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Biology

Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho de edição de genes de edição de genes (CRISPR) regularmente interespaçado de alto rendimento para análise de rede de clusters microRNA que permite a geração rápida de um painel de linhas celulares geneticamente modificadas carregando combinações únicas de exclusão de membros de cluster miRNA de até 35 kb dentro de um único experimento.

Abstract

MicroRNAs (miRNAs) surgiram como importantes reguladores celulares (supressores tumorais, fatores pró-oncogênicos) de câncer e metástase. A maioria dos estudos publicados se concentra em um único miRNA ao caracterizar o papel de pequenas RNAs no câncer. No entanto, ~30% dos genes miRNA humanos estão organizados em unidades agrupadas que são muitas vezes co-expressas, indicando um sistema complexo e coordenado de regulação de RNA não codificadora. Uma subescência mais clara de como as redes miRNA agrupadas funcionam cooperativamente para regular o crescimento do tumor, a agressividade do câncer e a resistência a medicamentos é necessária antes de traduzir pequenas RNAs não codificadas para a clínica.

O uso de um procedimento de edição de genes mediados regularmente interespaçoados (CRISPR) tem sido empregado para estudar o papel oncogênico de um aglomerado genômico de sete genes miRNA localizados dentro de um lócus de ~35.000 bp no contexto do câncer de próstata. Para esta abordagem, as linhas de células cancerígenas humanas foram infectadas com um vetor de lentivírus para doxycycline (DOX) indutível nuclease Cas9 cultivada em meio contendo DOX por 48 h. As células foram posteriormente co-transinfetadas com nICIR RNA (tracrRNA) sintético transativante (tracrRNA) complexados com oligonucleotídeos de RNA CRISPR (crRNA) específicos do local para permitir a rápida geração de linhas de células cancerosas carregando toda a exclusão do cluster miRNA e exclusões individuais ou combinadas do cluster genético miRNA dentro de um único experimento.

As vantagens deste sistema de edição de genes de alto rendimento são a capacidade de evitar subcloning vetorial de DNA demorado, a flexibilidade na transfectação de células com combinações de RNA guia única em um formato de 24 poços e a genotipagem pcr de menor custo usando lisatos de células brutas. Estudos que utilizam essa abordagem simplificada prometem descobrir redundâncias funcionais e interações sinérgicas/antagônicas entre membros do cluster miRNA, o que ajudará a caracterizar as complexas pequenas redes de RNA não codificadoras envolvidas em doenças humanas e informar melhor o design terapêutico futuro.

Introduction

São necessárias melhores ferramentas de pesquisa para investigar a contribuição de RNAs não codificadoras em doenças humanas. A distritação miRNA é frequentemente observada em distúrbios humanos, como o câncer, ao comparar os perfis de expressão desses pequenos RNAs não codificados nos tecidos e fluidos corporais (por exemplo, sangue, urina) de pacientes com câncer versus não-câncer, indivíduos saudáveis, empregando microarrays, PCR quantitativo em tempo real (qRT-PCR), e tecnologias de sequenciamento profundo de última geração 1,2 . Trabalhos recentes caracterizaram um grande subconjunto desses miRNAs como supressor de tumor, fatores oncogênicos e metástases que controlam a formação do tumor, a progressão da doença e a resistência a medicamentos. Superexpressão experimental e/ou baixa regulação/perda de miRNAs resultam em consequências funcionais e pleiotrópicos na célula, refletindo a ampla gama de atividades associadas ao câncer que essas RNAs não codificadas coordenam - crescimento, apoptose, diferenciação, remodelação da cromatina, angiogênese, epitelial para transições mesenquimais (EMT) e MET transições, metabolismo e resposta imune3.

Os MiRNAs são codificados como genes únicos ou residem em aglomerados genômicos, que são transcritos no núcleo e extensivamente processados antes de gerar as espécies de nucleotídeos de ~22 nucleotídeos (nt) de nucleotídeos biologicamente maduros e de fio único (nt) localizadas no citoplasma4. Esses pequenos RNAs exercem seus efeitos pós-transcrição e agem como reguladores genéticos negativos que se ligam aos alvos do RNA mensageiro (mRNA) de forma específica para trazer o complexo de silenciamento catalítico induzido pelo RNA (RISC) para o site mRNA, resultando em degradação do mRNA e/ou um bloco na tradução de proteínas. MiRNAs são uma classe extremamente abundante de RNAs não codificadoras em sistemas animais, e existem 2.654 miRNAs maduras no genoma humano (versão miRBase 22.1)5. Os MiRNAs normalmente associam-se à complementaridade incompleta aos seus alvos mRNA4. Portanto, um único miRNA pode regular dezenas a centenas de alvos mRNA distintos e impactar funcionalmente uma grande variedade de vias biológicas. Para aumentar a complexidade dos mecanismos baseados em miRNA, um único mRNA pode ser regulado por múltiplos miRNAs distintos. É, portanto, desafiador investigar como a desregulação do miRNA interrompe o equilíbrio homeostático do corpo e leva à malignidade humana.

A maioria dos estudos publicados se concentrou em um único miRNA ao caracterizar seu papel em eventos de doenças. No entanto, ~30% dos genes miRNA humanos estão organizados em unidades agrupadas (tipicamente ~10 quilobases [kb]) que são frequentemente transcritas na mesma orientação e co-expressas, indicando um sistema coordenado e complexo de regulação de RNA não codificação6. O maior aglomerado de miRNA humanos policistrônico é o cluster 14q32 composto por 54 precursores de miRNA. Uma das unidades de miRNA agrupadas mais bem estudadas associadas a cânceres humanos é o aglomerado policistrônico miR-17-92 composto por miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 e miR-92-1 residindo dentro do intron 3 do RNA não codificador, c13orf25. O cluster miR-17-92 é frequentemente amplificado em malignidades hematopoiéticas e superexpresso em tumores sólidos e estabeleceu papéis oncogênicos na promoção da progressão do ciclo celular, apoptose e angiogênese7. Além disso, o tumor supressivo miR-15a e miR-16-1 localizados dentro do intron do gene não codificador Leu2 é frequentemente excluído em leucemias e rebaixado em uma grande gama de cânceres, funcionando para bloquear o crescimento do tumor, visando o gene antipoptótico BCL2 e genes adicionais de progressão do ciclo celular8. O cluster miR-888 é elevado em pacientes com câncer de próstata de alto grau e consiste em sete genes miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) localizados no cromossomo humano Xq27.3 9,10.

O cluster miR-888 mapeia dentro do lócus HPCX1 (Câncer de Próstata Hereditário, X-ligado 1) abrangendo Xq27-2, que foi identificado pela análise de linkage dos pedigrees familiares de câncer de próstata hereditário 11,12,13,14,15,29. A caracterização funcional de membros individuais miR-888 agrupados usando ferramentas convencionais de misexpressão miRNA - miRNA imita e inibidores antissamerais - indicou que esses miRNAs desempenham papéis sobrepostos na regulação do crescimento do tumor de próstata e invasão 9,10. No entanto, esses métodos experimentais não se prestam facilmente ao estudo de como vários membros miR-888 agrupados agem sinergicamente ou antagonistamente em uma rede de RNA não codificadora para controlar a homeostase tecidual e a progressão do câncer. Este protocolo simplificado descrito usando a tecnologia de edição de genes CRISPR de alto rendimento é modificado para dissecar molecularmente clusters miRNA associados a cânceres humanos (por exemplo, cluster miR-888) para preencher essa lacuna de conhecimento.

Genes bacterianos CRISPR e CRISPR (cas) mediam a imunidade adaptativa contra bacteriófagos16. A descoberta deste antigo sistema de vigilância procaryótica foi rapidamente adaptada como uma ferramenta científica eficiente para atingir facilmente qualquer lócus genômico desejado e fazer alterações de sequência de DNA dentro de uma grande variedade de sistemas animais e tipos de células, tanto in vitro quanto in vivo16,17. Essa técnica tem grande promessa como método eficaz para interrogar redes miRNA no contexto da doença humana. Para isso, este protocolo de edição de genes CRISPR de alta produtividade para estudar o cluster miR-888 abrange ~35 kb no cromossomo X humano em linhas de células de câncer de próstata humanas imortalizadas (LNCaP, PC3-ML) é construído para interrogar como os membros do cluster coordenam caminhos de progressão do câncer. Essa abordagem pode ser aplicada à caracterização de qualquer cluster de miRNA e permite que os pesquisadores gerem rapidamente linhas celulares humanas carregando toda a exclusão do cluster miRNA e exclusões individuais e combinadas do cluster de genes miRNA dentro de um único experimento.

