Summary
该协议描述了用于microRNA聚类网络分析的高通量簇规则间隔短回文重复（CRISPR）基因编辑工作流程，允许在单个实验中快速生成一组携带独特miRNA簇成员缺失组合的转基因细胞系。
Abstract
微RNA（miRNA）已成为癌症和转移的重要细胞调节因子（肿瘤抑制因子，促致癌因子）。大多数已发表的研究在表征小RNA在癌症中的作用时都集中在单个miRNA上。然而，约30%的人miRNA基因被组织在通常共表达的簇状单元中，表明非编码RNA调控系统复杂且协调。在将非编码小RNA翻译到临床之前，需要更清楚地说明簇状miRNA网络如何协同工作以调节肿瘤生长，癌症侵袭性和耐药性。
使用高通量簇有规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）介导的基因编辑程序已被用于研究位于前列腺癌背景下长度约为35，000 bp的位点内的七个miRNA基因的基因组簇的致癌作用。对于这种方法，人类癌细胞系被多西环素（DOX）诱导的Cas9核酸酶的慢病毒载体感染，该载体在含DOX的培养基中生长48小时。随后，这些细胞与合成的反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）共转染，并与基因组位点特异性CRISPR RNA（crRNA）寡核苷酸复合，以允许在单个实验中快速产生携带整个miRNA簇缺失和单个或组合miRNA基因簇缺失的癌细胞系。
这种高通量基因编辑系统的优点是能够避免耗时的DNA载体亚克隆，灵活地以24孔格式使用独特的引导RNA组合转染细胞，以及使用粗细胞裂解物进行低成本的PCR基因分型。使用这种简化方法的研究有望揭示miRNA集群成员之间的功能冗余和协同/拮抗相互作用，这将有助于表征涉及人类疾病的复杂小型非编码RNA网络，并更好地为未来的治疗设计提供信息。
Introduction
需要更好的研究工具来研究非编码RNA对人类疾病的贡献。在比较癌症患者组织和体液（例如血液、尿液）中这些小的非编码RNA的表达谱与非癌、健康个体的表达谱时，通常观察到MiRNA失调，采用微阵列、定量实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和下一代深度测序技术1，2.最近的工作将这些miRNA的很大一部分表征为肿瘤抑制因子，致癌因子和转移因子，可控制肿瘤形成，疾病进展和耐药性。miRNA的实验性过表达和/或下调/丢失导致细胞中的功能性和多效性后果，反映了这些非编码RNA协调的广泛癌症相关活动 - 生长，细胞凋亡，分化，染色质重塑，血管生成，上皮至间充质（EMT）和MET过渡，代谢和免疫反应3。
MiRNA被编码为单个基因或驻留在基因组簇中，这些基因组簇在细胞核中转录并广泛处理，然后产生生物成熟的单链~22个核苷酸（nt）miRNA物种，这些物种位于细胞质4中。这些小RNA在转录后发挥其作用，并充当负基因调节剂，以序列特异性方式与信使RNA（mRNA）靶标结合，将催化RNA诱导的沉默复合物（RISC）带到mRNA位点，导致mRNA降解和/或蛋白质翻译中的阻断。MiRNA是动物系统中一类极其丰富的非编码RNA，人类基因组中存在2，654个成熟的miRNA（miRBase版本22.1）5。MiRNA通常与它们的mRNA靶标4的不完全互补性相关。因此，单个miRNA可以调节数十到数百个不同的mRNA靶标，并在功能上影响大范围的生物途径。为了增加基于miRNA的机制的复杂性，单个mRNA可以由多个不同的miRNA调节。因此，研究miRNA失调如何破坏身体的稳态平衡并导致人类恶性肿瘤是具有挑战性的。
大多数已发表的研究在表征其在疾病事件中的作用时都集中在单个miRNA上。然而，约30%的人miRNA基因以簇状单元（通常为~10千碱基酶[kb]）组织，这些单元通常以相同的方向转录并共表达，表明非编码RNA调节的协调和复杂系统6。最大的多cistronic人miRNA簇是14q32簇，由54个miRNA前体组成。与人类癌症相关的最充分研究的簇状miRNA单元之一是miR-17-92多cistronic簇，由miR-17，miR-18a，miR-19a，miR-20a，miR-19b-1和miR-92-1组成，位于非编码RNA的内含子3 c13orf25内。miR-17-92簇在造血恶性肿瘤中频繁扩增，在实体瘤中过表达，在促进细胞周期进展、细胞凋亡和血管生成7中已确立致癌作用。此外，位于非编码基因Leu2内含子内的肿瘤抑制性miR-15a和miR-16-1簇在白血病中常被删除，在大范围的癌症中下调，通过靶向抗凋亡基因BCL2和附加细胞周期进展基因8来阻断肿瘤生长。miR-888簇在高级别前列腺癌患者中升高，由位于人染色体Xq27.39，10上的七个miRNA基因（miR-892c，-890，-888，-892a，-892b，-891b和-891a）组成。
HPCX1位点（遗传性前列腺癌，X连锁1）内的miR-888簇图谱跨越Xq27-2，通过对遗传性前列腺癌家族谱系11，12，13，14，15，29的连锁分析确定。使用常规miRNA错表达工具（miRNA模拟物和反义抑制剂）对单个miR-888聚集成员的功能表征表明，这些miRNA在调节前列腺肿瘤生长和侵袭方面起着重叠的作用9，10。然而，这些实验方法并不容易研究多个miR-888簇成员如何在非编码RNA网络中协同作用或拮抗作用以控制组织稳态和癌症进展。使用高通量CRISPR基因编辑技术对所述简化方案进行修改，以分子解剖与人类癌症相关的miRNA簇（例如，miR-888簇），以弥合这一知识差距。
细菌脆皮和清脆皮相关（cas）基因介导对噬菌体的适应性免疫16。这种古老的原体细胞监测系统的发现很快被改编为一种有效的科学工具，可以轻松靶向任何所需的基因组位点，并在体外和体内的各种动物系统和细胞类型中进行DNA序列改变16，17。这项技术作为在人类疾病背景下询问miRNA网络的有效方法，具有很大的前景。为此，构建了这种高通量CRISPR基因编辑方案，用于研究未朽人类前列腺癌细胞系（LNCaP，PC3-ML）中人类染色体X上跨越约35 kb的miR-888簇，以询问集群成员如何协调癌症进展途径。这种方法可以应用于表征任何miRNA簇，并允许研究人员在单个实验中快速生成携带整个miRNA簇缺失以及单个和组合miRNA基因簇缺失的人类细胞系。
在此过程中，建立携带多西环素（DOX）诱导的慢病毒表达系统的稳定细胞系，该系统使研究人员能够通过组成性DOX诱导启动子TRE3G控制化脓性链球菌CRISPR相关内切酶Cas9（csn1）基因的表达。Tet-On 3G 二分系统涉及一个构成性人类伸长因子 1α （hEF1α） 启动子，以驱动 Tet-On 3G 基因和抗坏死因子基因 （BlastR） 作为双子转录本的转录。Tet-On 3G 反式激活蛋白仅在 DOX 存在下与 TRE3G 启动子结合，从而产生强大的 Cas9 转录。在没有 DOX 的情况下，没有或非常小的基础 Cas9 表达。因此，研究人员可以在CRISPR基因编辑步骤期间诱导在补充DOX的培养基中生长的细胞中产生高Cas9蛋白，并在DOX戒断时控制快速清除CAS9蛋白。
