) में स्थानांतरित करें, इसके बाद चरण 2.15 तक सभी चरणों का पालन करें।

3. चैंबर तैयारी

नोट:: प्रत्येक नमूने में एक इमेजिंग कक्ष जिसमें नमूना रखा जाएगा के साथ एक स्लाइड की आवश्यकता है।

  1. नमूना स्लाइड के बीच में रखें।
  2. एक गर्म गोंद बंदूक का उपयोग करके, स्लाइड के किनारों पर दीवारें बनाएं, लगभग ऊतक के रूप में उच्च। कोनों में से एक पर एक छोटा सा अंतर (लगभग 5 मिमी) छोड़ना सुनिश्चित करें (चित्रा 2 ए, बी)।
  3. ऊपरी सतह को नम रखने और कवरस्लिप और ऊतक के बीच बनने वाले बुलबुले को रोकने के लिए नमूने पर रिम्स की 1-2 बूंदें लागू करें।
  4. रिम्स बूंदों को लागू करने के तुरंत बाद, दीवारों पर गर्म गोंद की अंतिम परत जोड़ें (ताकि वे मस्तिष्क / स्लाइस की ऊंचाई तक पहुंच सकें) और तुरंत प्रगति करें (जबकि गर्म गोंद अभी भी तरल है) चरण 3.5 में।
  5. एक coverslip के साथ शीर्ष सील, यह अभी भी गर्म गर्म गोंद परत (चित्रा 2 सी) के शीर्ष पर के रूप में संभव के रूप में समान रूप से रखने के लिए।
  6. गर्म गोंद की दीवारों (चित्रा 2 डी, ई) में छोड़े गए अंतराल के माध्यम से रिम्स के साथ कक्ष को भरें।
  7. गर्म गोंद के साथ अंतराल को बंद करें। अंदर कोई हवा न छोड़ें (चित्र2F)।
  8. यदि गर्म गोंद दीवारें स्लाइड की सीमाओं से परे फैली हुई हैं, तो विस्तारित किनारों को काटें (चित्रा 2 जी)।
  9. यदि इमेजिंग के लिए उपयोग किया जाने वाला उद्देश्य विसर्जित है, तो कवरस्लिप के ऊपर की दीवारों पर एक और 2-3 मिमी गोंद जोड़ें ताकि विसर्जन समाधान लंबी अवधि तक चले (चित्रा 2 एच)।

4. इमेजिंग (confocal या दो फोटॉन)

