Biology

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704

Charlotte Chambers¹, Linh Quan¹, Grace Yi¹, Aurora Esquela-Kerscher¹

¹Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Questo protocollo descrive un flusso di lavoro di editing genico CRISPR (Short Palindromic Repeats) ad alto rendimento per l'analisi della rete di cluster di microRNA che consente la rapida generazione di un pannello di linee cellulari geneticamente modificate che trasportano combinazioni uniche di delezione dei membri del cluster di miRNA fino a 35 kb all'interno di un singolo esperimento.

Abstract

I microRNA (miRNA) sono emersi come importanti regolatori cellulari (soppressori tumorali, fattori pro-oncogeni) del cancro e delle metastasi. La maggior parte degli studi pubblicati si concentra su un singolo miRNA quando caratterizza il ruolo dei piccoli RNA nel cancro. Tuttavia, circa il 30% dei geni dei miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate che sono spesso co-espresse, indicando un sistema complesso e coordinato di regolazione dell'RNA non codificante. Una sottovalutazione più chiara di come le reti di miRNA raggruppate funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività del cancro e la resistenza ai farmaci è necessaria prima di tradurre piccoli RNA non codificanti in clinica.

L'uso di una procedura di editing genico mediata da brevi ripetizioni palindrome raggruppate regolarmente intervallate (CRISPR) ad alto rendimento è stato impiegato per studiare il ruolo oncogenico di un cluster genomico di sette geni miRNA situati all'interno di un locus che copre ~ 35.000 bp di lunghezza nel contesto del cancro alla prostata. Per questo approccio, le linee cellulari tumorali umane sono state infettate da un vettore di lentivirus per la nucleasi Cas9 inducibile da doxiciclina (DOX) coltivata in mezzo contenente DOX per 48 ore. Le cellule sono state successivamente co-trasfettate con RNA CRISPR trans-attivante sintetico (tracrRNA) complessato con oligonucleotidi CRISPR RNA (crRNA) sito-specifici genomici per consentire la rapida generazione di linee cellulari tumorali che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di geni miRNA individuali o combinati all'interno di un singolo esperimento.

I vantaggi di questo sistema di editing genetico ad alto rendimento sono la capacità di evitare la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo, la flessibilità nel trasfettare le cellule con combinazioni uniche di RNA guida in un formato a 24 pozzetti e la genotipizzazione PCR a basso costo utilizzando lisati di cellule grezze. Gli studi che utilizzano questo approccio semplificato promettono di scoprire ridondanze funzionali e interazioni sinergiche / antagoniste tra i membri del cluster di miRNA, che aiuteranno a caratterizzare le complesse piccole reti di RNA non codificanti coinvolte nella malattia umana e informeranno meglio la futura progettazione terapeutica.

Introduction

Sono necessari migliori strumenti di ricerca per studiare il contributo degli RNA non codificanti nelle malattie umane. La disregolazione dei miRNA è spesso osservata in disturbi umani come il cancro quando si confrontano i profili di espressione di questi piccoli RNA non codificanti nei tessuti e nei fluidi corporei (ad esempio, sangue, urina) di pazienti oncologici rispetto a individui sani non cancerogeni, che impiegano microarray, PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e tecnologie di sequenziamento profondo di prossima generazione ^1,2 . Lavori recenti hanno caratterizzato un ampio sottoinsieme di questi miRNA come fattori oncosoppressori, oncogeni e metastasi che controllano la formazione del tumore, la progressione della malattia e la resistenza ai farmaci. La sovraespressione sperimentale e/o la downregulation/perdita di miRNA provocano conseguenze funzionali e pleiotropiche nella cellula, riflettendo l'ampia gamma di attività associate al cancro coordinate da questi RNA non codificanti- crescita, apoptosi, differenziazione, rimodellamento della cromatina, angiogenesi, transizioni da epiteliale a mesenchimale (EMT) e MET, metabolismo e risposta immunitaria³.

I miRNA sono codificati come singoli geni o risiedono in cluster genomici, che vengono trascritti nel nucleo e ampiamente elaborati prima di generare le specie di miRNA biologicamente mature, a singolo filamento ~ 22 nucleotide (nt) localizzate nel citoplasma⁴. Questi piccoli RNA esercitano i loro effetti post-trascrizionalmente e agiscono come regolatori genici negativi che si legano ai bersagli dell'RNA messaggero (mRNA) in modo specifico per sequenza per portare il complesso di silenziamento indotto dall'RNA catalitico (RISC) al sito dell'mRNA, con conseguente degradazione dell'mRNA e / o un blocco nella traduzione delle proteine. I miRNA sono una classe estremamente abbondante di RNA non codificanti nei sistemi animali e nel genoma umano esistono 2.654 miRNA maturi (miRBase release 22.1)⁵. I miRNA si associano tipicamente a una complementarità incompleta ai loro bersagli mRNA⁴. Pertanto, un singolo miRNA può regolare da decine a centinaia di bersagli mRNA distinti e avere un impatto funzionale su una vasta gamma di percorsi biologici. Per aumentare la complessità dei meccanismi basati sui miRNA, un singolo mRNA può essere regolato da miRNA multipli e distinti. È quindi difficile indagare su come la disregolazione del miRNA interrompa l'equilibrio omeostatico del corpo e porti alla malignità umana.

La maggior parte degli studi pubblicati si sono concentrati su un singolo miRNA quando caratterizzano il loro ruolo negli eventi di malattia. Tuttavia, ~ 30% dei geni miRNA umani sono organizzati in unità raggruppate (tipicamente ~ 10 kilobasi [kb]) che sono spesso trascritte nello stesso orientamento e co-espresse, indicando un sistema coordinato e complesso di regolazione dell'RNA non codificante⁶. Il più grande cluster di miRNA umani policistronici è l'ammasso 14q32 che comprende 54 precursori di miRNA. Una delle unità di miRNA cluster più ben studiate associate ai tumori umani è il cluster policistronico miR-17-92 composto da miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 e miR-92-1 residenti all'interno dell'introne 3 dell'RNA non codificante, c13orf25. Il cluster miR-17-92 è frequentemente amplificato nelle neoplasie ematopoietiche e sovraespresso nei tumori solidi e ha stabilito ruoli oncogeni nel promuovere la progressione del ciclo cellulare, l'apoptosi e l'angiogenesi⁷. Inoltre, il cluster soppressivo del tumore miR-15a e miR-16-1 situato all'interno dell'introne del gene non codificante Leu2 viene spesso eliminato nelle leucemie e sottoregolato in una vasta gamma di tumori, funzionando per bloccare la crescita tumorale prendendo di mira il gene antiapoptotico BCL2 e ulteriori geni di progressione del ciclo cellulare⁸. Il cluster miR-888 è elevato nei pazienti con carcinoma prostatico di alto grado ed è costituito da sette geni miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) situati sul cromosoma umano Xq27.3 ^9,10.

Il cluster miR-888 mappa all'interno del locus HPCX1 (Hereditary Prostate Cancer, X-linked 1) che copre Xq27-2, che è stato identificato dall'analisi di linkage dei pedigree ereditari della famiglia del cancro alla prostata ^{11,12,13,14,15,29}. La caratterizzazione funzionale dei singoli membri raggruppati di miR-888 utilizzando strumenti convenzionali di errata espressione del miRNA - imitazioni di miRNA e inibitori antisenso - ha indicato che questi miRNA svolgono ruoli sovrapposti nella regolazione della crescita e dell'invasione del tumore alla prostata ^9,10. Tuttavia, questi metodi sperimentali non si prestano facilmente a studiare come più membri raggruppati di miR-888 agiscono sinergicamente o antagonisticamente in una rete di RNA non codificante per controllare l'omeostasi tissutale e la progressione del cancro. Questo protocollo semplificato descritto che utilizza la tecnologia di editing genico CRISPR ad alto rendimento viene modificato per sezionare molecolarmente i cluster di miRNA associati ai tumori umani (ad esempio, cluster miR-888) per colmare questa lacuna di conoscenza.

I geni batterici CRISPR e CRISPR-associated (cas) mediano l'immunità adattativa contro i batteriofagi¹⁶. La scoperta di questo antico sistema di sorveglianza procariotica è stata rapidamente adattata come un efficace strumento scientifico per colpire facilmente qualsiasi luogo genomico desiderato e apportare alterazioni della sequenza del DNA all'interno di una vasta gamma di sistemi animali e tipi di cellule sia in vitro che in vivo^16,17. Questa tecnica è molto promettente come metodo efficace per interrogare le reti di miRNA nel contesto della malattia umana. A tal fine, questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento per studiare il cluster miR-888 che copre ~ 35 kb sul cromosoma X umano in linee cellulari di cancro alla prostata umano immortalizzato (LNCaP, PC3-ML) è costruito per interrogare come i membri del cluster coordinano i percorsi di progressione del cancro. Questo approccio può essere applicato alla caratterizzazione di qualsiasi cluster di miRNA e consente ai ricercatori di generare rapidamente linee cellulari umane che trasportano l'intera delezione del cluster di miRNA e delezioni di cluster di miRNA individuali e combinate all'interno di un singolo esperimento.

