Outil d’édition de gènes CRISPR pour l’analyse de réseaux de microARN

Summary

Ce protocole décrit un flux de travail d’édition de gènes CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats) à haut débit pour l’analyse de réseaux de microARN qui permet la génération rapide d’un panel de lignées cellulaires génétiquement modifiées portant des combinaisons uniques de délétion de membres de clusters de miARN allant jusqu’à 35 kb dans une seule expérience.

Abstract

Les microARN (miARN) sont apparus comme d’importants régulateurs cellulaires (suppresseurs de tumeurs, facteurs pro-oncogènes) du cancer et des métastases. La plupart des études publiées se concentrent sur un seul miARN lors de la caractérisation du rôle des petits ARN dans le cancer. Cependant, environ 30% des gènes de miARN humains sont organisés en unités groupées qui sont souvent co-exprimées, indiquant un système complexe et coordonné de régulation de l’ARN non codant. Une sous-estimation plus claire de la façon dont les réseaux de miARN groupés fonctionnent de manière coopérative pour réguler la croissance tumorale, l’agressivité du cancer et la résistance aux médicaments est nécessaire avant de traduire les petits ARN non codants à la clinique.

L’utilisation d’une procédure d’édition de gènes à répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées à haut débit (CRISPR) a été utilisée pour étudier le rôle oncogène d’un groupe génomique de sept gènes miARN situés dans un locus d’une longueur d’environ 35 000 pb dans le contexte du cancer de la prostate. Pour cette approche, des lignées cellulaires cancéreuses humaines ont été infectées par un vecteur de lentivirus pour la nucléase Cas9 inductible à la doxycycline (DOX) cultivée dans un milieu contenant du DOX pendant 48 h. Les cellules ont ensuite été co-transfectées avec de l’ARN CRISPR transactivant synthétique (tracrRNA) complexé avec des oligonucléotides d’ARN CRISPR (crRNA) spécifiques au site génomique pour permettre la génération rapide de lignées cellulaires cancéreuses porteuses de la délétion de l’ensemble du groupe de miARN et des délétions de groupes de gènes de miARN individuels ou combinés au sein d’une seule expérience.

Les avantages de ce système d’édition de gènes à haut débit sont la possibilité d’éviter le sous-clonage de vecteurs d’ADN fastidieux, la flexibilité de transfecter des cellules avec des combinaisons d’ARN guides uniques dans un format de 24 puits, et le génotypage PCR à moindre coût à l’aide de lysats cellulaires bruts. Les études utilisant cette approche simplifiée promettent de découvrir des redondances fonctionnelles et des interactions synergiques / antagonistes entre les membres du cluster de miARN, ce qui aidera à caractériser les petits réseaux d’ARN complexes non codants impliqués dans les maladies humaines et à mieux éclairer la conception thérapeutique future.

Introduction

De meilleurs outils de recherche sont nécessaires pour étudier la contribution des ARN non codants dans les maladies humaines. La dérégulation des MiARN est souvent observée dans les troubles humains tels que le cancer lorsque l’on compare les profils d’expression de ces petits ARN non codants dans les tissus et les fluides corporels (par exemple, le sang, l’urine) des patients cancéreux par rapport aux personnes non cancéreuses en bonne santé, en utilisant des microréseaux, une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) et des technologies de séquençage profond de nouvelle génération ^1,2 . Des travaux récents ont caractérisé un grand sous-ensemble de ces miARN comme suppresseurs de tumeurs, oncogènes et métastases qui contrôlent la formation tumorale, la progression de la maladie et la résistance aux médicaments. La surexpression expérimentale et/ou la régulation négative/perte de miARN entraînent des conséquences fonctionnelles et pléiotropes dans la cellule, reflétant le large éventail d’activités associées au cancer que ces ARN non codants coordonnent - croissance, apoptose, différenciation, remodelage de la chromatine, angiogenèse, transitions épithéliale à mésenchymateuse (EMT) et MET, métabolisme et réponse immunitaire³.

Les miARN sont codés en tant que gènes uniques ou résident dans des grappes génomiques, qui sont transcrits dans le noyau et largement traités avant de générer les espèces de miARN monocaténaires (nt) biologiquement matures et monocaténaires (nt) localisées dans le cytoplasme⁴. Ces petits ARN exercent leurs effets post-transcriptionnellement et agissent comme des régulateurs de gènes négatifs qui se lient aux cibles d’ARN messager (ARNm) d’une manière spécifique à la séquence pour amener le complexe de silençage induit par l’ARN catalytique (RISC) au site de l’ARNm, entraînant une dégradation de l’ARNm et/ou un blocage de la traduction des protéines. Les miARN sont une classe extrêmement abondante d’ARN non codants dans les systèmes animaux, et 2 654 miARN matures existent dans le génome humain (miRBase release 22.1)⁵. Les MiARN s’associent généralement à une complémentarité incomplète avec leurs cibles d’ARNm⁴. Par conséquent, un seul miARN peut réguler des dizaines à des centaines de cibles d’ARNm distinctes et avoir un impact fonctionnel sur un large éventail de voies biologiques. Pour ajouter à la complexité des mécanismes basés sur les miARN, un seul ARNm peut être régulé par plusieurs miARN distincts. Il est donc difficile d’étudier comment la dérégulation du miARN perturbe l’équilibre homéostatique du corps et conduit à la malignité humaine.

La majorité des études publiées se sont concentrées sur un seul miARN lors de la caractérisation de leur rôle dans les événements pathologiques. Cependant, environ 30% des gènes de miARN humains sont organisés en unités groupées (généralement ~ 10 kilobases [kb]) qui sont souvent transcrites dans la même orientation et co-exprimées, indiquant un système coordonné et complexe de régulation de l’ARN non codant⁶. Le plus grand cluster de miARN humains polycistroniques est le cluster 14q32 comprenant 54 précurseurs de miARN. L’une des unités de miARN groupées les mieux étudiées associées aux cancers humains est le groupe polycistronique miR-17-92 composé de miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 et miR-92-1 résidant dans l’intron 3 de l’ARN non codant, c13orf25. Le groupe miR-17-92 est fréquemment amplifié dans les tumeurs malignes hématopoïétiques et surexprimé dans les tumeurs solides et a établi des rôles oncogènes dans la promotion de la progression du cycle cellulaire, de l’apoptose et de l’angiogenèse⁷. En outre, le groupe suppresseur de tumeur miR-15a et miR-16-1 situé dans l’intron du gène non codant Leu2 est souvent supprimé dans les leucémies et régulé à la baisse dans une large gamme de cancers, fonctionnant pour bloquer la croissance tumorale en ciblant le gène antiapoptotique BCL2 et d’autres gènes de progression du cycle cellulaire⁸. Le groupe miR-888 est élevé chez les patients atteints d’un cancer de la prostate de haut grade et se compose de sept gènes miARN (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b et -891a) situés sur le chromosome humain Xq27.3 ^9,10.

Les cartes de grappe miR-888 dans le locus HPCX1 (cancer héréditaire de la prostate, lié à l’X 1) couvrant Xq27-2, qui ont été identifiées par une analyse de couplage des pedigrees de la famille du cancer de la prostate héréditaire ^{11,12,13,14,15,29}. La caractérisation fonctionnelle des membres individuels en grappes de miR-888 à l’aide d’outils conventionnels de mauvaise expression des miARN - mimiques de miARN et inhibiteurs antisens - a indiqué que ces miARN jouent des rôles qui se chevauchent dans la régulation de la croissance et de l’invasion tumorales de la prostate ^9,10. Cependant, ces méthodes expérimentales ne se prêtent pas facilement à l’étude de la façon dont plusieurs membres groupés miR-888 agissent en synergie ou de manière antagoniste dans un réseau d’ARN non codant pour contrôler l’homéostasie tissulaire et la progression du cancer. Ce protocole simplifié décrit utilisant la technologie d’édition de gènes CRISPR à haut débit est modifié pour disséquer moléculairement les grappes de miARN associées aux cancers humains (par exemple, la grappe miR-888) afin de combler cette lacune dans les connaissances.

Les gènes bactériens CRISPR et associés à CRISPR (cas) médient l’immunité adaptative contre les bactériophages¹⁶. La découverte de cet ancien système de surveillance procaryote a été rapidement adaptée en tant qu’outil scientifique efficace pour cibler facilement tout locus génomique souhaité et effectuer des altérations de séquence d’ADN dans un large éventail de systèmes animaux et de types de cellules in vitro et in vivo^16,17. Cette technique est très prometteuse en tant que méthode efficace pour interroger les réseaux de miARN dans le contexte de la maladie humaine. À cette fin, ce protocole d’édition de gènes CRISPR à haut débit pour étudier le cluster miR-888 couvrant environ 35 kb sur le chromosome X humain dans des lignées cellulaires de cancer de la prostate humaine immortalisées (LNCaP, PC3-ML) est construit pour interroger la façon dont les membres du cluster coordonnent les voies de progression du cancer. Cette approche peut être appliquée à la caractérisation de n’importe quel groupe de miARN et permet aux chercheurs de générer rapidement des lignées cellulaires humaines porteuses de la délétion de l’ensemble du groupe de miARN et des délétions individuelles et combinées de grappes de gènes de miARN dans une seule expérience.