该协议还描述了合成CRISPR RNA （crRNA）寡核苷酸的设计，靶向整个miRNA簇两侧的区域，单个miRNA发夹（premiRNA）区域和/或簇内miRNA基因的子集。每个设计的crRNA都包含一个独特的5'-末端20 nt引导序列（与目标目标基因组序列互补），然后是一个不变的22 nt 化脓性链球菌 重复序列（5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGAAUCUUUUG-3'），可实现与通用反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）寡核苷酸18的碱基配对。退火的crRNA和曲克RNA（混合1：1比例）一起作为该方案的指导RNA（图1A）。在每个实验中，将两个合成引导RNA转染到DOX诱导的细胞中，以将细菌Cas9蛋白结合并护送到基因组DNA位点（5'和3'），位于靶向去除的miRNA簇区域的两侧（图1B）。
原空间器相邻基序（PAM）序列（5'-NGG-3'，用于野生 化脓性链球菌 Cas9）必须存在于细胞基因组中，并且位于指南RNA17靶向的20 nt DNA序列附近。PAM序列作为结合信号，并将内切酶Cas9酶的催化区域定位在靶向的基因组DNA位点上，随后导致位于PAM上游约3 nt的定向双链（ds）DNA切割。细胞的DNA修复机制修复切割的DNA末端，这可能导致完美的连接，但通常发生非同源末端连接（NHEJ），导致修复位点的小插入或缺失（插入）。由于miRNA是非编码基因，通常位于基因间和内源性区域，因此这些插入基因产生不需要的无意义/错义突变的风险很低。
通过在这些实验中采用合成RNA寡核苷酸（退火crRNA和tracrRNA，1：1摩尔比）编码引导RNA复合物，这种基因敲除策略避免了耗时的DNA载体亚克隆，并允许在将独特的引导RNA组合转染为24孔格式的细胞时具有极大的灵活性。制备用于PCR基因型筛选的粗细胞裂解物还避免了昂贵且耗时的DNA纯化方法，同时允许简化单集落细胞系生成和表型分析。事实上，这种高通量CRISPR基因编辑方案已成功用于在单个实验中转染具有32种独特引导RNA组合的培养前列腺癌细胞系（LNCaP，PC3-ML），并生成带有整个~35 kb miR-888簇区域缺失的敲除线;属于 miR-743 和 miR-891a 家族的 miR-888 集群成员的较小删除组合;以及 miR-888 簇中单个 miRNA 成员的缺失。像这样的研究将更清楚地说明聚集性miRNA如何合作调节肿瘤生长，侵袭性和耐药性，然后再将miRNA作为治疗和诊断工具转移到临床。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. 制备CRISPR基因编辑并指导RNA设计以生成miRNA簇敲除细胞系
- 使用DNA序列注释软件程序19创建包含感兴趣的miRNA簇区域（基因间，内旋）和至少1 kB周围基因组区域的完整基因组序列的DNA文件。
- 使用创建的DNA文件中 的特征 编辑工具标记目标miRNA簇位点（基因间，导入）和属于miRNA簇的每个单独的miRNA发夹序列，并记录其他附近的编码和非编码基因和/或调节特征5，20，21，22。
- 确保靶向删除的miRNA区域不会无意中破坏附近的蛋白质编码基因、非编码基因或重要的调节DNA元件。
注意：考虑本方案中使用的细胞系的基因组复杂性（例如，染色体重复/融合）。
- 使用生物信息学指南 RNA 设计软件工具（例如，23).确保在指南RNA设计工具中标注适当的Cas9酶（即 S. pyogenes 卡斯9）。
注意：合成的crRNA将包含这个独特的5'端20 nt引导序列（与DNA靶标互补），后跟不变的22 nt S. pyogenes 重复序列以允许与合成的通用tracrRNA寡核苷酸进行碱基配对。一起退火，它们将作为该协议中的指导RNA。- 引用创建的DNA文件（步骤1.1.），输入位于miRNA发夹/簇位点的上游（5'）或下游（3'）的约150 nt DNA序列，以靶向删除到生物信息学指南RNA设计软件工具23中。
注意：该设计工具将识别用于crRNA寡核苷酸设计的唯一20 nt序列，这些序列位于PAM序列（非靶向DNA链上）附近（例如， 化脓性链 炎Cas9 PAM序列NGG）。下面提供的是针对 mir-891a 基因位点（特别是代表性结果部分和表1中讨论的5A（891a））上游（5'）位点的crRNA设计 示例。- 打开指南RNA设计软件工具23。
- 在“输入名称”窗口中输入名称 5A（891a）。
- 在 “输入 DNA 序列 ”窗口中，输入位于 mir-891a 前体基因上游 （5'） 的 150 nt 基因组序列： 5'-阿加阿塔塔卡特加塔塔卡格
TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
TAGGTTAATCAATGTTGCATATCATATTATA
ATTACGTAGCTTCTTGTTTTTTTCTAGGTT
CCCAAAGATCTACAAATGTTGTCT-3' - 选中标记为 启用特异性检查 的框，以排除程序在计算上检测到的定位外网站。选择合适的生物体（即 人类 [智人]）。
- 指定用于研究的正确Cas9酶PAM，在这种情况下， 化脓性链球菌 Cas9-PAM：NGG，以生成以下默认设置：PAM相对于目标：之后;重复序列：咕咕咕相对于指南： 3;靶序列长度：20;相对于目标 5' 开始的切口：感觉 17 反感觉 17。
- 单击“ 下一步 ”按钮查看合成crRNA合成的结果。
注意：在本例中，建议合成的 crRNA 将识别 DNA 靶标 ATACATGT加塔塔塔卡， 并将位于 PAM：AGG 附近。
- 参考DNA文件（在步骤1.1中创建）以确定最靠近要删除的miRNA位点的最佳候选crRNA 20 nt靶序列，并且对预期的基因组靶标具有最高的特异性。
- 使用计算脱靶分析工具评估候选crRNA特异性，并预测与目标miRNA聚类感兴趣区域无关的基因组位点中的潜在脱靶位点（例如，24，25，26，27）。
- 记录潜在的脱靶结果，以便以后在通过PCR对单菌落CRISPR克隆细胞系进行基因分型时参考（步骤4.2.6.）。
注意：设计的crRNA寡核苷酸和基因组靶序列之间共享的序列互补性程度将决定Cas9酶在该位点切割基因组的选择性。由于引导RNA在3'到5'的方向上退火到基因组靶标，因此DNA靶标序列5'末端的不匹配（前8-10个碱基）通常会阻断Cas9介导的裂解。如果基因组靶序列与另一个基因组位点具有同源性，除了在DNA序列的前八个碱基内，则预计本指南RNA在该位点的脱靶率较低。 - 为每个靶向的miRNA位点设计四个独特的crRNA：两个设计的crRNA立即靶向互补的DNA序列，5'A，5'B）和两个设计的crRNA直接靶向互补的DNA序列，以立即靶向miRNA发夹/簇（3'A，3'B）的互补DNA序列。
注意：在进行CRISPR转染（第3节）时，将针对每个靶向的miRNA位点测试四种可能的5'和3'指导RNA对组合（5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B），以增加在单个实验中产生miRNA位点成功缺失的可能性。 - 使用创建的DNA文件中 的特征 编辑工具（步骤1.1）标记每个要合成的crRNA的DNA靶序列（带有相邻的PAM）。
- 引用创建的DNA文件（步骤1.1.），输入位于miRNA发夹/簇位点的上游（5'）或下游（3'）的约150 nt DNA序列，以靶向删除到生物信息学指南RNA设计软件工具23中。
- 设计和合成PCR引物（正向，反向）位于靶向miRNA簇区域的两侧，用于基因分型CRISPR细胞系（并在创建的DNA文件中标记引物）。
- 对于携带紧密簇状或单个miRNA的小基因组缺失的细胞系的基因分型细胞系，设计位于Cas9切割位点/敲除区域两侧约150 bp的PCR引物（正向，反向），以便能够通过凝胶电泳在单个PCR反应中检测野生型（~600 bp）和敲除（~300 bp）DNA片段。