In questa procedura, vengono stabilite linee cellulari stabili che trasportano un sistema di espressione lentivirale inducibile da doxiciclina (DOX) che consente allo sperimentatore di controllare l'espressione genica dell'endonucleasi Cas9 (csn1) associata a Streptococcus pyogenes CRISPR attraverso il promotore costitutivo inducibile DOX TRE3G. Il sistema bipartito Tet-On 3G coinvolge un promotore costitutivo del fattore di allungamento umano 1 alfa (hEF1alpha) per guidare la trascrizione sia del gene Tet-On 3G che del gene di resistenza alla blastidina (Blast^R) come trascrizione bicistronica. La proteina transattivante Tet-On 3G si lega al promotore TRE3G solo in presenza di DOX, con conseguente robusta trascrizione Cas9. In assenza di DOX, non vi è alcuna o molto minima espressione basale di Cas9. Pertanto, lo sperimentatore può indurre un'elevata produzione di proteina Cas9 in cellule cresciute in mezzi integrati con DOX durante le fasi di modifica del gene CRISPR e il controllo per una rapida clearance della proteina CAS9 al momento del ritiro di DOX.

Questo protocollo descrive anche la progettazione di oligonucleotidi sintetici crispr RNA (crRNA) mirati a regioni che fiancheggiano l'intero cluster di miRNA, singole regioni di miRNA hairpin (premiRNA) e / o sottoinsiemi di geni miRNA all'interno del cluster. Ogni crRNA progettato contiene una sequenza guida 5'-terminale da 20 nt (complementare alla sequenza genomica di interesse da prendere di mira), seguita da una sequenza di ripetizione S. pyogenes invariante da 22 nt (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') che consente l'accoppiamento di basi con gli oligonucleotidi universali trans-attivanti CRISPR RNA (tracrRNA)¹⁸. Insieme, il crRNA ricotto e il tracrRNA (rapporto misto 1:1) funzionano come RNA guida per questo protocollo (Figura 1A). In ogni esperimento, due RNA guida sintetici vengono trasfettati in cellule indotte da DOX per associare e scortare la proteina batterica Cas9 ai siti del DNA genomico (5' e 3') che fiancheggiano la regione del cluster di miRNA bersaglio per la rimozione (Figura 1B).

Una sequenza di motivo adiacente protospaziale (PAM) (5'-NGG-3' per il tipo selvaggio S. pyogenes Cas9) deve essere presente nel genoma cellulare e situata immediatamente adiacente alla sequenza di DNA da 20 nt bersaglio dell'RNA guida¹⁷. La sequenza PAM funge da segnale di legame e posiziona la regione catalitica dell'enzima Cas9 dell'endonucleasi sul sito del DNA genomico mirato, portando successivamente alla scissione diretta del DNA a doppio filamento (ds) situata ~ 3 nt a monte del PAM. Il macchinario di riparazione del DNA della cellula ripara le estremità del DNA scisso, il che può comportare una legatura perfetta, ma spesso si verifica un'unione finale non omologa (NHEJ), causando piccole inserzioni o delezioni (indels) nel sito di riparazione. Poiché i miRNA sono geni non codificanti spesso situati all'interno di regioni intergeniche e introniche, questi indel comportano un basso rischio di creare mutazioni indesiderate senza senso / missenso.

Impiegando oligonucleotidi sintetici di RNA (crRNA ricotto e tracrRNA, rapporto molare 1:1) che codificano per il complesso dell'RNA guida in questi esperimenti, questa strategia di knockout genico evita la sottoclonazione del vettore del DNA che richiede tempo e consente un'enorme flessibilità nel trasfettare combinazioni di RNA guida uniche alle cellule in un formato a 24 pozzetti. La preparazione di lisati di cellule grezze per lo screening del genotipo PCR evita anche costosi e dispendiosi in termini di tempo i metodi di purificazione del DNA, consentendo al contempo la generazione semplificata della linea cellulare a singola colonia e l'analisi fenotipica. In effetti, questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento è stato utilizzato con successo per trasfettare le linee cellulari del cancro alla prostata in coltura (LNCaP, PC3-ML) con 32 combinazioni di RNA guida uniche in un singolo esperimento e generare linee knockout che trasportano delezioni per l'intera regione del cluster miR-888 da ~ 35 kb; combinazioni di delezione più piccole per i membri del cluster miR-888 appartenenti alle famiglie miR-743 e miR-891a; così come delezioni per singoli membri di miRNA all'interno del cluster miR-888. Studi come questi forniranno una sottovalutazione più chiara di come i miRNA raggruppati funzionino in modo cooperativo per regolare la crescita del tumore, l'aggressività e la resistenza ai farmaci prima di tradurre i miRNA in clinica come strumenti terapeutici e diagnostici.

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Protocol

1. Preparazione per l'editing genetico CRISPR e guida la progettazione dell'RNA per generare linee cellulari knockout di cluster di miRNA

Creare un file di DNA contenente la sequenza genomica completa della regione di interesse del cluster di miRNA (intergenica, intronica) e almeno 1 kB di regioni genomiche circostanti utilizzando un programma software di annotazione della sequenza di DNA¹⁹.
1. Utilizzare uno strumento di modifica delle caratteristiche nel file del DNA creato per contrassegnare il locus del cluster di miRNA mirato (intergenico, intronico) e ogni singola sequenza di forcine di miRNA appartenente al cluster di miRNA, oltre a notare altri geni codificanti e non codificanti e / o caratteristiche regolatorie^vicine 5,20,21,22.
2. Assicurarsi che le regioni di miRNA mirate per la delezione non interrompano inavvertitamente i geni codificanti proteine vicine, i geni non codificanti o importanti elementi regolatori del DNA.
  NOTA: Considerare la complessità genomica (ad esempio, duplicazioni/fusioni cromosomiche) della linea cellulare utilizzata in questo protocollo.
Progettare crRNA sintetici mirati a 20 nt di sequenza genomica del DNA che fiancheggia l'intero cluster di miRNA, singole regioni di forcine di miRNA (pre-miRNA) e/o sottoinsiemi di geni miRNA all'interno del cluster utilizzando uno strumento software di progettazione di RNA guida bioinformatica (ad esempio,²³). Assicurarsi che l'enzima Cas9 appropriato sia annotato nello strumento di progettazione dell'RNA guida (ad esempio, S. pyogenes Cas9).
NOTA: Il crRNA sintetizzato conterrà questa sequenza guida unica di 5'-terminali 20 nt (complementare al bersaglio del DNA) seguita da un invariante 22 nt S. pyogenes sequenza ripetuta per consentire l'accoppiamento di basi con l'oligonucleotide tracrRNA universale sintetizzato. Ricotti insieme, funzioneranno come RNA guida in questo protocollo.
1. Facendo riferimento al file di DNA creato (Passo 1.1.), inserire ~150 nt di sequenza di DNA che risiede immediatamente a monte (5') o a valle (3') del locus miRNA hairpin/cluster mirato per la cancellazione nella guida bioinformatica RNA design software tool²³.
  NOTA: Lo strumento di progettazione identificherà sequenze univoche di 20 nt per la progettazione di oligonucleotidi crRNA che risiedono immediatamente adiacenti alla sequenza PAM (sul filamento di DNA non mirato) (ad esempio, S. pyogenes Cas9 PAM sequence NGG). Di seguito è riportato un esempio di progettazione di crRNA mirata a un sito immediatamente a monte (5') del locus del gene mir-891a (in particolare 5A(891a) discusso nella sezione dei risultati rappresentativi e nella Tabella 1).
  1. Aprire lo strumento software di progettazione dell'RNA guida²³.
  2. Immettere il nome 5A(891a) nella finestra Inserisci nome .
  3. Nella finestra Inserisci una sequenza di DNA , inserisci 150 nt di sequenza genomica che risiede immediatamente a monte (5') del gene precursore mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
    TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
    TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
    ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
    CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
  4. Selezionare la casella Abilita controllo specificità per escludere i siti off-targeting rilevati computazionalmente dal programma. Scegli l'organismo appropriato (cioè Umano [Homo sapiens]).
  5. Specificare il corretto enzima Cas9 PAM impiegato per gli studi, in questo caso, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, per generare le seguenti impostazioni predefinite: PAM rispetto al target: Dopo; Sequenza di ripetizione: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Relativo alla Guida: 3; Lunghezza della sequenza target: 20; Taglio rispetto all'obiettivo 5' di partenza: Senso 17 Anti-senso 17.
  6. Fare clic sul pulsante Avanti per visualizzare i risultati per la sintesi di crRNA sintetico.
    NOTA: In questo esempio, il crRNA suggerito da sintetizzare riconoscerà il bersaglio del DNA ATACATGCTGATAGTTACAC e si troverà adiacente a PAM:AGG.
2. Fare riferimento al file di DNA (creato nella fase 1.1.) per determinare le migliori sequenze target di crRNA 20 nt candidate che risiedono più vicine al locus miRNA da eliminare e possiedono la massima specificità per il bersaglio genomico previsto.
  1. Utilizzare strumenti di analisi computazionale off-targeting per valutare la specificità del crRNA candidato e prevedere potenziali siti di off-targeting in loci genomici non correlati alla regione di interesse del cluster di miRNA mirato (ad esempio, 24,25,26,27).
  2. Registrare i potenziali risultati di off-targeting per riferimento successivo durante la genotipizzazione di linee cellulari clonali CRISPR a colonia singola mediante PCR (Fase 4.2.6.).
    NOTA: L'estensione della complementarità di sequenza condivisa tra l'oligonucleotide crRNA progettato e la sequenza target genomica determinerà quanto selettivamente l'enzima Cas9 fende il genoma in quel luogo. Poiché l'RNA guida si ricottura al bersaglio genomico in una direzione da 3' a 5', i disallineamenti all'estremità 5' della sequenza target del DNA (le prime 8-10 basi) spesso bloccano la scissione mediata da Cas9. Se la sequenza genomica bersaglio condivide l'omologia con un altro locus genomico, tranne che all'interno delle prime otto basi della sequenza di DNA, si prevede che questo RNA guida abbia una bassa probabilità di off-targeting in questo sito.
  3. Progettare quattro crRNA unici per ogni locus miRNA mirato: due crRNA progettati per indirizzare sequenze di DNA complementari immediatamente 5' della forcina/cluster di miRNA (5'A, 5'B) e due crRNA progettati per indirizzare sequenze di DNA complementari immediatamente 3' della forcina/cluster di miRNA (3'A, 3'B).
    NOTA: Quando si eseguono le trasfezioni CRISPR (nella Sezione 3), quattro possibili combinazioni di coppie di RNA guida 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) saranno testate per ogni locus miRNA mirato per aumentare la probabilità di generare delezioni di miRNA locus di successo in un singolo esperimento.
  4. Utilizzare uno strumento di modifica delle funzionalità nel file del DNA creato (Passo 1.1.) per contrassegnare la sequenza target del DNA (con PAM adiacente) per ogni crRNA progettato da sintetizzare.
Progettare e sintetizzare primer PCR (avanti, indietro) fiancheggiando le regioni del cluster di miRNA mirate per la genotipizzazione delle linee cellulari CRISPR (ed etichettare i primer nel file di DNA creato).
1. Per la genotipizzazione di linee cellulari portatrici di piccole delezioni genomiche per miRNA strettamente raggruppati o individuali, progettare primer PCR (avanti, indietro) che risiedono a circa 150 bp su ciascun lato del sito di scissione Cas9 / regione di knockout che consentiranno il rilevamento di entrambi i frammenti di DNA wildtype (~ 600 bp) e knockout (~ 300 bp) in una singola reazione PCR tramite elettroforesi su gel.
2. Per la genotipizzazione di linee cellulari portatrici di grandi delezioni genomiche per combinazioni di precursori di miRNA o l'intero cluster di miRNA, progettare nuovamente primer PCR (avanti, indietro) che risiedono a circa 150 bp su ciascun lato del sito di scissione / knockout Cas9. Si noti che, se la delezione mirata del cluster di miRNA si estende per >4 kb di lunghezza, la reazione PCR probabilmente rileverà solo il frammento di DNA knockout più piccolo (~ 300 bp) ma non il frammento di DNA wildtype. Pertanto, progettare ulteriori primer PCR (avanti, indietro) in grado di rilevare la presenza o l'assenza di geni interni del cluster di miRNA per aiutare il processo di screening e convalidare le linee cellulari knockout omozigoti.