Dans cette procédure, des lignées cellulaires stables sont établies portant un système d’expression lentiviral inductible à la doxycycline (DOX) qui permet à l’investigateur de contrôler l’expression du gène de l’endonucléase Cas9 (csn1) associée à Streptococcus pyogenes CRISPR via le promoteur constitutif INDUCTIBLE DOX TRE3G. Le système bipartite Tet-On 3G implique un promoteur constitutif du facteur d’élongation humain 1 alpha (hEF1alpha) pour conduire la transcription du gène Tet-On 3G et du gène de résistance à la blasticidine (Blast^R) sous forme de transcription bicistronique. La protéine transactivatrice Tet-On 3G ne se lie au promoteur TRE3G qu’en présence de DOX, ce qui entraîne une transcription Cas9 robuste. En l’absence de DOX, il n’y a pas ou très peu d’expression basale de Cas9. Par conséquent, l’investigateur peut induire une production élevée de protéine Cas9 dans les cellules cultivées dans des milieux supplémentés en DOX pendant les étapes d’édition du gène CRISPR et le contrôle pour une clairance rapide de la protéine CAS9 lors du retrait doX.

Ce protocole décrit également la conception d’oligonucléotides synthétiques d’ARN CRISPR (ARNc) ciblant les régions flanquant l’ensemble du groupe de miARN, les régions individuelles en épingle à cheveux des miARN (prémiARN) et/ou des sous-ensembles de gènes de miARN au sein du cluster. Chaque ARNc conçu contient une séquence guide unique de 5'-terminal 20 nt (complémentaire à la séquence génomique d’intérêt à cibler), suivie d’une séquence de répétition invariante de 22 nt de S. pyogenes (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') qui permet l’appariement de bases avec les oligonucléotides universels transactivateurs de l’ARN CRISPR (tracrRNA)¹⁸. Ensemble, l’ARNc recuit et l’ARNr (rapport mixte 1:1) servent d’ARN guide pour ce protocole (Figure 1A). Dans chaque expérience, deux ARN guides synthétiques sont transfectés en cellules induites par DOX pour associer et escorter la protéine Cas9 bactérienne vers les sites d’ADN génomique (5' et 3') flanquant la région du cluster de miARN ciblée pour élimination (Figure 1B).

Une séquence de motif adjacent (PAM) de protospacer (5'-NGG-3' pour le type sauvage S. pyogenes Cas9) doit être présente dans le génome cellulaire et située immédiatement à côté de la séquence d’ADN 20 nt ciblée par l’ARN guide¹⁷. La séquence PAM sert de signal de liaison et positionne la région catalytique de l’enzyme Cas9 de l’endonucléase sur le site d’ADN génomique ciblé, conduisant par la suite à un clivage dirigé de l’ADN double brin (ds) situé à environ 3 nt en amont du PAM. La machinerie de réparation de l’ADN de la cellule répare les extrémités de l’ADN clivées, ce qui peut entraîner une ligature parfaite, mais souvent une jonction d’extrémité non homologue (NHEJ) se produit, provoquant de petites insertions ou délétions (indels) sur le site de réparation. Étant donné que les miARN sont des gènes non codants souvent situés dans des régions intergéniques et introniques, ces indels présentent un faible risque de créer des mutations indésirables absurdes / faux-sens.

En utilisant des oligonucléotides d’ARN synthétiques (ARNc recuit et tracrRNA, rapport molaire 1:1) codant pour le complexe d’ARN guide dans ces expériences, cette stratégie d’élimination génique évite le sous-clonage de vecteurs d’ADN fastidieux et permet une grande flexibilité dans la transfectation de combinaisons d’ARN guides uniques aux cellules dans un format de 24 puits. La préparation de lysats cellulaires bruts pour le dépistage du génotype par PCR évite également les méthodes de purification de l’ADN coûteuses et longues, tout en permettant une génération rationalisée de lignées cellulaires à colonie unique et une analyse phénotypique. En effet, ce protocole d’édition de gènes CRISPR à haut débit a été utilisé avec succès pour transfecter des lignées cellulaires de cancer de la prostate en culture (LNCaP, PC3-ML) avec 32 combinaisons d’ARN guides uniques en une seule expérience et générer des lignées knockout portant des délétions pour toute la région du cluster miR-888 d’environ 35 kb; des combinaisons de délétion plus petites pour les membres du cluster miR-888 appartenant aux familles miR-743 et miR-891a; ainsi que des suppressions pour les membres individuels des miARN au sein du cluster miR-888. Des études comme celles-ci fourniront une sous-estimation plus claire de la façon dont les miARN groupés fonctionnent de manière coopérative pour réguler la croissance tumorale, l’agressivité et la résistance aux médicaments avant de traduire les miARN à la clinique en tant qu’outils thérapeutiques et diagnostiques.

Protocol

1. Préparation à l’édition du gène CRISPR et conception d’ARN guide pour générer des lignées cellulaires knockout de groupes de miARN

1. Créez un fichier ADN contenant la séquence génomique complète de la région d’intérêt du cluster de miARN (intergénique, intronique) et au moins 1 Ko de régions génomiques environnantes à l’aide d’un logiciel d’annotation de séquence d’ADN¹⁹.
   1. Utilisez un outil d’édition de caractéristiques dans le fichier ADN créé pour marquer le locus du cluster de miARN ciblé (intergénique, intronique) et chaque séquence individuelle d’épingle à cheveux de miARN appartenant au cluster de miARN, ainsi que pour noter d’autres gènes codants et non codants à proximité et / ou des caractéristiques régulatrices ^5,20,21,22.
   2. Assurez-vous que les régions de miARN ciblées pour la délétion ne perturbent pas par inadvertance les gènes codant pour les protéines, les gènes non codants ou les éléments importants de l’ADN régulateurs.
      REMARQUE : Tenez compte de la complexité génomique (p. ex., duplications/fusions de chromosomes) de la lignée cellulaire utilisée dans ce protocole.
2. Concevoir des ARNc synthétiques ciblant 20 nt de séquence d’ADN génomique flanquant l’ensemble du groupe de miARN, des régions individuelles d’épingle à cheveux de miARN (pré-miARN) et/ou des sous-ensembles de gènes de miARN au sein de la grappe à l’aide d’un outil logiciel de conception d’ARN de guide bioinformatique (p. ex.,²³). S’assurer que l’enzyme Cas9 appropriée est notée dans l’outil de conception d’ARN guide (c.-à-d. S. pyogenes Cas9).
   REMARQUE: L’ARNc synthétisé contiendra cette séquence guide unique de 5'-terminal 20 nt (complémentaire à la cible d’ADN) suivie d’un invariant 22 nt S. pyogenes répéter la séquence pour permettre l’appariement de bases avec l’oligonucléotide universel synthétisé de l’ARNr. Recuits ensemble, ils serviront d’ARN guide dans ce protocole.
   1. En référençant le fichier ADN créé (étape 1.1.), entrez ~150 nt de séquence d’ADN résidant immédiatement en amont (5') ou en aval (3') du locus en épingle à cheveux/cluster miARN ciblé pour suppression dans l’outil logiciel de conception d’ARN du guide bioinformatique²³.
      REMARQUE : L’outil de conception permettra d’identifier des séquences uniques de 20 nt pour la conception d’oligonucléotides d’ARNc qui résident immédiatement à côté de la séquence PAM (sur le brin d’ADN non ciblé) (par exemple, S. pyogenes Cas9 PAM séquence NGG). Vous trouverez ci-dessous un exemple de conception d’ARNc ciblant un site immédiatement en amont (5') du locus du gène mir-891a (en particulier 5A(891a) discuté dans la section des résultats représentatifs et le tableau 1).
      1. Ouvrez le guide du logiciel de conception d’ARN^{outil 23}.
      2. Entrez le nom 5A(891a) dans la fenêtre Entrer un nom .
      3. Dans la fenêtre Entrer une séquence d’ADN , entrez 150 nt de séquence génomique résidant immédiatement en amont (5') du gène précurseur mir-891a : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
         TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
         TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
         ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTCTAGGTT
         CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Cochez la case Activer la vérification de spécificité pour exclure les sites hors ciblage détectés par calcul par le programme. Choisissez l’organisme approprié (c.-à-d. Humain [Homo sapiens]).
      5. Spécifiez l’enzyme Cas9 PAM correcte utilisée pour les études, dans ce cas, Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, pour générer les paramètres par défaut suivants: PAM par rapport à la cible: Après; Séquence de répétition: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; Par rapport au guide : 3; Longueur de la séquence cible: 20; Coupe par rapport à la cible 5' start: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Cliquez sur le bouton Suivant pour voir les résultats de la synthèse synthétique de l’ARNc.
         REMARQUE: Dans cet exemple, l’ARNc cr suggéré à synthétiser reconnaîtra la cible d’ADN ATACATGCTGATAGTTACAC et sera situé à côté de PAM: AGG.
   2. Référencez le fichier ADN (créé à l’étape 1.1.) pour déterminer les meilleures séquences cibles candidates d’ARNc 20 nt qui résident le plus près du locus de miARN à supprimer et possèdent la plus grande spécificité pour la cible génomique prévue.
      1. Utiliser des outils d’analyse computationnelle hors ciblage pour évaluer la spécificité de l’ARNc cr candidat et prédire les sites potentiels de non-ciblage dans les loci génomiques non liés à la région d’intérêt du cluster de miARN ciblée (p. ex.^,24,25,26,27).
      2. Enregistrer les résultats potentiels de non-ciblage pour référence ultérieure lors du génotypage des lignées cellulaires clonales CRISPR à colonie unique par PCR (étape 4.2.6.).
         REMARQUE: L’étendue de la complémentarité de séquence partagée entre l’oligonucléotide d’ARNc conçu et la séquence cible génomique dictera la façon sélective dont l’enzyme Cas9 clivent le génome à ce locus. Étant donné que l’ARN guide recuit vers la cible génomique dans une direction de 3' à 5', les incohérences à l’extrémité 5' de la séquence cible de l’ADN (les 8 à 10 premières bases) bloqueront souvent le clivage médié par Cas9. Si la séquence cible génomique partage l’homologie avec un autre locus génomique, sauf dans les huit premières bases de la séquence d’ADN, cet ARN guide devrait avoir une faible chance de dépersonnalisation sur ce site.
      3. Concevoir quatre ARNc uniques pour chaque locus de miARN ciblé : deux ARNc conçus pour cibler des séquences d’ADN complémentaires immédiatement à 5' de l’épingle à cheveux/cluster de miARN (5'A, 5'B) et deux ARNrc conçus pour cibler des séquences d’ADN complémentaires immédiatement 3' de l’épingle à cheveux/cluster de miARN (3'A, 3'B).
         REMARQUE: Lors de l’exécution des transfections CRISPR (dans la section 3), quatre combinaisons possibles de paires d’ARN guides de 5' et 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) seront testées pour chaque locus de miARN ciblé afin d’augmenter la probabilité de générer des délétions réussies de locus de miARN dans une seule expérience.
      4. Utilisez un outil d’édition de fonctions dans le fichier ADN créé (étape 1.1.) pour marquer la séquence cible d’ADN (avec PAM adjacent) pour chaque ARNc à synthétiser conçu.
3. Concevoir et synthétiser des amorces de PCR (avant, arrière) flanquant les régions de grappes de miARN ciblées pour le génotypage des lignées cellulaires CRISPR (et étiqueter les amorces dans le fichier ADN créé).
   1. Pour le génotypage de lignées cellulaires porteuses de petites délétions génomiques pour des miARN étroitement groupés ou individuels, concevez des amorces PCR (avant, arrière) résidant à environ 150 pb de chaque côté du site de clivage Cas9 / région knockout qui permettront de détecter à la fois les fragments d’ADN de type sauvage (~ 600 pb) et knockout (~ 300 pb) dans une seule réaction de PCR par électrophorèse sur gel.
   2. Pour le génotypage de lignées cellulaires porteuses de grandes délétions génomiques pour des combinaisons de précurseurs de miARN ou l’ensemble du groupe de miARN, encore une fois concevoir des amorces de PCR (avant, arrière) résidant à environ 150 pb de chaque côté du site de clivage / knockout Cas9. Notez que, si la délétion ciblée du cluster de miARN s’étend sur >4 kb de longueur, la réaction de PCR ne détectera probablement que le fragment d’ADN knockout plus petit (~ 300 pb), mais pas le fragment d’ADN de type sauvage. Par conséquent, concevez des amorces PCR supplémentaires (avant, arrière) qui peuvent détecter la présence ou l’absence de gènes internes de grappes de miARN pour faciliter le processus de dépistage et valider les lignées cellulaires knockout homozygotes.

