Biology

Инструмент редактирования генов CRISPR для анализа сети кластеров микроРНК

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704

Charlotte Chambers¹, Linh Quan¹, Grace Yi¹, Aurora Esquela-Kerscher¹

¹Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Этот протокол описывает высокопроизводительный процесс редактирования генов кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) для анализа сети кластеров микроРНК, который позволяет быстро генерировать панель генетически модифицированных клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции членов кластера miRNA размером до 35 кб в рамках одного эксперимента.

Abstract

МикроРНК (миРНК) стали важными клеточными регуляторами (супрессоры опухолей, проонкогенные факторы) рака и метастазирования. Большинство опубликованных исследований сосредоточены на одной миРНК при характеристике роли малых РНК в раке. Тем не менее, ~ 30% генов миРНК человека организованы в кластеризованные единицы, которые часто совместно экспрессируются, что указывает на сложную и скоординированную систему некодирующей регуляции РНК. Необходимо более четкое представление о том, как кластерные сети миРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности рака и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить некодирующие малые РНК в клинику.

Использование высокопроизводительной кластеризованной регулярно интерраспространяемой процедуры редактирования генов, опосредованной короткими палиндромными повторами (CRISPR), было использовано для изучения онкогенной роли геномного кластера из семи генов миРНК, расположенного в локусе длиной ~ 35 000 bp в контексте рака предстательной железы. Для этого подхода линии раковых клеток человека были инфицированы лентивирусным вектором для доксициклина (DOX)-индуцируемого нуклеазы Cas9, выращенной в DOX-содержащей среде в течение 48 ч. Впоследствии клетки были совместно трансфектированы синтетической трансактивирующей CRISPR РНК (tracrRNA), комплексованной с геномными сайт-специфическими олигонуклеотидами CRISPR РНК (crRNA), чтобы обеспечить быструю генерацию линий раковых клеток, несущих всю кластерную делецию miRNA и индивидуальные или комбинированные кластерные делеции генов miRNA в рамках одного эксперимента.

Преимуществами этой высокопроизводительной системы редактирования генов являются способность избежать трудоемкого субклонирования векторов ДНК, гибкость в трансфекции клеток с уникальными комбинациями направляющих РНК в формате 24 лунки и более дешевое генотипирование ПЦР с использованием сырых лизатов клеток. Исследования, использующие этот оптимизированный подход, обещают выявить функциональные избыточности и синергетические / антагонистические взаимодействия между членами кластера миРНК, что поможет охарактеризовать сложные небольшие некодирующие сети РНК, участвующие в заболеваниях человека, и лучше информировать будущий терапевтический дизайн.

Introduction

Необходимы более совершенные исследовательские инструменты для изучения вклада некодирующих РНК в заболевания человека. Дисрегуляция миРНК часто наблюдается при расстройствах человека, таких как рак, при сравнении профилей экспрессии этих небольших некодирующих РНК в тканях и жидкостях организма (например, крови, моче) больных раком с нераковыми, здоровыми людьми, использующими микрочипы, количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) и технологии глубокого секвенирования следующего поколения ^1,2 . Недавняя работа охарактеризовала большое подмножество этих миРНК как супрессор опухолей, онкогенные и метастазирующие факторы, которые контролируют образование опухоли, прогрессирование заболевания и лекарственную устойчивость. Экспериментальная сверхэкспрессия и/или понижающая регуляция/потеря миРНК приводят к функциональным и плейотропным последствиям в клетке, отражая широкий спектр связанных с раком действий, которые эти некодирующие РНК координируют - рост, апоптоз, дифференцировка, ремоделирование хроматина, ангиогенез, переходы эпителия в мезенхимальные (ЭМТ) и МЕТ, метаболизм и иммунный ответ³.

МиРНК кодируются как отдельные гены или находятся в геномных кластерах, которые транскрибируются в ядре и интенсивно обрабатываются перед генерацией биологически зрелых, одноцепочечных ~ 22 нуклеотидных (nt) видов миРНК, локализованных в цитоплазме⁴. Эти небольшие РНК оказывают свое действие посттранскрипционно и действуют как отрицательные регуляторы генов, которые связываются с мишенями матричной РНК (мРНК) специфическим для последовательности способом, чтобы привести каталитический РНК-индуцированный комплекс глушения (RISC) к сайту мРНК, что приводит к деградации мРНК и / или блоку в трансляции белка. МиРНК являются чрезвычайно распространенным классом некодирующих РНК в системах животных, и в геноме человека существует 2 654 зрелых миРНК (выпуск miRBase 22.1)⁵. МиРНК обычно ассоциируются с неполной комплементарностью к их мишеням мРНК⁴. Таким образом, одна миРНК может регулировать от десятков до сотен различных мишеней мРНК и функционально воздействовать на большой спектр биологических путей. Чтобы усложнить механизмы на основе миРНК, одна мРНК может регулироваться несколькими различными миРНК. Таким образом, сложно исследовать, как дисрегуляция миРНК нарушает гомеостатический баланс организма и приводит к злокачественным новообразованиям человека.

Большинство опубликованных исследований были сосредоточены на одной миРНК при характеристике их роли в событиях заболевания. Тем не менее, ~ 30% генов миРНК человека организованы в кластеризованные единицы (обычно ~ 10 килобаз [kb]), которые часто транскрибируются в одной и той же ориентации и совместно экспрессируются, что указывает на скоординированную и сложную систему некодирующей регуляции РНК⁶. Крупнейшим полицистронным кластером миРНК человека является кластер 14q32, состоящий из 54 предшественников миРНК. Одной из наиболее хорошо изученных кластеризованных единиц миРНК, связанных с раком человека, является полицистронный кластер miR-17-92, состоящий из miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 и miR-92-1, находящихся в интроне 3 некодирующей РНК c13orf25. Кластер miR-17-92 часто усиливается при злокачественных новообразованиях кроветворения и чрезмерно экспрессируется в солидных опухолях и установил онкогенную роль в содействии прогрессированию клеточного цикла, апоптозу и ангиогенезу⁷. Кроме того, опухолевый супрессивный кластер miR-15a и miR-16-1, расположенный в интроне некодирующего гена Leu2, часто удаляется при лейкемиях и подавляется в большом диапазоне раковых заболеваний, функционируя для блокирования роста опухоли путем нацеливания на антиапоптотический ген BCL2 и дополнительные гены прогрессирования клеточного цикла⁸. Кластер miR-888 повышен у пациентов с раком предстательной железы высокой степени и состоит из семи генов миРНК (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b и -891a), расположенных на хромосоме человека Xq27.3 ^9,10.

Кластер miR-888 картирует локус HPCX1 (наследственный рак предстательной железы, X-linked 1), охватывающий Xq27-2, который был идентифицирован путем анализа связей наследственного рака предстательной железы семейства родословных ^{11,12,13,14,15,29}. Функциональная характеристика отдельных членов кластеризации miR-888 с использованием обычных инструментов дезэкспрессии миРНК - имитаций миРНК и антисмысловых ингибиторов - показала, что эти миРНК играют перекрывающиеся роли в регуляции роста опухоли предстательной железы и инвазии ^9,10. Однако эти экспериментальные методы не позволяют легко изучить, как несколько кластеризованных членов miR-888 действуют синергетически или антагонистично в некодирующей сети РНК для контроля гомеостаза тканей и прогрессирования рака. Этот описанный оптимизированный протокол с использованием высокопроизводительной технологии редактирования генов CRISPR модифицирован для молекулярного рассечения кластеров миРНК, связанных с раком человека (например, кластер miR-888), чтобы преодолеть этот пробел в знаниях.

Бактериальные гены CRISPR и CRISPR-ассоциированные (cas) опосредуют адаптивный иммунитет против бактериофагов¹⁶. Открытие этой древней системы наблюдения за прокариотами было быстро адаптировано в качестве эффективного научного инструмента для легкого нацеливания на любой желаемый геномный локус и изменения последовательности ДНК в большом диапазоне систем животных и типов клеток как in vitro, так и in vivo^16,17. Этот метод имеет большие перспективы в качестве эффективного метода опроса сетей миРНК в контексте заболеваний человека. С этой целью этот высокопроизводительный протокол редактирования генов CRISPR для изучения кластера miR-888, охватывающий ~ 35 КБ на хромосоме X человека в увековеченных клеточных линиях рака предстательной железы человека (LNCaP, PC3-ML), построен для опроса о том, как члены кластера координируют пути прогрессирования рака. Этот подход может быть применен к характеристике любого кластера миРНК и позволяет исследователям быстро генерировать клеточные линии человека, несущие всю делецию кластера миРНК и индивидуальные и комбинированные делеции кластера генов миРНК в рамках одного эксперимента.

В этой процедуре устанавливаются стабильные клеточные линии, несущие доксициклин (DOX)-индуцируемую лентивирусную систему экспрессии, которая позволяет исследователю контролировать экспрессию гена Streptococcus pyogenes CRISPR-ассоциированной эндонуклеазы Cas9 (csn1) через конститутивный DOX-индуцируемый промотор TRE3G. Двудольная система Tet-On 3G включает в себя конститутивный промотор фактора удлинения человека 1 альфа (hEF1alpha) для управления транскрипцией как гена Tet-On 3G, так и гена резистентности к бластицидину (Blast^R) в качестве бицистронного транскрипта. Белок трансактиватора Tet-On 3G связывается с промотором TRE3G только в присутствии DOX, что приводит к надежной транскрипции Cas9. При отсутствии DOX отсутствует или очень минимальная базальная экспрессия Cas9. Таким образом, исследователь может индуцировать высокую выработку белка Cas9 в клетках, выращенных в средах, дополненных DOX, на этапах редактирования гена CRISPR и контролировать быстрый клиренс белка CAS9 при отмене DOX.