Neste procedimento, são estabelecidas linhas de células estáveis carregando um sistema de expressão lentiviral indutível doxycycline (DOX) que permite ao pesquisador controlar a expressão genética endonuclease associada ao Streptococcus pyogenes CRISPR Cas9 (csn1) através do promotor indutível DOX constitutivo TRE3G. O sistema bipartido Tet-On 3G envolve um fator de alongamento humano constitutivo 1 alfa (hEF1alpha) para conduzir a transcrição tanto do gene Tet-On 3G quanto do gene de resistência blasticidina (BlastR) como uma transcrição bicistronic. A proteína transativadora Tet-On 3G só se liga ao promotor TRE3G na presença do DOX, resultando em uma transcrição robusta do Cas9. Na ausência do DOX, não há nenhuma expressão basal cas9 muito mínima. Portanto, o pesquisador pode induzir uma alta produção de proteínas Cas9 em células cultivadas em mídia suplementada com DOX durante as etapas de edição de genes CRISPR e controle para liberação rápida de proteína CAS9 após a retirada do DOX.

Este protocolo também descreve o design de oligonucleotídeos crispr sintéticos (crRNA) visando regiões que flanqueam todo o cluster miRNA, regiões individuais de grampo de cabelo miRNA (premiRNA) e/ou subconjuntos de genes miRNA dentro do cluster. Cada crRNA projetado contém uma sequência de guias única de 5'terminal 20 nt (complementar à sequência genômica de interesse a ser alvo), seguido por um invariante 22 nt S. sequência de repetição de pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAUGUAUGCUUUG-3') que permite o pareamento de base com o oligonucleotídeos CRISPR18 universal transativante. Juntos, o crRNA enaltado e tracrRNA (proporção 1:1 misto) funcionam como o RNA guia para este protocolo (Figura 1A). Em cada experimento, dois RNAs guia sintético são transfectados em células induzidas pelo DOX para associar e escoltar a proteína Cas9 bacteriana aos locais de DNA genômico (5' e 3') flanqueando a região do cluster miRNA destinada à remoção (Figura 1B).

Uma sequência de motivo adjacente protoespaço (PAM) (5'-NGG-3' para tipo selvagem S. pyogenes Cas9) deve estar presente no genoma celular e localizada imediatamente adjacente à sequência de DNA de 20 nt alvo do guia RNA17. A sequência PAM serve como um sinal de ligação e posiciona a região catalítica da enzima endonuclease Cas9 no local de DNA genômico direcionado, posteriormente levando ao decote de DNA direcionado, de dupla-encalha (ds), localizado ~3 nt rio acima do PAM. O maquinário de reparação de DNA da célula repara as extremidades de DNA rachadas, o que pode resultar em ligadura perfeita, mas muitas vezes a junção final nonhomologous (NHEJ) ocorre, causando pequenas inserções ou exclusões (indels) no local de reparo. Uma vez que os miRNAs são genes não codificadores frequentemente localizados dentro de regiões intergênicas e intrônicas, esses indels têm um baixo risco de criar mutações indesejadas sem sentido/missense.

Ao empregar oligonucleotídeos RNA sintéticos (crRNA enlatado e tracrRNA, razão molar 1:1) codificação para o complexo RNA guia nesses experimentos, esta estratégia de eliminação genética evita o subcloamento vetorial de DNA demorado e permite uma enorme flexibilidade na transfeminação de combinações de RNA guia exclusivo para células em um formato de 24 poços. A preparação de lises de células brutas para a triagem do genótipo PCR também evita métodos caros e demorados de purificação de DNA, ao mesmo tempo em que permite a geração simplificada da linha celular de colônia única e a análise fenotípica. De fato, este protocolo de edição de genes CRISPR de alto rendimento tem sido usado com sucesso para transfetar linhas de células cancerígenas de próstata cultivadas (LNCaP, PC3-ML) com 32 combinações de RNA guia exclusivo em um único experimento e gerar linhas eliminatórias carregando exclusões para toda a região de cluster ~35 kb miR-888; combinações de exclusão menores para membros de cluster miR-888 pertencentes às famílias miR-743 e miR-891a; bem como exclusões para membros miRNA individuais dentro do cluster miR-888. Estudos como esses fornecerão uma subestagem mais clara de como os miRNAs agrupados funcionam cooperativamente para regular o crescimento do tumor, a agressividade e a resistência a medicamentos antes de traduzir miRNAs para a clínica como ferramentas terapêuticas e diagnósticas.

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Protocol

1. Preparação para edição de genes CRISPR e guiar o design do RNA para gerar linhas de células knockout de cluster miRNA

  1. Crie um arquivo de DNA contendo a sequência genômica completa da região de interesse do cluster miRNA (intergênica, intronic) e pelo menos 1 kB de regiões genômicas circundantes usando um programa de software de anotação de sequência de DNA19.
    1. Use uma ferramenta de edição de recursos no arquivo de DNA criado para marcar o lócus de cluster miRNA (intergênico, intronic) e cada sequência individual de grampo de cabelo miRNA pertencente ao cluster miRNA, além de notar outros genes de codificação e não codificação próximos e/ou recursos regulatórios 5,20,21,22.
    2. Certifique-se de que as regiões miRNA destinadas à exclusão não interrompam inadvertidamente genes de codificação de proteínas próximos, genes não codificadores ou elementos importantes de DNA regulatório.
      NOTA: Considere a complexidade genômica (por exemplo, duplicações/fusões de cromossomo) da linha celular utilizada neste protocolo.
  2. Projete crRNAs sintéticas visando 20 nt de sequência de DNA genômico flanqueando todo o cluster miRNA, regiões individuais de grampo de cabelo miRNA (pré-miRNA) e/ou subconjuntos de genes miRNA dentro do cluster usando uma ferramenta de software de design de RNA guia bioinformática (por exemplo,23). Certifique-se de que a enzima Cas9 apropriada seja notada na ferramenta de design RNA guia (ou seja, S. pyogenes Cas9).
    NOTA: O crRNA sintetizado conterá esta sequência de guia única de 5'terminais de 20 nt (complementar ao alvo de DNA) seguida por um invariante 22 nt S. pyogenes sequência de repetição para permitir o emparelhamento de base com o oligonucleotídeo tracrRNA universal sintetizado. Juntos, eles funcionarão como o RNA guia neste protocolo.
    1. Referindo-se ao arquivo de DNA criado (Passo 1.1.), digite ~150 nt de sequência de DNA residindo imediatamente rio acima (5') ou rio abaixo (3') do lócus de pino/cluster miRNA direcionado para exclusão na ferramenta de software de design RNA guia bioinformática23.
      NOTA: A ferramenta de design identificará sequências únicas de 20 nt para o design de oligonucleotídeos crRNA que residem imediatamente adjacentes à sequência PAM (na cadeia de DNA não-alvo) (por exemplo, S. pyogenes Cas9 PAM sequência NGG). Fornecido abaixo é um exemplo de design de crRNA direcionado a um site imediatamente upstream (5') do lócus gene mir-891a (especificamente 5A(891a) discutido na seção de resultados representativos e tabela 1).
      1. Abra a ferramenta de software de design RNAguia 23.
      2. Digite o nome 5A(891a) na janela Enter Name .
      3. Na janela Enter a DNA sequence window, digite 150 nt de sequência genômica residente imediatamente upstream (5') do gene precursor mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGATAGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Verifique a caixa marcada Ativar verificação de especificidade para excluir sites fora de segmentação detectados computacionalmente pelo programa. Escolha o organismo apropriado (ou seja, Humano [Homo sapiens]).
      5. Especifique a enzima Pam correta empregada para os estudos, neste caso, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, para gerar as seguintes configurações padrão: PAM relativa ao alvo: Depois; Sequência repetida: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUG; Relativo ao Guia: 3; Comprimento da sequência do alvo: 20; Corte em relação ao início do alvo 5': Sentido 17 Anti-sentido 17.
      6. Clique no botão Próximo para ver os resultados da síntese de crRNA sintética.
        NOTA: Neste exemplo, o crRNA sugerido a ser sintetizado reconhecerá o alvo de DNA ATACATGCTGATAGTTACAC e será localizado ao lado de PAM:AGG.
    2. Faça referência ao arquivo de DNA (criado na Etapa 1.1.) para determinar as sequências de alvos crRNA 20 nt mais próximas do lócus miRNA a serem excluídas e possuam a maior especificidade para o alvo genômico pretendido.
      1. Use ferramentas de análise de off-targeting computacionais para avaliar a especificidade do crRNA do candidato e prever potenciais sites fora do alvo em loci genômicos não relacionados com a região de interesse do cluster miRNA alvo (por exemplo, 24,25,26,27).
      2. Regisso potencial de resultados fora do alvo para referência posterior quando genotipagem linhas de células clonais CRISPR de uma única colônia por PCR (Passo 4.2.6.).
        NOTA: A extensão da complementaridade da sequência compartilhada entre o oligonucleotídeo crRNA projetado e a sequência de alvos genômica ditará o quão seletivamente a enzima Cas9 corta o genoma naquele lócus. Uma vez que o guia RNA se refere ao alvo genômico em uma direção de 3' a 5', os desencontros no final da sequência de alvos de DNA de 5'' (as primeiras bases 8-10) muitas vezes bloqueiam o decote mediado por Cas9. Se a sequência genômica de alvos compartilhar a hologia com outro lócus genômico, exceto dentro das oito primeiras bases da sequência de DNA, este RNA guia é previsto para ter uma baixa chance de off-targeting neste local.
      3. Projete quatro crRNAs exclusivos para cada lócus miRNA direcionado: dois crRNAs projetados para atingir sequências complementares de DNA imediatamente 5' do grampo/cluster miRNA (5'A, 5'B) e dois crRNAs projetados para atingir sequências complementares de DNA imediatamente 3' do grampo/cluster miRNA (3'A, 3'B).
        NOTA: Ao realizar as transfecções CRISPR (na Seção 3), quatro combinações possíveis de pares de RNA guia 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) serão testadas para cada lócus miRNA direcionado para aumentar a probabilidade de gerar loções de mirna bem sucedidas em um único experimento.
      4. Use uma ferramenta de edição de recursos no arquivo de DNA criado (Passo 1.1.) para marcar a sequência de alvo de DNA (com PAM adjacente) para que cada crRNA projetado seja sintetizado.
  3. Projete e sintetize primers PCR (para frente, para trás) flanqueando as regiões de cluster miRNA direcionadas para genotipagem de linhas celulares CRISPR (e rotular os primers no arquivo de DNA criado).
    1. Para as linhas celulares genotipadas que carregam pequenas exclusões genômicas para miRNAs estreitamente agrupadas ou individuais, projete primers PCR (para a frente, reverso) residentes aproximadamente 150 bp em cada lado da região de cleavage Cas9/knockout que permitirá a detecção tanto do tipo selvagem (~600 bp) quanto de fragmentos de DNA knockout (~300 bp) em uma única reação pcr via eletrofose gel.
    2. Para as linhas celulares genotipagem que carregam grandes exclusões genômicas para combinações precursoras de miRNA ou todo o cluster miRNA, projete novamente primers PCR (para frente, reverso) residindo aproximadamente 150 bp em cada lado do site de decote/nocaute Cas9. Observe que, se a exclusão do cluster miRNA alvo se estender >4 kb de comprimento, a reação do PCR provavelmente só detectará o fragmento menor (~300 bp) de DNA de nocaute, mas não o fragmento de DNA do tipo selvagem. Portanto, projete primers PCR adicionais (para frente, reverso) que possam detectar a presença ou ausência de genes internos de cluster miRNA para ajudar no processo de triagem e validar para linhas celulares de nocaute homozigos.