2. Génération de lignées cellulaires lentivirales stables portant la cassette d’expression Cas9 inductible DOX

REMARQUE: Effectuer tous les travaux de culture cellulaire et de virus dans une hotte de biosécurité certifiée en utilisant les procédures BSL2 et la technique aseptique.

1. Déterminer le type de lignée cellulaire approprié pour les études CRISPR et les milieux de croissance préférés.
   REMARQUE: Ce protocole a été développé pour les lignées cellulaires du cancer de la prostate humaine LNCaP (milieu préféré: RPMI, 10% sérum bovin fœtal [FBS]) et PC3-ML (milieu préféré: DMEM, 10% FBS).
2. Effectuer une courbe de « mort » de la blasticidine pour déterminer la concentration optimale de médicament à sélectionner pour les cellules infectées par le lentivirus porteuses de la cassette du gène de résistance à la blasticidine (étape 2.3.).
   1. Plaquez les cellules dans 11 puits d’une plaque de 24 puits et se développent à 37 °C, 5 % de CO₂ dans le milieu préféré jusqu’à environ 75 % de confluent.
   2. Diluer la blasticidine (milieu de travail 1 mg/mL) dans le milieu privilégié avec une concentration finale allant de 0, 1 à 10 μg/mL et diluée par incréments de 1 μg/mL.
   3. Étiquetez les puits de la plaque de 24 puits ensemencée de 1 à 11. Retirer le milieu de croissance des puits et le remplacer par les concentrations appropriées de blasticidine.
   4. Changez le milieu avec les concentrations appropriées de blasticidine tous les deux jours pendant 7 à 10 jours.
   5. Examinez les cellules quotidiennement pendant le cours du temps et déterminez la concentration minimale de blasticidine nécessaire pour tuer toutes les cellules dans les 5 à 7 jours.
      REMARQUE: Une courbe de « destruction » de la blasticidine devra être effectuée pour chaque lignée cellulaire spécifique utilisée pour les expériences d’édition de gènes CRISPR.
3. Infecter les cellules avec le lentivirus porteur de la cassette d’expression Cas9 inductible DOX et effectuer la sélection de la blasticidine en utilisant la concentration optimale déterminée à l’étape 2.2.
   1. Dans trois puits d’une plaque de 6 puits, ensemencer 5 × 10⁴ cellules par puits et croître dans le milieu préféré à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant la nuit (ON).
   2. Le lendemain, décongeler le vecteur d’expression du lentivirus pour cas9 inductible doX (Lenti-iCas9) sur la glace. Mélanger doucement (ne pas vortexer les particules virales).
      REMARQUE: Conservez le lentivirus dans des aliquotes à -80 ° C pour éviter les cycles multiples de gel / dégel, ce qui diminuera les titres viraux et l’efficacité de l’infection.
   3. Calculer le volume nécessaire pour transduire 5 × 10⁴ cellules avec le virus à une multiplicité d’infection de 0,3 (MOI = 0,3) en fonction de la concentration de titre viral.
   4. Pipeter le volume de virus approprié dans 250 μL (par puits) de milieu préféré sans sérum et sans antibiotique complété par 0,8 μg/mL de bromure d’hexadiméthrine. Mélanger doucement.
      REMARQUE: Le bromure d’hexadiméthrine est un polymère cationique qui augmente l’adsorption virale et l’efficacité des infections.
   5. Retirez le support. Ajouter les 250 μL de milieu de transduction préparé avec le virus Lenti-iCas9 (MOI = 0,3) aux cellules et incuber ON à 37 °C, 5 % de CO₂. (Raccourcissez le temps d’incubation à 4-6 h si les cellules présentent des effets toxiques liés au virus.)
   6. Remplacez le milieu par un milieu frais préféré et laissez les cellules récupérer pendant 1-2 jours.
   7. Effectuer la sélection de la blasticidine sur les cellules infectées pendant 10 à 14 jours en utilisant la concentration optimale de blasticidine dérivée de la courbe de « tuer » décrite à l’étape 2.2.
      1. En parallèle, cultiver les cellules non infectées dans un milieu avec la concentration optimale de blasticidine à utiliser comme témoin positif pour la sélection virale.
   8. Changez le milieu complété par la concentration optimale de blasticidine tous les 3 jours pendant le temps de sélection pour éliminer les cellules mortes.
      REMARQUE: Seules les cellules qui survivent à la sélection de la blasticidine auront intégré le vecteur lentiviral.
   9. Développez les lignées cellulaires Lenti-iCas9 sélectionnées par la blasticidine.
      REMARQUE : Enregistrez le numéro de passage de cellule à chaque expansion.
      1. Congeler une partie des cellules Lenti-iCas9 dans le milieu préféré complété par 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour un stockage cryovial à long terme.
      2. Analyser une partie des cellules Lenti-iCas9 par transfert Western⁹ pour identifier la lignée cellulaire présentant les niveaux de protéine Cas9 inductibles par DOX les plus robustes (voir l’étape 2.3.).
4. Effectuer une courbe de concentration de doxycycline sur les lignées cellulaires Lenti-iCas9 nouvellement établies afin de déterminer les conditions optimales pour l’induction de la protéine Cas9.
   1. Installez quatre plaques indépendantes de 6 puits pour chaque lignée cellulaire testée afin d’effectuer ce cours de temps de concentration DOX. La plaque 5 × 10⁴ cellules par puits de chaque plaque de 6 puits et croître à 37 °C, 5% de CO₂ dans le milieu préféré pendant 24 h.
   2. Diluer le DOX (base de travail 1 mg/mL) dans le milieu préféré avec une courbe de concentration finale de DOX comprise entre 0, 50, 100, 150, 250 et 500 ng/mL.
   3. Étiquetez les puits de chaque plaque de 6 puits ensemencée de 1 à 6. Retirer le milieu et le remplacer par les concentrations de DOX appropriées. Plaques de croissance 1-4 jusqu’aux points de temps suivants: 24 h, 48 h et 72 h d’induction DOX; et 120 h après le retrait du DOX (initialement 72 h induit par le DOX).
   4. Récoltez les puits de la plaque à chaque point temporel en utilisant des méthodes appropriées (p. ex. trypsinisation). Conservez les granulés de la cellule à -80 °C. Traiter les pastilles de cellules dans un tampon RIPA pour l’isolation des lysats et l’analyse par transfert western Cas9.
      1. Exécuter 40 μg de lysat cellulaire pour chaque échantillon du cours de temps d’induction DOX à l’aide d’un gel Bis-Tris dénaturant de 4% à 12% et transférer les protéines dans une membrane immunoblot.
      2. Hybrider la membrane immunoblot avec un anticorps primaire contre Cas9 pour détecter la protéine 160 kDa. Normaliser les niveaux de Cas9 à l’aide d’un gène d’entretien ménager tel que GAPDH (37 kDa).
   5. Sur la base des résultats du transfert western, déterminer la concentration optimale de DOX pour induire Cas9 dans les lignées cellulaires Lenti-iCas9.
      REMARQUE: Ce cours de temps révélera également à quel point l’expression de Cas9 est étroitement réglementée 120 h après le retrait du DOX.
   6. Établir des colonies unicellulaires pour les lignées cellulaires Lenti-iCas9 montrant une expression robuste de la protéine Cas9 afin d’optimiser les transfections CRISPR (à la section 3).

3. Réalisation de réactions CRISPR par induction Cas9 et transfection d’ARN guide synthétique de cellules à l’aide d’un format à haut débit

Remarque : Un diagramme de flux de travail est illustré à la figure 1.