2. Generazione di linee cellulari lentivirali stabili che trasportano la cassetta di espressione Cas9 inducibile da DOX

NOTA: Eseguire tutte le colture cellulari e il lavoro sui virus in una cappa di biosicurezza certificata utilizzando procedure BSL2 e tecnica asettica.

Determinare il tipo di linea cellulare appropriato per gli studi CRISPR e il mezzo di crescita preferito.
NOTA: Questo protocollo è stato sviluppato per le linee cellulari di carcinoma prostatico umano LNCaP (mezzo preferito: RPMI, siero bovino fetale al 10% [FBS]) e PC3-ML (mezzo preferito: DMEM, 10% FBS).
Eseguire una curva di "morte" della blasticidina per determinare la concentrazione ottimale del farmaco da selezionare per le cellule infette da lentivirus che trasportano la cassetta del gene della resistenza alla blasticidina (Fase 2.3.).
1. Le cellule a piastre in 11 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti crescono a 37 °C, 5% CO₂ nel mezzo preferito fino a circa il 75% confluente.
2. Diluire la blastidina (stock di lavoro 1 mg/mL) nel mezzo preferito con una concentrazione finale compresa tra 0, 1 e 10 μg/mL e diluita con incrementi di 1 μg/mL.
3. Etichettare i pozzetti del piatto seminato a 24 pozzetti da 1 a 11. Rimuovere il terreno di coltura dai pozzetti e sostituirlo con le opportune concentrazioni di blastidina.
4. Cambiare il mezzo con le concentrazioni appropriate di blastidina a giorni alterni per 7-10 giorni.
5. Esaminare le cellule ogni giorno durante il corso del tempo e determinare la concentrazione minima di blasticidina necessaria per uccidere tutte le cellule entro 5-7 giorni.
  NOTA: Una curva di "uccisione" della blasticidina dovrà essere eseguita per ogni specifica linea cellulare impiegata per gli esperimenti di editing genetico CRISPR.
Infettare le cellule con lentivirus che trasportano la cassetta di espressione Cas9 inducibile dox ed eseguire la selezione della blasticidina utilizzando la concentrazione ottimale determinata nella fase 2.2.
1. In tre pozzetti di un piatto a 6 pozzetti, seminare 5 × 10⁴ cellule per pozzetto e crescere nel mezzo preferito a 37 °C, 5% CO₂ durante la notte (ON).
2. Il giorno dopo, scongelare il vettore di espressione del lentivirus per Cas9 inducibile da DOX (Lenti-iCas9) sul ghiaccio. Mescolare delicatamente (non vortex particelle virali).
  NOTA: Conservare il lentivirus in aliquote a -80 °C per evitare cicli multipli di congelamento/disgelo, che ridurranno i titoli virali e l'efficienza dell'infezione.
3. Calcola il volume necessario per trasdurre 5 × 10⁴ cellule con virus ad una molteplicità di infezione di 0,3 (MOI = 0,3) in base alla concentrazione del titolo virale.
4. Pipettare il volume appropriato del virus in 250 μL (per pozzetto) di mezzo preferito privo di siero e senza antibiotici integrato con 0,8 μg/mL di esadimerina bromuro. Mescolare delicatamente.
  NOTA: L'esadimerina bromuro è un polimero cationico trovato per aumentare l'adsorbimento virale e l'efficienza delle infezioni.
5. Rimuovere il supporto. Aggiungere i 250 μL di mezzo di trasduzione preparato con il virus Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) alle cellule e incubare ON a 37 °C, 5% CO₂. (Ridurre il tempo di incubazione a 4-6 ore se le cellule mostrano effetti tossici correlati al virus.)
6. Sostituire il mezzo con un mezzo fresco preferito e consentire alle cellule di recuperare per 1-2 giorni.
7. Eseguire la selezione della blasticidina sulle cellule infette per 10-14 giorni utilizzando la concentrazione ottimale di blasticidina derivata dalla curva "uccidere" descritta nella fase 2.2.
  1. In parallelo, far crescere le cellule non infette in mezzo con la concentrazione ottimale di blasticidina da utilizzare come controllo positivo per la selezione virale.
8. Cambiare il mezzo integrato con la concentrazione ottimale di blasticidina ogni 3 giorni durante il corso del tempo di selezione per rimuovere le cellule morte.
  NOTA: Solo le cellule che sopravvivono alla selezione della blasticidina avranno integrato il vettore lentivirale.
9. Espandi le linee cellulari Lenti-iCas9 selezionate dalla blastidina.
  NOTA: registrare il numero di passaggio della cella ad ogni espansione.
  1. Congelare una parte delle cellule Lenti-iCas9 nel mezzo preferito integrato con il 10% di dimetilsolfossido (DMSO) per la conservazione crioviale a lungo termine.
  2. Analizzare una porzione delle cellule Lenti-iCas9 mediante Western blot⁹ per identificare la linea cellulare che presenta i livelli di proteina Cas9 più robusti e inducibili da DOX (vedere Passo 2.3.).
Eseguire una curva di concentrazione di doxiciclina su linee cellulari Lenti-iCas9 di nuova costituzione per determinare le condizioni ottimali per l'induzione della proteina Cas9.
1. Impostare quattro piastre indipendenti a 6 pozzetti per ogni linea cellulare testata per eseguire questo corso di concentrazione DOX. La piastra 5 × 10⁴ celle per pozzetto di ogni piastra a 6 pozzetti e cresce a 37 °C, 5% CO₂ nel mezzo preferito per 24 ore.
2. Diluire DOX (stock di lavoro 1 mg/mL) nel mezzo preferito con una curva di concentrazione finale di DOX compresa tra 0, 50, 100, 150, 250 a 500 ng/mL.
3. Etichettare i pozzetti di ogni piatto a 6 pozzetti seminato da 1 a 6. Rimuovere il mezzo e sostituirlo con le concentrazioni di DOX appropriate. Far crescere le piastre 1-4 fino ai seguenti punti temporali: 24 h, 48 h e 72 h induzione DOX; e 120 ore dopo il prelievo di DOX (inizialmente 72 ore indotte da DOX).
4. Raccogliere i pozzetti del piatto in ogni punto temporale utilizzando metodi appropriati (ad esempio, tripsinizzazione). Conservare il pellet cellulare a -80 °C. Elaborare i pellet di cella nel tampone RIPA per l'isolamento del lisato e l'analisi Cas9 western blot.
  1. Eseguire 40 μg di lisato cellulare per ogni campione del corso di tempo di induzione DOX utilizzando un gel di Bis-Tris denaturante al 4%-12% e trasferire le proteine su una membrana immunoblot.
  2. Ibridare la membrana immunoblot con un anticorpo primario contro Cas9 per rilevare la proteina 160 kDa. Normalizzare i livelli di Cas9 utilizzando un gene di pulizia come GAPDH (37 kDa).
5. Sulla base dei risultati del western blot, determinare la concentrazione ottimale di DOX per indurre Cas9 nelle linee cellulari Lenti-iCas9.
  NOTA: Questo corso di tempo rivelerà anche quanto strettamente l'espressione Cas9 è regolata su 120 h post rimozione DOX.
6. Stabilire colonie monocellulari per le linee cellulari Lenti-iCas9 che mostrino una robusta espressione della proteina Cas9 per ottimizzare le trasfezioni CRISPR (nella Sezione 3).