Этот протокол также описывает разработку синтетических олигонуклеотидов CRISPR РНК (crRNA), нацеленных на области, фланкирующие весь кластер miRNA, отдельные области шпильки miRNA (premiRNA) и / или подмножества генов miRNA в кластере. Каждая разработанная цРНК содержит уникальную 5'-концевую 20-нтовую направляющую последовательность (комплементарную геномной последовательности, представляющую интерес для нацеливания), за которой следует инвариантная повторная последовательность 22 nt S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), которая позволяет спаривать основания с универсальными трансактивирующими CRISPR РНК (тракрРНК) олигонуклеотидами¹⁸. Вместе отожженные crRNA и tracrRNA (смешанное соотношение 1:1) функционируют в качестве направляющей РНК для этого протокола (рисунок 1A). В каждом эксперименте две синтетические направляющие РНК трансфектируются в клетки, индуцированные DOX, чтобы связать и сопровождать бактериальный белок Cas9 к геномным участкам ДНК (5' и 3'), фланкирующим область кластера миРНК, предназначенную для удаления (рисунок 1B).

Протоспейсерная смежная последовательность мотивов (PAM) (5'-NGG-3' для дикого типа S. pyogenes Cas9) должна присутствовать в геноме клетки и располагаться непосредственно рядом с последовательностью ДНК 20 нт, на которую нацелена направляющая РНК¹⁷. Последовательность PAM служит связующим сигналом и позиционирует каталитическую область фермента эндонуклеазы Cas9 на целевом геномном участке ДНК, что впоследствии приводит к направленному, двухцепочечному (ds) расщеплению ДНК, расположенному ~ 3 nt вверх по течению от PAM. Механизм репарации ДНК клетки восстанавливает расщепленные концы ДНК, что может привести к идеальной перевязке, но часто происходит негомологичное соединение конца (NHEJ), вызывая небольшие вставки или делеции (indels) в месте ремонта. Поскольку миРНК являются некодирующими генами, часто расположенными в межгенных и интронных областях, эти индели несут низкий риск создания нежелательных бессмысленных мутаций.

Используя синтетические олигонуклеотиды РНК (отожженные crRNA и tracrRNA, молярное соотношение 1:1), кодирующие комплекс направляющей РНК в этих экспериментах, эта стратегия нокаута генов позволяет избежать трудоемкого субклонирования векторов ДНК и обеспечивает огромную гибкость в трансфекции уникальных комбинаций направляющих РНК в клетки в формате 24 лунки. Подготовка сырых клеточных лизатов для скрининга генотипа ПЦР также позволяет избежать дорогостоящих и трудоемких методов очистки ДНК, обеспечивая при этом оптимизированную генерацию одноколониальных клеточных линий и фенотипический анализ. Действительно, этот высокопроизводительный протокол редактирования генов CRISPR был успешно использован для трансфекции культивируемых клеточных линий рака предстательной железы (LNCaP, PC3-ML) с 32 уникальными комбинациями направляющих РНК в одном эксперименте и генерации нокаутирующих линий, несущих делеции для всей кластерной области ~ 35 кб miR-888; меньшие комбинации делеций для членов кластера miR-888, принадлежащих к семействам miR-743 и miR-891a; а также делеции для отдельных членов miRNA в кластере miR-888. Подобные исследования обеспечат более четкое представление о том, как кластерные миРНК функционируют совместно для регулирования роста опухоли, агрессивности и лекарственной устойчивости, прежде чем переводить миРНК в клинику в качестве терапевтических и диагностических инструментов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка к редактированию генов CRISPR и руководство проектированием РНК для генерации нокаутирующих клеточных линий кластера миРНК

Создайте файл ДНК, содержащий полную геномную последовательность интересующей кластерной области миРНК (интергенной, интронной) и, по меньшей мере, 1 КБ окружающих геномных областей, используя программу¹⁹ для аннотирования последовательностей ДНК.
1. Используйте инструмент редактирования признаков в созданном файле ДНК для маркировки целевого локуса кластера миРНК (интергенного, интронного) и каждой отдельной последовательности шпильки миРНК, принадлежащей кластеру миРНК, а также для обозначения других близлежащих кодирующих и некодирующих генов и/или регуляторных признаков 5,20,21,22.
2. Убедитесь, что области миРНК, предназначенные для делеции, непреднамеренно не нарушают близлежащие гены, кодирующие белок, некодирующие гены или важные регуляторные элементы ДНК.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Рассмотрим геномную сложность (например, дупликации/слияния хромосом) клеточной линии, используемой в этом протоколе.
Разработка синтетических crРНК, нацеленных на 20 nt геномной последовательности ДНК, фланкирующей весь кластер miRNA, отдельные области miRNA шпильки (pre-miRNA) и / или подмножеств генов miRNA в кластере, используя биоинформационный инструмент программного обеспечения для проектирования направляющей РНК (например,²³). Убедитесь, что соответствующий фермент Cas9 отмечен в инструменте проектирования направляющей РНК (т.е. S. pyogenes Cas9).
ПРИМЕЧАНИЕ: Синтезированная crRNA будет содержать эту уникальную 5'-концевую 20 nt направляющую последовательность (комплементарную к мишени ДНК), за которой следует инвариант 22 nt S. pyogenes повторная последовательность для обеспечения спаривания оснований с синтезированным универсальным олигонуклеотидом тракрРНК. Отожженные вместе, они будут функционировать как направляющая РНК в этом протоколе.
1. Ссылаясь на созданный файл ДНК (шаг 1.1.), введите ~150 нт последовательности ДНК, находящейся непосредственно вверх по течению (5') или вниз по течению (3') от заколки/локуса кластера миРНК, предназначенного для делеции, в биоинформационное руководство по проектированию РНК программного инструмента²³.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент проектирования будет идентифицировать уникальные 20-нтовые последовательности для конструкции олигонуклеотидов crRNA, которые находятся непосредственно рядом с последовательностью PAM (на нецелевой цепи ДНК) (например, S. pyogenes Cas9 PAM sequence NGG). Ниже приведен пример конструкции crRNA, нацеленной непосредственно на участок выше (5') локуса гена mir-891a (в частности, 5A(891a), обсуждаемый в разделе репрезентативных результатов и таблице 1).
  1. Откройте руководство по проектированию РНК программного инструмента²³.
  2. Введите имя 5A(891a) в окне Введите имя .
  3. В окне Enter a DNA sequence (Введите последовательность ДНК ) введите 150 nt геномной последовательности, находящейся непосредственно выше (5') гена-предшественника mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
    TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
    TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
    ATTACGTAGCTTCTTTTTTTTTTTTTTTTCTAGGTT
    CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
  4. Установите флажок Включить проверку специфичности , чтобы исключить сайты, удаленные от таргетинга, обнаруженные программой с помощью вычислений. Выберите подходящий организм (т.е. Человека [Homo sapiens]).
  5. Укажите правильный фермент Cas9 PAM, используемый для исследований, в данном случае Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, для генерации следующих настроек по умолчанию: PAM относительно цели: После; Повторная последовательность: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Относительно направляющей: 3; Длина целевой последовательности: 20; Сокращение относительно начала мишени 5': Sense 17 Anti-sense 17.
  6. Нажмите кнопку Далее , чтобы просмотреть результаты синтеза синтетической crRNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере предлагаемая синтезируемая crRNA распознает ДНК-мишень ATACATGCTGATAGTTACAC и будет расположена рядом с PAM:AGG.
2. Обратитесь к файлу ДНК (созданному на шаге 1.1.), чтобы определить наилучшие потенциальные целевые последовательности crRNA 20 nt, которые находятся ближе всего к локусу миРНК, подлежащему удалению, и обладают наивысшей специфичностью для предполагаемой геномной мишени.
  1. Используйте вычислительные инструменты анализа вне таргетинга для оценки специфичности креРНК-кандидата и прогнозирования потенциальных нецелевых участков в геномных локусах, не связанных с целевой областью кластера миРНК, представляющей интерес (например^{, 24,25,26,27}).
  2. Запишите потенциальные результаты нецеленаправленности для последующего использования при генотипировании одноколониальных клональных клеточных линий CRISPR с помощью ПЦР (шаг 4.2.6.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Степень комплементарности последовательностей, разделяемая между разработанным олигонуклеотидом crRNA и геномной целевой последовательностью, будет определять, насколько избирательно фермент Cas9 расщепляет геном в этом локусе. Поскольку направляющая РНК отжигается к геномной мишени в направлении от 3' до 5', несоответствия на 5' конце последовательности мишени ДНК (первые 8-10 оснований) часто блокируют Cas9-опосредованное расщепление. Если геномная целевая последовательность разделяет гомологию с другим геномным локусом, за исключением первых восьми оснований последовательности ДНК, прогнозируется, что эта направляющая РНК имеет низкую вероятность отклонения от нацеливания на этот участок.
  3. Разработать четыре уникальные crRNAs для каждого целевого локуса miRNA: два разработанных crРНК для нацеливания на комплементарные последовательности ДНК непосредственно 5' шпильки/кластера миРНК (5'A, 5'B) и две разработанные crРНК для нацеливания на комплементарные последовательности ДНК непосредственно 3' шпильки/кластера миРНК (3'A, 3'B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении трансфекции CRISPR (в разделе 3) четыре возможные комбинации 5' и 3' направляющих пар РНК (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) будут протестированы для каждого целевого локуса микроРНК, чтобы увеличить вероятность генерации успешных делеций локуса микроРНК в одном эксперименте.
  4. Используйте инструмент редактирования функций в созданном файле ДНК (шаг 1.1.), чтобы пометить целевую последовательность ДНК (с соседним PAM) для каждой разработанной crRNA, подлежащей синтезу.
Проектирование и синтез праймеров ПЦР (вперед, назад), фланкирующих целевые области кластера миРНК для генотипирования клеточных линий CRISPR (и маркировка праймеров в созданном файле ДНК).
1. Для генотипирования клеточных линий, несущих небольшие геномные делеции для тесно сгруппированных или отдельных миРНК, разработают праймеры ПЦР (вперед, назад), расположенные примерно по 150 bp на каждой стороне участка расщепления Cas9 / области нокаута, которые позволят обнаружить как дикий тип (~ 600 bp), так и нокаут (~ 300 bp) фрагменты ДНК в одной реакции ПЦР с помощью гелевого электрофореза.
2. Для генотипирования клеточных линий, несущих большие геномные делеции для комбинаций предшественников миРНК или всего кластера миРНК, снова разрабатывают праймеры ПЦР (вперед, назад), расположенные примерно 150 bp на каждой стороне сайта расщепления / нокаута Cas9. Обратите внимание, что, если целевая делеция кластера миРНК охватывает >4 кб в длину, реакция ПЦР, скорее всего, обнаружит только меньший (~ 300 bp) нокаутирующий фрагмент ДНК, но не фрагмент ДНК дикого типа. Поэтому разработайте дополнительные праймеры ПЦР (вперед, в обратном направлении), которые могут обнаруживать наличие или отсутствие внутренних генов кластера миРНК, чтобы помочь процессу скрининга и проверить гомозиготные нокаутирующие клеточные линии.