1. Sur le papier, cartographiez les combinaisons de paires d’ARNc qui seront transfectées dans chaque puits d’une plaque de 24 puits ciblant l’ensemble du groupe de miARN, diverses combinaisons de gènes de miARN en grappes, ainsi que des membres individuels du groupe de miARN.
   1. Sur la carte, étiquetez quatre puits par locus de miARN ciblé. Avoir chaque puits représentant une réaction de transfection, avec deux ARNc uniques positionnés à 5' et 3' du locus génomique knockout du miARN souhaité et du tracrRNA (rapport molaire recuit 1:1).
   2. Assurez-vous que chacun des quatre puits marqués représente une paire unique d’ARNc pour la transfection (p. ex., 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      NOTE: La conception de deux ARNc de 5' et de deux ARNrc de 3' flanquant chaque locus de miARN ciblé (section 1) permet la génération de quatre paires d’ARN guides possibles de 5' et 3' dans la réaction de transfection.
2. Plaquer la lignée cellulaire Lenti-iCas9 à 5 x 10⁴ cellules/puits d’une plaque de 24 puits dans le milieu préféré contenant la concentration de DOX optimisée (déterminée à l’étape 2.4.). Cultiver les cellules pendant 24-48 h à 37 °C, 5% de CO₂ pour induire l’expression de la protéine Cas9.
3. Transfecter les cellules Lenti-iCas9 avec les ARN guides 5' et 3' préparés.
   1. Reconstituer les oligonucléotides d’ARNc et de tracrRNA synthétisés avec de l’eau sans nucléase à une concentration en stock de 10 μM. Conserver à -80 °C à long terme.
   2. Étiqueter quatre tubes de microcentrifugation de 1,5 mL par locus de miARN ciblé sur la base de la carte expérimentale conçue à l’étape 3.1., représentant les quatre combinaisons possibles de paires d’ARNc de 5' et 3' (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
   3. Dans chaque tube, mélanger un rapport molaire de 1:1 d’ARNr et d’ARNnc uniques (5' et 3') pour former le complexe d’ARN guide de 2 μM en utilisant la réaction suivante (volume final de 10 μL) :
      1. Ajouter 2,5 μL d’ARNr (souche de 10 μM), 1,25 μL de l’ARNc positionné 5' (stock de 10 μM), 1,25 μL de l’ARNc positionné 3' (stock de 10 μM) et 5 μL de 10 mM tris-HCL pH 7,5 à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL. Microcentrifugeuse pendant 30 s à 16 000 × g à mélanger. Incuber à température ambiante (RT) pendant 5 min.
   4. À chaque tube, ajouter 40 μL de milieu sérique réduit (p. ex. Opti-MEM) aux 10 μL de réaction du complexe d’ARN guide (volume total de 50 μL). Mélanger doucement en pipetant de haut en bas.
   5. Dans un tube de centrifugeuse propre de 1,5 mL, mélanger doucement 2 μL du réactif de transfection²⁸ (voir NOTE 3.3.5.1.) et 48 μL de milieu sérique réduit (p. ex. Opti-MEM, volume final de 50 μL) en pipetant de haut en bas. Incuber à RT pendant 5 min.
      1. Préparer un mélange maître du réactif de transfection en multipliant les quantités de réactif (2 μL) et de milieu sérique réduit (p. ex. Opti-MEM, 48 μL) par le nombre de puits à transfecter, plus 10 % de volume supplémentaire pour tenir compte de légères inexactitudes de pipetage.
         REMARQUE: Sélectionnez un réactif de transfection optimisé pour les petites transfections d’ARN et d’oligonucléotides d’ARN CRISPR, ainsi que pour la lignée cellulaire de type²⁸.
   6. À chaque tube contenant les 50 μL de mélange d’ARN guide (à partir de l’étape 3.3.4.), ajouter les 50 μL du réactif de transfection dilué (à partir de l’étape 3.3.5.). Pipet le mélange lentement de haut en bas une fois pour mélanger. Incuber à RT pendant 20 min.
   7. Ajouter 400 μL de milieu sans antibiotique complété par du DOX (concentration optimale) à chaque tube contenant les 100 μL du mélange ARN/transfection guide. Pipet doucement pour mélanger.
4. Retirez le milieu des cellules Lenti-iCas9 induites par DOX (étape 3.2.). Ajouter 500 μL de mélange milieu/DOX/ARN guide/transfection à partir de la carte expérimentale des plaques de 24 puits (étape 3.1.). Incuber les cellules transfectées pendant 48 h à 37 °C, 5 % de CO₂.
5. Remplacez le milieu par le milieu frais préféré sans DOX (pour éliminer la protéine Cas9 des cellules). Laissez les cellules récupérer pendant encore 24-48 h à 37 °C, 5% de CO₂.
6. Récoltez les cellules transfectées (trypsinisation) et préparez-les au génotypage et aux dilutions unicellulaires.
   REMARQUE: Les cellules représentent une population mixte contenant des cellules de type sauvage transfectées et non transfectées par le gène CRISPR. Cette étape déterminera l’efficacité de l’édition CRISPR avant d’investir du temps et des ressources dans l’expansion de colonies unicellulaires.
   1. Lavez les cellules 1x avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Incuber les cellules dans 100 μL de trypsine pendant 5 min à 37 °C, 5 % de CO₂ et transférer les cellules dans un tube centrifuge propre de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu.
   2. Inverser pour mélanger et microcentrifuger les cellules pendant 5 min à 200 × g à 20 °C. Retirez le milieu et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de PBS.
   3. Microcentrifugez les cellules lavées pendant 5 min à 200 × g à 20 °C. Retirez le PBS et remettez en suspension la pastille de la cellule dans 150 μL du milieu préféré.
7. Déterminer le nombre de cellules par microlitre des 150 μL de cellules remises en suspension à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un instrument automatisé de comptage cellulaire.
8. Séparer les 150 μL de cellules remises en suspension en trois parties.
   1. Congeler 1/3 des cellules transfectées (50 μL) dans un milieu plus 10 % de DMSO (volume final de 150 μL) dans les cryoviales pour une expansion future / stockage à long terme.
   2. Transférer 1/3 des cellules transfectées (50 μL) dans un tube PCR propre de 0,2 mL pour le génotypage.
      1. Microcentrifugez les cellules pendant 5 min à 200 × g à 4 °C et retirez le milieu.
      2. Remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 μL de PBS.
      3. Microcentrifugez les cellules pendant 5 min à 200 × g à 4 °C et retirez le PBS. Conserver les granulés de cellules à population mixte à long terme à -80 °C.
      4. Traiter la pastille de cellule pour le génotypage à l’aide du flux de travail de la section 4.
   3. Préparer le 1/3 final des cellules (50 μL) pour la dilution et le placage dans un format de plaque de 96 puits pour générer des colonies unicellulaires.
      1. Sur la base du nombre de cellules à l’étape 3.7., calculer les dilutions nécessaires pour obtenir 10, 5, 2 et 1 cellule(s) dans 100 μL de milieu par puits d’une plaque de 96 puits.
      2. À l’aide d’un multi-pipettor à 12 canaux et d’un réservoir de réactif stérile, ajoutez 100 μL de cellules diluées par puits à deux rangées de la plaque (24 puits au total) pour chaque dilution (10, 5, 2 ou 1 cellule par puits). Prévoyez 4 à 6 semaines pour que les cellules se développent jusqu’à la confluence pour l’expansion de la colonie unicellulaire. Observez les cellules chaque semaine au microscope optique et notez si les colonies représentent des colonies à une ou plusieurs cellules.
      3. Recueillir environ 10 à 15 colonies unicellulaires pour le génotypage (section 4). Identifier au moins trois lignées de colonies unicellulaires indépendantes et knock-out pour chaque locus de miARN ciblé. Conservez les lignées unicellulaires de type sauvage comme contrôles.
         REMARQUE: Le nombre de dépistage dépendra du type de lignée cellulaire et de l’impact du phénotype knockout de miARN sur la croissance / viabilité cellulaire.