2. Geração de linhas de células lentivirais estáveis carregando o de expressão Cas9 indutível do DOX

NOTA: Realize todo o trabalho de cultura celular e vírus em uma capa de biossegurança certificada usando procedimentos BSL2 e técnica asséptica.

  1. Determine o tipo de linha celular apropriada para os estudos CRISPR e mídia de crescimento preferencial.
    NOTA: Este protocolo foi desenvolvido para as linhas de células cancerígenas da próstata humana LNCaP (meio preferencial: RPMI, 10% soro bovino fetal [FBS]) e PC3-ML (meio preferencial: DMEM, 10% FBS).
  2. Realize uma curva de "morte" blasticidina para determinar a concentração ideal de drogas para selecionar para células infectadas por lentivírus que carregam o gene de resistência blasticidin (Passo 2.3.).
    1. As células da placa em 11 poços de uma placa de 24 poços e crescem a 37 °C, 5% de CO2 no meio preferido até aproximadamente 75% confluentes.
    2. Diluir o blasticidina (estoque de trabalho 1 mg/mL) no meio preferencial com uma concentração final variando de 0, 1, a 10 μg/mL e diluído em incrementos de 1 μg/mL.
    3. Rotule os poços da placa semeada de 24 poços de 1 a 11. Remova o meio de crescimento dos poços e substitua-se pelas concentrações blasticidina apropriadas.
    4. Troque o meio com as concentrações apropriadas de blasticidin a cada dois dias durante 7-10 dias.
    5. Examine as células diariamente durante o curso de tempo e determine a concentração mínima de blasticidina necessária para matar todas as células dentro de 5-7 dias.
      NOTA: Uma curva blasticidin "kill" precisará ser realizada para cada linha celular específica empregada para os experimentos de edição de genes CRISPR.
  3. Infecte as células com lentivírus carregando o de expressão Cas9 indutível do DOX e realize a seleção blasticidina usando a concentração ideal determinada na Etapa 2.2.
    1. Em três poços de placa de 6 poços, a semente 5 × 104 células por poço e cresce no meio preferido a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite (ON).
    2. No dia seguinte, descongele o vetor de expressão de lentivírus para Cas9 indutível do DOX (Lenti-iCas9) no gelo. Misture suavemente (não partículas de vírus vórtices).
      NOTA: Armazene o lentivírus em alíquotas a -80 °C para evitar múltiplos ciclos de congelamento/degelo, o que diminuirá os títulos virais e a eficiência da infecção.
    3. Calcule o volume necessário para transduzir 5 × 104 células com vírus em uma multiplicidade de infecção de 0,3 (MOI = 0,3) com base na concentração de titer viral.
    4. Pipet o volume de vírus apropriado em 250 μL (por poço) de meio preferencial livre de soro e sem antibióticos complementado com brometo hexadimetrino de 0,8 μg/mL. Misture suavemente.
      NOTA: Brometo de hexadimetrina é um polímero cationic encontrado para aumentar a adsorção viral e eficiência de infecção.
    5. Remova o meio. Adicione os 250 μL de meio de transdução preparado com o vírus Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) às células e incubar ON a 37 °C, 5% de CO2. (Encurtar o tempo de incubação para 4-6 h se as células apresentarem efeitos tóxicos relacionados ao vírus.)
    6. Substitua o meio por meio preferencial fresco e permita que as células se recuperem por 1-2 dias.
    7. Realize a seleção de blasticidin nas células infectadas por 10-14 dias usando a concentração ideal de blasticidina derivada da curva "kill" descrita no Passo 2.2.
      1. Em paralelo, cresçam as células não infectadas em meio com a concentração ideal de blasticidina para serem usadas como um controle positivo para a seleção viral.
    8. Altere o meio complementado com a concentração ideal de blasticidina a cada 3 dias durante o curso de tempo de seleção para remover células mortas.
      NOTA: Somente as células que sobreviverem à seleção blasticidina terão integrado o vetor lentiviral.
    9. Expanda as linhas celulares Lenti-iCas9 selecionadas por blasticidina.
      NOTA: Registo o número da passagem do celular em cada expansão.
      1. Congele uma porção das células Lenti-iCas9 em meio preferencial suplementado com sulfóxido de dimetil de 10% (DMSO) para armazenamento criovial de longo prazo.
      2. Analise uma porção das células Lenti-iCas9 por mancha ocidental9 para identificar a linha celular que exibe os níveis de proteína Cas9 indutíveis do DOX mais robustos (ver Passo 2.3.).
  4. Realize uma curva de concentração de doxiciclina em linhas celulares Lenti-iCas9 recém-estabelecidas para determinar as condições ideais para a indução da proteína Cas9.
    1. Configure quatro placas independentes de 6 poços para cada linha celular testada para realizar este curso de tempo de concentração do DOX. Placa 5 × 104 células por poço de cada placa de 6 poços e crescem a 37 °C, 5% de CO2 no meio preferido por 24 h.
    2. Diluir DOX (estoque de trabalho 1 mg/mL) no meio preferencial com uma curva de concentração do DOX final variando de 0, 50, 100, 150, 250 a 500 ng/mL.
    3. Rotule os poços de cada placa semeada de 6 poços de 1 a 6. Remova o meio e substitua-o pelas concentrações DOX apropriadas. Cultivar placas 1-4 até os seguintes pontos de tempo: 24 h, 48 h e indução DOX 72 h; e 120 h pós retirada do DOX (inicialmente 72 h induzida por DOX).
    4. Colher os poços da placa em cada ponto de tempo usando métodos apropriados (por exemplo, trippsinização). Armazene as pelotas de celular a -80 °C. Processe as pelotas de célula no buffer RIPA para isolamento de liseto e análise de manchas ocidentais Cas9.
      1. Execute 40 μg de lise celular para cada amostra do curso de tempo de indução do DOX usando um gel Bis-Tris desnaturing de 4%-12% e transfira as proteínas para uma membrana imunoblot.
      2. Hibridize a membrana do imunobloto com um anticorpo primário contra Cas9 para detectar a proteína de 160 kDa. Normalize os níveis de Cas9 usando um gene de limpeza como GAPDH (37 kDa).
    5. Com base nos resultados da mancha ocidental, determine a concentração ideal do DOX para induzir Cas9 nas linhas celulares Lenti-iCas9.
      NOTA: Este curso de tempo também revelará o quão rigorosamente a expressão Cas9 é regulada após a remoção do DOX pós 120 h.
    6. Estabeleça colônias unicelulares para as linhas celulares Lenti-iCas9 mostrando uma expressão robusta de proteína Cas9 para otimizar as transfecções CRISPR (na Seção 3).