  1. जांचें कि क्या चरण कक्ष को पकड़ सकता है, क्योंकि कक्ष की मोटाई कई मिलीमीटर तक पहुंच सकती है।
    नोट: उदाहरण के लिए, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाने वाला कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप ( सामग्री की तालिका देखें) कई चरणों (जैसे, परिपत्र, आयताकार) से सुसज्जित है। जो भी चरण कक्ष को पकड़ने के लिए चुना जाता है, वह अप्रासंगिक है जब तक कि इसके पैरामीटर कक्ष के आकार में फिट होते हैं।
  2. पर्याप्त काम करने की दूरी के साथ एक उद्देश्य के साथ काम करें, यानी, एक न्यूनतम काम करने की दूरी ≥3 मिमी, क्योंकि ब्याज का मस्तिष्क क्षेत्र गहराई में कुछ मिलीमीटर हो सकता है, और कवरस्लिप पूरी तरह से सीधा नहीं हो सकता है क्योंकि इसे मैन्युअल रूप से रखा गया था।
    नोट: एक प्रदर्शन के रूप में, चित्रा 1, वीडियो 1, और वीडियो 2 में प्रस्तुत परिणामों को दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के तहत प्राप्त किया गया था, जिसमें 3 मिमी काम करने की दूरी और 2.4 के आवर्धन के साथ पानी विसर्जन 16x उद्देश्य का उपयोग करके 652 x 483 μm क्षेत्र के दृश्य और विमानों के बीच 0.937 μm अंतराल के साथ एक z-स्टैक प्राप्त किया गया था।
  3. एकाधिक-क्षेत्र इमेजिंग करें, जिसमें कुछ घंटे या दिन भी लग सकते हैं। सुनिश्चित करें कि कंप्यूटर में पर्याप्त मुफ्त भंडारण है क्योंकि प्रत्येक छवि का आकार दसियों गीगाबिट तक पहुंच सकता है।
    नोट:: स्पष्टता इमेजिंग गहराई में काफी अधिक छवि अनुभागों में परिणाम हो सकता है। इसलिए, अभिव्यक्ति को कैप्चर करने के लिए उपयोग की जाने वाली तीव्रता छवि योग के दौरान ओवरएक्सप्रेशन को रोकने के लिए अपेक्षाकृत कम होनी चाहिए।
  4. विसर्जन उद्देश्यों के लिए, तरल को नियमित रूप से जांचें, जबकि इमेजिंग और यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त तरल के साथ पूरक करें।
    नोट: वीडियो 3 में प्रस्तुत डेटा की इमेजिंग के दौरान, वाष्पीकरण का मुकाबला करने के लिए हर 6-8 घंटे में कक्ष की सतह पर पानी जोड़ा गया था।
  5. छवि का अधिग्रहण करने के बाद, इसे कई अलग-अलग सॉफ़्टवेयर पैकेजों का उपयोग करके देखें और विश्लेषण करें।
    नोट:: अनुशंसित सॉफ़्टवेयर दोनों विज़ुअलाइज़ेशन और विश्लेषण के लिए Imaris और SyGlass शामिल हैं। Imaris सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एस्ट्रोसाइट्स के अनुकूलित पुनर्निर्माण के लिए सटीक पाइपलाइन पहले9 वर्णित किया गया है। संक्षेप में, इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली इमारिस विशेषताएं सभी सोमाटा के स्थान में स्थिति को निकालने के लिए सेल संरचनाओं और धब्बों को पूरी तरह से पुनर्निर्माण करने के लिए फिलामेंट्स थीं।

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Representative Results

मोटी मस्तिष्क ऊतक स्लाइस के सफल समाशोधन के परिणामस्वरूप प्रश्नों की एक नई श्रृंखला होती है जो एकल कोशिकाओं या कोशिकाओं के पड़ोसी समूहों के गुणों के विपरीत बड़ी कोशिका आबादी के गुणों के बारे में पूछे जा सकते हैं। सफल परिणाम प्राप्त करने के लिए, किसी को स्पष्टता प्रोटोकॉल का कड़ाई से पालन करना चाहिए, क्योंकि नमूनों के बीच विचरण को कम करने के लिए विचार किए जाने वाले मापदंडों की एक विस्तृत श्रृंखला है (उदाहरण के लिए, स्पष्टता का प्रतिशत, प्रतिदीप्ति जानकारी, सूजन पैरामीटर)।

चित्रा 1 समाशोधन विधि के सभी चरणों के माध्यम से फ्लोरोसेंट प्रोटीन अभिव्यक्ति सत्यापन से पूरी समाशोधन प्रक्रिया का वर्णन करता है। चित्रा 2 वर्णन करता है कि स्पष्ट ऊतक के लिए एक कक्ष कैसे तैयार किया जाए, जो दो-फोटॉन या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग के लिए इष्टतम है। इस प्रोटोकॉल में आवश्यक सामग्री कक्ष तैयारी के अन्य प्रोटोकॉल के सापेक्ष बेहद सस्ती हैं।

चित्रा 3 वीडियो 1 में वर्णित घन प्रस्तुत करता है, जहां माउस हिप्पोकैम्पस के CA1 भाग के एक साफ अनुभाग में 300 से अधिक एस्ट्रोसाइट्स दिखाए जाते हैं। चित्रा 4 वीडियो 2 में वर्णित घन प्रस्तुत करता है, जहां एस्ट्रोसाइट्स और उत्तेजक न्यूरोनल सोमाटा दोनों को मोटे पारदर्शी ऊतक में दिखाया गया है। चित्रा 5 एक पूरे गोलार्ध को प्रस्तुत करता है, जैसा कि वीडियो 3 में वर्णित है। मस्तिष्क-व्यापी न्यूरोनल अनुमानों को पृष्ठीय CA1 (हरे, GFP) और ventral CA1 (लाल, TdTomato) से प्रदर्शित किया जाता है।