2. Генерация стабильных лентивирусных клеточных линий, несущих DOX-индуцируемую cassette Cas9

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните всю работу с клеточными культурами и вирусами в сертифицированном вытяжке биобезопасности с использованием процедур BSL2 и асептической техники.

Определите подходящий тип клеточной линии для исследований CRISPR и предпочтительные питательные среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был разработан для клеточных линий рака предстательной железы человека LNCaP (предпочтительная среда: RPMI, 10% фетальная бычья сыворотка [FBS]) и PC3-ML (предпочтительная среда: DMEM, 10% FBS).
Выполните кривую «смерти» бластицидина, чтобы определить оптимальную концентрацию препарата для выбора инфицированных лентивирусом клеток, несущих кассету гена резистентности к бластицидину (шаг 2.3.).
1. Пластинчатые ячейки входят в 11 скважин 24-луночной плиты и растут при 37 °C, 5% CO₂ в предпочтительной среде до приблизительно 75% слива.
2. Бластицидин (рабочий материал 1 мг/мл) разбавляют в предпочтительной среде с конечной концентрацией в диапазоне от 0, 1 до 10 мкг/мл и разбавляют с шагом 1 мкг/мл.
3. Маркируйте колодцы засеянной 24-луночной плитой от 1 до 11. Удалите питательную среду из скважин и замените соответствующими концентрациями бластицидина.
4. Менять среду с соответствующими концентрациями бластицидина через день в течение 7-10 дней.
5. Исследуйте клетки ежедневно в течение временного курса и определите минимальную концентрацию бластицидина, необходимую для уничтожения всех клеток в течение 5-7 дней.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Кривая «убийства» бластицидина должна быть выполнена для каждой конкретной клеточной линии, используемой для экспериментов по редактированию генов CRISPR.
Инфицировать клетки лентивирусом, несущим DOX-индуцируемую cassette cassed Cas9, и выполнять отбор бластицидина с использованием оптимальной концентрации, определенной на этапе 2.2.
1. В трех лунках 6-луночной пластины семена 5 × 10⁴ ячейки на скважину и растут в предпочтительной среде при 37 °C, 5% CO₂ в течение ночи (ON).
2. На следующий день разморозьте вектор экспрессии лентивируса для DOX-индуцируемого Cas9 (Lenti-iCas9) на льду. Осторожно перемешать (не вихрять вирусные частицы).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Храните лентивирус в аликвотах при -80 °C, чтобы избежать многократных циклов замораживания/ оттаивания, которые уменьшат титры вируса и эффективность инфекции.
3. Рассчитайте объем, необходимый для трансдукции 5 × 10⁴ клеток с вирусом при кратности заражения 0,3 (MOI = 0,3) на основе концентрации вирусного титра.
4. Пипетируйте соответствующий объем вируса в 250 мкл (на лунку) предпочтительной среды без сыворотки и антибиотиков, дополненной 0,8 мкг/мл гексадиметрина бромида. Аккуратно перемешать.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Гексадиметрин бромид представляет собой катионный полимер, который, как установлено, повышает адсорбцию вируса и эффективность инфекции.
5. Извлеките носитель. Добавьте к клеткам 250 мкл подготовленной трансдукционной среды с вирусом Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) и инкубируйте ON при 37 °C, 5% CO₂. (Сократите время инкубации до 4-6 ч, если клетки проявляют токсические эффекты, связанные с вирусом.)
6. Замените среду свежей предпочтительной средой и дайте клеткам восстановиться в течение 1-2 дней.
7. Выполняйте отбор бластицидина на инфицированных клетках в течение 10-14 дней, используя оптимальную концентрацию бластицидина, полученную из кривой «убийства», описанной в шаге 2.2.
  1. Параллельно выращивайте неинфицированные клетки в среде с оптимальной концентрацией бластицидина, которая будет использоваться в качестве положительного контроля для вирусного отбора.
8. Меняйте среду, дополненную оптимальной концентрацией бластицидина каждые 3 дня в течение курса времени отбора, чтобы удалить мертвые клетки.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Только клетки, которые выдержат селекцию бластицидина, будут интегрировать лентивирусный вектор.
9. Разверните выбранные бластицидином клеточные линии Lenti-iCas9.
  ПРИМЕЧАНИЕ: Записывайте номер прохода ячейки при каждом расширении.
  1. Заморозьте часть клеток Lenti-iCas9 в предпочтительной среде, дополненной 10% диметилсульфоксидом (DMSO) для длительного криовиального хранения.
  2. Проанализируйте часть клеток Lenti-iCas9 с помощью западного пятна 9, чтобы^{определить} клеточную линию, демонстрирующую наиболее надежные уровни белка Cas9, индуцируемые DOX (см. Шаг 2.3.).
Выполните кривую концентрации доксициклина на недавно установленных клеточных линиях Lenti-iCas9, чтобы определить оптимальные условия для индукции белка Cas9.
1. Установите четыре независимые 6-луночные пластины для каждой тестируемой клеточной линии для выполнения этого курса времени концентрации DOX. Плита 5 × 10⁴ ячейки на лунку каждой 6-луночной плиты и расти при 37 °C, 5% CO₂ в предпочтительной среде в течение 24 ч.
2. Разбавляют DOX (рабочий материал 1 мг/мл) в предпочтительной среде с конечной кривой концентрации DOX в диапазоне от 0, 50, 100, 150, 250 до 500 нг/мл.
3. Маркируйте колодцы каждой засеянной 6-луночной плиты от 1 до 6. Удалите среду и замените соответствующими концентрациями DOX. Вырастите пластины за 1-4 до следующих временных интервалов: 24 ч, 48 ч и 72 ч индукции DOX; и 120-часовой выход из DOX (первоначально 72-часовой DOX-индуцированный).
4. Заготавливайте колодцы плиты в каждый момент времени, используя соответствующие методы (например, трипсинизацию). Храните гранулы ячейки при -80 °C. Обработайте клеточные гранулы в буфере RIPA для выделения лизата и анализа западного блоттинга Cas9.
  1. Запустите 40 мкг клеточного лизата для каждого образца курса DOX-индукции с использованием денатурирующего 4%-12% геля Bis-Tris и перенесите белки на иммуноблочную мембрану.
  2. Гибридизируйте мембрану иммуноблота с первичным антителом против Cas9 для обнаружения белка 160 кДа. Нормализуйте уровень Cas9 с помощью гена домашнего хозяйства, такого как GAPDH (37 кДа).
5. Основываясь на результатах вестерн-блоттинга, определите оптимальную концентрацию DOX для индуцирования Cas9 в клеточных линиях Lenti-iCas9.
  ПРИМЕЧАНИЕ: На этот раз курс также покажет, насколько жестко выражение Cas9 регулируется через 120 часов после удаления DOX.
6. Создание одноклеточных колоний для клеточных линий Lenti-iCas9, демонстрирующих надежную экспрессию белка Cas9 для оптимизации трансфекции CRISPR (в разделе 3).