3. Realizando reações CRISPR por indução Cas9 e transfecção de RNA guia sintético de células usando um formato de alto rendimento

NOTA: Um diagrama de fluxo de trabalho é mostrado na Figura 1.

  1. No papel, mapeie as combinações de pares de crRNA que serão transfeinadas em cada poço de uma placa de 24 poços visando todo o cluster miRNA, várias combinações de genes miRNA agrupados, bem como membros individuais do cluster miRNA.
    1. No mapa, rotule quatro poços por lócus miRNA direcionado. Cada um bem representa uma reação de transfecção, com dois crRNAs únicos posicionados 5' e 3' do lócus genômico miRNA desejado e o tracrRNA (razão molar 1:1).
    2. Certifique-se de que cada um dos quatro poços rotulados represente um par de crRNA exclusivo para transfecção (por exemplo, 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      NOTA: O design de dois crRNAs de 5' e dois crRNAs de 3' flanqueando cada lócus miRNA (Seção 1) permite a geração de quatro possíveis pares de RNA guia de 5' e 3' na reação de transfecção.
  2. Emplaque a linha celular Lenti-iCas9 em 5 x 104 células/poço de uma placa de 24 poços no meio preferido contendo a concentração OTIMIZAda DOX (determinada na Etapa 2.4.). Cresça as células por 24-48 h a 37 °C, 5% de CO2 para induzir a expressão proteica Cas9.
  3. Transfeito as células Lenti-iCas9 com os RNAs guias preparados de 5' e 3'.
    1. Reconstitua os oligonucleotídeos de crRNA e tracrRNA sintetizados com água sem nuclease a uma concentração de estoque de 10 μM. Armazenar a -80 °C a longo prazo.
    2. Rotule quatro tubos de microcentrifuuge de 1,5 mL por locus miRNA direcionado com base no mapa experimental projetado na Etapa 3.1., representando as quatro combinações possíveis de pares de crRNA de 5' e 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B; 5'B + 3'B).
    3. Em cada tubo, misture uma razão molar de 1:1 de tracrRNA e crRNAs únicas (5' e 3') para formar o complexo de RNA guia de 2 μM usando a reação seguinte (volume final de 10 μL):
      1. Adicionar 2,5 μL de tracrRNA (10 μM de estoque), 1,25 μL do crRNA posicionado de 5''(10 μM de estoque), 1,25 μL do crRNA de 3' posicionado (10 μM de estoque) e 5 μL de 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 a um tubo centrífuga de 1,5 mL. Microcentrifuuge para 30 s a 16.000 × g para misturar. Incubar em temperatura ambiente (RT) por 5 min.
    4. A cada tubo, adicione 40 μL de meio de soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM) aos 10 μL de reação complexa RNA guia (volume total de 50 μL). Misture suavemente por pipetting para cima e para baixo.
    5. Em um tubo de centrífugas de 1,5 mL limpo, misture 2 μL do reagente de transfecção28 (ver NOTA 3.3.5.1.) e 48 μL de meio soro reduzido (por exemplo, Opti-MEM, volume final de 50 μL) suavemente por tubulação para cima e para baixo. Incubar na RT por 5 min.
      1. Prepare uma mistura mestre do reagente de transfecção multiplicando o reagente (2 μL) e o meio sérico reduzido (por exemplo, Opti-MEM, 48 μL) pelo número de poços a serem transfecidos, além de 10% de volume extra para contabilizar pequenas imprecisões de tubulação.
        NOTA: Selecione um reagente de transfecção otimizado para pequenas transfecções de oligonucleotídeos de RNA e RNA CRISPR, bem como para a linha celular tipo28.
    6. A cada tubo contendo os 50 μL de guia RNA mix (a partir da etapa 3.3.4.), adicione os 50 μL do reagente de transfecção diluído (da Etapa 3.3.5.). Enconca a mistura lentamente para cima e para baixo uma vez para misturar. Incubar na RT por 20 minutos.
    7. Adicione 400 μL de meio livre de antibióticos complementados com DOX (concentração ideal) em cada tubo contendo os 100 μL da mistura guia RNA/transfecção. Pipeta suavemente para misturar.
  4. Remova o meio das células Lenti-iCas9 induzidas pelo DOX (Passo 3.2.). Adicione 500 μL de media/DOX/guia RNA/transfecção com base no mapa experimental da placa de 24 poços (Passo 3.1.). Incubar as células transfeinadas por 48 h a 37 °C, 5% de CO2.
  5. Substitua o meio pelo meio preferido fresco sem DOX (para limpar a proteína Cas9 das células). Deixe as células se recuperarem por mais 24-48 h a 37 °C, 5% de CO2.
  6. Colher as células transfeinadas (trippsinização) e preparar-se para genotipagem e diluições unicelulares.
    NOTA: As células representam uma população mista contendo células do tipo selvagem editadas e não transtravadas por genes CRISPR. Esta etapa determinará a eficiência da edição crispr antes de investir tempo/recursos na expansão de colônias unicelulares.
    1. Lave as células 1x com 1 mL de soro fisiológico tamponado por fosfato (PBS). Incubar as células em 100 μL de trippsina por 5 min a 37 °C, 5% DE CO2 e transferir as células para um tubo de centrífuga de 1,5 mL limpo contendo 1 mL de meio.
    2. Inverta para misturar e microcentificar as células por 5 min a 200 × g a 20 °C. Remova o meio e resuspende a pelota da célula em 1 mL de PBS.
    3. Microcentrifuugar as células lavadas por 5 min a 200 × g a 20 °C. Remova o PBS e resuspense a pelota da célula em 150 μL do meio preferido.
  7. Determine o número celular por microliter dos 150 μL de células resuspended usando um hemocitómetro ou instrumento automatizado de contagem de células.
  8. Separe os 150 μL de células resuspended em três partes.
    1. Congelar 1/3 de células transfeinadas (50 μL) em média mais 10% DMSO (volume final de 150 μL) em criovials para expansão futura/armazenamento a longo prazo.
    2. Transfira 1/3 de células transfeinadas (50 μL) em um tubo PCR limpo de 0,2 mL para genotipagem.
      1. Microcentrize as células por 5 min a 200 × g a 4 °C e remova o meio.
      2. Resuspense a pelota de célula em 100 μL de PBS.
      3. Microcentrar as células por 5 min a 200 × g a 4 °C e remover o PBS. Armazenar pelotas de células de população mista a longo prazo a -80 °C.
      4. Processe a pelota celular para genotipagem usando o fluxo de trabalho na Seção 4.
    3. Prepare o 1/3 final das células (50 μL) para diluição e revestimento em um formato de placa de 96 poços para gerar colônias unicelulares.
      1. Com base na contagem de células da etapa 3.7., calcule as diluições necessárias para atingir 10, 5, 2 e 1 células(s) em 100 μL de médio por poço de uma placa de 96 poços.
      2. Utilizando um multi-tubulator de 12 canais e um reservatório de reagente estéril, adicione 100 μL de células diluídas por poço a duas fileiras da placa (24 poços no total) para cada diluição (10, 5, 2 ou 1 célula por poço). Permita que 4-6 semanas para as células cresçam para confluência para a expansão de colônias unicelulares. Observe as células semanalmente sob um microscópio leve e observe se as colônias representam colônias de células únicas ou múltiplas.
      3. Colete ~10-15 colônias unicelulares para genotipagem (Seção 4). Identifique pelo menos três linhas independentes, eliminatórias, colônias unicelulares para cada lócus miRNA direcionado. Mantenha linhas de célula única tipo selvagem como controles.
        NOTA: O número de triagem dependerá do tipo de linha celular e do impacto do fenótipo de nocaute miRNA no crescimento/viabilidade celular.