वीडियो 1 हिप्पोकैम्पस एस्ट्रोसाइट्स (>300) की एक मोटी छवि प्रस्तुत करता है जो एक स्पष्टता प्रक्रिया के बाद दो फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया जाता है। प्रतिदीप्ति एस्ट्रोसाइट्स के लिए विशिष्ट वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन द्वारा प्रदान की गई थी। वीडियो 2 एस्ट्रोसाइट्स और हिप्पोकैम्पल पिरामिड कोशिकाओं के नाभिक के बीच स्थानिक निकटता प्रस्तुत करता है। वीडियो 3 एक पूरे गोलार्ध में अक्षीय बंडलों का पता लगाता है; अक्षतंतु प्राथमिक मोटर कॉर्टेक्स से प्रोजेक्ट करते हैं और रीढ़ की हड्डी से वापस पता लगाए जाते हैं। एक और बंडल पृष्ठीय हिप्पोकैम्पस से सुप्रा मैमिलरी निकायों की ओर पता लगाया जाता है। अंत में, यह वेंट्रल हिप्पोकैम्पस में अपनी उत्पत्ति की ओर मम्मिलरी निकायों से अक्षतंतुओं के एक लाल बंडल का पता लगाता है। सभी चिह्नित कोशिकाएं विशेष रूप से उत्तेजक होती हैं।