- 对于携带miRNA前体组合或整个miRNA簇的大基因组缺失的细胞系的基因分型，再次设计位于Cas9裂解/敲除位点每侧约150 bp的PCR引物（正向，反向）。请注意，如果靶向miRNA簇缺失的长度跨越>4 kb，则PCR反应可能仅检测较小的（~300 bp）敲除DNA片段，而不会检测到野生型DNA片段。因此，设计额外的PCR引物（正向，反向）可以检测是否存在内部miRNA簇基因，以帮助筛选过程并验证纯合敲除细胞系。
2. 生成携带 DOX 诱导 Cas9 表达盒的稳定慢病毒细胞系
注意：使用BSL2程序和无菌技术在经过认证的生物安全罩中执行所有细胞培养和病毒工作。
- 确定CRISPR研究和首选生长培养基的合适细胞系类型。
注意：该方案是为人类前列腺癌细胞系LNCaP（首选培养基：RPMI，10%胎牛血清[FBS]）和PC3-ML（首选培养基：DMEM，10%FBS）开发的。 - 执行卵泡肽“死亡”曲线，以确定为携带原始细胞灭虫素抗性基因盒的慢病毒感染细胞选择的最佳药物浓度（步骤2.3）。
- 将细胞板放入24孔板的11孔中，并在37°C，5%CO2 中优选培养基中生长，直到约75%汇合。
- 在优选培养基中稀释卵泡肽（工作储备1 mg / mL），最终浓度范围为0，1至10μg/ mL，并以1μg/ mL的增量稀释。
- 标记播种的24孔板的孔从1到11。从孔中取出生长培养基，并用适当的生黄溶蛋白浓度代替。
- 每隔一天用适当的生黄肽浓度更换培养基，持续7-10天。
- 在时间过程中每天检查细胞，并确定在5-7天内杀死所有细胞所需的最小卵泡肽浓度。
注意：需要对用于CRISPR基因编辑实验的每种特定细胞系进行原始细胞蛋白“杀伤”曲线。
- 用携带DOX诱导的Cas9表达盒的慢病毒感染细胞，并使用步骤2.2中确定的最佳浓度进行卵泡肽选择。
- 在6孔板的三个孔中，接种5×每孔104 个细胞，并在37°C，5%CO2 过夜（ON）的优选培养基中生长。
- 第二天，将 DOX 诱导的 Cas9 （Lenti-iCas9） 的慢病毒表达载体解冻在冰上。轻轻混合（不要涡旋病毒颗粒）。
注意：将慢病毒在-80°C下等分试样储存，以避免多次冻融循环，这会降低病毒滴度和感染效率。 - 根据病毒滴度浓度，计算以0.3（MOI = 0.3）的感染多重度转导5×10 4 个病毒细胞所需的体积。
- 将适当的病毒体积移液到250μL（每孔）无血清和无抗生素的首选培养基中，并补充0.8μg/ mL六聚二甲基溴化物。轻轻混合。
注意：溴化六己二甲嘧啶是一种阳离子聚合物，可提高病毒吸附和感染效率。 - 取出培养基。将制备的250μL具有Lenti-iCas9病毒（MOI = 0.3）的转导培养基加入细胞中，并在37°C，5%CO2下孵育。（如果细胞表现出与病毒相关的毒性作用，则将孵育时间缩短至4-6小时。
- 用新鲜的首选培养基替换培养基，让细胞恢复1-2天。
- 使用从步骤2.2中描述的“杀死”曲线衍生的最佳早稻肽浓度对受感染的细胞进行10-14天的先子糖选择。
- 同时，在具有最佳生毒肽浓度的培养基中生长未感染的细胞，以用作病毒选择的阳性对照。
- 在选择时间过程中每3天更换一次补充最佳卵泡肽浓度的培养基，以除去死细胞。
注意：只有从卵泡糖选择中存活下来的细胞才会整合慢病毒载体。 - 扩展选择的原始细胞素的伦蒂-iCas9细胞系。
注意：每次扩增时记录细胞传代数。- 将一部分Lenti-iCas9细胞冷冻在优选的培养基中，补充10%二甲基亚砜（DMSO）用于长期冷冻储存。
- 通过蛋白质印迹9分析一部分Lenti-iCas9细胞，以鉴定表现出最稳定的DOX诱导Cas9蛋白水平的细胞系（参见步骤2.3）。
- 在新建立的Lenti-iCas9细胞系上进行多西环素浓度曲线，以确定Cas9蛋白诱导的最佳条件。
- 为测试的每个细胞系设置四个独立的6孔板，以执行此DOX浓度时间过程。板5×每个6孔板的每孔104 个细胞，并在37°C，5%CO2 在优选培养基中生长24小时。
- 在首选培养基中稀释 DOX（工作储备 1 mg/mL），最终 DOX 浓度曲线范围为 0、50、100、150、250 至 500 ng/mL。
- 标记每个接种的6孔板的孔，从1到6。取出培养基，并更换为适当的 DOX 浓度。生长板1-4直到以下时间点：24小时，48小时和72小时DOX诱导;和DOX退出后120小时（最初72小时DOX诱导）。
- 使用适当的方法（例如胰蛋白酶消化）在每个时间点收获板的孔。将细胞沉淀储存在-80°C。 在 RIPA 缓冲液中处理细胞沉淀，用于裂解物分离和 Cas9 蛋白质印迹分析。
- 使用变性的4%-12%Bis-Tris凝胶为DOX诱导时间过程的每个样品运行40μg细胞裂解物，并将蛋白质转移到免疫印迹膜中。
- 将免疫印迹膜与针对Cas9的一抗杂交以检测160 kDa蛋白。使用管家基因（如 GAPDH （37 kDa））使Cas9水平正常化。
- 根据蛋白质印迹结果，确定在伦蒂-iCas9细胞系中诱导Cas9的最佳DOX浓度。
注意：这一次的课程还将揭示Cas9表达在DOX移除后120小时受到的严格控制。 - 为显示稳健的 Cas9 蛋白表达的 Lenti-iCas9 细胞系建立单细胞集落，以优化 CRISPR 转染（第 3 部分）。
3. 使用高通量形式通过Cas9诱导和合成引导RNA转染细胞进行CRISPR反应
注意：工作流关系图如图 1 所示。
- 在纸上，绘制出将转染到24孔板的每个孔中的crRNA对组合，靶向整个miRNA簇，各种簇状miRNA基因组合以及单个miRNA簇成员。
- 在地图上，标记每个靶向miRNA位点四个孔。让每个孔代表一个转染反应，将两个独特的crRNA定位为5'和3'的所需miRNA敲除基因组位点和traccrRNA（退火1：1摩尔比）。
- 确保四个标记孔中的每一个都代表一个用于转染的唯一crRNA对（例如，5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B）。
注意：设计两个5'crRNA和两个3'crRNA位于每个靶向miRNA位点的两侧（第1部分），可以在转染反应中产生四个可能的5'和3'引导RNA对。
- 将Lenti-iCas9细胞系置于含有优化DOX浓度（在步骤2.4中测定）的首选培养基中的24孔板的5×10 4个细胞/孔中。在37°C，5%CO 2下培养细胞24-48小时以诱导Cas9蛋白表达。
- 用制备的5'和3'引导RNA转染伦蒂-iCas9细胞。
- 用无核酸酶的水将合成的crRNA和traccrRNA寡核苷酸重构至10μM的储备浓度。
- 根据步骤3.1中设计的实验图谱，为每个靶向miRNA位点标记四个1.5 mL微量离心管，代表四种可能的5'和3'crRNA对组合（5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B）。
- 在每个试管中，使用以下反应（最终体积为10μL）将1：1摩尔比的tracrRNA和独特的crRNA（5'和3'）混合在一起，形成2μM引导RNA复合物：
- 将 2.5 μL 曲克RNA（10 μM 储备品）、1.25 μL 5' 定位的 crRNA（10 μM 储备品）、1.25 μL 3' 定位的 crRNA（10 μM 储备品）和 5 μL 10 mM TRIS-HCL pH 7.5 加入 1.5 mL 离心管中。微量离心30秒，以16，000× g 混合。在室温（RT）下孵育5分钟。