4. Genotipagem pcr de linhas celulares CRISPR usando lises de células brutas

  1. Colher colônias individuais de células únicas de poços quase confluentes de uma placa de 96 poços.
    NOTA: A remoção do meio/PBS descrito nessas etapas pode ser realizada manualmente usando um aspirador de vácuo no gabinete de biossegurança, mas tenha cuidado para evitar contaminação cruzada. Use uma nova ponta pipetman "amarela" estéril de 200 μL para cada poço da placa de 96 poços ao aspirar, na qual cada ponta amarela trocada é firmemente colocada na extremidade de uma pipeta de pasto de vidro estéril presa ao aspirador de vácuo.
    1. Lave os poços 1x com 100 μL de PBS. Aspire a PBS.
    2. Adicione 50 μL de trippsina e incubar por 2-5 min a 37 °C, 5% de CO2.
    3. Tubo suavemente para cima e para baixo e transfira as células resuspended em um tubo centrífugo de 1,5 mL contendo 1 mL de meio.
    4. Inverta para misturar e dotecer suavemente as células em uma microcentrifusagem por 5 min a 200 × g a 20 °C.
    5. Retire o meio e adicione 1 mL de PBS. Gire suavemente o tubo para interromper a pelota e inverta várias vezes para misturar.
    6. Microcentrifuuge por 5 min a 200 × g a 20 °C para pelotar as células.
    7. Remova o PBS e resuspense a pelota em 300 μL de PBS fresco.
    8. Divida a amostra de 300 μL em duas partes.
      1. Transfira 200 μL das células (2/3 da pelota) para um poço de uma placa de 24 poços contendo 1 mL do meio preferido. Uma vez validado o genótipo, use essas células para expandir as linhas de células de nocaute mediadas pelo CRISPR para análise funcional.
      2. Transfira 100 μL das células (1/3 da pelota) para um tubo PCR de 0,2 mL. Microcentrifuuge por 5 min a 3.000 x g a 4 °C. Remova o PBS. Armazene a pelota a -80 °C.
  2. Prepare as células brutas para genotipagem e análise de sequência usando os primers PCR projetados na Etapa 1.3. Inclua os lises celulares preparados a partir de células não transtravas nesses experimentos para usar como controles positivos do tipo selvagem.
    1. Resuspenque a pelota celular em 4 μL de tampão de polimerase de DNA 5x (ver a Tabela de Materiais, concentração final 1x), 1 μL de Proteinase K (20 ng/mL estoque), 1 μL de RNase A (10 ng/mL estoque) e água sem nuclease até um volume total de 20 μL.
    2. Lise as células em um termociclador usando um programa PCR: 56 °C para 30 min e 96 °C por 5 min. Armazene as células a -20 °C.
    3. Execute uma reação pcr usando os primers PCR projetados (para frente, para trás) que flanqueiam os locais-alvo do guia RNA 5' e 3' (Tabela 1).
      NOTA: As condições do tampão de polimerase de DNA e do termociclador dependerão da enzima de polimerase de DNA Taq usada para a reação pcr. Este protocolo foi otimizado para uma Polimerase de DNA Phusion HF.
      1. Configure a mistura de reação pcr no gelo: 5 μL de 5x buffer de polimerase de DNA, 0,5 μL de primer PCR dianteiro (10 μM de estoque), 0,5 μL de primer PCR reverso (10 μM de estoque), 0,5 μL de 10 mM dNTPs, 0,25 μL de DNA Polymerase, 1-4 μL de liseto celular e água sem nuclease até um volume total de 25 μL.
      2. Execute a reação pcr em um termociclador usando o programa: 98 °C para 3 min, e 35 ciclos de 98 °C para 10 s, 62 °C para 15 s, 72 °C para 15 s e depois 72 °C para 10 min. Mantenha por 4 °C. Consulte o NOTE 4.2.3. acima.
    4. Coloque os produtos PCR em um gel de 1% de agarose para análise de eletroforese.
    5. Extrair DNA dos fragmentos isolados de PCR do tamanho molecular previsto para os genótipos de nocaute (e tipo selvagem). Prepare as amostras para sequenciamento de DNA.
    6. Valide que a reação CRISPR foi bem sucedida e realize o sequenciamento de DNA dos fragmentos de PCR isolados para identificar o local do decote Cas9 e confirmar a exclusão do lócus miRNA.
      1. Isole pelo menos três linhas de células knockout independentes para cada lócus miRNA alvo do CRISPR. Reter linhas celulares tipo selvagem (e heterozigoso) para usar como controles em estudos funcionais a jusante.
      2. Realize a análise qRT-PCR ou northern blot para confirmar que as linhas de células knockout não expressam miRNA maduro para o lócus excluído.
        NOTA: O sequenciamento do genoma inteiro (WGS) é o método mais definitivo para validar a edição e o off-targeting de genes CRISPR.
      3. Teste para efeitos crispr fora de segmentação por PCR, que foram previstos computacionalmente (Passo 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Se a triagem extensiva de colônias unicelulares resultar apenas em genótipos heterozigosos, repita a transfecção guia do RNA nas linhas heterozigógenas unicelulares.
        NOTA: A incapacidade de obter linhas celulares homozigos podem indicar efeitos letais devido à perda de miRNA ou à complexidade genômica inerente (por exemplo, duplicações/fusões de cromossomo) da linha celular parental que requerem uma análise mais aprofundada.

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Representative Results

Este protocolo de exclusão CRISPR de alta produtividade foi empregado com sucesso usando transfecção de linhas de células cancerígenas humanas Indutíveis Cas9 e PC3-ML com guia de oligonucleotídeo sintético RNAs visando o cluster miR-888, que foram estudados no contexto do câncer de próstata. O cluster miR-888 foi inicialmente identificado em uma tela de perfil de expressão como sendo elevado em pacientes com câncer de próstata com doença de alto grau em comparação com pacientes de baixo grau e não-câncer 9,10. O cluster miR-888, com 35.124 bp, consiste em sete miRNAs (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b e -891a) no cromossomo humano Xq27.3 (Figura 2A). Este lócus está dentro do HPCX1 (Câncer de Próstata Hereditária, Xq27-28), que está associado ao câncer de próstata hereditário 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b e -892c compartilham a selélogia sequencial e pertencem à família miR-743 conservada por mamíferos. Os membros do cluster miR-891a e miR-891b compartilham apenas a seleção de seleção e pertencem à família miR-891 específica de primatas. A organização genômica do cluster miR-888 é conservada em primatas, implicando a conservação funcional de uma importante rede de sinalização30.

Trabalhos anteriores usando superexpressão experimental (miRNA imita) e inibição (oligonucleotídeos antissamerados) para avaliar a atividade individual de membros do cluster miR-888 revelaram um papel sobreposto para todos os membros do grupo miR-888 para promover a invasão celular do câncer de próstata usando ensaiosde câmara de Matrigel Boyden 9,10. Mais notavelmente, o miR-888 e o miR-891a funcionaram de forma semelhante para induzir o crescimento das células da próstata (ensaios WST-1), acelerar a carga do tumor de próstata em xenoenxertos de camundongos e regular alvos comuns (por exemplo, TIMP-2)9,10. No entanto, este trabalho sugeriu uma interação mais complexa entre os membros do cluster miR-888. Por exemplo, o miR-888 e o miR-891a mostraram efeitos sinérgicos na promoção da proliferação de células de próstata PC3-N, enquanto tanto o miR-890 quanto o miR-892c apresentaram efeitos inibitórios de crescimento usando os ensaios WST-19. Portanto, este protocolo CRISPR de alto rendimento foi empregado para interrogar geneticamente a rede de clusters miR-888 no contexto do câncer de próstata.

O fluxo de trabalho descrito para edição de genes CRISPR Cas9 (Figura 1) permitiu o teste de 32 reações únicas de transfecção de RNA guia CRISPR em um único experimento usando um formato de 24 poços. Este protocolo resultou na identificação bem sucedida de um painel de linhas de células eliminatórias de câncer de próstata humana carregando exclusões para todo o cluster miR-888, combinações específicas de membros de cluster miRNA e membros individuais de miRNA. A geração de linhas celulares Cas9 indutíveis estáveis foi estabelecida pela primeira vez. Resumidamente, as células cancerígenas humanas de próstata PC3-ML e LNCaP foram infectadas com um vetor de lentivírus indutível do DOX (Lenti-iCas9; EditR Indutível Lentiviral hEF1aBlastCas9 Partículas nuclease; MOI 0.3) para 6 h (LNCaP) ou durante a noite (PC3-ML), dependendo da suscetibilidade da linha celular inerente para a toxicidade do vírus.

As linhas celulares infectadas posteriormente foram submetidas à seleção de blasticidina (7,5 μg/mL) e expansão de colônias unicelulares. Estudos de manchas ocidentais foram utilizados para selecionar as linhas celulares PC3-ML e LNCaP Lenti-iCas9 de colônia única, exibindo a expressão Cas9 mais robusta com base em um curso de tempo de indução do DOX (Figura 2A). Este sistema indutível Lentiviral Cas9 foi fortemente controlado, e, após a retirada do DOX por 120 h, a maior parte da proteína Cas9 foi limpa das células (Figura 2A). Uma curva de concentração DOX determinou que 250 ng/mL DOX era a dose ideal para induzir uma expressão robusta de proteína Cas9 nestas linhas de células de próstata Lenti-iCas9 (Figura 2B). Usando uma ferramenta de design de crRNA on-line23, crRNAs exclusivas (dois crRNAs de 5' e dois crRNAs de 3' flanqueando cada lócus de nocaute miRNA planejado para permitir quatro possíveis combinações de RNA guia de 5' e 3' e 3') foram projetadas que tinham como alvo toda a região de cluster ~35 kb miR-888; combinações menores de cluster dentro da família miR-743 ou da família miR-891; bem como exclusões individuais de miRNA (miR-888, -891a) (Figura 3A). Ao realizar os experimentos CRISPR, as linhas celulares Lenti-iCas9 do câncer de próstata humano foram cultivadas em meio suplementado com 250 ng/mL DOX por 48 h para induzir a expressão Cas9.