3. Выполнение реакций CRISPR путем индукции Cas9 и трансфекции синтетической направляющей РНК клеток с использованием высокопроизводительного формата

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема рабочего процесса показана на рисунке 1.

На бумаге наметьте комбинации пар crRNA, которые будут трансфектированы в каждую лунку 24-луночной пластины, нацеленной на весь кластер miRNA, различные кластерные комбинации генов miRNA, а также отдельные члены кластера miRNA.
1. На карте обозначьте четыре лунки на целевой локус миРНК. Каждая скважина представляет трансфекционную реакцию, с двумя уникальными crРНК, расположенными в 5' и 3' желаемого нокаутирующего геномного локуса миРНК и тракрРНК (отожженное молярное соотношение 1:1).
2. Убедитесь, что каждая из четырех меченых скважин представляет собой уникальную пару crRNA для трансфекции (например, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция двух 5' crRNAs и двух 3' crRNAs, фланкирующих каждый целевой локус миРНК (Секция 1), позволяет генерировать четыре возможные 5' и 3' направляющие пары РНК в трансфекционной реакции.
Обложите клеточную линию Lenti-iCas9 при 5 x 10⁴ ячейках/лунке 24-луночной пластины в предпочтительной среде, содержащей оптимизированную концентрацию DOX (определенную на этапе 2.4.). Выращивайте клетки в течение 24-48 ч при 37 °C, 5% CO₂ , чтобы индуцировать экспрессию белка Cas9.
Трансфектируйте клетки Lenti-iCas9 с помощью подготовленных 5' и 3' направляющих РНК.
1. Восстанавливают синтезированные олигонуклеотиды крРНК и тракрРНК без нуклеазной водой до концентрации запаса 10 мкМ. Хранить при -80 °C в течение длительного времени.
2. Пометить четыре 1,5 мл микроцентрифужных трубки на целевой локус миРНК на основе экспериментальной карты, разработанной на этапе 3.1., представляющей четыре возможные комбинации пар 5' и 3' crRNA (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
3. В каждой пробирке смешайте молярное соотношение тракрРНК и уникальных crРНК (5' и 3') вместе, чтобы сформировать комплекс направляющей РНК 2 мкМ, используя следующую реакцию (конечный объем 10 мкл):
  1. Добавьте 2,5 мкл тракрРНК (запас 10 мкМ), 1,25 мкл 5' позиционированной crРНК (запас 10 мкМ), 1,25 мкл 3'позиционированной crРНК (10 мкМ запас) и 5 мкл 10 мМ TRIS-HCL pH 7,5 к 1,5 мл центрифужной трубки. Микроцентрифуга в течение 30 с при 16 000 × г для смешивания. Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 5 мин.
4. К каждой пробирке добавляют 40 мкл восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM) к 10 мкл комплексной реакции направляющей РНК (общий объем 50 мкл). Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз.
5. В чистой центрифужной трубке объемом 1,5 мл смешайте 2 мкл трансфекционного реагента²⁸ (см. ПРИМЕЧАНИЕ 3.3.5.1.) и 48 мкл восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM, конечный объем 50 мкл) путем пипетирования вверх и вниз. Инкубировать на RT в течение 5 мин.
  1. Приготовьте мастер-смесь трансфекционного реагента путем умножения количества реагента (2 мкл) и восстановленной сывороточной среды (например, Opti-MEM, 48 мкл) на количество скважин, подлежащих трансфекции, плюс 10% дополнительного объема с учетом незначительных неточностей пипетирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите трансфекционный реагент, оптимизированный для малых РНК и CRISPR РНК олигонуклеотидных трансфектов, а также для клеточной линии типа²⁸.
6. К каждой пробирке, содержащей 50 мкл смеси направляющей РНК (из стадии 3.3.4.), добавляют 50 мкл разбавленного трансфекционного реагента (из стадии 3.3.5.). Пипетка смеси медленно вверх и вниз один раз, чтобы перемешать. Инкубировать в RT в течение 20 мин.
7. Добавьте 400 мкл среды без антибиотиков, дополненной DOX (оптимальная концентрация), в каждую пробирку, содержащую 100 мкл направляющей смеси РНК/трансфекции. Пипетку аккуратно перемешать.
Удалите среду из DOX-индуцированных клеток Lenti-iCas9 (шаг 3.2.). Добавьте 500 мкл смеси среды/ДОКС/направляющей РНК/трансфекции на основе экспериментальной карты 24-луночной пластины (Шаг 3.1.). Инкубируют трансфектированные клетки в течение 48 ч при 37 °C, 5% CO₂.
Замените среду свежей предпочтительной средой без DOX (чтобы очистить клетки белок Cas9). Дайте клеткам восстановиться еще 24-48 ч при 37 °C, 5% CO₂.
Собирают трансфектированные клетки (трипсинизация) и готовят к генотипированию и одноклеточным разведениям.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки представляют собой смешанную популяцию, содержащую трансфектированные генами CRISPR и нетрансфектированные клетки дикого типа. Этот шаг определит эффективность редактирования CRISPR перед инвестированием времени / ресурсов в расширение одноклеточной колонии.
1. Промыть клетки 1 раз 1 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Инкубируют клетки в 100 мкл трипсина в течение 5 мин при 37 °C, 5% CO₂ и переносят клетки в чистую центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл среды.
2. Инвертировать для смешивания и микроцентрифугирования клеток в течение 5 мин при 200 × г при 20 °C. Удалите среду и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 1 мл PBS.
3. Микроцентрифугируют промытые клетки в течение 5 мин при 200 × г при 20 °C. Удалите PBS и повторно суспендируйте ячейку гранулы в 150 мкл предпочтительной среды.
Определите количество клеток на микролитр из 150 мкл повторно суспендированных клеток с помощью гемоцитометра или автоматизированного прибора для подсчета клеток.
Разделите 150 мкл ресуспендированных клеток на три части.
1. Заморозить 1/3 трансфектированных клеток (50 мкл) в среде плюс 10% ДМСО (конечный объем 150 мкл) в криовиалах для будущего расширения/длительного хранения.
2. Переведите 1/3 трансфектированных клеток (50 мкл) в чистую ПЦР-трубку 0,2 мл для генотипирования.
  1. Микроцентрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 × г при 4 °C и удаляют среду.
  2. Повторное суспендирование клеточной гранулы в 100 мкл PBS.
  3. Микроцентрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 × г при 4 °C и удаляют PBS. Храните гранулы клеток смешанной популяции в течение длительного времени при -80 °C.
  4. Обработайте гранулу ячейки для генотипирования, используя рабочий процесс, описанный в разделе 4.
3. Подготовьте конечную 1/3 клеток (50 мкл) для разбавления и покрытия в 96-луночном пластинчатом формате для получения одноклеточных колоний.
  1. Основываясь на количестве ячеек на этапе 3.7, рассчитайте разбавления, необходимые для достижения 10, 5, 2 и 1 ячейки (ячеек) в 100 мкл среды на скважину 96-луночной пластины.
  2. Используя 12-канальный мультипипетатор и стерильный резервуар реагентов, добавьте 100 мкл разбавленных ячеек на скважину в два ряда пластины (всего 24 скважины) для каждого разбавления (10, 5, 2 или 1 ячейка на скважину). Дайте 4-6 недель, чтобы клетки выросли до слияния для расширения одноклеточной колонии. Наблюдайте за клетками еженедельно под световым микроскопом и отмечайте, представляют ли колонии одно- или многоклеточные колонии.
  3. Соберите ~10-15 одноклеточных колоний для генотипирования (раздел 4). Определите, по крайней мере, три независимые, нокаутирующие, одноклеточные колониальные линии для каждого целевого локуса миРНК. Сохраняйте одноклеточные линии дикого типа в качестве элементов управления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количество скрининга будет зависеть от типа клеточной линии и влияния фенотипа нокаута миРНК на рост/жизнеспособность клеток.