- 向每个试管中，向10μL引导RNA复合物反应（总体积50μL）中加入40μL还原血清培养基（例如Opti-MEM）。通过上下移液轻轻混合。
- 在干净的1.5 mL离心管中，通过上下移液轻轻混合2μL转染试剂28（参见注3.3.5.1）和48μL还原血清培养基（例如Opti-MEM，最终体积为50μL）。在室温下孵育5分钟。
- 通过将试剂（2 μL）和减少的血清培养基（例如Opti-MEM，48 μL）量乘以要转染的孔数，加上10%的额外体积以考虑轻微的移液不准确，来制备转染试剂的预混液。
注意：选择针对小RNA和CRISPR RNA寡核苷酸转染以及28型细胞系进行优化的转染试剂。
- 通过将试剂（2 μL）和减少的血清培养基（例如Opti-MEM，48 μL）量乘以要转染的孔数，加上10%的额外体积以考虑轻微的移液不准确，来制备转染试剂的预混液。
- 向每个含有50μL引导RNA混合物的试管（从步骤3.3.4开始），加入50μL稀释的转染试剂（从步骤3.3.5开始）。将混合物缓慢上下移液一次以混合。在室温下孵育20分钟。
- 向含有100μL引导RNA/转染混合物的每个管中加入400μL补充有DOX（最佳浓度）的无抗生素培养基。轻轻移液以混合。
- 从DOX诱导的伦蒂-iCas9细胞中取出培养基（步骤3.2.）。根据24孔板实验图谱（步骤3.1）加入500μL培养基/ DOX /指导RNA /转染混合物。将转染的细胞在37°C，5%CO2下孵育48小时。
- 用不含DOX的新鲜首选培养基替换培养基（以清除细胞中的Cas9蛋白）。让细胞在37°C，5%CO2下再恢复24-48小时。
- 收获转染的细胞（胰蛋白酶消化）并准备进行基因分型和单细胞稀释。
注意：细胞代表包含转染的CRISPR基因编辑和未转染的野生型细胞的混合群体。此步骤将确定在投入时间/资源进行单细胞菌落扩增之前CRISPR编辑的效率。- 用1mL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤细胞1x。将细胞在100μL胰蛋白酶中在37°C，5%CO2 下孵育5分钟，并将细胞转移到含有1mL培养基的干净的1.5mL离心管中。
- 反转以混合并在20°C下以200× g 微量离心细胞5分钟。 取出培养基并将细胞沉淀重悬于1mL PBS中。
- 在20°C下以200× g 微量离心洗涤的细胞5分钟。 除去PBS并将细胞沉淀重悬于优选培养基的150μL中。
- 使用血细胞计数器或自动细胞计数仪确定150μL重悬细胞的每微升细胞数。
- 将150μL重悬的细胞分成三部分。
- 在培养基中冷冻1/3转染细胞（50μL）加上10%DMSO（最终体积为150μL）在冷冻管中，以便将来扩增/长期储存。
- 将转染细胞的1/3（50μL）转移到干净的0.2mL PCR管中进行基因分型。
- 在4°C下以200× g 微量离心细胞5分钟并除去培养基。
- 将细胞沉淀重悬于100μLPBS中。
- 在4°C下以200× g 微量离心细胞5分钟并除去PBS。将混合群体细胞沉淀长期储存在-80°C。
- 使用第4节中的工作流程处理细胞沉淀以进行基因分型。
- 准备最终的1/3细胞（50μL）进行稀释并以96孔板形式接种以产生单细胞菌落。
- 根据步骤3.7.中的细胞计数，计算在96孔板的每孔100μL培养基中达到10，5，2和1个细胞所需的稀释度。
- 使用12通道多移液器和无菌试剂储液器，每次稀释（每孔10，5，2或1个细胞）将每孔100μL稀释细胞加入板的两排（总共24孔）。允许4-6周的细胞生长到汇合处以进行单细胞集落扩增。每周在光学显微镜下观察细胞，并注意菌落是否代表单细胞或多细胞集落。
- 收集约10-15个单细胞菌落进行基因分型（第4部分）。为每个靶向miRNA位点鉴定至少三个独立的敲除性单细胞集落系。保留野生型单细胞系作为对照。
注意：筛选数量将取决于细胞系类型和miRNA敲除表型对细胞生长/活力的影响。
4. 使用粗细胞裂解物对CRISPR细胞系进行PCR基因分型
- 从96孔板的近融合孔中收获单个单细胞菌落。
注意：这些步骤中描述的介质/ PBS的去除可以使用生物安全柜中的真空吸气器手动进行，但要小心避免交叉污染。吸气时，对96孔板的每个孔使用新的无菌“黄色”200μL移液器吸头，其中每个交换的黄色吸头牢固地放置在连接到真空吸管的无菌玻璃牧场移液管的末端。- 用100μLPBS洗涤孔1x。吸出公共广播公司。
- 加入50μL胰蛋白酶，并在37°C，5%CO 2下孵育2-5分钟。
- 轻轻地上下移液，并将重悬的细胞转移到含有1mL培养基的1.5 mL离心管中。
- 倒置以混合并在20°C下以200× g 在微量离心机中轻轻沉淀细胞5分钟。
- 取出培养基并加入 1 mL PBS。轻轻轻拂管以破坏颗粒并反转几次以混合。
- 在20°C下以200× g 微量离心5分钟以沉淀细胞。
- 取出PBS并将沉淀重悬于300μL新鲜PBS中。
- 将300μL样品分成两部分。
- 将200μL细胞（沉淀的2/3）转移到含有1mL优选培养基的24孔板的孔中。一旦基因型被验证，使用这些细胞来扩展CRISPR介导的敲除细胞系以进行功能分析。
- 将100μL细胞（沉淀的1/3）转移到0.2mL PCR管中。在4°C下以3，000× g 微量离心5分钟。 删除公共广播公司。将沉淀储存在-80°C。
- 使用步骤1.3中设计的PCR引物制备用于基因分型和序列分析的粗细胞裂解物。在这些实验中包括从未转染细胞制备的细胞裂解物，以用作野生型阳性对照。
- 将细胞沉淀重悬于4μL5x DNA聚合酶缓冲液（参见 材料表，终浓度1x），1μL蛋白酶K（20ng / mL储备），1μLRNase A（10ng / mL储备）和无核酸酶水，总体积为20μL。
- 使用PCR程序在热循环仪中裂解细胞：56°C持续30分钟，96°C持续5分钟。将细胞裂解物储存在-20°C。
- 使用设计的PCR引物（正向，反向）进行PCR反应，该引物位于引导RNA 5'和3'引导RNA靶向位点的两侧（表1）。
注意：DNA聚合酶缓冲液和热循环仪条件将取决于用于PCR反应的Taq DNA聚合酶。该方案针对普西翁HF DNA聚合酶进行了优化。- 在冰上设置PCR反应混合物：5μL 5x DNA聚合酶缓冲液，0.5μL正向PCR引物（10μM储备），0.5μL反向PCR引物（10μM储备），0.5μL10mM dNTPs，0.25μL DNA聚合酶，1-4μL细胞裂解物和无核酸酶水，总体积为25μL。
- 使用程序在热循环仪中运行PCR反应：98°C 3分钟，98°C循环35次10秒，62°C循环15秒，72°C15秒，然后72°C循环10分钟。保持4°C。 见注4.2.3。以上。
- 将PCR产物上样到1%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
- 从分离的PCR片段中提取DNA，该片段具有敲除（和野生型）基因型的预测分子大小。准备用于 DNA 测序的样品。
- 验证CRISPR反应是否成功，并对分离的PCR片段进行DNA测序，以鉴定Cas9裂解位点并确认miRNA位点缺失。
- 为CRISPR靶向的每个miRNA位点分离至少三个独立的敲除细胞系。保留野生型（和杂合子）细胞系，用作下游功能研究的对照。
- 进行qRT-PCR或北印迹分析，以确认敲除细胞系不表达缺失位点的成熟miRNA。
注意：全基因组测序（WGS）是验证CRISPR基因编辑和脱靶的最明确方法。 - 通过PCR测试CRISPR脱靶效应，这是通过计算预测的（步骤1.2.3）。24，25，26，27.