4. Génotypage par PCR de lignées cellulaires CRISPR à l’aide de lysats cellulaires bruts

1. Récoltez des colonies unicellulaires individuelles à partir de puits presque confluents d’une plaque de 96 puits.
   REMARQUE: L’élimination du milieu / PBS décrit dans ces étapes peut être effectuée manuellement à l’aide d’un aspirateur à vide dans l’armoire de biosécurité, mais veillez à éviter la contamination croisée. Utilisez une nouvelle pointe de pipetman stérile « jaune » de 200 μL pour chaque puits de la plaque de 96 puits lors de l’aspiration, dans laquelle chaque pointe jaune échangée est fermement placée à l’extrémité d’une pipette de pâturage en verre stérile fixée à l’aspirateur à vide.
   1. Lavez les puits 1x avec 100 μL de PBS. Aspirez le PBS.
   2. Ajouter 50 μL de trypsine et incuber pendant 2-5 min à 37 °C, 5% de CO₂.
   3. Pipetez doucement de haut en bas et transférez les cellules remises en suspension dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL contenant 1 mL de milieu.
   4. Inverser pour mélanger et abreuver doucement les cellules dans une microcentrifugeuse pendant 5 min à 200 × g à 20 °C.
   5. Retirez le support et ajoutez 1 mL de PBS. Faites glisser doucement le tube pour perturber la pastille et inversez plusieurs fois pour mélanger.
   6. Microcentrifugeuse pendant 5 min à 200 × g à 20 °C pour granuler les cellules.
   7. Retirez le PBS et remettez en suspension le granulé dans 300 μL de PBS frais.
   8. Divisez l’échantillon de 300 μL en deux parties.
      1. Transférer 200 μL des cellules (2/3 de la pastille) dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 1 mL du milieu préféré. Une fois le génotype validé, utilisez ces cellules pour élargir les lignées cellulaires knockout médiées par CRISPR pour l’analyse fonctionnelle.
      2. Transférer 100 μL des cellules (1/3 de la pastille) dans un tube PCR de 0,2 mL. Microcentrifugeuse pendant 5 min à 3 000 x g à 4 °C. Retirez le PBS. Conserver la pastille à -80 °C.
2. Préparer des lysats cellulaires bruts pour le génotypage et l’analyse de séquence à l’aide des amorces PCR conçues à l’étape 1.3. Inclure les lysats cellulaires préparés à partir de cellules non transfectées dans ces expériences pour les utiliser comme témoins positifs de type sauvage.
   1. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 μL de tampon d’ADN polymérase 5x (voir le tableau des matériaux, concentration finale 1x), 1 μL de protéinase K (stock de 20 ng/mL), 1 μL de RNase A (stock de 10 ng/mL) et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume total de 20 μL.
   2. Lyser les cellules dans un thermocycleur à l’aide d’un programme de PCR : 56 °C pendant 30 min et 96 °C pendant 5 min. Stocker les lysats cellulaires à -20 °C.
   3. Effectuer une réaction de PCR à l’aide des amorces de PCR conçues (avant, arrière) qui flanquent les sites ciblés de l’ARN guide 5' et 3' (tableau 1).
      REMARQUE: Les conditions du tampon d’ADN polymérase et du thermocycleur dépendront de l’enzyme ADN polymérase Taq utilisée pour la réaction de PCR. Ce protocole a été optimisé pour une Phusion HF ADN Polymérase.
      1. Mettre en place le mélange de réactions PCR sur glace : 5 μL de 5x tampon d’ADN polymérase, 0,5 μL d’amorce PCR directe (10 μM de stock), 0,5 μL d’amorce de PCR inverse (10 μM de stock), 0,5 μL de 10 mM de dNTPs, 0,25 μL d’ADN polymérase, 1-4 μL de lysat cellulaire et de l’eau sans nucléase jusqu’à un volume total de 25 μL.
      2. Exécutez la réaction PCR dans un thermocycleur à l’aide du programme : 98 °C pendant 3 min, et 35 cycles de 98 °C pendant 10 s, 62 °C pendant 15 s, 72 °C pendant 15 s, puis 72 °C pendant 10 min. Maintenir jusqu’à 4 °C. Voir NOTE 4.2.3. au-dessus.
   4. Chargez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% pour l’analyse par électrophorèse.
   5. Extraire l’ADN des fragments PCR isolés de la taille moléculaire prédite pour les génotypes knockout (et de type sauvage). Préparez les échantillons pour le séquençage de l’ADN.
   6. Valider que la réaction CRISPR a réussi et effectuer le séquençage de l’ADN des fragments pcR isolés pour identifier le site de clivage Cas9 et confirmer la délétion du locus miARN.
      1. Isolez au moins trois lignées cellulaires knockout indépendantes pour chaque locus de miARN ciblé par CRISPR. Conserver des lignées cellulaires de type sauvage (et hétérozygotes) pour les utiliser comme témoins dans les études fonctionnelles en aval.
      2. Effectuer une analyse qRT-PCR ou Northern Blot pour confirmer que les lignées cellulaires knockout n’expriment pas de miARN mature pour le locus supprimé.
         REMARQUE: Le séquençage du génome entier (WGS) est la méthode la plus définitive pour valider l’édition et le dé-ciblage du gène CRISPR.
      3. Test des effets de dé-ciblage CRISPR par PCR, qui ont été prédits par calcul (étape 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Si un criblage intensif de colonies unicellulaires n’aboutit qu’à des génotypes hétérozygotes, répétez la transfection d’ARN guide dans les lignées hétérozygotes unicellulaires.
         REMARQUE : L’incapacité d’obtenir des lignées cellulaires knockout homozygotes pourrait indiquer des effets mortels dus à la perte de miARN ou à la complexité génomique inhérente (p. ex., duplications/fusions de chromosomes) de la lignée cellulaire parentale qui nécessitent une analyse plus approfondie.

Representative Results

Ce protocole de délétion CRISPR à haut débit a été utilisé avec succès en utilisant la transfection de lignées cellulaires cancéreuses humaines LNCaP et PC3-ML inductibles par Cas9 avec des ARN guides d’oligonucléotides synthétiques ciblant le cluster miR-888, qui ont été étudiés dans le contexte du cancer de la prostate. Le groupe miR-888 a été initialement identifié dans un dépistage de profilage d’expression comme étant élevé chez les patients atteints d’un cancer de la prostate atteints d’une maladie de haut grade par rapport aux patients de bas grade et non cancéreux ^9,10. Le groupe miR-888, couvrant 35 124 pb, se compose de sept miARN (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b et -891a) sur le chromosome humain Xq27.3 (Figure 2A). Ce locus se trouve dans le HPCX1 (Cancer héréditaire de la prostate, X-linked 1, Xq27-28), qui est associé au cancer héréditaire de la prostate ^{11,12,13,14,15,29}. miR-888, -890, -892a, -892b et -892c partagent l’homologie de séquence et appartiennent à la famille miR-743 conservée par les mammifères. Les membres du cluster miR-891a et miR-891b ne partagent que l’homologie de séquence entre eux et appartiennent à la famille miR-891 spécifique aux primates. L’organisation génomique du cluster miR-888 est conservée chez les primates, ce qui implique la conservation fonctionnelle d’un important réseau de signalisation³⁰.

Des travaux antérieurs utilisant la surexpression expérimentale (mimiques de miARN) et l’inhibition (oligonucléotides antisens) pour évaluer l’activité individuelle des membres du cluster miR-888 ont révélé un rôle de chevauchement pour tous les membres du cluster miR-888 pour promouvoir l’invasivité des cellules cancéreuses de la prostate à l’aide des tests^de chambre Matrigel Boyden ^9,10. Plus particulièrement, miR-888 et miR-891a fonctionnaient de la même manière pour induire la croissance des cellules de la prostate (tests WST-1), accélérer la charge tumorale de la prostate dans les xénogreffes de souris et réguler les cibles courantes (par exemple, TIMP-2)^9,10. Cependant, ces travaux ont suggéré une interaction plus complexe entre les membres du groupe miR-888. Par exemple, miR-888 et miR-891a ont montré des effets synergiques dans la promotion de la prolifération des cellules de la prostate PC3-N, tandis que miR-890 et miR-892c ont montré des effets inhibiteurs de la croissance en utilisant les tests WST-1⁹. Par conséquent, ce protocole CRISPR à haut débit a été utilisé pour interroger génétiquement le réseau de grappes miR-888 dans le contexte du cancer de la prostate.

Le flux de travail décrit pour l’édition du gène CRISPR Cas9 (Figure 1) a permis de tester 32 réactions de transfection d’ARN guide CRISPR uniques en une seule expérience utilisant un format de 24 puits. Ce protocole a abouti à l’identification réussie d’un panel de lignées cellulaires knock-out du cancer de la prostate humain portant des délétions pour l’ensemble du groupe miR-888, des combinaisons spécifiques de membres du cluster miARN et des membres individuels du miARN. La génération de lignées cellulaires Cas9 inductibles stables a d’abord été établie. En bref, les cellules cancéreuses humaines de la prostate PC3-ML et LNCaP ont été infectées par un vecteur de lentivirus Streptococcus pyogenes Cas9 inductible par DOX (Lenti-iCas9; EditR Inductible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Particules nucléases; MOI 0,3) pendant 6 h (LNCaP) ou pendant la nuit (PC3-ML), selon la sensibilité inhérente de la lignée cellulaire à la toxicité virale.

Les lignées cellulaires infectées ont ensuite subi une sélection de blasticidine (7,5 μg/mL) et une expansion de colonie unicellulaire. Des études par transfert de Western ont été utilisées pour sélectionner les lignées cellulaires PC3-ML et LNCaP Lenti-iCas9 à colonie unique présentant l’expression cas9 la plus robuste basée sur un cours de temps d’induction DOX (Figure 2A). Ce système inductible Cas9 lentiviral a été étroitement contrôlé et, après le retrait doX pendant 120 h, la majeure partie de la protéine Cas9 a été éliminée des cellules (Figure 2A). Une courbe de concentration de DOX a déterminé que 250 ng/mL de DOX était la dose optimale pour induire une expression robuste de la protéine Cas9 dans ces lignées cellulaires de la prostate Lenti-iCas9 (Figure 2B). À l’aide d’un outil de conception d’ARNc en ligne²³, des ARNc uniques (deux ARNc de 5' et deux ARNc de 3' flanquant chaque locus knockout de miARN planifié pour permettre quatre combinaisons d’ARN guides possibles de 5' et 3') ont été conçus pour cibler l’ensemble de la région du cluster miR-888 d’environ 35 kb; des combinaisons de grappes plus petites au sein de la famille miR-743 ou de la famille miR-891; ainsi que des délétions individuelles de miARN (miR-888, -891a) (Figure 3A). Lors de la réalisation des expériences CRISPR, les lignées cellulaires Lenti-iCas9 du cancer de la prostate humain ont été cultivées dans un milieu complété par 250 ng / mL DOX pendant 48 h pour induire l’expression de Cas9.