Figure 1
चित्र 1: समाशोधन प्रक्रिया का विस्तृत विवरण। (A) फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति का सत्यापन। इस उदाहरण में, माउस हिप्पोकैम्पस के सीए 1 भाग में सभी एस्ट्रोसाइट्स एक लाल प्रोटीन (टीडीटोमेटो, मैजेंटा में चित्रित) व्यक्त करते हैं, और सभी उत्तेजक न्यूरॉन्स अपने नाभिक (एच 2 बी-जीएफपी) में एक हरे रंग के प्रोटीन को व्यक्त करते हैं। इस छवि को 2-फोटॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। छवि को 2.4 के आवर्धन के साथ एक जल विसर्जन 16x उद्देश्य (0.8 एनए) का उपयोग करके 15.5 फ्रेम / सेकंड पर 652 x 483 μm क्षेत्र प्राप्त करने के लिए लिया गया था और विमानों के बीच 0.937 μm अंतराल के साथ एक z-स्टैक प्राप्त किया गया था। विशिष्टता और पेनेट्रेंस को इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री9 द्वारा सत्यापित किया गया था। (बी) मस्तिष्क को पकड़ने वाली ट्यूब में टैंक से एन2 गैस को स्थानांतरित करने के लिए इसके अंत में सुई के साथ एक पाइप की आवश्यकता होती है। (सी) ट्यूब के अंदर हवा को दो छेद बनाकर एन2 के साथ बदल दिया जाता है, गैस टैंक से पाइपिंग से जुड़ी सुई के माध्यम से एन2 के प्रवाह के लिए एक (ऊपरी तीर) और बहिर्वाह के लिए दूसरा (नीचे तीर)। (डी) degassing के तुरंत बाद मॉडलिंग मिट्टी के साथ छेद को कवर एन2 ट्यूब से बाहर निकलने से रोकता है। (ई) एक गर्म स्नान में 3.5 घंटे के लिए degassed समाधान हीटिंग। (एफ) सफल पोलीमराइजेशन के परिणामस्वरूप एक मस्तिष्क में जेल वाले एचएस में एम्बेडेड होता है। गैस के बुलबुले बहुलक में फंस सकते हैं। (जी) जेल से निष्कर्षण के तुरंत बाद मस्तिष्क को वांछित मोटाई में काटने के लिए सबसे अच्छा बिंदु है। (एच) छिद्रित ट्यूब नमूने तक पहुंचने के लिए हलचल पर समाधान के प्रवाह की अनुमति देते हैं। (I) छिद्रित ट्यूबों के अंदर मस्तिष्क को एक 2 एल बीकर फिट करने के लिए बनाए गए आकार के एक स्व-निर्मित धारक द्वारा लंबवत रूप से आयोजित किया जाता है, जो एक हॉटप्लेट हलचल पर खड़ा होता है। (जे) एक मस्तिष्क का उदाहरण जो पर्याप्त रूप से स्पष्ट नहीं है। नमूने को लगभग एक और सप्ताह के लिए CS2 में उत्तेजित किया जाना चाहिए। (के) पर्याप्त रूप से स्पष्ट मस्तिष्क का उदाहरण। (एल) पीबीएसटी में स्पष्ट मस्तिष्क डालते समय, ऊतक पहले की तुलना में सफेद हो जाता है। रंग का यह परिवर्तन ट्राइटन के कारण है और इस समाधान से अगले में ले जाने पर गायब हो जाएगा। (एम) रिम्स में >24 घंटे के बाद, मस्तिष्क फिर से पूरी तरह से पारदर्शी हो जाएगा। संक्षेप: GFP = हरे रंग के फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एनए = संख्यात्मक एपर्चर; एचएस = हाइड्रोजेल समाधान; CS2 = समाशोधन समाधान 2; PBST = फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा जिसमें 0.5% ट्राइटन एक्स -100 होता है; रिम्स = अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कक्ष की तैयारी। (ए) गर्म गोंद की दीवारों की पहली परत एक स्लाइड के किनारों को कवर करती है और दीवारों को छूने के बिना मस्तिष्क को शामिल करने के लिए पर्याप्त जगह छोड़ देती है। स्लाइड के ऊपरी-बाएं कोने में एक छेद छोड़ दिया जाता है। (बी) ऊतक की ऊंचाई तक पहुंचने के लिए परत के बाद परत जोड़ना। (C) सीधे कवरस्लिप (सफेद तीर) कक्ष को सील करता है। (घ) कक्ष की दीवारों में छेद के माध्यम से रिम्स से भरा कक्ष। (ई) कक्ष रिम्स से भरा हुआ है, जिससे कोई हवा का बुलबुला नहीं रह जाता है। (च) किसी भी रिसाव को रोकने के लिए गर्म गोंद के साथ कक्ष में छेद को सील करना। साइड व्यू। (जी) इस स्तर पर, स्लाइड के किनारों पर विस्तारित किसी भी गर्म गोंद अवशेष को कक्ष से काट दिया जाना चाहिए। (एच) पूरी तरह से तैयार कक्ष, माइक्रोस्कोप के तहत इमेजिंग के लिए तैयार है। संक्षिप्त नाम: RIMS = अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सभी छविवाले एस्ट्रोसाइट्स (AAV1-GFAP::TdTomato, लाल) एक साफ हिप्पोकैम्पस में। वीडियो 1 से एक एकल फ्रेम सभी छविवाले एस्ट्रोसाइट्स (AAV1-GFAP:: TdTomato, लाल) को एक साफ हिप्पोकैम्पस में कैप्चर करता है। छवि गुणों के सभी विवरण वीडियो 1 के तहत वर्णित हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: एस्ट्रोसाइट्स (AAV1-GFAP:: TdTomato, लाल) और हिप्पोकैम्पल पिरामिड कोशिकाओं नाभिक (AAV5-CaMKII:: H2B-eGFP, हरा) मोटी पारदर्शी ऊतक में। वीडियो 2 से एक एकल फ्रेम दोनों एस्ट्रोसाइट्स (AAV1-GFAP:: TdTomato, लाल) और हिप्पोकैम्पल पिरामिड कोशिकाओं नाभिक (AAV5-CaMKII:: H2B-eGFP, हरा) को मोटी पारदर्शी ऊतक में दिखा रहा है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: हरे अक्षतंतु (AAV5-CaMKII:: eGFP, हरा) और लाल अक्षतंतु (AAV5-CaMKII:: TdTomato). वीडियो 3 से एक एकल फ्रेम माउस मस्तिष्क में कई स्थानों से व्युत्पन्न दोनों प्रकार के अक्षतंतुओं को दिखाता है जिसे पूरे गोलार्ध में खोजा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 1: हिप्पोकैम्पस पृष्ठीय CA1 एस्ट्रोसाइट्स के >1 मिमी मोटी टुकड़ा (AAV1-GFAP::TdTomato, लाल) के फुटेज। वीडियो को एक स्पष्टता प्रक्रिया के बाद 2.4 के आवर्धन के साथ 16x उद्देश्य (0.8 एनए) का उपयोग करके दो-फोटॉन माइक्रोस्कोप के साथ अधिग्रहित किया गया था। चित्रा 1A के समान, z-स्टैक अंतराल को 0.937 μm पर सेट किया गया था। प्रतिदीप्ति एस्ट्रोसाइट्स के लिए विशिष्ट वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन द्वारा प्रदान की गई थी। इस घन में एस्ट्रोसाइट्स की संख्या >300 है, और अधिकांश प्रक्रियाएं अधिकांश कोशिकाओं में विश्लेषण के लिए उपलब्ध हैं। संक्षिप्त रूप: NA = संख्यात्मक एपर्चर; AAV = एडेनो से जुड़े वायरस; GFAP = glial fibrillary acidic protein है। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 2: एस्ट्रोसाइट्स और उत्तेजक न्यूरॉन्स नाभिक एक 3 डी घन में। घन में चित्रा 1A और वीडियो 1 के लिए उल्लिखित ऑप्टिकल स्थितियों के तहत dCA1 के सभी लामिना शामिल हैं। यह घन एस्ट्रोसाइट्स (AAV1-GFAP:: TdTomato, लाल) और हिप्पोकैम्पल पिरामिड कोशिकाओं के नाभिक (AAV5-CaMKII:: H2B-eGFP, हरा) के बीच स्थानिक निकटता को प्रदर्शित करता है। संक्षेप: AAV = एडेनो-संबद्ध वायरस; GFAP = glial fibrillary अम्लीय प्रोटीन; CAMKII = कैल्शियम / कैलमोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज द्वितीय; eGFP = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; H2B = हिस्टोन 2B. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