- 如果广泛的单细胞集落筛选仅导致杂合基因型，请在单细胞杂合子系中重复引导RNA转染。
注意：无法获得纯合敲除细胞系可能表明由于miRNA丢失或亲本细胞系固有的基因组复杂性（例如染色体重复/融合）而需要进一步分析的致死作用。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这种高通量CRISPR缺失方案成功地使用了Cas9诱导的LNCaP和PC3-ML人癌细胞系的转染，以及靶向miR-888集群的合成寡核苷酸指南RNA，这些RNA在前列腺癌的背景下进行了研究。miR-888簇最初在表达分析筛选中被鉴定为在患有高级别疾病的前列腺癌患者中升高，而低级别和非癌症患者为9，10。miR-888簇跨越35，124 bp，由人类染色体Xq27.3上的七个miRNA（miR-892c，-890，-888，-892a，-892b，-891b和-891a）组成（图2A）。该位点位于HPCX1（遗传性前列腺癌，X连锁1，Xq27-28）内，其与遗传性前列腺癌11，12，13，14，15，29相关。miR-888、-890、-892a、-892b和-892c共享序列同源性，属于哺乳动物保守的miR-743家族。簇成员miR-891a和miR-891b彼此仅共享序列同源性，属于灵长类动物特异性miR-891家族。miR-888集群的基因组组织在灵长类动物中是保守的，这意味着重要的信号网络30的功能守恒。
先前使用实验过表达（miRNA模拟）和抑制（反义寡核苷酸）研究来评估单个miR-888集群成员活性的工作显示，所有miR-888集群成员在使用Matrigel Boyden室测定9，10促进前列腺癌细胞侵袭性的重叠作用。最值得注意的是，miR-888和miR-891a的功能类似于诱导前列腺细胞生长（WST-1测定），加速小鼠异种移植物中的前列腺肿瘤负荷，并调节共同靶标（例如，TIMP-2）9，10。然而，这项工作表明miR-888集群成员之间存在更复杂的相互作用。例如，miR-888和miR-891a在促进PC3-N前列腺细胞增殖方面显示出协同作用，而miR-890和miR-892c均使用WST-1测定9显示出抑制生长效应。因此，这种高通量CRISPR方案被用于在前列腺癌的背景下对miR-888集群网络进行基因询问。
所描述的CRISPR Cas9基因编辑工作流程（图1）允许在使用24孔格式的单次实验中测试32种独特的CRISPR指南RNA转染反应。该协议成功鉴定了一组载满整个miR-888簇，特定miRNA簇成员组合和单个miRNA成员的缺失的人前列腺癌敲除细胞系。首先建立了稳定的可诱导Cas9细胞系的产生。简而言之，PC3-ML和LNCaP人前列腺癌细胞被DOX诱导 的化脓性链球菌 Cas9慢病毒载体（慢血性-iCas9;编辑可诱导慢病毒hEF1a母细胞Cas9核酸酶颗粒;MOI 0.3）持续6小时（LNCaP）或过夜（PC3-ML），这取决于固有的细胞系对病毒毒性的敏感性。
受感染的细胞系随后经历卵泡肽选择（7.5μg/ mL）和单细胞集落扩增。使用蛋白质印迹研究选择基于DOX诱导时间过程的单菌落PC3-ML和LNCaP慢铁-iCas9细胞系，这些细胞系表现出最强的Cas9表达（图2A）。这种慢病毒Cas9诱导系统受到严格控制，并且在DOX戒断120小时后，大部分Cas9蛋白从细胞中清除（图2A）。DOX浓度曲线确定250 ng / mL DOX是在这些Lenti-iCas9前列腺细胞系中诱导稳健的Cas9蛋白表达的最佳剂量（图2B）。使用在线crRNA设计工具23，设计了独特的crRNA（两个5'和两个3'crRNA，位于每个计划的miRNA敲除位点的两侧，以允许四种可能的5'和3'引导RNA组合），靶向整个〜35 kb miR-888簇区域;miR-743系列或miR-891系列中的较小集群组合;以及单个miRNA缺失（miR-888，-891a）（图3A）。在进行CRISPR实验时，将人前列腺癌Lenti-iCas9细胞系在补充250 ng / mL DOX的培养基中生长48小时以诱导Cas9表达。
然后将细胞以24孔板形式转染，合成的通用tracrRNA与一组独特的5'和3'基因组位点特异性crRNA复合（1：1摩尔比）（表2）。从细胞培养基中取出DOX后48小时从前列腺癌细胞中清除Cas9蛋白。48小时后（转染后96小时）收获孔，并使用粗细胞裂解物制备每个收获的细胞沉淀的三分之一用于PCR基因分型（表3）。PCR反应的凝胶电泳分析表明，每次CRISPR转染都会扩增代表敲除基因型的预测DNA片段大小（图3B）。对这些分离的敲除PCR片段进行DNA测序证实，转染的5'和3'引导RNA将Cas9切割/连接指向PAM位点上游〜3 nt，并验证了靶向miRNA位点的基因组损失（代表性示例如图 4C所示）。由于miR-888簇位于X染色体的基因间区域（远离任何蛋白质编码基因），因此预计由于NHEJ，通常在Cas9切割位点具有INDELS的敲除细胞系不会引起下游人工效应。
尽管CRISPR转染反应成功（图3B），但转染的细胞代表了转染（敲除）和未转染（野生型）细胞的混合细胞群。该群体还代表了携带靶向miRNA位点的纯合子和杂合缺失的细胞的混合物。LNCaP和PC3前列腺癌细胞系来自具有异常核型的男性，包括两条X染色体31，32。因此，将每个细胞转染反应的一部分以96孔板形式连续稀释，以获得单细胞集落系。通过PCR筛选这些菌落，以选择缺乏靶向miRNA位点所有拷贝的纯合细胞系。
及时遵循这一程序非常重要，因为过去的数据表明miR-888集群在促进肿瘤细胞生长和疾病侵袭性方面起作用。预计携带miR-888集群成员的CRISPR缺失的癌细胞的生长速度将比野生型细胞慢。一个合理的担忧是，随着时间的推移，包含miRNA敲除和野生型细胞混合群体的引导RNA转染孔将导致野生型细胞迅速超过培养物中受损突变细胞。注意到这种情况的发生，并且在使用高侵袭性PC3-ML细胞系的实验中尤其明显。因此，在进行CRISPR转染实验后48-72小时内进行涉及连续稀释以产生单细胞集落系或用于冷冻储存的细胞制备的步骤，以保留混合群体样品中的敲除细胞。
对于miR-888集群，CRISPR工作流程中最费力的部分是产生纯合的单细胞集落miRNA缺失。该过程的一个挑战是，培养的LNCaP和PC3-ML细胞在单细胞密度下接种时通常不能很好地茁壮成长。此外，在miR-888集群成员的组合丧失时，细胞生长似乎在表型上受到损害（并且与细胞系的侵袭性相关）。因此，对于一些靶向某些miRNA位点组合的转染反应，需要额外的细胞稀释液（使用96孔格式）以产生足够的单细胞集落系进行基因分型。当通过电泳凝胶成像筛选单细胞菌落的基因型时，比较野生型的条带强度与敲除PCR片段的条带强度是有帮助的，并确定细胞系是杂合子（等带强度）还是代表多细胞集落（不等带强度），这将受益于额外的单细胞稀释。如果注意到细胞菌落具有异常大小的PCR片段并且与野生型或敲除型基因型不一致，则从研究中消除这些品系。
对与野生型和敲除型基因型一致的分离PCR片段的DNA测序对于每个已建立的单细胞菌落进行重新验证，并使用独立方法（即qRT-PCR，WGS）进行确认。就这些实验中产生纯合零细胞系的典型效率而言，这与靶向miRNA位点和使用的细胞类型有关。例如，使用LNCaP获得单菌落 mir-891a 敲除线的效率为30%，但在PC3-ML细胞中降至约7%。这种差异可能是由于固有的细胞类型差异（例如，PC3-ML细胞具有比LNCaP细胞更高的分裂率/转移电位）。CRISPR效率差异还可以反映miRNA损失的功能影响（例如，miR-891a促进细胞生长和侵袭性9，10），因此，在PC3-ML等更具侵袭性的细胞系中，敲除表型可能会被放大。获得用于miR-888簇较大miRNA位点缺失的单菌落系表现出效率降低。我们无法确定这是由于敲除DNA的较大区域，还是强调了miR-888成员在前列腺癌细胞中的基本和重叠的功能作用。
从该工作流程生成的单细胞集落扩增的敲除miR-888簇细胞系的详细描述和表型分析正在进行中，并将在其他地方发表。作为这些CRISPR基因编辑研究中产生的miRNA缺失的代表性结果，显示了携带单个mir-891a缺失的LNCaP前列腺癌细胞的研究结果。通过PCR对单细胞集落进行基因分型并验证序列（图4A-C）。未分析表现出异常大小的PCR片段的细胞系（例如，图4D所示的克隆L14 H7）。一旦获得mir-891a位点的敲除和野生型单细胞集落，就进行了功能研究。过去的研究表明，miR-891a（miRNA模拟慢病毒载体）的过表达会诱导前列腺细胞生长9，因此，预测miR-891a的丢失将显示互惠效应。比较mir-891a敲除和野生型细胞的WST-1增殖测定证实了这一假设，miR-891a丢失导致生长减慢（图4D，E）。
图1：用于生成miRNA簇缺失的CRISPR基因编辑工作流程 （A）指南RNA由退火的合成crRNA和traccrRNA寡核苷酸（混合1：1摩尔比）组成。crRNA寡核苷酸被设计为包含一个独特的5'-末端20 nt引导序列（黄色），与靶向基因组DNA位点互补，后跟一个不变的22 nt 化脓性链球菌 重复序列（绿色），该序列与tracrRNA寡核苷酸碱基配对。红色箭头表示Cas9酶双链DNA裂解位点通常位于PAM上游3 nt. （B）该实验工作流程描绘了24孔板的单孔。将感染有 DOX 诱导的 Cas9 慢病毒载体（Lenti-iCas9，MOI 0.3）的细胞在具有 DOX 的培养基中生长 48 小时以诱导 Cas9 蛋白表达。将两个合成的引导RNA（1：1摩尔比的crRNA：：tracrRNA混合）转染到Cas9诱导的细胞中。指南RNA将Cas9护送到基因组DNA位点（5'和3'），位于靶向去除的miRNA簇区域的两侧。转染后48小时制备细胞以进行稀释，使用96孔格式产生用于PCR基因分型和下游表型分析的单细胞集落。缩写：CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;微核酸 = 微核糖核酸;稀氨酸 = 脆皮核糖核酸;曲克拉RNA = 反式激活克里斯普RNA;nt = 核苷酸;Cas9 = 脆皮环切酶相关内切酶;PAM = 原始间隔邻接基序;DOX = 多西环素;MOI = 感染的多重性。 请点击此处查看此图的大图。