4. Генотипирование ПЦР клеточных линий CRISPR с использованием сырых клеточных лизатов

Добывайте отдельные, одноклеточные колонии из почти сливающихся колодцев плиты из 96 лунок.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление среды/PBS, описанное на этих этапах, может быть выполнено вручную с использованием вакуумного аспиратора в шкафу биобезопасности, но будьте осторожны, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Используйте новый стерильный «желтый» 200-мкл пипетманный наконечник для каждой скважины 96-луночной пластины при аспирации, в котором каждый замененный желтый наконечник прочно помещается на конце стерильной стеклянной пастбищной пипетки, прикрепленной к вакуумному аспиратору.
1. Промывайте колодцы 1x со 100 мкл PBS. Аспирировать PBS.
2. Добавьте 50 мкл трипсина и инкубируйте в течение 2-5 мин при 37 °C, 5% CO₂.
3. Осторожно пипетируйте вверх и вниз и перенесите повторно суспендированные ячейки в центрифужную трубку объемом 1,5 мл, содержащую 1 мл среды.
4. Инвертировать, чтобы перемешать и аккуратно гранулировать клетки в микроцентрифуге в течение 5 мин при 200 × г при 20 °C.
5. Извлеките носитель и добавьте 1 мл PBS. Осторожно проведите трубкой, чтобы разрушить гранулу, и переверните несколько раз, чтобы перемешать.
6. Микроцентрифугу в течение 5 мин при 200 × г при 20 °С гранулировать клетки.
7. Удалите PBS и повторно суспендируйте гранулу в 300 мкл свежего PBS.
8. Разделите образец объемом 300 мкл на две части.
  1. Перенесите 200 мкл клеток (2/3 гранулы) в скважину из 24-луночной пластины, содержащей 1 мл предпочтительной среды. Как только генотип будет проверен, используйте эти клетки для расширения CRISPR-опосредованных линий нокаут-клеток для функционального анализа.
  2. Переложите 100 мкл клеток (1/3 гранулы) в ПЦР-трубку 0,2 мл. Микроцентрифуга в течение 5 мин при 3 000 х г при 4 °C. Удалите PBS. Хранить гранулы при -80 °C.
Подготовьте неочищенные клеточные лизаты для генотипирования и анализа последовательностей с помощью праймеров ПЦР, разработанных на этапе 1.3. Включите клеточные лизаты, приготовленные из нетрансфицированных клеток, в эти эксперименты для использования в качестве положительного контроля дикого типа.
1. Повторно суспендируют клеточную гранулу в 4 мкл 5x ДНК-полимеразного буфера (см. Таблицу материалов, конечная концентрация 1x), 1 мкл протеиназы K (запас 20 нг/мл), 1 мкл РНКазы А (запас 10 нг/мл) и безнуклеазную воду до общего объема 20 мкл.
2. Лизируйте клетки в термоциклере с помощью программы ПЦР: 56 °C в течение 30 мин и 96 °C в течение 5 мин. Хранить лизаты клеток при -20 °C.
3. Выполняют реакцию ПЦР с использованием разработанных праймеров ПЦР (прямых, обратных), которые обрамляют направляющие РНК 5' и 3' направляющие РНК-таргетные участки (табл. 1).
  ПРИМЕЧАНИЕ: Условия буфера ДНК-полимеразы и термоциклера будут зависеть от фермента ДНК-полимеразы Taq, используемого для реакции ПЦР. Этот протокол был оптимизирован для ДНК-полимеразы Phusion HF.
  1. Настройте реакционную смесь ПЦР на льду: 5 мкл 5x ДНК-полимеразного буфера, 0,5 мкл прямого ПЦР-праймера (запас 10 мкМ), 0,5 мкл праймера обратной ПЦР (запас 10 мкМ), 0,5 мкл 10 мМ дНТП, 0,25 мкл ДНК-полимеразы, 1-4 мкл клеточного лизата и безнуклеазная вода до общего объема 25 мкл.
  2. Запустите реакцию ПЦР в термоциклере с помощью программы: 98 °C в течение 3 мин и 35 циклов 98 °C в течение 10 с, 62 °C в течение 15 с, 72 °C в течение 15 с, а затем 72 °C в течение 10 мин. Держите при температуре 4 °C. ПРИМЕЧАНИЕ 4.2.3. над.
4. Загрузите продукты ПЦР на 1% агарозный гель для анализа электрофореза.
5. Извлеките ДНК из изолированных фрагментов ПЦР прогнозируемого молекулярного размера для нокаутных (и диких) генотипов. Подготовьте образцы для секвенирования ДНК.
6. Подтвердите, что реакция CRISPR была успешной, и выполните секвенирование ДНК изолированных фрагментов ПЦР для идентификации места расщепления Cas9 и подтверждения делеции локуса миРНК.
  1. Изолируйте по крайней мере три независимые нокаутирующие клеточные линии для каждого локуса микроРНК, на который нацелен CRISPR. Сохраняйте клеточные линии дикого типа (и гетерозиготные) для использования в качестве контроля в последующих функциональных исследованиях.
  2. Выполните qRT-PCR или анализ северного пятна, чтобы подтвердить, что нокаутирующие клеточные линии не экспрессируют зрелую миРНК для удаленного локуса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Секвенирование всего генома (WGS) является наиболее окончательным методом проверки редактирования генов CRISPR и нецеленаправленности.
  3. Тест на эффекты CRISPR с помощью ПЦР, которые были предсказаны вычислительно (Шаг 1.2.3.) 24,25,26,27.
  4. Если обширный скрининг одноклеточной колонии приводит только к гетерозиготным генотипам, повторите направляющую трансфекцию РНК в одноклеточных гетерозиготных линиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможность получения гомозиготных нокаутных клеточных линий может указывать на летальные эффекты из-за потери миРНК или присущей ей геномной сложности (например, дупликации/слияния хромосом) родительской клеточной линии, которые требуют дальнейшего анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Этот высокопроизводительный протокол делеции CRISPR был успешно использован с использованием трансфекции Cas9-индуцируемых LNCaP и PC3-ML линий раковых клеток человека с синтетическими олигонуклеотидными направляющими РНК, нацеленными на кластер miR-888, которые были изучены в контексте рака предстательной железы. Кластер miR-888 был первоначально идентифицирован на скрининге профилирования экспрессии как повышенный у пациентов с раком предстательной железы с высокой степенью заболевания по сравнению с пациентами с низкой степенью и нераком ^9,10. Кластер miR-888, охватывающий 35 124 bp, состоит из семи miRNAs (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b и -891a) на хромосоме человека Xq27.3 (рисунок 2A). Этот локус находится в пределах HPCX1 (наследственный рак предстательной железы, X-linked 1, Xq27-28), который связан с наследственным раком предстательной железы 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b и -892c имеют общую гомологию последовательности и принадлежат к семейству miR-743, сохраняемому млекопитающими. Члены кластера miR-891a и miR-891b только разделяют гомологию последовательности друг с другом и принадлежат к семейству miR-891, специфичному для приматов. Геномная организация кластера miR-888 сохраняется у приматов, что подразумевает функциональное сохранение важной сигнальной сети³⁰.

Предыдущая работа с использованием экспериментальных исследований сверхэкспрессии (имитация miRNA) и ингибирования (антисмысловые олигонуклеотиды) для оценки индивидуальной активности членов кластера miR-888 выявила перекрывающуюся роль для всех членов кластера miR-888 для повышения инвазивности клеток рака предстательной железы с использованием камерных анализов Матригеля Бойдена ^9,10. В частности, miR-888 и miR-891a функционировали аналогично, чтобы индуцировать рост клеток предстательной железы (анализы WST-1), ускорять нагрузку на опухоль предстательной железы у мышиных ксенотрансплантатов и регулировать общие мишени (например, TIMP-2)^9,10. Однако эта работа предполагала более сложное взаимодействие между членами кластера miR-888. Например, miR-888 и miR-891a показали синергетические эффекты в стимулировании пролиферации клеток простаты PC3-N, тогда как miR-890 и miR-892c показали ингибирующие эффекты роста с использованием анализов WST-1⁹. Поэтому этот высокопроизводительный протокол CRISPR был использован для генетического опроса кластерной сети miR-888 в контексте рака предстательной железы.

Описанный рабочий процесс редактирования гена CRISPR Cas9 (рисунок 1) позволил протестировать 32 уникальные реакции трансфекции направляющей РНК CRISPR в одном эксперименте с использованием 24-луночного формата. Этот протокол привел к успешной идентификации панели нокаутирующих клеточных линий рака предстательной железы человека, несущих делеции для всего кластера miR-888, специфических комбинаций членов кластера miRNA и отдельных членов miRNA. Впервые была создана генерация стабильных индуцируемых клеточных линий Cas9. Вкратце, клетки рака предстательной железы человека PC3-ML и LNCaP были инфицированы DOX-индуцируемым вектором лентивируса Streptococcus pyogenes Cas9 (Lenti-iCas9; EditR Индуцируемые лентивирусные частицы hEF1aBlastCas9; MOI 0,3) в течение 6 ч (LNCaP) или на ночь (PC3-ML), в зависимости от присущей клеточной линии восприимчивости к токсичности вируса.

Инфицированные клеточные линии впоследствии подверглись отбору бластицидина (7,5 мкг/мл) и расширению одноклеточной колонии. Исследования вестерн-блоттинга были использованы для выбора одноколониальных клеточных линий PC3-ML и LNCaP Lenti-iCas9, демонстрирующих наиболее надежную экспрессию Cas9 на основе курса времени индукции DOX (рисунок 2A). Эта лентивирусная индуцируемая система Cas9 жестко контролировалась, и после отмены DOX в течение 120 ч большая часть белка Cas9 была удалена из клеток (рисунок 2A). Кривая концентрации DOX определила, что 250 нг/мл DOX является оптимальной дозой для индуцирования надежной экспрессии белка Cas9 в этих клеточных линиях простаты Lenti-iCas9 (рисунок 2B). Используя онлайн-инструмент проектирования crRNA²³, были разработаны уникальные crRNAs (две 5' и две 3' crRNAs, фланкирующие каждый запланированный нокаутирующий локус miRNA, чтобы обеспечить четыре возможные комбинации 5' и 3' направляющей РНК), которые нацелены на всю область кластера ~ 35 kb miR-888; меньшие кластерные комбинации в пределах семейства miR-743 или семейства miR-891; а также отдельные делеции миРНК (miR-888, -891a) (рисунок 3A). При проведении экспериментов CRISPR клеточные линии рака предстательной железы человека Lenti-iCas9 выращивали в среде, дополненной 250 нг /мл DOX в течение 48 ч, чтобы индуцировать экспрессию Cas9.