वीडियो 3: एक पूरे गोलार्ध में अक्षीय बंडलों का पता लगाना। हरे अक्षतंतु (AAV5-CaMKII:: eGFP, हरे) रीढ़ की हड्डी पर समाप्त आसानी से प्राथमिक मोटर प्रांतस्था (7 मिमी से अधिक अलग) के लिए वापस पता लगाया जाता है। हिप्पोकैम्पस (पृष्ठीय पक्ष) से, एक और बंडल सुप्रा मम्मिलरी निकायों (मस्तिष्क के अधिकांश वेंट्रल पक्ष) की ओर पता लगाया जाता है, जो लगभग 3 मिमी लंबा होता है। वीडियो की दूसरी छमाही अक्षतंतुओं के एक लाल बंडल का पता लगाती है (AAV5-CaMKII: : tdTomato) वेंट्रल हिप्पोकैम्पस में वापस माम्मिलरी निकायों में अपने लक्ष्य स्थान से उत्पन्न होता है। छवि को एक ओलंपस स्कैनिंग लेजर कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप FV1000 के तहत 4x उद्देश्य (0.16 एनए) का उपयोग करके लिया गया था, और पूरे गोलार्ध को प्रस्तुत करने के लिए MATL FluoView-सुविधा का उपयोग करके कई ROIs को जोड़ा गया था। संक्षेप: AAV = एडेनो-संबद्ध वायरस; CAMKII = कैल्शियम / कैलमोडुलिन-निर्भर प्रोटीन किनेज द्वितीय; eGFP = बढ़ाया हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; एनए = संख्यात्मक एपर्चर; MATL = एकाधिक क्षेत्र समय-अंतराल। कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