图2：携带多西环素诱导的Cas9慢病毒盒的癌细胞系表现出严格的Cas9蛋白调控. （A）蛋白质印迹分析显示，人前列腺癌PC3-ML细胞系感染了Lenti-iCas9载体（EditR诱导性慢病毒hEF1aBlastCas9核酸酶颗粒，MOI 0.3）并在含有250 ng / mL DOX的培养基中生长48小时，表达了最佳的Cas9蛋白水平。Cas9 表达被归一化为 GAPDH 表达。（B）在250 ng / mL DOX培养基中生长48小时和120小时（+ DOX）的PC3-ML细胞显示出强大的Cas9蛋白表达。从培养基中去除DOX（-DOX）120小时（120小时后）导致Cas9蛋白清除率，如蛋白质印迹分析所测量的那样。当生成LNCaP伦蒂-iCas9细胞系（未显示）时，获得了类似的结果。缩写：CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;Cas9 = 脆皮环切酶相关内切酶;DOX = 多西环素;MOI = 感染的多重性;GAPDH = 甘油醛 3-磷酸脱氢酶。 请点击此处查看此图的大图。
图3：高通量CRISPR实验设计，可在单个实验中生成多个miR-888簇缺失组合 （A）位于人类染色体Xq27.3上的miR-888簇图，表明哺乳动物保守的miR-743家族成员 mir-892c，-890，-888，-892a 和 -892b （蓝盒）以及灵长类动物特异性miR-891家族成员miR-891a和-891b（栗色盒）。使用独特的合成crRNA寡核苷酸（绿箭头）来生成miR-888簇敲除组合。正向和反向PCR引物（红色小矩形）被设计用于对细胞进行基因分型并筛选敲除。（B）这一代表性结果显示了转染的PC3-ML细胞（Lenti-iCas9）中的25个CRISPR反应，这些反应在单个实验中靶向一系列miR-888簇敲除组合。24孔板的每个转染孔都包含两个独特的gRNA，位于靶向miRNA基因组位点（Δ）的5'和3'侧（如 表2所示）。为每种CRISPR反应制备粗细胞裂解物并进行PCR基因分型。通过凝胶电泳以预测的敲除尺寸迁移的分离PCR片段进行DNA测序，并验证其是否具有靶向Cas9切割和miRNA位点去除。预测的 WT PCR 片段 bp 大小在括号中标明，所需的 CRISPR KO PCR 片段大小显示在凝胶底部。缩写：CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;Cas9 = 脆皮环切酶相关内切酶;糖核酸 = 引导核糖核酸;DOX = 多西环素;bp = 碱基对;WT = 野生型;KO = 淘汰赛。 请点击此处查看此图的大图。
图4：使用显示抑制增殖的CRISPR基因编辑为 mir-891a 删除的前列腺癌细胞 （A）PCR引物（紫色）和两个5'和两个3'引导RNA（橙色）靶向 mir-891a 基因两侧的基因组序列（绿色）的设计。（B）对转染的LNCaP细胞进行PCR基因分型，指示为5'和3'指导RNA，证实所有4种指导RNA组合均获得Δmir-891a缺失。转染后48小时由混合细胞群制成细胞裂解物。（C）对PCR片段进行测序和验证。一个具有代表性的例子显示了用5A（891a）和3B（891a）引导RNA处理的转染细胞的DNA序列，导致预测的Cas9裂解位点（PAM位点的上游3 nt）和CRISPR Δmir-891a缺失。（D）获得单细胞集落并进行PCR基因分型。 克隆L14 G9被序列验证为KO，克隆L14 G9作为 mir-891a 基因的WT。（E）miR-891a先前被证明可以诱导前列腺癌细胞生长，因此，miR-891a丢失被预测具有倒数表型。与WT细胞（L14 G9 [WT]，红色）相比， mir-891a （L14 G9 [KO]，蓝色）缺失的前列腺癌细胞的WST-1测定显示增殖受到抑制。缩写：CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;Cas9 = 脆皮环切酶相关内切酶;WT = 野生型;KO = 淘汰赛;WST-1 = 水溶性四唑盐-1。 请点击此处查看此图的大图。
| PCR反应设置在冰上。 | ||
| 元件 | 25 μL 反应 | 最终浓度 |
| 5x DNA聚合酶缓冲液 | 5 微升 | 1 倍 |
| 前向荧光定量 PCR 引物 （10 μM） | 0.5 微升 | 0.2 微米 |
| 反向荧光定量 PCR 引物 （10 μM） | 0.5 微升 | 0.2 微米 |
| 10 mM 数字孪生浦 | 0.5 微升 | 200 微米 |
| 脱氧核糖核酸聚合酶（2 U/μL） | 0.25 微升 | 0.125 U/ 25 μL |
| 粗细胞裂解物 | 1 - 4 μL | 变量 |
| 无核酸酶水 | 高达 25 μL | |
| 热循环仪PCR反应的条件： | ||
| 步 | 温度 | 时间 |
| 初始变性 | 98 °C | 3 分钟 |
| 98 °C | 10 秒 | |
| 35 次循环 | 62 °C | 15 秒 |
| 72 °C | 15 秒 | |
| 最终扩展 | 72 °C | 10 分钟 |
| 拿 | 4 °摄氏度 |
表1：粗裂解物基因分型的PCR反应条件。 缩写：dNTP = 脱氧核苷酸。
| 针对性删除的删除网站 | 指导核糖核酸组合 | 野生型（桶装） | 淘汰赛（桶装） | 聚合酶链反应引物对 |
| ∆全集群 | 5A（891a）+3A（892c） 5B（891a）+3A（892c） 5A（891a）+3B（892c） 5B（891a）+3B（892c） |
35,664 | 389 496 378 485 |
891a 富卫 892c 修订版 |
| ∆892c/890/888 | 5A（888）+3A（892c） 5B（888）+3A（892c） 5A（888）+3B（892c） 5B（888）+3B（892c） |
2,739 | 478 487 467 476 |
888 富卫 892c 修订版 |
| ∆892c/890 | 3A（888）+3A（892c） 3B（888）+3A（892c） 3A（888）+3B（892c） 3B（888）+3B（892c） |
2,739 | 710 754 699 743 |
888 富卫 892c 修订版 |
| ∆892b/892a | 5A（888）+5A（892b） 5B（888）+5A（892b） 5A（888）+5B（892b） 5B（888）+5B（892b） |
2,938 | 554 547 573 566 |
892b 固件 888 修订版 |
| ∆892b/892a/888 | 5A（892b）+3A（888） 5A（892b）+3B（888） 5B（892b）+3A（888） |
2,938 | 322 278 341 |
892b 固件 888 修订版 |
| ∆743 家庭 | 5A（892b）+3A（892c） 5B（892b）+3A（892c） 5A（892b）+3B（892c） 5B（892b）+3B（892c） |
5,015 | 370 389 359 378 |
892b 固件 892c 修订版 |
| ∆891 家庭 | 5A（891a）+3A（891b） 5B（891a）+3A（891b） |
27,294 | 330 270 |
891a 富卫 891b 修订版 |
| ∆891a | 5A（891a）+3A（891a） 5A（891a）+3B（891a） 5B（891a）+3A（891a） 5B（891a）+3B（891a） |
554 | 333 273 454 394 |
891a 富卫 891a 修订版 |
表 2：用于生成 miR-888 簇敲除组合的 CRISPR 指南 RNA。 缩写：CRISPR = 簇状规则间隔的短回文重复;bp = 碱基对;富卫 = 前进;转速 = 反向。
| 底漆 | 序列 | 铁氧饱和 （°C） |
| 888 富卫 | 阿加卡特卡特卡加塔格 | 52.2 |
| 888 修订版 | 卡特加特加特卡加加加 | 55.9 |
| 891a 富卫 | 特格加特克加特克塔卡 | 53.9 |
| 891a 修订版 | 断续器 | 54.8 |
| 891b 修订版 | 断续器 | 55.6 |
| 892b 固件 | GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA | 53.5 |
| 892b 修订版 | CTCTATTATTACGTCGTGATTGC | 53.5 |
| 892c 固件 | TGT加克塔卡加特TAG | 53.9 |
| 892c 修订版 | 咔咔咔 | 53.5 |
表3：用于基因分型的PCR引物。 缩写：FWD = 前进;转速 = 反向;Tm = 熔化温度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
这种CRISPR基因编辑程序允许研究人员快速生成带有独特miRNA簇缺失组合的整个细胞系组合。由5'和3'基因组位点特异性crNA组成的合成引导RNA的转染与合成tracrRNA（1：1摩尔比）退火，在该方案中避免了耗时的质粒载体亚克隆，并允许使用24孔格式进行更灵活和高通量的实验设计。携带 DOX 诱导的 Cas9 慢病毒盒的细胞系的生成可在引导 RNA 的细胞转染期间实现严格 DOX 调节和稳健的 Cas9 表达，并在后续步骤中 DOX 从培养基中退出时快速清除该细菌蛋白。该程序还依赖于粗细胞裂解物进行PCR基因分型，这需要最少的细胞材料进行分析，并避免使用昂贵且劳动密集型的二氧化硅柱DNA纯化方法或需要使用分光光度计测量核酸浓度，从而进一步简化了研究者的方法。
事实上，这里分享的代表性结果表明，该方法成功地在单个实验中用32种独特的引导RNA组合转染人类前列腺癌细胞系，并产生多个单细胞集落敲除系，在整个~35 kb miR-888簇区域携带缺失;属于 miR-743 和 miR-891a 家族的 miR-888 集群成员的较小删除组合;以及 miR-888 簇中单个 miRNA 成员的缺失。该工作流程产生了宝贵的细胞系资源，以开始在人类前列腺疾病的背景下分子剖析miR-888集群网络，并确定miR-888集群成员如何在功能上重叠或相互协同/拮抗地相互作用以调节前列腺肿瘤生长，癌症侵袭性和耐药性（将在其他地方发表）。随着这项研究转向治疗晚期和转移性前列腺癌患者的诊断和治疗应用，这些研究将是至关重要的。