3. Esecuzione di reazioni CRISPR mediante induzione Cas9 e trasfezione di RNA guida sintetico delle cellule utilizzando un formato ad alto rendimento

NOTA: nella Figura 1 viene illustrato un diagramma del flusso di lavoro.

Su carta, mappare le combinazioni di coppie di crRNA che saranno trasfettate in ciascun pozzetto di una placca a 24 pozzetti che mira all'intero cluster di miRNA, varie combinazioni di geni miRNA raggruppati e singoli membri del cluster di miRNA.
1. Sulla mappa, etichettare quattro pozzetti per locus miRNA mirato. Ognuno di essi rappresenta una reazione di trasfezione, con due crRNA unici posizionati a 5' e 3' del locus genomico knockout del miRNA desiderato e del tracrRNA (rapporto molare 1:1 ricotto).
2. Assicurarsi che ciascuno dei quattro pozzetti etichettati rappresenti una coppia di crRNA unica per la trasfezione (ad esempio, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
  NOTA: La progettazione di due crRNA da 5' e due crRNA da 3' che fiancheggiano ciascun locus miRNA mirato (Sezione 1) consente la generazione di quattro possibili coppie di RNA guida 5' e 3' nella reazione di trasfezione.
Placcare la linea cellulare Lenti-iCas9 a 5 x 10⁴ celle/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nel mezzo preferito contenente la concentrazione ottimizzata di DOX (determinata nella fase 2.4.). Far crescere le cellule per 24-48 ore a 37 °C, 5% CO₂ per indurre l'espressione della proteina Cas9.
Trasfettate le cellule Lenti-iCas9 con gli RNA guida da 5' e 3' preparati.
1. Ricostituire gli oligonucleotidi di crRNA e tracrRNA sintetizzati con acqua priva di nucleasi ad una concentrazione di stock di 10 μM. Conservare a -80 °C a lungo termine.
2. Etichettare quattro tubi microcentrifuga da 1,5 mL per locus miRNA mirato in base alla mappa sperimentale progettata nella fase 3.1., che rappresenta le quattro possibili combinazioni di coppie di crRNA 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
3. In ogni tubo, mescolare un rapporto molare 1:1 di tracrRNA e crRNA unici (5' e 3') insieme per formare il complesso di RNA guida da 2 μM usando la seguente reazione (volume finale di 10 μL):
  1. Aggiungere 2,5 μL di tracrRNA (10 μM di stock), 1,25 μL del crRNA posizionato a 5' (10 μM di stock), 1,25 μL del crRNA posizionato da 3' (10 μM stock) e 5 μL di 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 a un tubo centrifugo da 1,5 mL. Microcentrifuga per 30 s a 16.000 × g da miscelare. Incubare a temperatura ambiente (RT) per 5 min.
4. A ciascun tubo, aggiungere 40 μL di mezzo sierico ridotto (ad esempio, Opti-MEM) ai 10 μL di reazione complessa dell'RNA guida (volume totale di 50 μL). Mescolare delicatamente pipettando su e giù.
5. In un tubo centrifugo pulito da 1,5 mL, miscelare 2 μL del reagente di trasfezione²⁸ (vedere NOTA 3.3.5.1.) e 48 μL di mezzo sierico ridotto (ad esempio, Opti-MEM, volume finale di 50 μL) delicatamente mediante pipettatura su e giù. Incubare a RT per 5 min.
  1. Preparare una miscela principale del reagente di trasfezione moltiplicando le quantità di reagente (2 μL) e di mezzo sierico ridotto (ad esempio, Opti-MEM, 48 μL) per il numero di pozzetti da trasfettare, più il 10% di volume extra per tenere conto di lievi imprecisioni di pipettaggio.
    NOTA: Selezionare un reagente di trasfezione ottimizzato per le piccole trasfezioni di oligonucleotidi di RNA e CRISPR RNA, nonché per la linea cellulare di tipo²⁸.
6. A ciascun tubo contenente i 50 μL di miscela di RNA guida (dal passo 3.3.4.), aggiungere i 50 μL del reagente di trasfezione diluito (dal punto 3.3.5.). Pipettare la miscela lentamente su e giù una volta per mescolare. Incubare a RT per 20 min.
7. Aggiungere 400 μL di mezzo privo di antibiotici integrato con DOX (concentrazione ottimale) a ciascun tubo contenente i 100 μL della miscela guida RNA/trasfezione. Pipettare delicatamente per mescolare.
Rimuovere il mezzo dalle celle Lenti-iCas9 indotte da DOX (Passaggio 3.2.). Aggiungere 500 μL di media/DOX/RNA guida/mix di trasfezione basato sulla mappa sperimentale delle placche a 24 pozzetti (Fase 3.1.). Incubare le cellule trasfettate per 48 ore a 37 °C, 5% CO₂.
Sostituire il mezzo con il mezzo fresco preferito senza DOX (per eliminare la proteina Cas9 dalle cellule). Consentire alle cellule di recuperare per altre 24-48 ore a 37 °C, 5% CO₂.
Raccogliere le cellule trasfettate (tripsinizzazione) e prepararsi per la genotipizzazione e le diluizioni unicellulari.
NOTA: Le cellule rappresentano una popolazione mista contenente cellule wild-type trasfettate geneticamente modificate e non trasfettate. Questo passaggio determinerà l'efficienza dell'editing CRISPR prima di investire tempo / risorse nell'espansione della colonia a singola cellula.
1. Lavare le cellule 1x con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Incubare le cellule in 100 μL di tripsina per 5 minuti a 37 °C, 5% CO₂ e trasferire le cellule in un tubo centrifugo pulito da 1,5 mL contenente 1 mL di mezzo.
2. Invertire per miscelare e microcentrifificare le cellule per 5 minuti a 200 × g a 20 °C. Rimuovere il mezzo e risospescere il pellet cellulare in 1 mL di PBS.
3. Microcentrifificare le celle lavate per 5 minuti a 200 × g a 20 °C. Rimuovere il PBS e risospesciare il pellet cellulare in 150 μL del mezzo preferito.
Determinare il numero di cellule per microlitro dei 150 μL di cellule risospese utilizzando un emocitometro o uno strumento automatizzato di conteggio delle cellule.
Separare i 150 μL di celle risospese in tre parti.
1. Congelare 1/3 di cellule trasfettate (50 μL) in media più il 10% di DMSO (volume finale di 150 μL) in crioviali per future espansioni/conservazione a lungo termine.
2. Trasferire 1/3 delle cellule trasfettate (50 μL) in un tubo PCR pulito da 0,2 mL per la genotipizzazione.
  1. Microcentrifugare le cellule per 5 minuti a 200 × g a 4 °C e rimuovere il mezzo.
  2. Risospendare il pellet di cella in 100 μL di PBS.
  3. Microcentrifugare le celle per 5 minuti a 200 × g a 4 °C e rimuovere il PBS. Conservare i pellet cellulari a popolazione mista a lungo termine a -80 °C.
  4. Elaborare il pellet di cella per la genotipizzazione utilizzando il flusso di lavoro di cui alla Sezione 4.
3. Preparare l'ultimo 1/3 delle cellule (50 μL) per la diluizione e la placcatura in un formato a piastre a 96 pozzetti per generare colonie monocellulari.
  1. In base al conteggio delle cellule nel passaggio 3.7., calcolare le diluizioni necessarie per ottenere 10, 5, 2 e 1 cella(e) in 100 μL di mezzo per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  2. Utilizzando un multi-pipettor a 12 canali e un serbatoio di reagente sterile, aggiungere 100 μL di cellule diluite per pozzetto a due file della piastra (24 pozzetti totali) per ogni diluizione (10, 5, 2 o 1 cella per pozzetto). Lasciare 4-6 settimane affinché le cellule crescano fino alla confluenza per l'espansione della colonia unicellulare. Osservare le cellule settimanalmente al microscopio ottico e notare se le colonie rappresentano colonie a cellula singola o multipla.
  3. Raccogliere ~10-15 colonie monocellulari per la genotipizzazione (Sezione 4). Identificare almeno tre linee di colonie monocellulari indipendenti, knockout, per ogni locus miRNA mirato. Mantenere le linee a cella singola di tipo wild come controlli.
    NOTA: Il numero di screening dipenderà dal tipo di linea cellulare e dall'impatto del fenotipo del knockout del miRNA sulla crescita/vitalità cellulare.