हाइड्रोजेल समाधान (1 एल)
भौतिक राशि
VA-044 प्रारंभकर्ता 2.5 ग्राम
PFA 4% 900 mL
एक्रिलामाइड (40%) 50 mL
बिसाक्रिलामाइड (2%) 50 mL

तालिका 1: हाइड्रोजेल समाधान की तैयारी (1 एल)। हाइड्रोजेल समाधान को बर्फ की ठंडी सतह पर तैयार किया जाना चाहिए। जिस क्रम में सामग्री को मिलाया जाता है वह महत्वपूर्ण नहीं है। ध्यान दें कि एक्रिलामाइड का कुल प्रतिशत 2% समान प्रोटोकॉल के विपरीत है जो या तो 1%17 या 4%22 का उपयोग करते हैं।

समाशोधन समाधान (1 L)
भौतिक राशि
CS1 CS2
बोरिक एसिड (M.W. = 61.83 g/mol) 12.366 ग्राम 3.4 ग्राम
SDS 80 ग्राम 80 ग्राम
Tris आधार (M.W. = 121.14 g/mol) 0 12.1 ग्राम
आसुत जल (DW) 1 L तक भरें 1 L तक भरें
NaOH पीएच 8.5
0.5% ट्राइटन एक्स-100 के साथ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के 1 एल
भौतिक राशि
PBS 995 mL
ट्राइटन एक्स-100 5 mL

तालिका 2: 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के साथ फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा के समाधान 1 और 2 (1 एल) और 1 एल को साफ़ करने की तैयारी। समाशोधन समाधान पहले से तैयार किया जा सकता है और एक लंबी अवधि के लिए कमरे के तापमान पर रखा जा सकता है। बोरिक एसिड और एसडीएस युक्त किसी भी समाधान को एसडीएस या बोरिक एसिड के साथ साँस लेने या त्वचा के संपर्क से बचने के लिए धुएं के हुड के नीचे संभाला जाना चाहिए। CS1 में NaOH को 8.5 पर pH सेट करने के लिए अंतिम रूप से जोड़ा जाना चाहिए। प्रत्येक मस्तिष्क के नमूने को सीएस 1 के कम से कम 5-25 मिलीलीटर में रखा जाना चाहिए और पर्याप्त प्रसार के लिए रात भर रखा जाना चाहिए। संक्षेप: CS1 = समाशोधन समाधान 1; SDS = सोडियम dodecyl सल्फेट; M.W. = आणविक भार।

उत्पाद का नाम प्राथमिक लाभ प्राथमिक नुकसान
RapiClear नमूना पारदर्शी रहता है ऊतक सूजन
RapiClear सीएस नमूना सामान्य आकार में वापस सिकुड़जाता है नमूना पारदर्शिता खो सकता है

तालिका 3: फायदे और नुकसान के साथ रिम्स विकल्प। Rapiclear (RC, RI = 1.47) या CLARITY-specific Rapiclear (CSRC, RI = 1.45)। इन दो समाधानों के बीच प्राथमिक अंतर यह है कि जबकि CSRC स्पष्ट मस्तिष्क को अपने मूल आकार में वापस सिकोड़ता है, RC समाधान नहीं करता है, जिससे साफ किए गए नमूने में थोड़ा सूजन आ जाती है। संक्षिप्त नाम: RI = अपवर्तक सूचकांक।

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Discussion

ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क अनुसंधान में एक क्रांतिकारी उपकरण प्रस्तुत करती हैं, जो उन प्रश्नों को आमंत्रित करती हैं जो पहले नहीं पूछे जा सकते थे। कोशिकाओं के एक छोटे समूह, एक एकल सेल, या यहां तक कि एक एकल synapse के गुणों को लक्षित करने से, CLARITY अब प्रासंगिक fluorophores का उपयोग करके कुल सेल आबादी या लंबी दूरी की कनेक्टिविटी सुविधाओं के लक्ष्यीकरण को सक्षम बनाता है।

फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति और स्पष्टता प्रक्रिया संयोजन का परिणाम बाइनरी नहीं है; कई कारक प्रक्रिया के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो सबऑप्टिमल परिणामों के लिए अग्रणी है। सबसे पहले, फ्लोरोफोर अभिव्यक्ति को पहले से सत्यापित किया जाना चाहिए। जैसा कि स्पष्टता प्रक्रिया कुछ जानकारी हानि का कारण बनती है, पर्याप्त फ्लोरोफोर प्रोटीन अभिव्यक्ति स्पष्टता प्रक्रिया के अंत में छवि की वैधता के लिए महत्वपूर्ण है। दूसरा, ट्रांसक्रैनियल परफ्यूजन को सावधानीपूर्वक संभाला जाना चाहिए, यह सुनिश्चित करते हुए कि सभी रक्त मस्तिष्क से बाहर निकलते हैं, क्योंकि रक्त के ऑटोफ्लोरेसेंस से मोटी स्लाइस में अविश्वसनीय डेटा होगा। तीसरा, प्रोटोकॉल में चर्चा किए गए सभी मापदंडों को सटीकता के साथ समाशोधन प्रक्रिया के प्रत्येक चरण में संभाला जाना चाहिए, उदाहरण के लिए, प्रत्येक चरण में पोलीमराइजेशन या तापमान अशुद्धता से पहले एचएस में ओ2 अवशेष सक्रिय सामग्रियों के बीच रासायनिक प्रतिक्रिया को होने से रोकेंगे।

पिछले प्रोटोकॉल17,22 एचएस में एक्रिलामाइड की विभिन्न सांद्रता की सिफारिश करते हैं। एक्रिलामाइड का प्राथमिक उद्देश्य अमाइन अवशेषों (प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड) के साथ अणुओं को बेहतर ढंग से ठीक करना है। एकाग्रता में मामूली परिवर्तन पूरी समाशोधन प्रक्रिया को बहुत प्रभावित करते हैं: यदि निर्धारण बहुत कॉम्पैक्ट है, तो लिपिड अणु ऊतक से डिस्कनेक्ट नहीं होंगे, और समाशोधन प्रक्रिया अनावश्यक रूप से लंबी होगी या अपारदर्शी दिमाग में परिणाम होगी। एक्रिलामाइड की कम सांद्रता, हालांकि, लिपिड से रहित होने के बाद मस्तिष्क संरचना को पर्याप्त रूप से बनाए नहीं रखेगी। इस प्रोटोकॉल में, एक्रिलामाइड प्रतिशत को स्थिर अभी तक स्पष्ट ऊतक के नाजुक संतुलन प्रदान करने के लिए सेट किया गया है।

अधिकांश समाशोधन प्रक्रिया सीएस 2 में होती है, और ऊतक स्पष्टता स्तर का दैनिक परीक्षण किया जाना चाहिए। PBST क्लीनअप समाशोधन समाधान और अपवर्तक सूचकांक मिलान समाधान के बीच एक आवश्यक कदम है क्योंकि यह अवशिष्ट एसडीएस अणुओं को साफ करता है, जो रिम्स के साथ बातचीत कर सकता है। PBST (0.5%) में स्पष्ट ऊतक को अनिश्चित काल तक रखना भी संभव है यदि कक्ष तैयारी की अभी तक आवश्यकता नहीं है।

रिम्स में मस्तिष्क को रखते समय, किसी को समाधानों के लाभों और सीमाओं से परिचित होना चाहिए। उदाहरण के लिए, RapiClear लगभग साफ ऊतकों में भी पूर्ण पारदर्शिता का कारण होगा, लेकिन यह भी कुछ सूजन का कारण होगा, जिसे डेटा का विश्लेषण करते समय उपेक्षित नहीं किया जाना चाहिए। पिछले माप9 सभी अक्षों (यानी, डोर्सोवेंट्रल, पूर्वकाल-पीछे, और पार्श्व-औसत दर्जे के अक्षों) के साथ समान विस्तार का सुझाव देते हैं, जिससे एक ही मस्तिष्क क्षेत्र से पतले स्लाइस की तुलना में सूजन के सूचकांक की गणना करना संभव हो जाता है। स्पष्टता-विशिष्ट RapiClear का उपयोग करना सूजन को समाप्त करता है; हालांकि, यदि कोई एसडीएस बचा हुआ ऊतक में रहता है, तो वे गैर-पारदर्शी द्रव्यमान में एकत्रित होंगे।