As células foram então transfectadas em um formato de placa de 24 poços com o tracrRNA universal sintético complexo (razão molar 1:1) com um conjunto único de crRNAs genômicas de 5' e 3' genômicas (Tabela 2). O DOX foi removido da cultura celular média 48 h pós transfecção para limpar a proteína Cas9 das células cancerosas da próstata. Os poços foram colhidos 48h depois (96h pós transfecção) e um terço de cada pelota de célula colhida foi preparado para genotipagem pcr usando lises de células brutas (Tabela 3). A análise de eletroforese gel das reações do PCR indicou que o tamanho do fragmento de DNA previsto representando o genótipo nocaute foi amplificado para cada transfecção CRISPR (Figura 3B). O sequenciamento de DNA desses fragmentos de PCR de nocaute isolado confirmou que as RNAs guias transfectadas de 5' e 3' direcionaram o decote/ligadura Cas9 ~3 nt a montante dos locais PAM e validaram a perda genômica do lócus miRNA direcionado (exemplo representativo mostrado na Figura 4C). Uma vez que o aglomerado miR-888 reside em uma região intergênica do cromossomo X (longe de qualquer genes codificadores de proteínas), não era previsto que as linhas de células eliminatórias, que muitas vezes possuíam INDELs no local do decote Cas9 devido ao NHEJ, causariam efeitos artefatos a jusante.

Embora as reações de transfecção crispr tenham sido bem sucedidas (Figura 3B), as células transfeccionadas representavam uma população de células mistas de células transfecidas (nocaute) e não transtravadas (tipo selvagem). Essa população também representou uma mistura de células que carregavam exclusões homozigosas e heterozigosas para o lobo miRNA direcionado. As linhas de células cancerígenas de câncer de próstata LNCaP e PC3 são derivadas de machos que possuem karyótipos anormais que incluem dois cromossomos X31,32. Portanto, uma parte de cada reação de transfecção celular foi diluída em série em um formato de placa de 96 poços para obter linhas de colônia unicelular. Essas colônias foram rastreadas pelo PCR para selecionar linhas celulares homozigos que não tinham todas as cópias do lócus miRNA alvo.

Esse procedimento foi importante a ser seguido em tempo hábil, uma vez que dados anteriores indicaram um papel para o grupo miR-888 na promoção do crescimento das células tumorais e da agressividade da doença. As células cancerígenas que carregam exclusões CRISPR para os membros do cluster miR-888 foram previstas para crescer mais lentamente do que as células do tipo selvagem. Uma preocupação válida era que, com o tempo, os poços RNA-transfectados guia, contendo uma população mista de miRNA knockout e células do tipo selvagem, resultariam em células do tipo selvagem rapidamente superando as células mutantes comprometidas na cultura. Isso foi notado para ocorrer e foi especialmente pronunciado em experimentos usando as linhas de células PC3-ML altamente agressivas. Assim, foram realizadas etapas envolvendo diluições seriais para gerar linhas de colônia unicelulares ou preparação celular para criostoragem dentro de 48-72 h após a realização dos experimentos de transfecção crispr para preservar as células eliminatórias nas amostras da população mista.

A parte mais trabalhosa do fluxo de trabalho CRISPR para o cluster miR-888 foi a geração de exclusões de miRNA de colônias homozigais e unicelulares. Um desafio nesse processo foi que as células LNCaP e PC3-ML cultivadas normalmente não prosperavam bem quando banhadas em densidades unicelulares. Além disso, o crescimento celular parecia estar fenotipicamente comprometido após a perda combinatória de membros de cluster miR-888 (e correlacionado com a agressividade da linha celular). Portanto, para algumas das reações de transfecção visando certas combinações de locus miRNA, diluições celulares adicionais (usando um formato de 96 poços) foram necessárias para gerar linhas suficientes de colônias unicelulares para genotipagem. Ao selecionar os genótipos das colônias unicelulares por imagem de gel eletroforese, foi útil comparar a intensidade da banda do tipo selvagem em comparação com os fragmentos de PCR nocaute e determinar se a linha celular era heterozigous (igual intensidade de banda) ou representava uma colônia multi-células (intensidade de banda desigual), que se beneficiaria de rodadas adicionais de diluições unicelulares. Se as colônias de células possuírem fragmentos de PCR de tamanho anormal e inconsistentes com genótipos do tipo selvagem ou nocaute, essas linhas foram eliminadas do estudo.

O sequenciamento de DNA de fragmentos isolados de PCR consistentes para os genótipos do tipo selvagem e nocaute foram revalidados para cada colônia unicelular estabelecida e confirmados usando métodos independentes (ou seja, qRT-PCR, WGS). Em termos da eficiência típica de gerar linhas celulares homozigosas nulas nesses experimentos, isso variou com o lócus miRNA direcionado e o tipo de célula utilizado. Por exemplo, a eficiência na obtenção de linhas eliminatórias mir-891a de colônia única usando LNCaP foi de 30%, mas caiu para ~7% em células PC3-ML. Essa diferença pode ser devido a diferenças inerentes ao tipo celular (por exemplo, as células PC3-ML possuem taxas de divisão/potencial metastático mais elevados do que as células LNCaP). As diferenças de eficiência do CRISPR também podem refletir o impacto funcional da perda de miRNA (por exemplo, miR-891a promove o crescimento celular e a agressividade 9,10) e, assim, fenótipos de nocaute poderiam ser ampliados em linhas celulares mais agressivas, como PC3-ML. A obtenção de linhas de colônia única para exclusões maiores de lócus miRNA do cluster miR-888 apresentou eficiências reduzidas. Não conseguimos determinar se isso foi devido à eliminação de regiões maiores do DNA ou ressaltamos os papéis funcionais essenciais e sobrepostos dos membros miR-888 em células cancerosas da próstata.

A descrição detalhada e a análise fenotípica das linhas celulares de cluster miR-888 expandidas pela colônia de células únicas geradas a partir deste fluxo de trabalho estão em andamento e serão publicadas em outros lugares. Como resultado representativo das exclusões de miRNA geradas nestes estudos de edição de genes CRISPR, os achados das células cancerígenas da próstata LNCaP que carregam uma exclusão individual mir-891a são mostrados. Colônias unicelulares foram genótipadas por PCR e sequência verificada (Figura 4A-C). Não foram analisadas linhas celulares que exibem fragmentos pcr de tamanho anormal (por exemplo, clone L14 H7 mostrado na Figura 4D). Uma vez que as colônias de células únicas e eliminatórias foram obtidas para o lócus mir-891a, foram realizados estudos funcionais. Trabalhos anteriores mostraram que a superexpressão do miR-891a (miRNA imita vetor lentiviral) induz o crescimento das células da próstata9 e, portanto, previu-se que a perda de miR-891a mostraria efeitos recíprocos. Ensaios de proliferação WST-1 comparando mir-891a knockout e células do tipo selvagem confirmaram essa hipótese, e a perda de miR-891a resultou em crescimento desacelerado (Figura 4D,E).