Затем клетки трансфектировали в 24-луночном пластинчатом формате с синтетическим универсальным комплексом тракрРНК (молярное соотношение 1:1) с уникальным набором 5' и 3' геномных сайт-специфических crРНК (таблица 2). DOX удаляли из клеточной культуральной среды через 48 ч после трансфекции, чтобы очистить белок Cas9 из клеток рака предстательной железы. Скважины были заготовлены через 48 ч (96 ч после трансфекции), и одна треть каждой собранной клеточной гранулы была подготовлена для генотипирования ПЦР с использованием сырых клеточных лизатов (таблица 3). Анализ гель-электрофореза реакций ПЦР показал, что прогнозируемый размер фрагмента ДНК, представляющий нокаутирующий генотип, был амплифицирован для каждой трансфекции CRISPR (рисунок 3B). Секвенирование ДНК этих изолированных нокаутированных фрагментов ПЦР подтвердило, что трансфектированные 5' и 3' направляющие РНК направляли расщепление/лигирование Cas9 ~ 3 nt вверх по течению от участков PAM и подтверждали геномную потерю целевого локуса миРНК (репрезентативный пример, показанный на рисунке 4C). Поскольку кластер miR-888 находится в межгенной области хромосомы X (далекой от каких-либо белково-кодирующих генов), не ожидалось, что нокаутирующие клеточные линии, которые часто обладали INDEL в месте расщепления Cas9 из-за NHEJ, вызовут нисходящие артефактные эффекты.

Хотя реакции трансфекции CRISPR были успешными (рисунок 3B), трансфектированные клетки представляли собой смешанную клеточную популяцию трансфектированных (нокаут) и нетрансфектных (дикий тип) клеток. Эта популяция также представляла собой смесь клеток, несущих гомозиготные и гетерозиготные делеции для целевого локуса миРНК. Клеточные линии рака предстательной железы LNCaP и PC3 получены от мужчин, обладающих аномальными кариотипами, которые включают две Х-хромосомы^31,32. Поэтому часть каждой реакции трансфекции клеток последовательно разбавляли в 96-луночном пластинчатом формате для получения одноклеточных колониальных линий. Эти колонии были проверены с помощью ПЦР для отбора гомозиготных клеточных линий, в которых отсутствовали все копии целевого локуса миРНК.

Эта процедура была важна для своевременного выполнения, поскольку прошлые данные указывали на роль кластера miR-888 в стимулировании роста опухолевых клеток и агрессивности заболевания. Было предсказано, что раковые клетки, несущие делеции CRISPR для членов кластера miR-888, растут медленнее, чем клетки дикого типа. Обоснованная обеспокоенность заключалась в том, что со временем направляющие РНК-трансфектированные колодцы, содержащие смешанную популяцию нокаутированных клеток миРНК и клеток дикого типа, приведут к тому, что клетки дикого типа быстро превзойдут скомпрометированные мутантные клетки в культуре. Это было отмечено и было особенно выражено в экспериментах с использованием высокоагрессивных клеточных линий PC3-ML. Таким образом, этапы, включающие последовательные разведения для генерации одноклеточных колониальных линий или клеточную подготовку к криосохранению, выполняли в течение 48-72 ч после выполнения экспериментов по трансфекции CRISPR для сохранения нокаутирующих клеток в образцах смешанной популяции.

Наиболее трудоемкой частью рабочего процесса CRISPR для кластера miR-888 была генерация гомозиготных одноклеточных колониальных делеций миРНК. Одна из проблем в этом процессе заключалась в том, что культивируемые клетки LNCaP и PC3-ML обычно плохо процветали при покрытии плотностью одиночных клеток. Кроме того, рост клеток, по-видимому, был фенотипически скомпрометирован при комбинаторной потере членов кластера miR-888 (и коррелировал с агрессивностью клеточной линии). Поэтому для некоторых трансфекционных реакций, нацеленных на определенные комбинации локусов миРНК, требовалось дополнительное разбавление клеток (с использованием формата 96 лунок) для генерации достаточного количества одноклеточных колониальных линий для генотипирования. При скрининге генотипов одноклеточных колоний с помощью электрофорезной гелевой визуализации было полезно сравнить интенсивность полосы дикого типа по сравнению с нокаутными фрагментами ПЦР и определить, была ли клеточная линия гетерозиготной (равная интенсивность полосы) или представляла собой многоклеточную колонию (неравная интенсивность полосы), которая выиграла бы от дополнительных раундов одноклеточных разведений. Если было отмечено, что колонии клеток обладают фрагментами ПЦР аномального размера и несовместимы с генотипами дикого типа или нокаута, эти линии были исключены из исследования.

Секвенирование ДНК изолированных фрагментов ПЦР, согласованных для генотипов дикого типа и нокаутов, было повторно проверено для каждой установленной одноклеточной колонии и подтверждено с использованием независимых методов (т.е. qRT-PCR, WGS). С точки зрения типичной эффективности генерации гомозиготных нулевых клеточных линий в этих экспериментах, это варьировалось в зависимости от целевого локуса микроРНК и используемого типа клеток. Например, эффективность получения одноколониальных линий выбивания mir-891a с использованием LNCaP составила 30%, но снизилась до ~7% в ячейках PC3-ML. Эта разница может быть связана с врожденными различиями типов клеток (например, клетки PC3-ML обладают более высокой скоростью деления / метастатическим потенциалом, чем клетки LNCaP). Различия в эффективности CRISPR могут также отражать функциональное влияние потери микроРНК (например, miR-891a способствует росту клеток и агрессивности ^9,10) и, таким образом, нокаутные фенотипы могут быть увеличены в более агрессивных клеточных линиях, таких как PC3-ML. Получение одноколониальных линий для более крупных делеций локуса миРНК кластера miR-888 показало снижение эффективности. Мы не смогли определить, было ли это связано с выбиванием больших областей ДНК или подчеркнуло существенные и перекрывающиеся функциональные роли членов miR-888 в клетках рака предстательной железы.

Подробное описание и фенотипический анализ одноклеточных колониальных линий кластерных клеток miR-888, полученных в результате этого рабочего процесса, продолжаются и будут опубликованы в других местах. В качестве репрезентативного результата делеций миРНК, полученных в этих исследованиях редактирования генов CRISPR, показаны результаты для клеток рака предстательной железы LNCaP, несущих индивидуальную делецию mir-891a. Одноклеточные колонии генотипировали с помощью ПЦР и проверяли последовательность (рисунок 4A-C). Клеточные линии, демонстрирующие фрагменты ПЦР аномального размера, не анализировались (например, клон L14 H7, показанный на рисунке 4D). После того, как для локуса mir-891a были получены нокаутные и одноклеточные колонии дикого типа, были проведены функциональные исследования. Прошлые работы показали, что сверхэкспрессия miR-891a (miRNA-имитирующий лентивирусный вектор) индуцирует рост клеток предстательной железы⁹ и, следовательно, было предсказано, что потеря miR-891a покажет взаимные эффекты. Анализы пролиферации WST-1, сравнивающие нокаут mir-891a и клетки дикого типа, подтвердили эту гипотезу, а потеря miR-891a привела к замедлению роста (рисунок 4D, E).