Les cellules ont ensuite été transfectées dans un format de plaque de 24 puits avec l’ARNr universel synthétique complexé (rapport molaire 1:1) avec un ensemble unique d’ARNc génomiques spécifiques au site de 5' et 3' (tableau 2). Le DOX a été retiré du milieu de culture cellulaire 48 h après la transfection pour éliminer la protéine Cas9 des cellules cancéreuses de la prostate. Les puits ont été récoltés 48 h plus tard (96 h après la transfection) et un tiers de chaque pastille cellulaire récoltée a été préparé pour le génotypage par PCR à l’aide de lysats cellulaires bruts (tableau 3). L’analyse par électrophorèse sur gel des réactions de PCR a indiqué que la taille prévue du fragment d’ADN représentant le génotype knockout était amplifiée pour chaque transfection CRISPR (Figure 3B). Le séquençage de l’ADN de ces fragments isolés de PCR knockout a confirmé que les ARN guides transfectés de 5' et 3' dirigeaient le clivage/ligature Cas9 ~3 nt en amont des sites PAM et validaient la perte génomique du locus miARN ciblé (exemple représentatif illustré à la figure 4C). Étant donné que le groupe miR-888 réside dans une région intergénique du chromosome X (loin de tout gène codant pour les protéines), il n’était pas prévu que les lignées cellulaires knockout, qui possédaient souvent des UNDAL au site de clivage Cas9 en raison du NHEJ, provoqueraient des effets artifactuels en aval.

Bien que les réactions de transfection CRISPR aient été couronnées de succès (Figure 3B), les cellules transfectées représentaient une population mixte de cellules transfectées (knockout) et non transfectées (de type sauvage). Cette population représentait également un mélange de cellules porteuses de délétions homozygotes et hétérozygotes pour le locus de miARN ciblé. Les lignées cellulaires de cancer de la prostate LNCaP et PC3 sont dérivées d’hommes possédant des caryotypes anormaux qui comprennent deux chromosomes X^31,32. Par conséquent, une partie de chaque réaction de transfection cellulaire a été diluée en série dans un format de plaque de 96 puits pour obtenir des lignées de colonies unicellulaires. Ces colonies ont été examinées par PCR pour sélectionner des lignées cellulaires homozygotes qui n’avaient pas toutes les copies du locus de miARN ciblé.

Cette procédure était importante à suivre en temps opportun car les données antérieures ont indiqué un rôle pour le cluster miR-888 dans la promotion de la croissance des cellules tumorales et de l’agressivité de la maladie. On a prédit que les cellules cancéreuses porteuses de délétions CRISPR pour les membres du cluster miR-888 se développeraient plus lentement que les cellules de type sauvage. Une préoccupation légitime était que, au fil du temps, les puits guidés transfectés par l’ARN, contenant une population mixte de cellules knock-out et de cellules de type sauvage, entraîneraient une concurrence rapide des cellules de type sauvage avec les cellules mutantes compromises en culture. Cela a été noté et a été particulièrement prononcé dans les expériences utilisant les lignées cellulaires PC3-ML très agressives. Ainsi, des étapes impliquant des dilutions en série pour générer des lignées de colonies unicellulaires ou une préparation cellulaire pour le cryostockage ont été effectuées dans les 48 à 72 heures suivant la réalisation des expériences de transfection CRISPR pour préserver les cellules knockout dans les échantillons de population mixte.

La partie la plus laborieuse du flux de travail CRISPR pour le cluster miR-888 a été la génération de délétions homozygotes de miARN de colonie unicellulaire. L’un des défis de ce processus était que les cellules LNCaP et PC3-ML cultivées ne se développaient généralement pas bien lorsqu’elles étaient plaquées à des densités unicellulaires. En outre, la croissance cellulaire semblait être phénotypiquement compromise lors de la perte combinatoire des membres du cluster miR-888 (et corrélée à l’agressivité de la lignée cellulaire). Par conséquent, pour certaines des réactions de transfection ciblant certaines combinaisons de locus de miARN, des dilutions cellulaires supplémentaires (utilisant un format de 96 puits) ont été nécessaires pour générer suffisamment de lignées de colonies unicellulaires pour le génotypage. Lors du criblage des génotypes des colonies unicellulaires par imagerie sur gel d’électrophorèse, il a été utile de comparer l’intensité de la bande du type sauvage par rapport aux fragments de PCR knockout et de déterminer si la lignée cellulaire était hétérozygote (intensité de bande égale) ou représentait une colonie multicellulaire (intensité de bande inégale), ce qui bénéficierait de cycles supplémentaires de dilutions unicellulaires. Si les colonies cellulaires possédaient des fragments de PCR de taille anormale et incompatibles avec les génotypes de type sauvage ou knockout, ces lignées ont été éliminées de l’étude.

Le séquençage de l’ADN de fragments de PCR isolés compatibles avec les génotypes de type sauvage et knockout a été revalidé pour chaque colonie unicellulaire établie et confirmé à l’aide de méthodes indépendantes (c.-à-d. qRT-PCR, WGS). En termes d’efficacité typique de la génération de lignées cellulaires nulles homozygotes dans ces expériences, cela variait avec le locus de miARN ciblé et le type de cellule utilisé. Par exemple, l’efficacité dans l’obtention de lignes knockout mir-891a à colonie unique en utilisant LNCaP était de 30%, mais a chuté à ~ 7% dans les cellules PC3-ML. Cette différence pourrait être due à des différences inhérentes au type cellulaire (p. ex., les cellules PC3-ML possèdent des taux de division/potentiel métastatique plus élevés que les cellules LNCaP). Les différences d’efficacité CRISPR pourraient également refléter l’impact fonctionnel de la perte de miARN (par exemple, miR-891a favorise la croissance cellulaire et l’agressivité ^9,10) et, par conséquent, les phénotypes knockout pourraient être amplifiés dans des lignées cellulaires plus agressives telles que PC3-ML. L’obtention de lignées à colonie unique pour des délétions de locus miARN plus importantes du groupe miR-888 a montré des efficacités réduites. Nous n’avons pas été en mesure de déterminer si cela était dû à l’élimination de plus grandes régions de l’ADN ou à la mise en évidence des rôles fonctionnels essentiels et chevauchants des membres miR-888 dans les cellules cancéreuses de la prostate.

Une description détaillée et une analyse phénotypique des lignées cellulaires de grappes miR-888 à colonie unicellulaire élargies générées à partir de ce flux de travail sont en cours et seront publiées ailleurs. En tant que résultat représentatif des délétions de miARN générées dans ces études d’édition de gènes CRISPR, les résultats pour les cellules cancéreuses de la prostate LNCaP porteuses d’une délétion individuelle mir-891a sont montrés. Les colonies unicellulaires ont été génotypées par PCR et la séquence a été vérifiée (figure 4A-C). Les lignées cellulaires présentant des fragments de PCR de taille anormale n’ont pas été analysées (p. ex., le clone L14 H7 illustré à la figure 4D). Une fois que des colonies unicellulaires de type knockout et sauvage ont été obtenues pour le locus mir-891a, des études fonctionnelles ont été effectuées. Des travaux antérieurs ont montré que la surexpression de miR-891a (miARN imitant le vecteur lentiviral) induit la croissance des cellules de la prostate⁹ et, par conséquent, il a été prédit que la perte de miR-891a montrerait des effets réciproques. Les essais de prolifération WST-1 comparant les cellules knock-out mir-891a et les cellules de type sauvage ont confirmé cette hypothèse, et la perte de miR-891a a entraîné un ralentissement de la croissance (Figure 4D, E).