Figure 1
Figura 1: Fluxo de trabalho de edição de genes CRISPR para gerar exclusões de cluster miRNA. (A) O RNA guia consiste nos oligonucleotídeos sintéticos de crRNA e tracrRNA (razão molar mista de 1:1). O oligonucleotídeo crRNA foi projetado para conter uma sequência de guia única de 5'terminal 20 nt (amarelo) complementar ao local de DNA genômico direcionado e é seguido por uma sequência de repetição de estreptococos de 22 nt invariante (verde) que combina com o oligonucleotídeo tracrRNA. Setas vermelhas indicam que os locais de decote de DNA de dupla vertente cas9 tipicamente localizados a montante do PAM. (B) Este fluxo de trabalho experimental retrata um único poço de uma placa de 24 poços. As células infectadas com um vetor cas9 lentivírus indutível do DOX (Lenti-iCas9, MOI 0.3) são cultivadas em médio com DOX por 48 h para induzir a expressão proteica Cas9. Dois RNAs guia sintético (razão molar mista de 1:1 de crRNA::tracrRNA) são transfectados em células induzidas por Cas9. O guia RNAs escolta Cas9 até os locais de DNA genômico (5' e 3') flanqueando a região do cluster miRNA alvo de remoção. As células são preparadas 48 h pós transfecção para diluição usando um formato de 96 poços para gerar colônias unicelulares para genotipagem PCR e análises fenotípicas a jusante. Abreviaturas: CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; miRNA = microRNA; crRNA = RNA CRISPR; tracrRNA = RNA CRISPR de ativação trans; nt = nucleotídeo; Cas9 = Endonuclease associada ao CRISPR; PAM = motivo adjacente protoespaço; DOX = doxiciclina; MOI = multiplicidade de infecção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Linhas celulares cancerígenas que carregam um lentiviral indutível Cas9 indutível de doxiciclina, exibindo uma regulação rigorosa da proteína Cas9. (A) A análise da mancha ocidental mostrou que as linhas celulares PC3-ML do câncer de próstata humano infectadas com o vetor Lenti-iCas9 (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) e cultivadas por 48 h em médio contendo 250 ng/mL DOX expressaram níveis ótimos de proteína Cas9. A expressão Cas9 foi normalizada para a expressão GAPDH. (B) As células PC3-ML cultivadas em média com 250 ng/mL DOX para 48 h e 120 h (+DOX) apresentaram expressão robusta de proteína Cas9. A remoção do DOX da mídia (-DOX) por 120 h (120 h post) resultou no despejo de proteína Cas9, medido pela análise de manchas ocidentais. Resultados semelhantes foram obtidos ao gerar a linha celular LNCaP Lenti-iCas9 (não mostrada). Abreviaturas: CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; Cas9 = Endonuclease associada ao CRISPR; DOX = doxiciclina; MOI = multiplicidade de infecção; GAPDH = glicealdeído 3-fosfato desidrogenase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Design experimental CRISPR de alta produtividade para gerar múltiplas combinações de exclusão de cluster miR-888 em um único experimento. (A) Diagrama do cluster miR-888 localizado no cromossomo humano Xq27.3, indicando os membros da família mamífera-conservado mir-892c, -890, -888, -892a e -892b (caixas azuis) e os membros da família miR-891 específicos de primatas miR-891a e -891b (caixas quilombolas). Oligonucleotídeos de crRNA sintéticos únicos (setas verdes) foram usados para gerar as combinações de nocaute de cluster miR-888. Primers PCR dianteiros e invertidos (pequenos retângulos vermelhos) foram projetados para genótipo de células e tela para nocautes. (B) Este resultado representativo mostra 25 reações CRISPR em células PC3-ML transfectadas (Lenti-iCas9) que tinham como alvo uma gama de combinações de nocaute de cluster miR-888 em um único experimento. Cada poço transfectado de uma placa de 24 poços continha dois gRNAs únicos flanqueando os lados de 5' e 3' do locus genômico miRNA (Δ) (conforme listado na Tabela 2). As células brutas foram preparadas para cada reação CRISPR e genótipo PCR. Fragmentos de PCR isolados migrando nos tamanhos de nocaute previstos por eletroforese de gel foram sequenciados em DNA e validados para a remoção de lócus cas9 e lócus miRNA. Os tamanhos de bp do fragmento WT PCR previstos são indicados entre parênteses, e os tamanhos de fragmentos DE PCR CRISPR KO desejados são mostrados na parte inferior do gel. Abreviaturas: CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; Cas9 = Endonuclease associada ao CRISPR; gRNA = guia RNA; DOX = doxiciclina; bp = par de base; WT = tipo selvagem; KO = nocaute. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Células cancerígenas da próstata excluídas para mir-891a usando edição de genes CRISPR exibindo proliferação suprimida. (A) Design de primers PCR (roxo) e os dois RNAs guia de 5' e dois'' (laranja) visando sequências genômicas flanqueando o gene mir-891a (verde). (B) Genotipagem pcr de células LNCaP transfectadas com RNAs guia indicadas de 5' e 3' confirmaram que as deleções de Δmir-891a foram obtidas para todas as quatro combinações de RNA guia. Os lysatos celulares foram feitos de populações de células mistas 48 h pós transfecção. (C) Fragmentos de PCR foram sequenciados e validados. Um exemplo representativo mostra a sequência de DNA de células transfeinadas tratadas com 5A(891a) e 3B(891a) guia RNAs, resultando no local de decote Cas9 previsto (3 nt upstream do site PAM) e CRISPR Δmir-891a exclusão. (D) Foram obtidas colônias unicelulares e genótipadas de PCR. Clone L14 G9 foi validado como um KO e clone L14 G9 como um WT para o gene mir-891a . (E) miR-891a foi previamente mostrado para induzir o crescimento de células cancerígenas da próstata e, portanto, a perda de miR-891a foi prevista para ter o fenótipo recíproco. Ensaios WST-1 de células cancerígenas da próstata excluídas para mir-891a (L14 G9 [KO], azul) mostraram proliferação suprimida em comparação com células WT (L14 G9 [WT], vermelho). Abreviaturas: CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; Cas9 = Endonuclease associada ao CRISPR; WT = tipo selvagem; KO = nocaute; WST-1 = tetrazolium solúvel em água-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A reação do PCR está configurada no gelo.
Componente Reação de 25 μL Concentração Final
5x Tampão de polimerase de DNA 5 μL 1x
Primer PCR avançado (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
Primer PCR reverso (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
DNTPs de 10 mM 0,5 μL 200 μM
DNA Polymerase (2 U/µL) 0,25 μL 0.125 U/ 25 μL
Liseto de célula bruta 1 - 4 μL variável
Água sem nuclease até 25 μL
Condições do thermocycler para reação pcr:
Passo Temperatura Hora
Desnaturação inicial 98 °C 3 min.
98 °C 10 s
35 ciclos 62 °C 15 s
72 °C 15 s
Extensão final 72 °C 10 min.
Segurar 4 °C

Tabela 1: Condições de reação do PCR para genotipagem de lise bruta. Abreviação: dNTP = desoxynucleotídeos.

Site de exclusão direcionado ao CRISPR Combinação de RNA guia Tipo selvagem (bp) Nocaute (bp) Pares de primer PCR
∆ ClusterFull 5A(891a)+3A(892c)
5B(891a)+3A(892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B(891a)+3B(892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a FWD
892c REV
∆892c/890/888 5A'(888)+3A(892c)
5B'(888)+3A(892c)
5A'(888)+3B(892c)
5B'(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 FWD
892c REV
∆892c/890 3A'(888)+3A(892c)
3B'(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B'(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 FWD
892c REV
∆892b/892a 5A'(888)+5A(892b)
5B'(888)+5A(892b)
5A'(888)+5B(892b)
5B'(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b FWD
888 REV
∆892b/892a/888 5A(892b )+3A'(888)
5A(892b +3B'(888)
5B(892b )+3A'(888)		 2,938 322
278
341		 892b FWD
888 REV
família ∆743 5A(892b)+3A(892c)
5B(892b)+3A(892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B(892b)+3B(892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b FWD
892c REV
família ∆891 5A(891a)+3A(891b)
5B(891a)+3A(891b )		 27,294 330
270		 891a FWD
891b REV
∆891a 5A(891a)+3A(891a )
5A(891a)+3B(891a )
5B(891a)+3A(891a )
5B(891a)+3B(891a )		 554 333
273
454
394		 891a FWD
891a REV

Tabela 2: Guia CRISPR RNAs usadas para gerar combinações de eliminação de cluster miR-888. Abreviaturas: CRISPR = agrupamento regularmente interespaçado repetições palindômicas curtas; bp = par de base; FWD = para a frente; REV = reverso.

Cartilha Seqüenciar Tm (°C)
888 FWD AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG 52.2
888 REV CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a FWD TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a REV TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b REV TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b FWD GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b REV CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c FWD TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c REV CACTCTCACTTGGCTTCATG 53.5

Tabela 3: Primers PCR usados para genotipagem. Abreviaturas: FWD = para a frente; REV = reverso; Tm = temperatura de fusão.

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Discussion

Este procedimento de edição de genes CRISPR permite que o investigador gere rapidamente um painel inteiro de linhas celulares carregando combinações únicas de exclusão de cluster miRNA. A transfecção de RNAs guia sintéticos compostas por crRNAs genômicas de 5' e 3' genômicas com tracrRNA sintética (razão molar 1:1) neste protocolo evita o subcloamento de vetores plasmídeos demorados e permite um design experimental mais flexível e de alto rendimento usando um formato de 24 poços. A geração de linhas celulares que carregam um lentiviral Cas9 indutível do DOX permite uma expressão Cas9 fortemente regulamentada e robusta do DOX durante a transfecção celular de RNAs guia e liberação rápida desta proteína bacteriana após a retirada do DOX do meio de cultura em etapas subsequentes. Este procedimento também conta com lisatos de células brutas para genotipagem pcr, que requer material celular mínimo para análise e evita o uso de métodos de purificação de DNA da coluna de sílica dispendida e intensiva em mão-de-obra ou a necessidade de medir concentrações de ácido nucleico usando um espectotógrafo, agilizando ainda mais os métodos para o pesquisador.