4. Genotipizzazione PCR di linee cellulari CRISPR utilizzando lisati cellulari grezzi

Raccogli colonie individuali unicellulari da pozzi quasi confluenti di una piastra a 96 pozzetti.
NOTA: La rimozione del mezzo/PBS descritto in questi passaggi può essere eseguita manualmente utilizzando un aspiratore a vuoto nell'armadio di biosicurezza, ma fare attenzione ad evitare la contaminazione incrociata. Utilizzare una nuova punta sterile "gialla" da 200 μL per ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti durante l'aspirazione, in cui ogni punta gialla scambiata è saldamente posizionata all'estremità di una pipetta sterile di pascolo di vetro attaccata all'aspiratore sottovuoto.
1. Lavare i pozzetti 1x con 100 μL di PBS. Aspirare il PBS.
2. Aggiungere 50 μL di tripsina e incubare per 2-5 minuti a 37 °C, 5% CO₂.
3. Pipettare delicatamente su e giù e trasferire le celle risospese in un tubo centrifugo da 1,5 ml contenente 1 mL di mezzo.
4. Capovolgere per mescolare e pellettificare delicatamente le celle in una microcentrifuga per 5 minuti a 200 × g a 20 °C.
5. Rimuovere il supporto e aggiungere 1 mL di PBS. Far scorrere delicatamente il tubo per interrompere il pellet e invertire più volte per mescolare.
6. Microcentrifuga per 5 min a 200 × g a 20 °C per pellettificare le celle.
7. Rimuovere il PBS e risospesciare il pellet in 300 μL di PBS fresco.
8. Dividere il campione da 300 μL in due parti.
  1. Trasferire 200 μL delle celle (2/3 del pellet) in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti contenente 1 mL del mezzo preferito. Una volta convalidato il genotipo, utilizzare queste cellule per espandere le linee cellulari knockout mediate da CRISPR per l'analisi funzionale.
  2. Trasferire 100 μL delle celle (1/3 del pellet) in un tubo PCR da 0,2 mL. Microcentrifuga per 5 minuti a 3.000 x g a 4 °C. Rimuovere il PBS. Conservare il pellet a -80 °C.
Preparare lisati di cellule grezze per la genotipizzazione e l'analisi di sequenza utilizzando i primer PCR progettati nella fase 1.3. Includere i lisati cellulari preparati da cellule non trasfettate in questi esperimenti da utilizzare come controlli positivi wild-type.
1. Risospesso il pellet cellulare in 4 μL di 5x tampone di DNA polimerasi (vedere la tabella dei materiali, concentrazione finale 1x), 1 μL di proteinasi K (20 ng/mL di stock), 1 μL di RNasi A (10 ng/mL di stock) e acqua priva di nucleasi fino a un volume totale di 20 μL.
2. Lisare le celle in un termociclatore utilizzando un programma PCR: 56 °C per 30 min e 96 °C per 5 min. Conservare i lisati cellulari a -20 °C.
3. Eseguire una reazione PCR utilizzando i primer PCR progettati (avanti, indietro) che fiancheggiano i siti bersaglio dell'RNA guida 5' e 3' (Tabella 1).
  NOTA: Le condizioni del tampone della DNA polimerasi e del termociclo dipenderanno dall'enzima Taq DNA polimerasi utilizzato per la reazione PCR. Questo protocollo è stato ottimizzato per una Phusion HF DNA Polimerasi.
  1. Impostare la miscela di reazione PCR su ghiaccio: 5 μL di 5x tampone di DNA polimerasi, 0,5 μL di primer PCR in avanti (10 μM di stock), 0,5 μL di primer PCR inverso (10 μM stock), 0,5 μL di 10 mM dNTPs, 0,25 μL di DNA polimerasi, 1-4 μL di lisato cellulare e acqua priva di nucleasi fino a un volume totale di 25 μL.
  2. Eseguire la reazione PCR in un termociclatore utilizzando il programma: 98 °C per 3 min e 35 cicli di 98 °C per 10 s, 62 °C per 15 s, 72 °C per 15 s e poi 72 °C per 10 min. Tenere premuto per 4 °C. Cfr. NOTA 4.2.3. sopra.
4. Caricare i prodotti PCR su un gel di agarosio all'1% per l'analisi dell'elettroforesi.
5. Estrarre il DNA dai frammenti isolati di PCR della dimensione molecolare prevista per i genotipi knockout (e wild-type). Preparare i campioni per il sequenziamento del DNA.
6. Convalidare che la reazione CRISPR abbia avuto successo ed eseguire il sequenziamento del DNA dei frammenti isolati di PCR per identificare il sito di scissione Cas9 e confermare la delezione del locus miRNA.
  1. Isolare almeno tre linee cellulari knockout indipendenti per ogni locus miRNA bersaglio di CRISPR. Mantenere linee cellulari wild-type (ed eterozigoti) da utilizzare come controlli negli studi funzionali a valle.
  2. Eseguire l'analisi qRT-PCR o northern blot per confermare che le linee cellulari knockout non esprimono miRNA maturo per il locus eliminato.
    NOTA: Il sequenziamento dell'intero genoma (WGS) è il metodo più definitivo per convalidare l'editing genetico CRISPR e l'off-targeting.
  3. Test per gli effetti di off-targeting CRISPR mediante PCR, che sono stati previsti computazionalmente (Passo 1.2.3.) 24,25,26,27.
  4. Se lo screening esteso di colonie monocellulari si traduce solo in genotipi eterozigoti, ripetere la trasfezione dell'RNA guida nelle linee eterozigoti a singola cellula.
    NOTA: L'incapacità di ottenere linee cellulari knockout omozigoti potrebbe indicare effetti letali dovuti alla perdita di miRNA o alla complessità genomica intrinseca (ad esempio, duplicazioni/fusioni cromosomiche) della linea cellulare parentale che richiedono ulteriori analisi.

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Representative Results

Questo protocollo di delezione CRISPR ad alto rendimento è stato impiegato con successo utilizzando la trasfezione di linee cellulari tumorali umane LNCaP e PC3-ML inducibili Cas9 con RNA guida oligonucleotidica sintetici mirati al cluster miR-888, che sono stati studiati nel contesto del cancro alla prostata. Il cluster miR-888 è stato inizialmente identificato in uno screening di profilazione dell'espressione come elevato nei pazienti con cancro alla prostata con malattia di alto grado rispetto ai pazienti di basso grado e non oncologici ^9,10. L'ammasso miR-888, che si estende su 35.124 bp, è costituito da sette miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) sul cromosoma umano Xq27.3 (Figura 2A). Questo locus si trova all'interno dell'HPCX1 (Cancro alla prostata ereditario, X-linked 1, Xq27-28), che è associato al cancro alla prostata ereditario 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b e -892c condividono l'omologia di sequenza e appartengono alla famiglia miR-743 conservata nei mammiferi. I membri del cluster miR-891a e miR-891b condividono solo l'omologia di sequenza tra loro e appartengono alla famiglia miR-891 specifica dei primati. L'organizzazione genomica del cluster miR-888 è conservata attraverso i primati, implicando la conservazione funzionale di un'importante rete di segnalazione³⁰.

Precedenti lavori che utilizzavano studi sperimentali di sovraespressione (imitazioni di miRNA) e di inibizione (oligonucleotidi antisenso) per valutare l'attività individuale dei membri del cluster miR-888 hanno rivelato un ruolo sovrapposto per tutti i membri del cluster miR-888 per promuovere l'invasività delle cellule tumorali della prostata utilizzando i saggi della camera Matrigel Boyden ^9,10. In particolare, miR-888 e miR-891a hanno funzionato in modo simile per indurre la crescita delle cellule della prostata (saggi WST-1), accelerare il carico tumorale della prostata negli xenotrapianti di topo e regolare bersagli comuni (ad esempio, TIMP-2)^9,10. Tuttavia, questo lavoro ha suggerito un'interazione più complessa tra i membri del cluster miR-888. Ad esempio, miR-888 e miR-891a hanno mostrato effetti sinergici nel promuovere la proliferazione delle cellule prostatiche PC3-N, mentre sia miR-890 che miR-892c hanno mostrato effetti inibitori sulla crescita utilizzando i saggi WST-1⁹. Pertanto, questo protocollo CRISPR ad alto rendimento è stato impiegato per interrogare geneticamente la rete di cluster miR-888 nel contesto del cancro alla prostata.

Il flusso di lavoro descritto per l'editing del gene CRISPR Cas9 (Figura 1) ha permesso di testare 32 reazioni uniche di trasfezione dell'RNA guida CRISPR in un singolo esperimento utilizzando un formato a 24 pozzetti. Questo protocollo ha portato all'identificazione di successo di un pannello di linee cellulari knockout del cancro alla prostata umano che trasportano delezioni per l'intero cluster miR-888, specifiche combinazioni di membri del cluster di miRNA e singoli membri di miRNA. La generazione di linee cellulari Cas9 inducibili stabili è stata stabilita per la prima volta. In breve, le cellule tumorali della prostata umane PC3-ML e LNCaP sono state infettate da un vettore di lentivirus Streptococcus pyogenes Cas9 inducibile da DOX (Lenti-iCas9; EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles; MOI 0,3) per 6 ore (LNCaP) o durante la notte (PC3-ML), a seconda della suscettibilità intrinseca della linea cellulare alla tossicità del virus.

Le linee cellulari infette sono state successivamente sottoposte a selezione di blastidine (7,5 μg/mL) e all'espansione di colonie monocellulari. Gli studi Western blot sono stati utilizzati per selezionare le linee cellulari PC3-ML e LNCaP Lenti-iCas9 a colonia singola che mostrano l'espressione di Cas9 più robusta basata su un corso temporale di induzione DOX (Figura 2A). Questo sistema lentivirale inducibile Cas9 è stato strettamente controllato e, dopo il ritiro del DOX per 120 ore, la maggior parte della proteina Cas9 è stata eliminata dalle cellule (Figura 2A). Una curva di concentrazione di DOX ha determinato che 250 ng/mL dox era la dose ottimale per indurre una robusta espressione della proteina Cas9 in queste linee cellulari della prostata Lenti-iCas9 (Figura 2B). Utilizzando uno strumento di progettazione crRNA online²³, sono stati progettati crRNA unici (due crRNA da 5' e due crRNA da 3' che fiancheggiano ogni locus knockout di miRNA pianificato per consentire quattro possibili combinazioni di RNA guida da 5' e 3') che miravano all'intera regione del cluster miR-888 da ~ 35 kb; combinazioni di cluster più piccole all'interno della famiglia miR-743 o della famiglia miR-891; così come le delezioni individuali di miRNA (miR-888, -891a) (Figura 3A). Durante l'esecuzione degli esperimenti CRISPR, le linee cellulari lenti-iCas9 del cancro alla prostata umano sono state coltivate in mezzo integrato con 250 ng / mL DOX per 48 ore per indurre l'espressione di Cas9.