Figure 1 : Flux de travail d’édition de gènes CRISPR pour générer des délétions de grappes de miARN. (A) L’ARN guide se compose de l’ARNc synthétique recuit et des oligonucléotides d’ARNtr (rapport molaire mixte 1:1). L’oligonucléotide d’ARNc est conçu pour contenir une séquence guide unique de 5'-terminal 20 nt (jaune) complémentaire au site d’ADN génomique ciblé et est suivi d’une séquence de répétition invariante de 22 nt Streptococcus pyogenes (vert) qui base la paire avec l’oligonucléotide d’ARNr. Les flèches rouges indiquent les sites de clivage de l’ADN double brin de l’enzyme Cas9 généralement situés à 3 nt en amont du PAM. (B) Ce flux de travail expérimental représente un seul puits d’une plaque de 24 puits. Les cellules infectées par un vecteur de lentivirus Cas9 inductible par DOX (Lenti-iCas9, MOI 0.3) sont cultivées en milieu avec DOX pendant 48 h pour induire l’expression de la protéine Cas9. Deux ARN guides synthétiques (rapport molaire mixte 1:1 de crRNA::tracrRNA) sont transfectés en cellules induites par Cas9. Les ARN guides escortent Cas9 vers les sites d’ADN génomique (5' et 3') flanquant la région du cluster de miARN ciblée pour l’élimination. Les cellules sont préparées 48 h après la transfection pour dilution en utilisant un format de 96 puits pour générer des colonies unicellulaires pour le génotypage par PCR et les analyses phénotypiques en aval. Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées ; miARN = microARN; ARN cr = ARN CRISPR; tracrRNA = trans-activation de l’ARN CRISPR; nt = nucléotide; Cas9 = endonucléase associée à CRISPR; PAM = protospacer motif adjacent; DOX = doxycycline; MOI = multiplicité de l’infection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Lignées cellulaires cancéreuses porteuses d’une cassette lentivirale Cas9 inductible à la doxycycline présentant une régulation serrée de la protéine Cas9. (A) L’analyse par transfert Western a montré que les lignées cellulaires PC3-ML du cancer de la prostate humaine infectées par le vecteur Lenti-iCas9 (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) et cultivées pendant 48 h dans un milieu contenant 250 ng/mL DOX ont exprimé des niveaux optimaux de protéine Cas9. L’expression de Cas9 a été normalisée à l’expression de GAPDH. (B) Les cellules PC3-ML cultivées dans un milieu avec 250 ng/mL de DOX pendant 48 h et 120 h (+DOX) ont montré une expression robuste de la protéine Cas9. L’élimination du DOX du milieu (-DOX) pendant 120 h (120 h après) a entraîné la clairance de la protéine Cas9, telle que mesurée par l’analyse par transfert western. Des résultats similaires ont été obtenus lors de la génération de la lignée cellulaire LNCaP Lenti-iCas9 (non montrée). Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées ; Cas9 = endonucléase associée à CRISPR; DOX = doxycycline; MOI = multiplicité de l’infection; GAPDH = glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Conception expérimentale CRISPR à haut débit pour générer plusieurs combinaisons de délétion de grappes miR-888 en une seule expérience. (A) Diagramme de la grappe miR-888 située sur le chromosome humain Xq27.3, indiquant les membres de la famille miR-743 conservés par les mammifères mir-892c, -890, -888, -892a et -892b (boîtes bleues) et les membres de la famille miR-891 spécifiques aux primates miR-891a et -891b (boîtes marron). Des oligonucléotides synthétiques uniques d’ARNc (flèches vertes) ont été utilisés pour générer les combinaisons d’élimination du cluster miR-888. Les amorces de PCR avant et arrière (petits rectangles rouges) ont été conçues pour génotyper les cellules et dépister les knockouts. (B) Ce résultat représentatif montre 25 réactions CRISPR dans des cellules PC3-ML transfectées (Lenti-iCas9) qui ont ciblé une gamme de combinaisons d’élimination de clusters miR-888 en une seule expérience. Chaque puits transfecté d’une plaque de 24 puits contenait deux ARNg uniques flanquant les côtés 5' et 3' du locus génomique (Δ) du miARN ciblé (tel qu’indiqué dans le tableau 2). Des lysats cellulaires bruts ont été préparés pour chaque réaction CRISPR et génotypés par PCR. Des fragments de PCR isolés migrant aux tailles de knockout prévues par électrophorèse sur gel ont été séquencés par l’ADN et validés pour le clivage Cas9 ciblé et l’élimination du locus du miARN. Les tailles bp prédites des fragments WT PCR sont indiquées entre parenthèses, et les tailles de fragments CRISPR KO PCR souhaitées sont indiquées au bas du gel. Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées ; Cas9 = endonucléase associée à CRISPR; ARNg = ARN guide; DOX = doxycycline; bp = paire de base; WT = type sauvage; KO = KO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Cellules cancéreuses de la prostate supprimées pour mir-891a à l’aide de l’édition de gènes CRISPR présentant une prolifération supprimée. (A) Conception d’amorces de PCR (violet) et des deux ARN guides de 5' et deux 3' (orange) ciblant les séquences génomiques flanquant le gène mir-891a (vert). (B) Le génotypage par PCR de cellules LNCaP transfectées avec des ARN guides indiqués de 5' et 3' a confirmé que des délétions de Δmir-891a ont été obtenues pour les quatre combinaisons d’ARN guides. Les lysats cellulaires ont été fabriqués à partir de populations de cellules mixtes 48 heures après la transfection. (C) Les fragments de PCR ont été séquencés et validés. Un exemple représentatif montre la séquence d’ADN de cellules transfectées traitées avec des ARN guides 5A(891a) et 3B(891a), entraînant le site de clivage Cas9 prédit (3 nt en amont du site PAM) et la délétion CRISPR Δmir-891a. (D) Des colonies unicellulaires ont été obtenues et génotypées par PCR. Le clone L14 G9 a été validé en tant que KO et le clone L14 G9 en tant que WT pour le gène mir-891a. (E) il a déjà été démontré que le miR-891a induit la croissance des cellules cancéreuses de la prostate et, par conséquent, la perte du miR-891a devrait avoir le phénotype réciproque. Les tests WST-1 de cellules cancéreuses de la prostate supprimées pour mir-891a (L14 G9 [KO], bleu) ont montré une prolifération supprimée par rapport aux cellules WT (L14 G9 [WT], rouge). Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées ; Cas9 = endonucléase associée à CRISPR; WT = type sauvage; KO = KO; WST-1 = sel de tétrazolium soluble dans l’eau-1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La réaction pcr est mise en place sur la glace.
Composant	Réaction de 25 μL	Concentration finale
5x Tampon ADN polymérase	5 μL	1x
Amorce de PCR directe (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
Amorce de PCR inversée (10 μM)	0,5 μL	0,2 μM
10 mM dNTPs	0,5 μL	200 μM
ADN polymérase (2 U/μL)	0,25 μL	0,125 U/ 25 μL
Lysat de cellules brutes	1 - 4 μL	variable
Eau sans nucléase	jusqu’à 25 μL
Conditions du thermocycleur pour la réaction PCR:
Pas	Température	Heure
Dénaturation initiale	98 °C	3 min
	98 °C	10 s
35 cycles	62 °C	15 s
	72 °C	15 s
Prolongation finale	72 °C	10 min
Tenir	4 °C

Tableau 1 : Conditions de réaction à la PCR pour le génotypage du lysat brut. Abréviation : dNTP = désoxynucléotides.

Site de suppression ciblé par CRISPR	Combinaison d’ARN guide	Type sauvage (bp)	Knockout (pb)	Paires d’amorces PCR
∆ Cluster complet	5A(891a)+3A(892c) 5B(891a)+3A(892c) 5A(891a)+3B(892c) 5B(891a)+3B(892c)	35,664	389 496 378 485	891a FWD 892c REV
∆892c/890/888	5A'(888)+3A(892c) 5B'(888)+3A(892c) 5A'(888)+3B(892c) 5B'(888)+3B(892c)	2,739	478 487 467 476	888 FWD 892c REV
∆892c/890	3A'(888)+3A(892c) 3B'(888)+3A(892c) 3A'(888)+3B(892c) 3B'(888)+3B(892c)	2,739	710 754 699 743	888 FWD 892c REV
∆892b/892a	5A'(888)+5A(892b) 5B'(888)+5A(892b) 5A'(888)+5B(892b) 5B'(888)+5B(892b)	2,938	554 547 573 566	892b FWD 888 REV
∆892b/892a/888	5A(892b )+3A'(888) 5A(892b )+3B'(888) 5B(892b )+3A'(888)	2,938	322 278 341	892b FWD 888 REV
famille ∆743	5A(892b)+3A(892c) 5B(892b)+3A(892c) 5A(892b)+3B(892c) 5B(892b)+3B(892c)	5,015	370 389 359 378	892b FWD 892c REV
famille ∆891	5A(891a)+3A(891b) 5B(891a)+3A(891b )	27,294	330 270	891a FWD 891b REV
∆891a	5A(891a)+3A(891a ) 5A(891a)+3B(891a ) 5B(891a)+3A(891a ) 5B(891a)+3B(891a )	554	333 273 454 394	891a FWD 891a REV

Tableau 2 : ARN guides CRISPR utilisés pour générer des combinaisons d’élimination de grappes miR-888. Abréviations : CRISPR = répétitions palindromiques courtes régulièrement espacées ; bp = paire de base; FWD = avant; REV = inverse.

Amorce	Séquence	Tm (°C)
888 FWD	AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG	52.2
888 REV	CTGGATGATGGCCAAGACAAG	55.9
891a FWD	TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA	53.9
891a REV	TTCATCTTGCTGCTACCTGTC	54.8
891b REV	TCATCTTGCTGCTATACGTCCT	55.6
892b FWD	GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA	53.5
892b REV	CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC	53.5
892c FWD	TGTGAGCACCTACAGGTTAG	53.9
892c REV	CACTCTCACTTGGCTTCATG	53.5

Tableau 3 : Amorces de PCR utilisées pour le génotypage. Abréviations : FWD = forward; REV = inverse; Tm = température de fusion.

Discussion

Cette procédure d’édition de gènes CRISPR permet à l’investigateur de générer rapidement un panel entier de lignées cellulaires portant des combinaisons uniques de délétion de grappes de miARN. La transfection d’ARN guides synthétiques composés d’ARNnc génomiques spécifiques à un site de 5' et 3' recuits avec de l’ARNr synthétique (rapport molaire 1:1) dans ce protocole évite le sous-clonage vectoriel plasmidique fastidieux et permet une conception expérimentale plus flexible et à haut débit utilisant un format à 24 puits. La génération de lignées cellulaires portant une cassette lentivirale Cas9 inductible au DOX permet une expression cas9 robuste et étroitement régulée par DOX lors de la transfection cellulaire des ARN guides et une clairance rapide de cette protéine bactérienne lors du retrait DOX du milieu de culture dans les étapes suivantes. Cette procédure repose également sur des lysats cellulaires bruts pour le génotypage par PCR, ce qui nécessite un minimum de matériel cellulaire pour l’analyse et évite l’utilisation de méthodes coûteuses et laborieuses de purification de l’ADN de colonne de silice ou la nécessité de mesurer les concentrations d’acide nucléique à l’aide d’un spectrophotomètre, rationalisant davantage les méthodes pour l’investigateur.

En effet, les résultats représentatifs partagés ici ont montré une adaptation réussie de cette méthode pour transfecter les lignées cellulaires du cancer de la prostate humaine avec 32 combinaisons d’ARN guides uniques dans une seule expérience et générer plusieurs lignées knock-out de colonies unicellulaires porteuses de délétions pour l’ensemble de la région du cluster miR-888 d’environ 35 kb; des combinaisons de délétion plus petites pour les membres du cluster miR-888 appartenant aux familles miR-743 et miR-891a; ainsi que des suppressions pour les membres individuels des miARN au sein du cluster miR-888. Ce flux de travail a généré une ressource précieuse sur la lignée cellulaire pour commencer à disséquer moléculairement le réseau de grappes miR-888 dans le contexte de la maladie de la prostate humaine et à déterminer comment les membres du groupe miR-888 se chevauchent fonctionnellement ou interagissent de manière synergique / antagoniste les uns avec les autres pour réguler la croissance tumorale de la prostate, l’agressivité du cancer et la résistance aux médicaments (à publier ailleurs). Ces études seront cruciales alors que cette recherche évolue vers des applications diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement des patients atteints de formes avancées et métastatiques de cancer de la prostate.