Рисунок 1: Рабочий процесс редактирования генов CRISPR для генерации кластерных делеций миРНК. (A) Направляющая РНК состоит из отожженных синтетических олигонуклеотидов crRNA и tracrRNA (смешанное молярное соотношение 1:1). Олигонуклеотид crRNA предназначен для содержания уникальной 5'-концевой 20-нтовой направляющей последовательности (желтой), комплементарной целевому сайту геномной ДНК, и за ней следует инвариантная 22 nt Streptococcus pyogenes повторная последовательность (зеленая), которая пара оснований с олигонуклеотидом тракрРНК. Красные стрелки указывают на двухцепочечные участки расщепления ДНК фермента Cas9, обычно расположенные в 3 нт выше по течению от PAM. (B) Этот экспериментальный рабочий процесс изображает одну скважину из 24-луночной пластины. Клетки, инфицированные DOX-индуцируемым вектором лентивируса Cas9 (Lenti-iCas9, MOI 0,3), выращивают в среде с DOX в течение 48 ч, чтобы индуцировать экспрессию белка Cas9. Две синтетические направляющие РНК (смешанное молярное соотношение 1:1 crRNA::tracrRNA) трансфектируются в Cas9-индуцированные клетки. Направляющие РНК сопровождают Cas9 к геномным участкам ДНК (5' и 3'), фланкирующим область кластера миРНК, предназначенную для удаления. Клетки готовят через 48 ч после трансфекции для разбавления с использованием 96-луночного формата для генерации одноклеточных колоний для генотипирования ПЦР и последующего фенотипического анализа. Сокращения: CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; миРНК = микроРНК; crRNA = CRISPR РНК; тракрРНК = трансактивирующая CRISPR РНК; nt = нуклеотид; Cas9 = CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза; PAM = протоспейсер смежный мотив; DOX = доксициклин; MOI = множественность инфекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Линии раковых клеток, несущие доксициклин-индуцируемую лентивирусную кассету Cas9, демонстрирующую жесткую регуляцию белка Cas9. (A) Анализ вестерн-блоттинга показал, что клеточные линии рака предстательной железы человека PC3-ML инфицированы вектором Lenti-iCas9 (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0,3) и выращены в течение 48 ч в среде, содержащей 250 нг/мл DOX, экспрессировали оптимальные уровни белка Cas9. Выражение Cas9 было нормализовано до выражения GAPDH. (B) Клетки PC3-ML, выращенные в среде с 250 нг/мл DOX в течение 48 ч и 120 ч (+DOX), показали устойчивую экспрессию белка Cas9. Удаление DOX из среды (-DOX) в течение 120 ч (120 ч после) привело к клиренсу белка Cas9, измеренному анализом вестерн-блоттинга. Аналогичные результаты были получены при генерации клеточной линии LNCaP Lenti-iCas9 (не показана). Сокращения: CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas9 = CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза; DOX = доксициклин; МВД = множественность инфекции; GAPDH = глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Высокопроизводительный экспериментальный проект CRISPR для генерации нескольких комбинаций делеции кластера miR-888 в одном эксперименте. (A) Диаграмма кластера miR-888, расположенного на хромосоме человека Xq27.3, с указанием сохраненных млекопитающими членов семейства miR-743 mir-892c, -890, -888, -892a и -892b (синие коробки) и членов семейства miR-891 miR-891 miR-891a и -891b (бордовые коробки). Уникальные синтетические олигонуклеотиды crRNA (зеленые стрелки) были использованы для генерации комбинаций нокаутов кластера miR-888. Прямые и обратные праймеры ПЦР (небольшие красные прямоугольники) были разработаны для генотипирования клеток и скрининга на нокауты. (B) Этот репрезентативный результат показывает 25 реакций CRISPR в трансфектированных клетках PC3-ML (Lenti-iCas9), которые были нацелены на ряд комбинаций нокаутов кластеров miR-888 в одном эксперименте. Каждый трансфектированный колодец 24-луночной пластины содержал две уникальные гРНК, фланкирующие 5' и 3' стороны целевого геномного локуса миРНК (Δ) (как указано в таблице 2). Сырые клеточные лизаты получали для каждой реакции CRISPR и генотипировали ПЦР. Изолированные фрагменты ПЦР, мигрирующие в прогнозируемых размерах нокаута с помощью гелевого электрофореза, были секвенированы ДНК и проверены для целенаправленного расщепления Cas9 и удаления локуса миРНК. Прогнозируемые размеры фрагмента WT PCR bp указаны в скобках, а желаемые размеры фрагментов CRISPR KO PCR показаны в нижней части геля. Сокращения: CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas9 = CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза; гРНК = направляющая РНК; DOX = доксициклин; bp = пара оснований; WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Клетки рака предстательной железы удалены для mir-891a с использованием редактирования гена CRISPR, демонстрируя подавленную пролиферацию. (A) Дизайн праймеров ПЦР (фиолетовый) и двух 5' и двух 3' направляющих РНК (оранжевый), нацеленных на геномные последовательности, фланкирующие ген mir-891a (зеленый). (B) Генотипирование ПЦР трансфектированных клеток LNCaP с указанными 5' и 3' направляющими РНК подтвердило, что делеции Δmir-891a были получены для всех четырех комбинаций направляющих РНК. Клеточные лизаты получали из смешанных клеточных популяций через 48 ч после трансфекции. (C) Фрагменты ПЦР были секвенированы и проверены. Репрезентативный пример показывает последовательность ДНК трансфектированных клеток, обработанных направляющими РНК 5A(891a) и 3B(891a), что приводит к прогнозируемому участку расщепления Cas9 (3 nt вверх по течению от сайта PAM) и делеции CRISPR Δmir-891a. (D) Были получены одноклеточные колонии и ПЦР-генотипированы. Клон L14 G9 был проверен последовательностью как KO, а клон L14 G9 как WT для гена mir-891a . (E) ранее было показано, что miR-891a индуцирует рост клеток рака предстательной железы, и, следовательно, потеря miR-891a, по прогнозам, будет иметь реципрокный фенотип. Анализы WST-1 клеток рака предстательной железы, удаленных для mir-891a (L14 G9 [KO], синий), показали подавленную пролиферацию по сравнению с клетками WT (L14 G9 [WT], красный). Сокращения: CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; Cas9 = CRISPR-ассоциированная эндонуклеаза; WT = дикий тип; НОКАУТ = нокаут; WST-1 = водорастворимая соль тетразолия-1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Реакция ПЦР устанавливается на льду.
Компонент	Реакция 25 мкл	Конечная концентрация
5x ДНК-полимеразный буфер	5 мкл	в 1 раз
Праймер прямой ПЦР (10 мкМ)	0.5 мкл	0,2 мкМ
Праймер для обратной ПЦР (10 мкМ)	0.5 мкл	0,2 мкМ
10 мМ дНТП	0.5 мкл	200 мкМ
ДНК-полимераза (2 ЕД/мкл)	0.25 мкл	0,125 U/ 25 мкл
Сырой клеточный лизат	1 - 4 мкл	переменная
Вода без нуклеаз	до 25 мкл
Термоциклерные условия для ПЦР-реакции:
Шаг	Температура	Время
Начальная денатурация	98 °С	3 мин
	98 °С	10 с
35 циклов	62 °С	15 с
	72 °С	15 с
Окончательное продление	72 °С	10 мин
Держать	4 °С

Таблица 1: Условия реакции ПЦР для генотипирования сырого лизата. Аббревиатура: dNTP = дезоксинуклеотиды.

Сайт удаления, ориентированный на CRISPR	Комбинация направляющей РНК	Дикий тип (bp)	Нокаут (bp)	Пары праймеров для ПЦР
∆Полный кластер	5А(891а)+3А(892с) 5B(891a)+3A(892c) 5А(891а)+3Б(892с) 5B(891a)+3B(892c)	35,664	389 496 378 485	891a FWD 892c REV
∆892c/890/888	5А'(888)+3А(892c) 5Б'(888)+3А(892с) 5А'(888)+3Б(892с) 5Б'(888)+3Б(892c)	2,739	478 487 467 476	888 FWD 892c REV
∆892c/890	3А'(888)+3А(892c) 3B'(888)+3A(892c) 3А'(888)+3Б(892c) 3B'(888)+3B(892c)	2,739	710 754 699 743	888 FWD 892c REV
∆892b/892a	5А'(888)+5А(892б) 5Б'(888)+5А(892б) 5А'(888)+5Б(892б) 5Б'(888)+5Б(892б)	2,938	554 547 573 566	892b FWD 888 ПРЕВ
∆892b/892a/888	5А(892б)+3А'(888) 5А(892б)+3Б'(888) 5B(892b) +3A'(888)	2,938	322 278 341	892b FWD 888 ПРЕВ
∆743 Семья	5А(892б)+3А(892с) 5B (892b) + 3A (892c) 5А(892б)+3Б(892с) 5B (892b) + 3B (892c)	5,015	370 389 359 378	892b FWD 892c REV
∆891 Семья	5А(891а)+3А(891б) 5Б(891а)+3А(891б)	27,294	330 270	891a FWD 891b REV
∆891а	5А(891а)+3А(891а) 5А(891а)+3Б(891а) 5Б(891а)+3А(891а) 5Б(891а)+3Б(891а)	554	333 273 454 394	891a FWD 891a REV

Таблица 2: Направляющие РНК CRISPR, используемые для генерации комбинаций нокаутов кластеров miR-888. Сокращения: CRISPR = сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы; bp = пара оснований; FWD = вперед; REV = обратный ход.

Букварь	Последовательность	Тм (°C)
888 FWD	AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG	52.2
888 ПРЕВ	CTGGATGATGGCCAAGACAAGCAAG	55.9
891a FWD	TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA	53.9
891a REV	TTCATCTTGCTGCTACCTGTC	54.8
891b REV	TCATCTTGCTGCTATACGTCCT	55.6
892b FWD	GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA	53.5
892b REV	CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC	53.5
892c FWD	TGTGAGCACCTACAGGTTAG	53.9
892c REV	CACTCTCACTTGGCTTCATG	53.5

Таблица 3: ПЦР-праймеры, применяемые для генотипирования. Сокращения: FWD = вперед; REV = обратный; Tm = температура плавления.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта процедура редактирования генов CRISPR позволяет исследователю быстро генерировать целую панель клеточных линий, несущих уникальные комбинации делеции кластеров миРНК. Трансфекция синтетических направляющих РНК, состоящих из 5' и 3' геномных сайт-специфических цРНК, отожженных синтетическими тракрРНК (молярное соотношение 1:1) в этом протоколе, позволяет избежать трудоемкого субклонирования плазмидных векторов и позволяет создать более гибкое и высокопроизводительное экспериментальное проектирование с использованием формата 24 лунки. Генерация клеточных линий, несущих лентивирусную кассету Cas9, индуцируемую DOX, обеспечивает жестко регулируемую DOX и надежную экспрессию Cas9 во время клеточной трансфекции направляющих РНК и быстрого клиренса этого бактериального белка при выводе DOX из культуральной среды на последующих этапах. Эта процедура также опирается на сырые лизаты клеток для генотипирования ПЦР, которое требует минимального клеточного материала для анализа и позволяет избежать использования дорогостоящих и трудоемких методов очистки ДНК кварцевой колонны или необходимости измерения концентраций нуклеиновых кислот с использованием спектрофотометра, что еще больше упрощает методы для исследователя.