De fato, os resultados representativos aqui compartilhados mostraram uma adaptação bem-sucedida deste método para transfetar linhas de células cancerígenas de próstata humanas com 32 combinações de RNA guia única em um único experimento e gerar múltiplas linhas eliminatórias de colônias unicelulares carregando exclusões para toda a região de cluster ~35 kb miR-888; combinações de exclusão menores para membros de cluster miR-888 pertencentes às famílias miR-743 e miR-891a; bem como exclusões para membros miRNA individuais dentro do cluster miR-888. Esse fluxo de trabalho gerou um valioso recurso de linha celular para começar a dissecar molecularmente a rede de clusters miR-888 no contexto da doença da próstata humana e determinar como os membros do cluster miR-888 se sobrepõem funcionalmente ou interagem sinergicamente/antagonistamente uns com os outros para regular o crescimento do tumor de próstata, a agressividade do câncer e a resistência a medicamentos (a serem publicados em outros lugares). Esses estudos serão cruciais à medida que esta pesquisa se move em direção a aplicações diagnósticas e terapêuticas para o tratamento de pacientes com formas avançadas e metastáticas de câncer de próstata.

Existem várias etapas críticas neste protocolo de edição de genes CRISPR de alto rendimento que os pesquisadores devem considerar cuidadosamente ao adaptar esse método para estudar redes adicionais de cluster miRNA em outros contextos de doença. Em primeiro lugar, o passo mais importante neste processo é o design cuidadoso do guia RNAs que flanqueiam o cluster miRNA para remoção medicada por CRISPR, bem como rnas guia adicionais para excluir miRNAs individuais ou combinações de membros de cluster miRNA. O pesquisador deve considerar cuidadosamente para não interromper os genes circundantes ou elementos regulatórios, especialmente se o cluster miRNA reside dentro de um gene intron ou está situado antissense para outro gene. Existem recursos de previsão de deselecionamento do CRISPR 24,25,26,27 disponíveis que podem ajudar o pesquisador na escolha dos oligonucleotídeos crRNA mais discriminantes para sintetizar. Este fluxo de trabalho descreve o design de dois crRNAs de 5' e dois' 3' flanqueando cada lócus miRNA direcionado que permitem que quatro combinações de RNA guia exclusivas sejam testadas na etapa de transfecção CRISPR e aumentem as chances de gerar a linha celular knockout desejada. No entanto, o pesquisador só precisa de uma dessas combinações de RNA guia para trabalhar com sucesso para interromper um lócus genético miRNA específico.

Em segundo lugar, o investigador deve decidir o método mais apropriado para fornecer Cas9 às células para edição de genes CRISPR. Este procedimento utilizou o sistema de expressão lentiviral Cas9 indutível do DOX, mas abordagens alternativas para a produção de proteínas Cas9 (por exemplo, proteína recombinante Cas9, entrega de Cas9 mRNA ou o uso de sistemas convencionais de vetor plasmídeo de expressão Cas9) podem ser facilmente adaptadas para este protocolo. Por exemplo, considerações experimentais poderiam ditar o uso da expressão transitória Cas9 versus gerar linhas de células de expressão lentiviral estáveis, o promotor usado para conduzir Cas9 (onipresente, tipo celular específico, indutível) e a incorporação de sistemas de seleção positivo/negativo para garantir a entrega de vetores de expressão Cas9 às células de interesse (ou seja, resistência a antibióticos).

Em terceiro lugar, é importante rapidamente genótipo de células transfectadas de população mista dentro de 48-72 h após a entrega do RNA guia no caso de que a perda do cluster de miRNA possa impactar negativamente a viabilidade/crescimento das células. Por exemplo, ao excluir fatores promotores de tumores, como o miR-891a nas linhas de células cancerosas da próstata, observou-se que essas células mir-891a cresceram mais lentamente do que as células não tratadas e, posteriormente, as células do tipo selvagem rapidamente ultrapassaram a população celular. Finalmente, é crucial integrar métodos adicionais de validação para garantir a remoção do locus miRNA durante o processo de triagem genotipípica, especialmente para exclusões genômicas maiores. Essas medidas incluem o uso de controles internos de genotipagem pcr que só são detectados se o alelo do tipo selvagem estiver presente e realizar a análise qRT-PCR em colônias unicelulares para garantir que as linhas celulares eliminatórias não estejam expressando os miRNAs direcionados. Todas essas considerações garantirão resultados bem-sucedidos para o investigador.

Houve algumas limitações óbvias encontradas ao incorporar essa técnica CRISPR em laboratório. Por exemplo, apesar da natureza de alto rendimento das etapas de transfecção guia do RNA descritas neste protocolo para gerar rapidamente múltiplas combinações de exclusão de cluster miRNA, a etapa limitante de taxa deste procedimento foi a triagem do genótipo e a expansão de linhas celulares de uma única colônia para cada exclusão miRNA mediada pelo CRISPR. A incorporação de estratégias positivas de seleção nesse protocolo seria uma vantagem; no entanto, ainda levaria ~3-4 semanas para expandir uma linha de uma colônia de células únicas cultivada em um formato de 96 poços. De fato, a coleção de pelo menos três linhas celulares independentes por lócus de lócus miRNA mais células do tipo selvagem ajudará a garantir que os fenótipos avaliados não sejam devido a efeitos de artefato/fora do alvo, mas isso novamente aumenta a natureza demorada deste procedimento. O pesquisador também pode precisar executar várias rodadas de edição de genes CRISPR para obter linhas celulares homozigos nulas. Isso é especialmente pronunciado em estudos usando linhas de células cancerígenas imortalizadas estabelecidas que muitas vezes possuem uma complexa paisagem genômica de rearranjos cromossômicos e karyótipos anormais.

Por exemplo, este estudo representativo utilizou linhas de células cancerígenas humanas derivadas do LNCaP e pc3 para gerar exclusões para o cluster miR-888, mapeando o cromossomo X. Era importante reconhecer que essas linhas de células cancerígenas de próstata derivadas do sexo masculino têm karyótipos anormais e possuíam dois cromossomos X (e as células PC3 também têm translocações parciais de cromossomo X em outros autossários)31,32. Apesar dessas condições, a edição de genes CRISPR foi robusta o suficiente para gerar nocautes homozigos usando essas linhas de células da próstata. No entanto, pode haver casos em que a linha celular de um investigador com um karyótipo anormal (por exemplo, inserções, exclusões, inversões, duplicações) poderia abrigar "mutações invisíveis" que obscurecerão a detecção de segunda (ou mais) cópias do lócus genético alvo devido a elementos perdidos que são necessários para detecção bem sucedida usando as primers/guide RNAs projetadas. Isso ressalta a importância de verificar as linhas celulares CRISPR nulas homozigos usando métodos independentes (ou seja, qRT-PCR, northern blot, WGS) antes de realizar ensaios funcionais. Por fim, este protocolo foi projetado para apenas eliminar combinações de cluster miRNA que mapeiam adjacentes umas às outras. Se um investigador deseja eliminar miRNAs que estão separadas entre outros genes miRNA, então várias rodadas de transfecções CRISPR serão necessárias, exigindo genotipagem cuidadosa e validação.

Apesar desses desafios, a capacidade de gerar rapidamente um painel completo de combinações de exclusão de miRNA para qualquer determinado cluster miRNA usando este protocolo descrito é uma enorme vantagem sobre os métodos existentes na caixa de ferramentas de pesquisa miRNA. Estudos de superexpressão usando mímicas de miRNA para caracterizar a função RNA não codificada podem levar a artefatos não intencionais ou toxicidades celulares. Da mesma forma, o uso de inibidores antissamonucleotídeos antissamo-americanos para determinar fenótipos de perda de função pode ser difícil, uma vez que os antimirs geralmente resultam em um knockdown e não uma eliminação completa da atividade miRNA. Tentar usar combinações de mímicas de miRNA ou antimirs miRNA para elucidar a sinalização da rede de cluster miRNA tem se mostrado trabalhosa e difícil de interpretar. Portanto, a incorporação da tecnologia de edição de genes CRISPR para interrogar como os membros do miRNA interagem dentro de um determinado cluster genômico não codificador permitirá que os pesquisadores obtenham uma compreensão mais clara de como as RNAs não codificadas influenciam as vias de sinalização de doenças e promete ter enormes implicações nos campos de diagnóstico e descoberta de drogas.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

As linhas de células PC3-ML foram gentilmente fornecidas por Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey ajudou na genotipagem pcr. Este trabalho foi apoiado por um Breedan Adams Foundation Grant, um Ryan Translational Research Fund, e um Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) para a AE-K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

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Biologia Edição 182 CRISPR Cas9 indutível nocaute de microRNA cluster miR-888
Ferramenta de edição de genes CRISPR para análise de rede de cluster microrna
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Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

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