这种高通量CRISPR基因编辑方案有几个关键步骤，研究人员在调整这种方法以研究其他疾病背景下的其他miRNA簇网络时应仔细考虑。首先，该过程中最重要的步骤是仔细设计用于CRISPR药物去除的miRNA簇两侧的指南RNA，以及用于删除单个miRNA或miRNA簇成员组合的附加指南RNA。研究人员应仔细考虑不破坏周围的基因或调节元件，特别是如果miRNA簇位于基因内含子内或与另一个基因反义。有CRISPR脱靶预测资源24，25，26，27可用，可以帮助研究人员选择最具歧视性的crRNA寡核苷酸进行合成。该工作流程描述了每个靶向miRNA位点两侧的两个5'和两个3'crRNA的设计，允许在CRISPR转染步骤中测试四种独特的引导RNA组合，并增加产生所需敲除细胞系的机会。然而，研究人员只需要这些指导RNA组合中的一种即可成功破坏特定的miRNA基因位点。
其次，研究人员应确定将Cas9递送到细胞进行CRISPR基因编辑的最合适方法。该程序使用DOX诱导的Cas9慢病毒表达系统，但Cas9蛋白生产的替代方法（例如，Cas9重组蛋白，Cas9 mRNA递送或使用传统的Cas9表达质粒载体系统）可以很容易地适用于该方案。例如，实验考虑因素可能决定使用Cas9瞬时表达与产生稳定的慢病毒表达细胞系，用于驱动Cas9（无处不在，细胞类型特异性，诱导性的）的启动子，以及结合阳性/阴性选择系统以确保Cas9表达载体递送到感兴趣的细胞（即抗生素耐药性）。
第三，重要的是在引导RNA递送后48-72小时内快速对混合群体转染细胞进行基因分型，以防miRNA簇的丢失可能对细胞的活力/生长产生负面影响。例如，当删除前列腺癌细胞系中的miR-891a等肿瘤促进因子时，注意到这些 mir-891a 敲除细胞的生长速度比未经处理的细胞慢，随后，野生型细胞迅速超过细胞群。最后，整合其他验证方法以确保在基因型筛选过程中去除miRNA位点至关重要，特别是对于较大的基因组缺失。这些措施包括使用内部PCR基因分型对照，仅在存在野生型等位基因时检测，并对单细胞集落进行qRT-PCR分析，以确保敲除细胞系不表达靶向miRNA。所有这些考虑因素将确保研究者获得成功的结果。
在将这种CRISPR技术纳入实验室时，遇到了一些明显的局限性。例如，尽管本方案中描述的指导RNA转染步骤具有高通量性质，可以快速生成多个miRNA簇缺失组合，但该过程的速率限制步骤是针对每个CRISPR介导的miRNA缺失进行基因型筛选和单菌落细胞系扩增。将积极选择策略纳入该协议将是一个优势;然而，从以96孔格式生长的单细胞菌落中扩展一个品系仍然需要~3-4周。事实上，每个miRNA位点敲除和野生型细胞至少收集三个独立的单菌落细胞系将有助于确保测定的表型不是由于伪影/脱靶效应，但这再次增加了该过程的耗时性质。研究人员可能还需要进行多轮CRISPR基因编辑以获得纯合零细胞系。这在使用已建立的永生化癌细胞系的研究中尤其明显，这些细胞系通常具有染色体重排和异常核型的复杂基因组景观。
例如，这项代表性研究使用LNCaP和PC3衍生的人前列腺癌细胞系来产生miR-888簇的缺失，映射到X染色体上。重要的是要认识到这些男性衍生的前列腺癌细胞系具有异常的核型并具有两条X染色体（并且PC3细胞在其他常染色体上也具有部分X染色体易位）31，32。尽管有这些条件，CRISPR基因编辑仍然足够强大，可以使用这些前列腺细胞系产生纯合子敲除。然而，在某些情况下，具有异常核型（例如，插入，缺失，倒置，重复）的研究者的细胞系可能含有“不可见的突变”，由于缺少使用设计的PCR引物/引导RNA成功检测所需的元素，因此会掩盖靶基因位点的第二（或更多）拷贝的检测。这强调了在进行功能测定之前使用独立方法（即qRT-PCR，北方印迹，WGS）验证纯合零CRISPR细胞系的重要性。最后，该协议旨在仅敲除彼此相邻的miRNA簇组合。如果研究人员希望敲除在其他miRNA基因之间分离的miRNA，则需要多轮CRISPR转染，需要仔细的基因分型和验证。
尽管存在这些挑战，但与miRNA研究工具箱中的现有方法相比，使用这种描述方案为任何给定的miRNA簇快速生成完整的miRNA缺失组合组合的能力是一个巨大的优势。使用miRNA模拟物表征非编码RNA功能的过表达研究可能导致无意的伪影或细胞毒性。同样，使用反义抗病毒寡核苷酸抑制剂来确定功能丧失表型可能很困难，因为抗病毒通常会导致敲低而不是完全消除miRNA活性。试图使用miRNA模拟物或miRNA抗复杂物的组合来阐明miRNA簇网络信号已被证明是费力且难以解释的。因此，将CRISPR基因编辑技术用于询问miRNA成员如何在给定的非编码基因组簇中相互作用，将使研究人员能够更清楚地了解非编码RNA如何影响疾病信号通路，并有望在诊断和药物发现领域产生巨大影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
PC3-ML细胞系由马克·斯特恩（德雷塞尔大学医学院）提供。贾斯汀·托克西协助PCR基因分型。这项工作得到了布里丹·亚当斯基金会赠款，瑞安转化研究基金和英联邦健康研究委员会赠款（CHRB-274-11-20）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL PCR tubes, flat cap | Fisher | 14-230-225 | Plasticware |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Seal-Rite | 1615-5500 | Plasticware |
| 24-well tissue culture plate | Corning Costar | 09761146 | Plasticware |
| 5x Phusion HF Buffer | Thermo Scientific | F-518L | PCR reagent, genotyping |
| 6-well tissue culture plate | Fisher | FB012927 | Plasticware |
| 96-well tissue culture plate | Falcon | 08-772-2C | Plasticware |
| Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal | AbCam | ab191468 | Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200 |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | Tisuue culture reagent |
| BLAST nucleotide search engine | National Center for Biotechnology Information | NA | Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov |
| Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes | Calbiochem | CAS 589205 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water |
| Countess 3 Automated Cell Counter | Invitrogen | A50298 | Equipment; Cell counter |
| Cryogenic tubes | Thermo Scientific | 50001012 | Plasticware |
| Dharmacon CRISPR Design Tool | Horizon Discovery Ltd. | NA | Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer |
| DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 | Dharmacon, Inc. | T-2002-02 | Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231100 | Tisuue culture reagent |
| DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | MT10013CV | Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells |
| Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution | Sigma-Aldrich | D3072-1ML | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | Tisuue culture reagent |
| Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed | Dharmacon, Inc. | U-002005-20 | CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides |
| Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol |
Dharmacon, Inc. | crRNA-460XXX | CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides |
| EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL | Dharmacon, Inc. | VCAS11227 | CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system |
| Ensembl genomic viewer | Ensembl | NA | Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences. |
| GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal | Santa Cruz Biotechnology | sc25778 | Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500 |
| Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit | IBI Scientific | IB47010 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified | Gibco | 16000044 | Tisuue culture reagent |
| Hexadimethrine bromide | MilliporeSigma | H9268 | CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL |
| Immobilon-FL PVDF Membrane | MilliporeSigma | IPFL10100 | Western blot reagent; nitrocellulose |
| Intercept (TBS) Blocking Buffer | LI-COR | 927-60001 | Western blot reagent |
| IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-68070 | Western blot reagent |
| IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody | LI-COR | 926-32211 | Western blot reagent |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5425 R | Plasticware |
| miRBase microRNA viewer | miRBase | NA | Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb. |
| NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well | Invitrogen | NP0321BOX | Western blot reagent |
| Odyssey CLx Imaging System | LI-COR | CLx | Equipment; Western blot imaging |
| Opti-MEM Reduced Serum Medium | Gibco | 31985062 | Transfection reagent |
| Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System | Owl | D2-BP | Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system |
| PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) | Integrated DNA Technology | NA | PCR reagent, genotyping |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Scientific | F530S | PCR reagent, genotyping |
| RIPA Lysis Buffer 10x | MilliporeSigma | 20-188 | Western blot reagent |
| Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade | Invitrogen | 25530049 | PCR reagent, genotyping |
| RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) | Thermo Scientific | EN0531 | PCR reagent, genotyping |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | MT10041CV | Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells |
| SnapGene Viewer | Snap Gene | NA | Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features |
| TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red | Gibco | 12563029 | Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin |
| UltraPure Agarose | Invitrogen | 16500100 | Nucleic acid gel electrophoresis reagent |
| Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler | ThermoFisher Scientific | 4375305 | Equipment |
| XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System | Invitrogen | EI0001 | Equipment; Protein gel electrophoresis system |
References
- Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
- Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
- Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
- Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
- Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
- Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
- Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
- Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
- Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
- Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
- Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
- Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
- Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
- Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
- SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
- Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
- Howe, K. L., et al.
- miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
- Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
- Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
- Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
- Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
- Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
- Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
- Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
- Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
- Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
- Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).