Le cellule sono state poi trasfettate in un formato di piastra a 24 pozzetti con il tracrRNA universale sintetico complessato (rapporto molare 1:1) con un set unico di crRNA genomici sito-specifici da 5' e 3' (Tabella 2). DOX è stato rimosso dal terreno di coltura cellulare 48 ore dopo la trasfezione per eliminare la proteina Cas9 dalle cellule tumorali della prostata. I pozzi sono stati raccolti 48 ore dopo (96 ore dopo la trasfezione) e un terzo di ogni pellet cellulare raccolto è stato preparato per la genotipizzazione PCR utilizzando lisati cellulari grezzi (Tabella 3). L'analisi dell'elettroforesi su gel delle reazioni PCR ha indicato che la dimensione prevista del frammento di DNA che rappresenta il genotipo knockout è stata amplificata per ogni trasfezione CRISPR (Figura 3B). Il sequenziamento del DNA di questi frammenti isolati di KNOCKOUT PCR ha confermato che gli RNA guida trasfettati da 5' e 3' hanno diretto la scissione/legatura cas9 ~ 3 nt a monte dei siti PAM e ha convalidato la perdita genomica del locus miRNA mirato (esempio rappresentativo mostrato in Figura 4C). Poiché il cluster miR-888 risiede in una regione intergenica del cromosoma X (lontano da qualsiasi gene che codifica per le proteine), non è stato previsto che le linee cellulari knockout, che spesso possedevano INDL nel sito di scissione Cas9 a causa di NHEJ, avrebbero causato effetti artefattuali a valle.

Sebbene le reazioni di trasfezione CRISPR abbiano avuto successo (Figura 3B), le cellule trasfettate rappresentavano una popolazione di cellule miste di cellule trasfettate (knockout) e non trasfettate (wild-type). Questa popolazione rappresentava anche una miscela di cellule portatrici di delezioni omozigoti ed eterozigoti per il locus miRNA mirato. Le linee cellulari di carcinoma prostatico LNCaP e PC3 derivano da maschi che possiedono cariotipi anormali che includono due cromosomi X^31,32. Pertanto, una porzione di ogni reazione di trasfezione cellulare è stata diluita in serie in un formato di piastra a 96 pozzetti per ottenere linee di colonie monocellulari. Queste colonie sono state sottoposte a screening tramite PCR per selezionare linee cellulari omozigoti che mancavano di tutte le copie del locus miRNA mirato.

Questa procedura è stata importante da seguire in modo tempestivo poiché i dati passati hanno indicato un ruolo per il cluster miR-888 nel promuovere la crescita delle cellule tumorali e l'aggressività della malattia. Si prevedeva che le cellule tumorali portatrici di delezioni CRISPR per i membri del cluster miR-888 crescessero più lentamente delle cellule selvatiche. Una preoccupazione valida era che, nel tempo, i pozzi guida trasfettati con RNA, contenenti una popolazione mista di cellule knockout di miRNA e wild-type, avrebbero portato a cellule wild-type che superavano rapidamente le cellule mutanti compromesse in coltura. Questo è stato notato per verificarsi ed è stato particolarmente pronunciato negli esperimenti che utilizzano le linee cellulari PC3-ML altamente aggressive. Pertanto, le fasi che coinvolgono diluizioni seriali per generare linee di colonie monocellulari o la preparazione cellulare per il criostorage sono state eseguite entro 48-72 ore dopo aver eseguito gli esperimenti di trasfezione CRISPR per preservare le cellule knockout nei campioni di popolazione mista.

La parte più laboriosa del flusso di lavoro CRISPR per il cluster miR-888 è stata la generazione di delezioni omozigoti di miRNA di colonie monocellulari. Una sfida in questo processo era che le cellule LNCaP e PC3-ML coltivate in genere non prosperavano bene quando placcate a densità a singola cellula. Inoltre, la crescita cellulare sembrava essere fenotipicamente compromessa dalla perdita combinatoria dei membri del cluster miR-888 (e correlata all'aggressività della linea cellulare). Pertanto, per alcune delle reazioni di trasfezione mirate a determinate combinazioni di locus miRNA, sono state necessarie ulteriori diluizioni cellulari (utilizzando un formato a 96 pozzetti) per generare abbastanza linee di colonie monocellulari per la genotipizzazione. Durante lo screening dei genotipi delle colonie monocellulari mediante imaging su gel per elettroforesi, è stato utile confrontare l'intensità della banda del wildtype rispetto ai frammenti di PCR knockout e determinare se la linea cellulare fosse eterozigote (uguale intensità di banda) o rappresentasse una colonia multicellulare (intensità di banda disuguale), che avrebbe beneficiato di ulteriori cicli di diluizioni monocellulari. Se si notava che le colonie cellulari possedevano frammenti di PCR di dimensioni anormali e incoerenti con genotipi wild-type o knockout, queste linee sono state eliminate dallo studio.

Il sequenziamento del DNA di frammenti isolati di PCR coerenti per i genotipi wild-type e knockout è stato riconvalidato per ogni colonia monocellulare stabilita e confermato utilizzando metodi indipendenti (ad esempio, qRT-PCR, WGS). In termini di efficienza tipica della generazione di linee cellulari nulle omozigoti in questi esperimenti, questo variava con il locus miRNA mirato e il tipo di cellula utilizzato. Ad esempio, l'efficienza nell'ottenere linee knockout mir-891a a colonia singola utilizzando LNCaP è stata del 30%, ma è scesa a ~ 7% nelle cellule PC3-ML. Questa differenza potrebbe essere dovuta a differenze intrinseche del tipo di cellula (ad esempio, le cellule PC3-ML possiedono tassi di divisione / potenziale metastatico più elevati rispetto alle cellule LNCaP). Le differenze di efficienza crispR potrebbero anche riflettere l'impatto funzionale della perdita di miRNA (ad esempio, miR-891a promuove la crescita cellulare e l'aggressività ^9,10) e, quindi, i fenotipi knockout potrebbero essere ingranditi in linee cellulari più aggressive come PC3-ML. L'ottenimento di linee a colonia singola per delezioni di locus miRNA più grandi del cluster miR-888 ha mostrato efficienze ridotte. Non siamo stati in grado di determinare se ciò fosse dovuto all'eliminazione di regioni più grandi del DNA o sottolineasse i ruoli funzionali essenziali e sovrapposti dei membri miR-888 nelle cellule tumorali della prostata.

La descrizione dettagliata e l'analisi fenotipica delle linee cellulari a cluster miR-888 a knockout espanse in colonia singola generate da questo flusso di lavoro sono in corso e saranno pubblicate altrove. Come risultato rappresentativo delle delezioni di miRNA generate in questi studi di modifica del gene CRISPR, vengono mostrati i risultati per le cellule tumorali della prostata LNCaP portatrici di una delezione individuale mir-891a. Le colonie monocellulari sono state genotipizzate mediante PCR e verificate la sequenza (Figura 4A-C). Le linee cellulari che mostravano frammenti di PCR di dimensioni anomale non sono state analizzate (ad esempio, il clone L14 H7 mostrato nella Figura 4D). Una volta ottenute colonie monocellulari knockout e wild-type per il locus mir-891a, sono stati eseguiti studi funzionali. Lavori precedenti hanno dimostrato che la sovraespressione di miR-891a (vettore lentivirale miRNA mimico) induce la crescita delle cellule della prostata⁹ e, pertanto, è stato previsto che la perdita di miR-891a avrebbe mostrato effetti reciproci. I saggi di proliferazione WST-1 che confrontano il knockout mir-891a e le cellule wild-type hanno confermato questa ipotesi, e la perdita di miR-891a ha portato a una crescita rallentata (Figura 4D, E).