इस संशोधित प्रोटोकॉल का एक और लाभ इसकी लागत है। पिछले प्रोटोकॉल एक कक्ष बनाने के लिए विभिन्न गोंद प्रकारों का सुझाव देते हैं जो रिम्स में मस्तिष्क को पकड़ सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम बस गर्म गोंद का उपयोग करते हैं। यह समाधानों के साथ प्रतिक्रिया नहीं करता है, हर जगह खरीदने के लिए उपलब्ध है, उपयोग करना आसान है, और पहले सुझाए गए गोंद की तुलना में काफी सस्ता है।

मोटे मस्तिष्क के नमूनों की इमेजिंग से प्राप्त डेटा पूरे सेल आबादी, मस्तिष्क संरचनाओं में कनेक्टिविटी, या बड़ी दूरी पर एक एकल अक्षतंतु की ट्रैकिंग का वर्णन कर सकता है (वीडियो 3)। यद्यपि इन विशेषताओं के बारे में प्रश्न पहले पूछे गए हैं, लेकिन मोटे मस्तिष्क स्लाइस का उपयोग करके प्राप्त किए जाने वाले डेटा की वैधता अब पतली-स्लाइस छवि ओवरले के पूर्व, गलती-प्रवण तरीकों पर बहुत सुधार करती है।

स्पष्टता प्रक्रिया मोटी स्लाइस के सफल और समान समाशोधन प्रदान करती है- कई मिलीमीटर से पूर्ण मस्तिष्क इमेजिंग तक। निष्क्रिय समाशोधन (यानी, ईटीसी का उपयोग नहीं करना) ऊतक को नुकसान के जोखिम को कम करता है, और वह समय जिसके लिए नमूने समाशोधन समाधानों में डूबे हुए हैं ताकि यह प्रोटीन संरक्षण की उच्च दक्षता को प्रभावित न करे।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता नहीं 803589), इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ अनुदान संख्या 1815/18), और कनाडा-इज़राइल अनुदान (CIHR-ISF, अनुदान संख्या 2591/18) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC) से धन प्राप्त हुआ है। हम पूरी पांडुलिपि पर टिप्पणी करने के लिए Nechama Novick धन्यवाद.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AAV1-GFAP::TdTomato ELSC Vector Core Facility (EVCF) viral vector used to detect astrocytes
AAV5-CaMKII::eGFP ELSC Vector Core Facility (EVCF) viral vector used to detect neurons
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP ELSC Vector Core Facility (EVCF) viral vector used to detect neuronal nuclei
AAV5-CaMKII::TdTomato ELSC Vector Core Facility (EVCF) viral vector used to detect neurons
Acrylamide (40%) Bio-rad #161-0140
Bisacrylamide (2%) Bio-rad #161-0142
Boric acid Sigma #B7901 Molecular weight - 61.83 g/mol
Confocal microscope, scanning, FV1000 Olympus 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA)
Imaris software Bitplane, UK A software that allows 3D analysis of images
NaOH Sigma #S5881
PBS
PFA 4% EMS #15710
RapiClear SunJin lab #RC147002
RapiClear CS SunJin lab #RCCS002
SDS Sigma #L3771
SyGlass software A software that allows 3D analysis of images using virtual reality
Tris base 1 M Bio-rad #002009239100 Molecular weight - 121.14 g/mol
Triton X-100 ChemCruz #sc-29112A
Two photon microscope Neurolabware Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) 
VA-044 Initiator Wako #011-19365

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References

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  21. Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
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तंत्रिका विज्ञान अंक 181
साफ दिमाग में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच स्थानिक बातचीत की जांच
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Refaeli, R., Goshen, I. Investigation of Spatial Interaction Between Astrocytes and Neurons in Cleared Brains. J. Vis. Exp. (181), e63679, doi:10.3791/63679 (2022).

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