Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CRISPR-genredigeringsverktyg för mikroRNA-klusternätverksanalys

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Detta protokoll beskriver ett high-throughput-grupperat regelbundet interspaced kort palindromiskt upprepningsarbetsflöde (CRISPR) genredigeringsarbetsflöde för mikroRNA-klusternätverksanalys som möjliggör snabb generering av en panel av genetiskt modifierade cellinjer som bär unika miRNA-klustermedlemsraderingskombinationer så stora som 35 kb inom ett enda experiment.

Abstract

MikroRNA (miRNA) har framstått som viktiga cellulära regulatorer (tumörsuppressorer, pro-onkogena faktorer) av cancer och metastasering. De flesta publicerade studier fokuserar på ett enda miRNA när man karakteriserar rollen som små RNA i cancer. Emellertid är ~ 30% av humana miRNA-gener organiserade i klustrade enheter som ofta uttrycks tillsammans, vilket indikerar ett komplext och samordnat system för icke-kodande RNA-reglering. En tydligare underskattning av hur klustrade miRNA-nätverk fungerar tillsammans för att reglera tumörtillväxt, canceraggressivitet och läkemedelsresistens krävs innan du översätter icke-kodande små RNA till kliniken.

Användningen av en high-throughput klustrad regelbundet interspaced kort palindromiska upprepningar (CRISPR) -medierad genredigeringsprocedur har använts för att studera den onkogena rollen hos ett genomiskt kluster av sju miRNA-gener som ligger inom en locus som spänner över ~ 35 000 bp i längd i samband med prostatacancer. För detta tillvägagångssätt infekterades humana cancercellinjer med en lentivirusvektor för doxycyklin (DOX) -inducerbart Cas9-nukleas odlat i DOX-innehållande medium i 48 timmar. Cellerna samtransfekterades därefter med syntetiska transaktiverande CRISPR-RNA (tracrRNA) komplexa med genomiska platsspecifika CRISPR-RNA (crRNA) oligonukleotider för att möjliggöra snabb generering av cancercellinjer som bär hela miRNA-klusterraderingen och individuella eller kombinerade miRNA-genklusterraderingar inom ett enda experiment.

Fördelarna med detta genredigeringssystem med hög genomströmning är förmågan att undvika tidskrävande DNA-vektorsubkloning, flexibiliteten i transfekterande celler med unika guide-RNA-kombinationer i ett 24-brunnsformat och den billigare PCR-genotypningen med råcellslysater. Studier som använder detta strömlinjeformade tillvägagångssätt lovar att avslöja funktionella redundanser och synergistiska / antagonistiska interaktioner mellan miRNA-klustermedlemmar, vilket kommer att hjälpa till att karakterisera de komplexa små icke-kodande RNA-nätverk som är involverade i mänsklig sjukdom och bättre informera framtida terapeutisk design.

Introduction

Bättre forskningsverktyg behövs för att undersöka bidraget från icke-kodande RNA vid mänsklig sjukdom. MiRNA-dysreglering observeras ofta vid mänskliga störningar som cancer när man jämför uttrycksprofilerna för dessa små icke-kodande RNA i vävnader och kroppsvätskor (t.ex. blod, urin) hos cancerpatienter kontra icke-cancer, friska individer, som använder mikroarrayer, kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) och nästa generations djupa sekvenseringstekniker 1,2 . Nyligen utfört arbete har karakteriserat en stor delmängd av dessa miRNA som tumörsuppressor-, onkogena och metastaseringsfaktorer som styr tumörbildning, sjukdomsprogression och läkemedelsresistens. Experimentellt överuttryck och / eller nedreglering / förlust av miRNA resulterar i funktionella och pleiotropa konsekvenser i cellen, vilket återspeglar det stora utbudet av cancerassocierade aktiviteter som dessa icke-kodande RNA samordnar - tillväxt, apoptos, differentiering, kromatinombyggnad, angiogenes, epitelial till mesenkymal (EMT) och MET-övergångar, metabolism och immunsvar3.

MiRNA kodas som enstaka gener eller finns i genomiska kluster, som transkriberas i kärnan och bearbetas i stor utsträckning innan de biologiskt mogna, enkelsträngade ~ 22 nukleotid (nt) miRNA-arterna lokaliserade i cytoplasman4 genereras. Dessa små RNA utövar sina effekter post-transkriptionellt och fungerar som negativa genregulatorer som binder till budbärar-RNA (mRNA) -mål på ett sekvensspecifikt sätt för att föra det katalytiska RNA-inducerade ljuddämpningskomplexet (RISC) till mRNA-platsen, vilket resulterar i mRNA-nedbrytning och / eller ett block i proteinöversättning. MiRNA är en extremt riklig klass av icke-kodande RNA i djursystem, och 2 654 mogna miRNA finns i det mänskliga genomet (miRBase release 22.1)5. MiRNA associerar vanligtvis med ofullständig komplementaritet till sina mRNA-mål4. Därför kan ett enda miRNA reglera tiotals till hundratals distinkta mRNA-mål och funktionellt påverka ett stort antal biologiska vägar. För att öka komplexiteten hos miRNA-baserade mekanismer kan ett enda mRNA regleras av flera, distinkta miRNA. Det är därför utmanande att undersöka hur miRNA-dysreglering stör kroppens homeostatiska balans och leder till mänsklig malignitet.