Il y a plusieurs étapes critiques dans ce protocole d’édition de gènes CRISPR à haut débit que les chercheurs devraient examiner attentivement lors de l’adaptation de cette méthode pour étudier des réseaux de grappes de miARN supplémentaires dans d’autres contextes de maladie. Tout d’abord, l’étape la plus importante de ce processus est la conception minutieuse des ARN guides qui flanquent le groupe de miARN pour l’élimination médicamenteuse CRISPR, ainsi que des ARN guides supplémentaires pour supprimer des miARN individuels ou des combinaisons de membres du groupe de miARN. L’investigateur doit veiller à ne pas perturber les gènes environnants ou les éléments régulateurs, en particulier si le groupe de miARN réside dans un gène intron ou est situé à l’opposé d’un autre gène. Il existe des ressources de prédiction crispR hors ciblage ^24,25,26,27 disponibles qui peuvent aider le chercheur à choisir les oligonucléotides d’ARNc les plus discriminants à synthétiser. Ce flux de travail décrit la conception de deux ARNc de 5' et deux ARNc de 3' flanquant chaque locus de miARN ciblé qui permettent de tester quatre combinaisons d’ARN guides uniques dans l’étape de transfection CRISPR et d’augmenter les chances de générer la lignée cellulaire knockout souhaitée. Cependant, l’investigateur n’a besoin que d’une seule de ces combinaisons d’ARN guides pour réussir à perturber un locus de gène miARN particulier.

Deuxièmement, l’investigateur doit décider de la méthode la plus appropriée pour administrer Cas9 aux cellules pour l’édition de gènes CRISPR. Cette procédure utilisait le système d’expression lentivirale Cas9 inductible doX, mais d’autres approches pour la production de protéines Cas9 (par exemple, la protéine recombinante Cas9, l’administration d’ARNm Cas9 ou l’utilisation de systèmes vectoriels plasmidiques d’expression Cas9 conventionnels) peuvent facilement être adaptées à ce protocole. Par exemple, des considérations expérimentales pourraient dicter l’utilisation de l’expression transitoire Cas9 par rapport à la génération de lignées cellulaires d’expression lentivirale stables, le promoteur utilisé pour conduire Cas9 (omniprésent, spécifique au type cellulaire, inductible), et l’incorporation de systèmes de sélection positifs / négatifs pour assurer l’administration du vecteur d’expression Cas9 aux cellules d’intérêt (c.-à-d. résistance aux antibiotiques).

Troisièmement, il est important de génotyper rapidement les cellules transfectées à population mixte dans les 48 à 72 heures suivant l’administration de l’ARN guide dans le cas où la perte du groupe de miARN pourrait avoir un impact négatif sur la viabilité / croissance des cellules. Par exemple, lors de la suppression des facteurs favorisant la tumeur tels que miR-891a dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate, il a été noté que ces cellules knock-out mir-891a se développaient plus lentement que les cellules non traitées et, par la suite, les cellules de type sauvage ont rapidement dépassé la population cellulaire. Enfin, il est crucial d’intégrer des méthodes de validation supplémentaires pour assurer l’élimination du locus miARN pendant le processus de criblage génotypique, en particulier pour les délétions génomiques plus importantes. Ces mesures comprennent l’utilisation de contrôles internes de génotypage par PCR qui ne sont détectés que si l’allèle de type sauvage est présent et l’exécution d’une analyse qRT-PCR sur des colonies unicellulaires pour s’assurer que les lignées cellulaires knock-out n’expriment pas les miARN ciblés. Toutes ces considérations assureront le succès de l’investigateur.

Il y avait des limites évidentes rencontrées lors de l’intégration de cette technique CRISPR dans le laboratoire. Par exemple, malgré la nature à haut débit des étapes guides de transfection de l’ARN décrites dans ce protocole pour générer rapidement plusieurs combinaisons de délétion de grappes de miARN, l’étape limitant le débit de cette procédure était le criblage du génotype et l’expansion des lignées cellulaires à colonie unique pour chaque délétion de miARN médiée par CRISPR. L’intégration de stratégies de sélection positive dans ce protocole serait un avantage; cependant, il faudrait encore environ 3 à 4 semaines pour étendre une lignée à partir d’une colonie unicellulaire cultivée dans un format de 96 puits. En effet, la collecte d’au moins trois lignées cellulaires indépendantes à colonie unique par knockout de locus miARN plus des cellules de type sauvage aidera à s’assurer que les phénotypes testés ne sont pas dus à des effets d’artefact / hors ciblage, mais cela ajoute encore à la nature chronophage de cette procédure. L’investigateur peut également avoir besoin d’effectuer plusieurs cycles d’édition de gènes CRISPR pour obtenir des lignées cellulaires nulles homozygotes. Ceci est particulièrement prononcé dans les études utilisant des lignées cellulaires cancéreuses immortalisées établies qui possèdent souvent un paysage génomique complexe de réarrangements chromosomiques et de caryotypes anormaux.

Par exemple, cette étude représentative a utilisé des lignées cellulaires de cancer de la prostate humaine dérivées du LNCaP et du PC3 pour générer des délétions pour le cluster miR-888, mapper sur le chromosome X. Il était important de reconnaître que ces lignées cellulaires de cancer de la prostate d’origine masculine ont des caryotypes anormaux et possédaient deux chromosomes X (et les cellules PC3 ont également des translocations partielles du chromosome X sur d’autres autosomes)^31,32. Malgré ces conditions, l’édition de gènes CRISPR était suffisamment robuste pour générer des knockouts homozygotes en utilisant ces lignées cellulaires de la prostate. Cependant, il peut y avoir des cas où la lignée cellulaire d’un investigateur avec un caryotype anormal (p. ex., insertions, délétions, inversions, duplications) pourrait abriter des « mutations invisibles » qui obscurciront la détection de deuxièmes copies (ou plus) du locus du gène ciblé en raison d’éléments manquants qui sont nécessaires pour une détection réussie à l’aide des amorces/ARN guides de PCR conçus. Cela souligne l’importance de vérifier les lignées cellulaires CRISPR nulles homozygotes à l’aide de méthodes indépendantes (c.-à-d. qRT-PCR, northern blot, WGS) avant d’effectuer des tests fonctionnels. Enfin, ce protocole est conçu pour éliminer uniquement les combinaisons de grappes de miARN qui se mappent les unes aux autres. Si un chercheur souhaite éliminer les miARN séparés entre d’autres gènes de miARN, plusieurs séries de transfections CRISPR seront nécessaires, nécessitant un génotypage et une validation minutieux.

Malgré ces défis, la capacité de générer rapidement un panel complet de combinaisons de délétion de miARN pour un cluster de miARN donné en utilisant ce protocole décrit est un énorme avantage par rapport aux méthodes existantes dans la boîte à outils de recherche sur les miARN. Les études de surexpression utilisant des mimiques de miARN pour caractériser la fonction d’ARN non codante peuvent conduire à des artefacts involontaires ou à des toxicités cellulaires. De même, l’utilisation d’inhibiteurs antisens antimir oligonucléotidiques pour déterminer les phénotypes de perte de fonction peut être difficile car les antimirs entraînent généralement une chute et non une élimination complète de l’activité des miARN. Tenter d’utiliser des combinaisons d’imitations de miARN ou d’antimirs de miARN pour élucider la signalisation du réseau de clusters de miARN s’est avéré laborieux et difficile à interpréter. Par conséquent, l’intégration de la technologie d’édition de gènes CRISPR pour interroger la façon dont les membres des miARN interagissent au sein d’une grappe génomique non codante donnée permettra aux chercheurs de mieux comprendre comment les ARN non codants influencent les voies de signalisation de la maladie et promet d’avoir d’énormes implications dans les domaines du diagnostic et de la découverte de médicaments.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap	Fisher	14-230-225	Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes	Seal-Rite	1615-5500	Plasticware
24-well tissue culture plate	Corning Costar	09761146	Plasticware
5x Phusion HF Buffer	Thermo Scientific	F-518L	PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate	Fisher	FB012927	Plasticware
96-well tissue culture plate	Falcon	08-772-2C	Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal	AbCam	ab191468	Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine	National Center for Biotechnology Information	NA	Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes	Calbiochem	CAS 589205	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter	Invitrogen	A50298	Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes	Thermo Scientific	50001012	Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool	Horizon Discovery Ltd.	NA	Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2	Dharmacon, Inc.	T-2002-02	Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher	BP231100	Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	MT10013CV	Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution	Sigma-Aldrich	D3072-1ML	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed	Dharmacon, Inc.	U-002005-20	CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA, desalted/deprotected, 2 nmol	Dharmacon, Inc.	crRNA-460XXX	CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL	Dharmacon, Inc.	VCAS11227	CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer	Ensembl	NA	Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal	Santa Cruz Biotechnology	sc25778	Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit	IBI Scientific	IB47010	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified	Gibco	16000044	Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide	MilliporeSigma	H9268	CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane	MilliporeSigma	IPFL10100	Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer	LI-COR	927-60001	Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-68070	Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody	LI-COR	926-32211	Western blot reagent
Microcentrifuge	Eppendorf	5425 R	Plasticware
miRBase microRNA viewer	miRBase	NA	Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well	Invitrogen	NP0321BOX	Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System	LI-COR	CLx	Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium	Gibco	31985062	Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System	Owl	D2-BP	Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides)	Integrated DNA Technology	NA	PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL)	Thermo Scientific	F530S	PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x	MilliporeSigma	20-188	Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade	Invitrogen	25530049	PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL)	Thermo Scientific	EN0531	PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium	Gibco	MT10041CV	Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer	Snap Gene	NA	Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red	Gibco	12563029	Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose	Invitrogen	16500100	Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler	ThermoFisher Scientific	4375305	Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System	Invitrogen	EI0001	Equipment; Protein gel electrophoresis system