Действительно, репрезентативные результаты, представленные здесь, показали успешную адаптацию этого метода для трансфекции клеточных линий рака предстательной железы человека с помощью 32 уникальных комбинаций направляющих РНК в одном эксперименте и генерации нескольких нокаутирующих линий одноклеточной колонии, несущих делеции для всей кластерной области ~ 35 kb miR-888; меньшие комбинации делеций для членов кластера miR-888, принадлежащих к семействам miR-743 и miR-891a; а также делеции для отдельных членов miRNA в кластере miR-888. Этот рабочий процесс создал ценный ресурс клеточной линии, чтобы начать молекулярно рассекать кластерную сеть miR-888 в контексте заболевания предстательной железы человека и определить, как члены кластера miR-888 функционально перекрывают или взаимодействуют синергетически / антагонистически друг с другом для регулирования роста опухоли предстательной железы, агрессивности рака и лекарственной устойчивости (будет опубликовано в другом месте). Эти исследования будут иметь решающее значение, поскольку это исследование движется к диагностическим и терапевтическим приложениям для лечения пациентов с прогрессирующими и метастатическими формами рака предстательной железы.

В этом высокопроизводительном протоколе редактирования генов CRISPR есть несколько важных шагов, которые исследователи должны тщательно учитывать при адаптации этого метода для изучения дополнительных кластерных сетей миРНК в других контекстах заболевания. Во-первых, наиболее важным шагом в этом процессе является тщательное проектирование направляющих РНК, которые обрамляют кластер миРНК для удаления с помощью CRISPR,а также дополнительных направляющих РНК для удаления отдельных миРНК или комбинаций членов кластера миРНК. Исследователь должен тщательно рассмотреть вопрос о том, чтобы не нарушать окружающие гены или регуляторные элементы, особенно если кластер миРНК находится внутри генного интрона или расположен антисмыслом по отношению к другому гену. Существуют ресурсы прогнозирования CRISPR ^24,25,26,27, которые могут помочь исследователю при выборе наиболее разборчивых олигонуклеотидов crRNA для синтеза. Этот рабочий процесс описывает конструкцию двух 5' и двух 3' crRNAs, фланкирующих каждый целевой локус miRNA, которые позволяют тестировать четыре уникальные комбинации направляющих РНК на этапе трансфекции CRISPR и увеличивают шансы на генерацию желаемой линии нокаутирующих клеток. Тем не менее, исследователю нужна только одна из этих комбинаций направляющих РНК, чтобы успешно работать над разрушением конкретного локуса гена миРНК.

Во-вторых, исследователь должен выбрать наиболее подходящий метод доставки Cas9 в клетки для редактирования генов CRISPR. В этой процедуре использовалась DOX-индуцируемая система лентивирусной экспрессии Cas9, но альтернативные подходы к производству белка Cas9 (например, рекомбинантный белок Cas9, доставка мРНК Cas9 или использование обычных векторных систем плазмиды экспрессии Cas9) могут быть легко адаптированы для этого протокола. Например, экспериментальные соображения могут диктовать использование переходной экспрессии Cas9 по сравнению с генерацией стабильных лентивирусных экспрессионных клеточных линий, промотора, используемого для управления Cas9 (вездесущим, специфичным для типа клеток, индуцируемым), и включения положительных / отрицательных систем отбора для обеспечения доставки вектора экспрессии Cas9 к интересующим клеткам (т. Е. Устойчивость к антибиотикам).

В-третьих, важно быстро генотипировать смешанные популяционные трансфектированные клетки в течение 48-72 ч после направляющей доставки РНК в случае, если потеря кластера миРНК может негативно повлиять на жизнеспособность/рост клеток. Например, при удалении опухолевых факторов, таких как miR-891a, в клеточных линиях рака предстательной железы было отмечено, что эти нокаутирующие клетки mir-891a росли медленнее, чем необработанные клетки, и, впоследствии, клетки дикого типа быстро обогнали клеточную популяцию. Наконец, крайне важно интегрировать дополнительные методы валидации для обеспечения удаления локуса миРНК во время процесса генотипического скрининга, особенно для более крупных геномных делеций. Эти меры включают использование внутреннего контроля генотипирования ПЦР, которые обнаруживаются только при наличии аллеля дикого типа, и выполнение анализа qRT-PCR на одноклеточных колониях, чтобы убедиться, что нокаутирующие клеточные линии не экспрессируют целевые миРНК. Все эти соображения обеспечат успешные результаты для исследователя.

Были некоторые очевидные ограничения, возникшие при внедрении этой техники CRISPR в лабораторию. Например, несмотря на высокую пропускную способность этапов первичной трансфекции РНК, описанных в этом протоколе, для быстрого создания нескольких комбинаций делеции кластера миРНК, ограничивающим скорость этапа этой процедуры был скрининг генотипа и расширение клеточных линий с одной колонией для каждой CRISPR-опосредованной делеции миРНК. Включение позитивных стратегий отбора в этот протокол было бы преимуществом; тем не менее, все равно потребуется ~ 3-4 недели, чтобы расширить линию из одноклеточной колонии, выращенной в формате 96 лунок. Действительно, сбор по крайней мере трех независимых одноколониальных клеточных линий на нокаут локуса миРНК плюс клетки дикого типа поможет гарантировать, что проанализированные фенотипы не связаны с эффектами артефакта / нецеленаправленности, но это снова добавляет трудоемкий характер этой процедуры. Исследователю также может потребоваться выполнить несколько раундов редактирования гена CRISPR для получения гомозиготных нулевых клеточных линий. Это особенно выражено в исследованиях с использованием установленных увековеченных линий раковых клеток, которые часто обладают сложным геномным ландшафтом хромосомных перестроек и аномальных кариотипов.

Например, в этом репрезентативном исследовании использовались клеточные линии рака предстательной железы человека, полученные из LNCaP и PC3, для генерации делеций для кластера miR-888, картирующихся на Х-хромосоме. Важно было признать, что эти мужские клеточные линии рака предстательной железы имеют аномальные кариотипы и обладают двумя Х-хромосомами (а клетки PC3 также имеют частичные транслокации Х-хромосом на других аутосомах)^31,32. Несмотря на эти условия, редактирование гена CRISPR было достаточно надежным, чтобы генерировать гомозиготные нокауты с использованием этих клеточных линий простаты. Однако могут быть случаи, когда клеточная линия исследователя с аномальным кариотипом (например, вставки, делеции, инверсии, дупликации) может содержать «невидимые мутации», которые будут скрывать обнаружение вторых (или более) копий целевого локуса гена из-за отсутствующих элементов, которые необходимы для успешного обнаружения с использованием разработанных праймеров ПЦР / направляющих РНК. Это подчеркивает важность проверки гомозиготных нулевых клеточных линий CRISPR с использованием независимых методов (например, qRT-PCR, northern blot, WGS) перед выполнением функциональных анализов. Наконец, этот протокол предназначен только для выбивания комбинаций кластеров миРНК, которые отображаются рядом друг с другом. Если исследователь хочет выбить миРНК, которые разделены между другими генами миРНК, то потребуется несколько раундов трансфекции CRISPR, требующие тщательного генотипирования и валидации.

Несмотря на эти проблемы, способность быстро генерировать полную панель комбинаций делеции миРНК для любого заданного кластера миРНК с использованием этого описанного протокола является огромным преимуществом по сравнению с существующими методами в наборе инструментов исследования миРНК. Исследования сверхэкспрессии с использованием имитации миРНК для характеристики некодирующей функции РНК могут привести к непреднамеренным артефактам или клеточной токсичности. Аналогичным образом, использование антисмысловых антимировых олигонуклеотидных ингибиторов для определения фенотипов потери функции может быть затруднено, поскольку антимира обычно приводит к нокдауну, а не к полному устранению активности миРНК. Попытка использовать комбинации имитаций миРНК или антимиров миРНК для выяснения сигналов кластерной сети миРНК оказалась трудоемкой и трудной для интерпретации. Таким образом, включение технологии редактирования генов CRISPR для опроса о том, как члены миРНК взаимодействуют в данном некодирующем геномном кластере, позволит исследователям получить более четкое представление о том, как некодирующие РНК влияют на сигнальные пути заболевания, и обещает иметь огромные последствия в области диагностики и открытия лекарств.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Acknowledgments

Клеточные линии PC3-ML были любезно предоставлены Марком Стерном (Медицинский колледж Университета Дрекселя). Джастин Токси помогал в генотипировании ПЦР. Эта работа была поддержана грантом Фонда Бридана Адамса, Фондом трансляционных исследований Райана и грантом Совета по исследованиям в области здравоохранения Содружества (CHRB-274-11-20) для AE-K.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 10⁷ TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Biology

Инструмент редактирования генов CRISPR для анализа сети кластеров микроРНК

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Representative Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

Tags

Cite this Article

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.