Figura 1: Flusso di lavoro di modifica del gene CRISPR per generare delezioni di cluster di miRNA. (A) L'RNA guida è costituito dagli oligonucleotidi sintetici crRNA e tracrRNA ricotti (rapporto molare misto 1:1). L'oligonucleotide crRNA è progettato per contenere una sequenza guida 5'-terminale 20 nt (gialla) complementare al sito del DNA genomico mirato ed è seguito da una sequenza di ripetizione di Streptococcus pyogenes invariante da 22 nt (verde) che si accoppia con l'oligonucleotide tracrRNA. Le frecce rosse indicano i siti di scissione del DNA a doppio filamento dell'enzima Cas9 in genere situati a 3 nt a monte del PAM. (B) Questo flusso di lavoro sperimentale raffigura un singolo pozzo di una piastra a 24 pozzetti. Le cellule infettate da un vettore di lentivirus Cas9 inducibile da DOX (Lenti-iCas9, MOI 0.3) vengono coltivate in mezzo con DOX per 48 ore per indurre l'espressione della proteina Cas9. Due RNA guida sintetici (rapporto molare misto 1:1 di crRNA::tracrRNA) vengono trasfettati in cellule indotte da Cas9. Gli RNA guida accompagnano Cas9 ai siti del DNA genomico (5' e 3') che fiancheggiano la regione del cluster di miRNA bersaglio della rimozione. Le cellule vengono preparate 48 ore dopo la trasfezione per la diluizione utilizzando un formato a 96 pozzetti per generare colonie monocellulari per la genotipizzazione PCR e le analisi fenotipiche a valle. Abbreviazioni: CRISPR = ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate; miRNA = microRNA; crRNA = RNA CRISPR; tracrRNA = RNA CRISPR trans-attivante; nt = nucleotide; Cas9 = endonucleasi associata a CRISPR; PAM = motivo adiacente protospacer; DOX = doxiciclina; MOI = molteplicità di infezione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Linee cellulari tumorali portatrici di una cassetta lentivirale Cas9 inducibile da doxiciclina che mostra una stretta regolazione della proteina Cas9. (A) L'analisi Western blot ha mostrato che le linee cellulari PC3-ML del cancro alla prostata umano infettate dal vettore Lenti-iCas9 (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) e cresciute per 48 ore in mezzo contenente 250 ng / mL DOX esprimevano livelli ottimali di proteina Cas9. L'espressione cas9 è stata normalizzata all'espressione GAPDH. (B) Le cellule PC3-ML cresciute in mezzo con 250 ng/mL DOX per 48 ore e 120 ore (+DOX) hanno mostrato una robusta espressione della proteina Cas9. La rimozione di DOX dal supporto (-DOX) per 120 ore (120 ore post) ha portato alla clearance della proteina Cas9, misurata dall'analisi western blot. Risultati simili sono stati ottenuti durante la generazione della linea cellulare LNCaP Lenti-iCas9 (non mostrata). Abbreviazioni: CRISPR = ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate; Cas9 = endonucleasi associata a CRISPR; DOX = doxiciclina; MOI = molteplicità di infezione; GAPDH = gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Progetto sperimentale CRISPR ad alto rendimento per generare più combinazioni di delezione di cluster miR-888 in un singolo esperimento. (A) Diagramma del cluster miR-888 situato sul cromosoma umano Xq27.3, che indica i membri della famiglia miR-743 conservati nei mammiferi mir-892c, -890, -888, -892a e -892b (scatole blu) e i membri della famiglia miR-891 specifici per i primati miR-891a e -891b (scatole marrone). Gli oligonucleotidi sintetici unici del crRNA (frecce verdi) sono stati utilizzati per generare le combinazioni di knockout del cluster miR-888. I primer PCR avanti e indietro (piccoli rettangoli rossi) sono stati progettati per genotipizzare le cellule e lo screening per i knockout. (B) Questo risultato rappresentativo mostra 25 reazioni CRISPR in cellule PC3-ML trasfettate (Lenti-iCas9) che hanno preso di mira una serie di combinazioni di knockout di cluster miR-888 in un singolo esperimento. Ogni pozzo trasfettato di una placca a 24 pozzetti conteneva due gRNA unici che fiancheggiavano i lati 5' e 3' del locus genomico miRNA mirato (Δ) (come elencato nella Tabella 2). I lisati di cellule grezze sono stati preparati per ogni reazione CRISPR e la PCR genotipizzata. I frammenti isolati di PCR che migravano alle dimensioni di knockout previste mediante elettroforesi su gel sono stati sequenziati e convalidati per la scissione cas9 mirata e la rimozione del locus miRNA. Le dimensioni bp del frammento WT PCR previste sono indicate tra parentesi e le dimensioni desiderate dei frammenti CRISPR KO PCR sono mostrate nella parte inferiore del gel. Abbreviazioni: CRISPR = ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate; Cas9 = endonucleasi associata a CRISPR; gRNA = RNA guida; DOX = doxiciclina; bp = coppia di basi; WT = wild-type; KO = knockout. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cellule tumorali della prostata cancellate per mir-891a utilizzando l'editing genetico CRISPR che mostra una proliferazione soppressa. (A) Progettazione di primer PCR (viola) e due RNA guida da 5' e due 3' (arancione) che prendono di mira sequenze genomiche che fiancheggiano il gene mir-891a (verde). (B) La genotipizzazione PCR di cellule LNCaP trasfettate con RNA guida 5' e 3' indicati ha confermato che sono state ottenute delezioni di Δmir-891a per tutte e quattro le combinazioni di RNA guida. I lisati cellulari sono stati prodotti da popolazioni di cellule miste 48 ore dopo la trasfezione. (C) I frammenti di PCR sono stati sequenziati e convalidati. Un esempio rappresentativo mostra la sequenza di DNA di cellule trasfettate trattate con RNA guida 5A (891a) e 3B (891a), con conseguente delezione prevista di Cas9 (3 nt a monte del sito PAM) e CRISPR Δmir-891a. (D) Sono state ottenute colonie monocellulari e sono state genotipizzate pcr. Il clone L14 G9 è stato sequenzializzato come KO e il clone L14 G9 come WT per il gene mir-891a . (E) miR-891a ha precedentemente dimostrato di indurre la crescita delle cellule tumorali della prostata e, pertanto, si prevedeva che la perdita di miR-891a avesse il fenotipo reciproco. I saggi WST-1 delle cellule tumorali della prostata cancellate per mir-891a (L14 G9 [KO], blu) hanno mostrato una proliferazione soppressa rispetto alle cellule WT (L14 G9 [WT], rosso). Abbreviazioni: CRISPR = ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate; Cas9 = endonucleasi associata a CRISPR; WT = wild-type; KO = knockout; WST-1 = sale tetrazolico solubile in acqua-1. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La reazione PCR è impostata su ghiaccio.
Componente	Reazione 25 μL	Concentrazione finale
5x Tampone dna polimerasi	5 μL	1x
Primer PCR in avanti (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
Primer PCR inversa (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
10 mM dNTPs	0,5 μL	200 μM
DNA polimerasi (2 U/μL)	0,25 μL	0,125 U/ 25 μL
Lisato di cellule grezze	1 - 4 μL	variabile
Acqua senza nucleasi	fino a 25 μL
Condizioni del termociclatore per la reazione PCR:
Passo	Temperatura	Ore
Denaturazione iniziale	98 °C	3 minuti
	98 °C	10 s
35 cicli	62 °C	15 s
	72 °C	15 s
Estensione finale	72 °C	10 minuti
Tenere	4 °C

Tabella 1: Condizioni di reazione PCR per la genotipizzazione del lisato grezzo. Abbreviazione: dNTP = deossinucleotidi.

Sito di eliminazione mirato a CRISPR	Combinazione di RNA guida	Wild-type (bp)	Knockout (bp)	Coppie di primer PCR
cluster ∆Full	5A(891a)+3A(892c) 5B (891a) + 3A (892c) 5A(891a)+3B(892c) 5B(891a)+3B(892c)	35,664	389 496 378 485	891a FWD 892c REV
∆892C/890/888	5A'(888)+3A(892c) 5B'(888)+3A(892c) 5A'(888)+3B(892c) 5B'(888)+3B(892c)	2,739	478 487 467 476	888 FWD 892c REV
∆892C/890	3A'(888)+3A(892c) 3B'(888)+3A(892c) 3A'(888)+3B(892c) 3B'(888)+3B(892c)	2,739	710 754 699 743	888 FWD 892c REV
∆892b/892a	5A'(888)+5A(892b) 5B'(888)+5A(892b) 5A'(888)+5B(892b) 5B'(888)+5B(892b)	2,938	554 547 573 566	FWD 892b 888 GIRI
∆892b/892a/888	5A(892b)+3A'(888) 5A(892b)+3B'(888) 5B(892b)+3A'(888)	2,938	322 278 341	FWD 892b 888 GIRI
famiglia ∆743	5A (892b) + 3A (892c) 5B (892b) + 3A (892c) 5A (892b) + 3B (892c) 5B (892b) + 3B (892c)	5,015	370 389 359 378	FWD 892b 892c REV
famiglia ∆891	5A(891a)+3A(891b) 5B(891a)+3A(891b)	27,294	330 270	891a FWD 891b REV
∆891a	5A(891a)+3A(891a) 5A(891a)+3B(891a) 5B(891a)+3A(891a) 5B(891a)+3B(891a)	554	333 273 454 394	891a FWD 891a REV

Tabella 2: RNA guida CRISPR utilizzati per generare combinazioni knockout cluster miR-888. Abbreviazioni: CRISPR = ripetizioni palindrome brevi raggruppate regolarmente intervallate; bp = coppia di basi; FWD = avanti; REV = inverso.

Abbecedario	Sequenza	Tm (°C)
888 FWD	AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG	52.2
888 GIRI	CTGGATGATGGCCAAGACAAG	55.9
891a FWD	TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA	53.9
891a REV	TTCATCTTGCTGCTACCTGTC	54.8
891b REV	TCATCTTGCTGCTATACGTCCT	55.6
FWD 892b	GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA	53.5
892b REV	CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC	53.5
FWD 892c	TGTGAGCACCTACAGGTTAG	53.9
892c REV	CACTCTCACTTGGCTTCATG	53.5

Tabella 3: Primer PCR utilizzati per la genotipizzazione. Abbreviazioni: FWD = forward; REV = inverso; Tm = temperatura di fusione.

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Discussion

Questa procedura di modifica del gene CRISPR consente allo sperimentatore di generare rapidamente un intero pannello di linee cellulari che trasportano combinazioni uniche di delezione di cluster di miRNA. La trasfezione di RNA guida sintetici composti da crRNA genomici sito-specifici da 5' e 3' ricotti con tracrRNA sintetico (rapporto molare 1:1) in questo protocollo evita la sottoclonazione del vettore plasmidico dispendioso in termini di tempo e consente un design sperimentale più flessibile e ad alto rendimento utilizzando un formato a 24 pozzetti. La generazione di linee cellulari che trasportano una cassetta lentivirale Cas9 inducibile da DOX consente un'espressione Cas9 strettamente regolata e robusta durante la trasfezione cellulare di RNA guida e una rapida clearance di questa proteina batterica al ritiro di DOX dal terreno di coltura nelle fasi successive. Questa procedura si basa anche sui lisati cellulari grezzi per la genotipizzazione PCR, che richiede materiale cellulare minimo per l'analisi ed evita l'uso di metodi di purificazione del DNA della colonna di silice costosi e laboriosi o la necessità di misurare le concentrazioni di acido nucleico utilizzando uno spettrofotometro, semplificando ulteriormente i metodi per lo sperimentatore.

In effetti, i risultati rappresentativi condivisi qui hanno mostrato un adattamento di successo di questo metodo per trasfettare le linee cellulari del cancro alla prostata umano con 32 combinazioni uniche di RNA guida in un singolo esperimento e generare più linee di knockout di colonie monocellulari che trasportano delezioni per l'intera regione del cluster miR-888 da ~ 35 kb; combinazioni di delezione più piccole per i membri del cluster miR-888 appartenenti alle famiglie miR-743 e miR-891a; così come delezioni per singoli membri di miRNA all'interno del cluster miR-888. Questo flusso di lavoro ha generato una preziosa risorsa di linea cellulare per iniziare a sezionare molecolarmente la rete di cluster miR-888 nel contesto della malattia della prostata umana e determinare come i membri del cluster miR-888 si sovrappongono funzionalmente o interagiscono sinergicamente / antagonisticamente tra loro per regolare la crescita del tumore alla prostata, l'aggressività del cancro e la resistenza ai farmaci (da pubblicare altrove). Questi studi saranno cruciali in quanto questa ricerca si muove verso applicazioni diagnostiche e terapeutiche per il trattamento di pazienti con forme avanzate e metastatiche di cancro alla prostata.

Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo di editing genetico CRISPR ad alto rendimento che i ricercatori dovrebbero considerare attentamente quando adattano questo metodo per studiare ulteriori reti di cluster di miRNA in altri contesti di malattia. In primo luogo, il passo più importante in questo processo è l'attenta progettazione degli RNA guida che fiancheggiano il cluster di miRNA per la rimozione medicata con CRISPR, nonché ulteriori RNA guida per eliminare singoli miRNA o combinazioni di membri del cluster di miRNA. Lo sperimentatore deve prestare particolare attenzione a non interrompere i geni circostanti o gli elementi regolatori, specialmente se il cluster di miRNA risiede all'interno di un introne genico o è situato in antisenso a un altro gene. Ci sono risorse di previsione off-targeting CRISPR 24,25,26,27 disponibili che possono aiutare il ricercatore nella scelta degli oligonucleotidi crRNA più discriminanti da sintetizzare. Questo flusso di lavoro descrive la progettazione di due crRNA da 5' e due 3' che fiancheggiano ciascun locus miRNA mirato che consentono di testare quattro combinazioni uniche di RNA guida nella fase di trasfezione CRISPR e aumentano le possibilità di generare la linea cellulare knockout desiderata. Tuttavia, lo sperimentatore ha bisogno solo di una di queste combinazioni di RNA guida per lavorare con successo per interrompere un particolare locus del gene miRNA.

In secondo luogo, lo sperimentatore dovrebbe decidere il metodo più appropriato per consegnare Cas9 alle cellule per l'editing del gene CRISPR. Questa procedura utilizzava il sistema di espressione lentivirale Cas9 inducibile da DOX, ma approcci alternativi per la produzione di proteine Cas9 (ad esempio, proteina ricombinante Cas9, consegna di mRNA Cas9 o l'uso di sistemi vettoriali plasmidici convenzionali di espressione Cas9) possono essere facilmente adattati per questo protocollo. Ad esempio, considerazioni sperimentali potrebbero dettare l'uso dell'espressione transitoria di Cas9 rispetto alla generazione di linee cellulari di espressione lentivirale stabili, il promotore utilizzato per guidare Cas9 (onnipresente, specifico per tipo cellulare, inducibile) e l'incorporazione di sistemi di selezione positiva / negativa per garantire la consegna del vettore di espressione Cas9 alle cellule di interesse (cioè resistenza agli antibiotici).

In terzo luogo, è importante genotipizzare rapidamente le cellule trasfettate a popolazione mista entro 48-72 ore dopo la consegna dell'RNA guida nel caso in cui la perdita del cluster di miRNA possa avere un impatto negativo sulla vitalità / crescita delle cellule. Ad esempio, quando si eliminano i fattori che promuovono il tumore come miR-891a nelle linee cellulari del cancro alla prostata, è stato notato che queste cellule knockout mir-891a sono cresciute più lentamente delle cellule non trattate e, successivamente, le cellule wild-type hanno rapidamente superato la popolazione cellulare. Infine, è fondamentale integrare ulteriori metodi di convalida per garantire la rimozione del locus miRNA durante il processo di screening genotipico, in particolare per le delezioni genomiche più grandi. Queste misure includono l'utilizzo di controlli di genotipizzazione PCR interni che vengono rilevati solo se è presente l'allele wild-type e l'esecuzione di analisi qRT-PCR su colonie monocellulari per garantire che le linee cellulari knockout non esprimano i miRNA mirati. Tutte queste considerazioni garantiranno risultati positivi per lo sperimentatore.

Ci sono state alcune ovvie limitazioni incontrate quando si incorpora questa tecnica CRISPR nel laboratorio. Ad esempio, nonostante la natura ad alto rendimento delle fasi di trasfezione dell'RNA guida descritte in questo protocollo per generare rapidamente più combinazioni di delezione di cluster di miRNA, la fase limitante la velocità di questa procedura è stata lo screening del genotipo e l'espansione delle linee cellulari a colonia singola per ogni delezione di miRNA mediata da CRISPR. L'incorporazione di strategie di selezione positiva in questo protocollo sarebbe un vantaggio; tuttavia, ci vorrebbero ancora ~ 3-4 settimane per espandere una linea da una colonia monocellulare cresciuta in un formato a 96 pozzetti. In effetti, la raccolta di almeno tre linee cellulari indipendenti a singola colonia per knockout del locus miRNA più cellule wild-type contribuirà a garantire che i fenotipi analizzati non siano dovuti a effetti artefatti / off-targeting, ma questo si aggiunge ancora una volta alla natura dispendiosa in termini di tempo di questa procedura. Lo sperimentatore potrebbe anche aver bisogno di eseguire più cicli di editing del gene CRISPR per ottenere linee cellulari nulle omozigoti. Ciò è particolarmente pronunciato negli studi che utilizzano linee cellulari tumorali immortalizzate consolidate che spesso possiedono un complesso panorama genomico di riarrangiamenti cromosomici e cariotipi anormali.

Ad esempio, questo studio rappresentativo ha utilizzato linee cellulari di carcinoma prostatico umano derivate da LNCaP e PC3 per generare delezioni per il cluster miR-888, mappando sul cromosoma X. Era importante riconoscere che queste linee cellulari di cancro alla prostata derivate da maschi hanno cariotipi anormali e possedevano due cromosomi X (e le cellule PC3 hanno anche traslocazioni parziali del cromosoma X su altri autosomi)^31,32. Nonostante queste condizioni, l'editing genetico CRISPR era abbastanza robusto da generare knockout omozigoti usando queste linee cellulari della prostata. Tuttavia, ci possono essere casi in cui la linea cellulare di un investigatore con un cariotipo anormale (ad esempio, inserzioni, delezioni, inversioni, duplicazioni) potrebbe ospitare "mutazioni invisibili" che oscureranno il rilevamento di seconde (o più) copie del locus del gene mirato a causa di elementi mancanti necessari per il rilevamento di successo utilizzando i primer / RNA guida PCR progettati. Ciò sottolinea l'importanza di verificare le linee cellulari CRISPR nulle omozigoti utilizzando metodi indipendenti (ad esempio, qRT-PCR, northern blot, WGS) prima di eseguire saggi funzionali. Infine, questo protocollo è progettato per eliminare solo le combinazioni di cluster di miRNA che mappano adiacenti l'una all'altra. Se un investigatore desidera eliminare i miRNA che sono separati tra altri geni miRNA, saranno necessari più cicli di trasfezioni CRISPR, che richiedono un'attenta genotipizzazione e convalida.

Nonostante queste sfide, la capacità di generare rapidamente un pannello completo di combinazioni di delezione di miRNA per un dato cluster di miRNA utilizzando questo protocollo descritto è un enorme vantaggio rispetto ai metodi esistenti nella cassetta degli attrezzi di ricerca dei miRNA. Gli studi di sovraespressione che utilizzano miRNA mimici per caratterizzare la funzione dell'RNA non codificante possono portare a artefatti non intenzionali o tossicità cellulari. Allo stesso modo, l'uso di inibitori oligonucleotidici antisenso antimir per determinare i fenotipi di perdita di funzione può essere difficile poiché gli antimir di solito provocano un knockdown e non una completa eliminazione dell'attività dei miRNA. Il tentativo di utilizzare combinazioni di imitazioni di miRNA o antimir di miRNA per chiarire la segnalazione della rete di cluster di miRNA si è dimostrato laborioso e difficile da interpretare. Pertanto, l'incorporazione della tecnologia di editing genetico CRISPR per interrogare il modo in cui i membri dei miRNA interagiscono all'interno di un determinato cluster genomico non codificante consentirà ai ricercatori di acquisire una comprensione più chiara di come gli RNA non codificanti influenzano i percorsi di segnalazione delle malattie e promette di avere enormi implicazioni nel campo diagnostico e della scoperta di farmaci.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgments

Le linee cellulari PC3-ML sono state gentilmente fornite da Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey ha aiutato nella genotipizzazione PCR. Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione della Fondazione Breedan Adams, un Fondo di ricerca traslazionale Ryan e una sovvenzione del Commonwealth Health Research Board (CHRB-274-11-20) ad AE-K.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 10⁷ TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system

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Biology

Strumento di editing genetico CRISPR per l'analisi della rete di cluster microRNA

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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