Majoriteten av publicerade studier har fokuserat på ett enda miRNA när de karakteriserar deras roll i sjukdomshändelser. Emellertid är ~ 30% av humana miRNA-gener organiserade i klustrade enheter (vanligtvis ~ 10 kilobaser [kb]) som ofta transkriberas i samma riktning och samuttrycks, vilket indikerar ett samordnat och komplext system av icke-kodande RNA-reglering6. Det största polycistroniska humana miRNA-klustret är 14q32-klustret som består av 54 miRNA-prekursorer. En av de mest välstuderade klustrade miRNA-enheterna associerade med human cancer är miR-17-92 polycistroniska klustret bestående av miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 och miR-92-1 bosatt inom intron 3 av det icke-kodande RNA, c13orf25. MiR-17-92-klustret förstärks ofta i hematopoetiska maligniteter och överuttrycks i solida tumörer och har etablerat onkogena roller för att främja cellcykelprogression, apoptos och angiogenes7. Dessutom raderas det tumörsuppressiva miR-15a- och miR-16-1-klustret som ligger inom intronen av den icke-kodande genen Leu2 ofta i leukemier och nedregleras i ett stort antal cancerformer, som fungerar för att blockera tumörtillväxt genom att rikta in sig på den antiapoptotiska genen BCL2 och ytterligare cellcykelprogressionsgener8. MiR-888-klustret är förhöjt hos patienter med högkvalitativ prostatacancer och består av sju miRNA-gener (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b och -891a) belägna på human kromosom Xq27.3 9,10.

MiR-888-klustret kartlägger inom HPCX1-locus (ärftlig prostatacancer, X-länkad 1) som spänner över Xq27-2, som identifierades genom länkanalys av ärftlig prostatacancerfamiljstamtavlor 11,12,13,14,15,29. Funktionell karakterisering av enskilda miR-888-klustrade medlemmar med hjälp av konventionella miRNA-feluttrycksverktyg - miRNA-miRNA-miRNA spelar överlappande roller för att reglera prostatatumörtillväxt och invasion 9,10. Dessa experimentella metoder lämpar sig dock inte lätt för att studera hur flera miR-888-klustrade medlemmar agerar synergistiskt eller antagonistiskt i ett icke-kodande RNA-nätverk för att kontrollera vävnadshomeostas och cancerprogression. Detta beskrivna strömlinjeformade protokoll med crispr-genredigeringsteknik med hög kapacitet modifieras för att molekylärt dissekera miRNA-kluster associerade med mänskliga cancerformer (t.ex. miR-888-kluster) för att överbrygga detta kunskapsgap.

Bakteriella CRISPR- och CRISPR-associerade (cas) gener förmedlar adaptiv immunitet mot bakteriofager16. Upptäckten av detta gamla prokaryota övervakningssystem anpassades snabbt som ett effektivt vetenskapligt verktyg för att enkelt rikta in sig på önskat genomiskt lokus och göra DNA-sekvensförändringar inom ett stort antal djursystem och celltyper både in vitro och in vivo16,17. Denna teknik har stort löfte som en effektiv metod för att förhöra miRNA-nätverk i samband med mänsklig sjukdom. För detta ändamål är detta CRISPR-genredigeringsprotokoll med hög genomströmning för att studera miR-888-klustret som spänner över ~ 35 kb på mänsklig kromosom X i odödliga humana prostatacancercellinjer (LNCaP, PC3-ML) konstruerat för att förhöra hur klustermedlemmar samordnar cancerprogressionsvägar. Detta tillvägagångssätt kan tillämpas för att karakterisera alla miRNA-kluster och gör det möjligt för utredare att snabbt generera mänskliga cellinjer som bär hela miRNA-klusterradering och individuella och kombinerade miRNA-genklusterraderingar inom ett enda experiment.

I denna procedur etableras stabila cellinjer som bär ett doxycyklin (DOX) -inducerbart lentivirralt uttryckssystem som gör det möjligt för utredaren att kontrollera Streptococcus pyogenes CRISPR-associerat endonukleas Cas9 (csn1) genuttryck genom den konstitutiva DOX-inducerbara promotorn TRE3G. Tet-On 3G-bipartitsystemet involverar en konstitutiv human töjningsfaktor 1 alfa (hEF1alpha) promotor för att driva transkriptionen av både Tet-On 3G-genen och blasticidinresistensgenen (BlastR) som ett bicistroniskt transkript. Tet-On 3G-transaktivatorproteinet binder endast till TRE3G-promotorn i närvaro av DOX, vilket resulterar i robust Cas9-transkription. I avsaknad av DOX finns det inget eller mycket minimalt basalt Cas9-uttryck. Därför kan prövaren inducera hög Cas9-proteinproduktion i celler odlade i media kompletterade med DOX under CRISPR-genredigeringsstegen och kontroll för snabb CAS9-proteinclearance vid DOX-uttag.

Detta protokoll beskriver också utformningen av syntetiska CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider som riktar sig mot regioner som flankerar hela miRNA-klustret, enskilda miRNA-hårnålsregioner (premiRNA) och / eller delmängder av miRNA-gener inom klustret. Varje designat crRNA innehåller en unik 5'-terminal 20 nt guidesekvens (komplementär till den genomiska sekvensen av intresse som ska riktas), följt av en invariant 22 nt S. pyogenes upprepa sekvens (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3') som möjliggör basparning med de universella transaktiverande CRISPR RNA (tracrRNA) oligonukleotiderna18. Tillsammans fungerar det glödgade crRNA och tracrRNA (blandat 1: 1-förhållande) som styr-RNA för detta protokoll (figur 1A). I varje experiment transfekteras två syntetiska styr-RNA till DOX-inducerade celler för att associera och eskortera det bakteriella Cas9-proteinet till de genomiska DNA-platserna (5 'och 3') som flankerar miRNA-klusterregionen som är avsedd för borttagning (Figur 1B).

En protospacer intilliggande motivsekvens (PAM) (5'-NGG-3' för vild typ S. pyogenes Cas9) måste finnas i cellgenomet och placeras omedelbart intill den 20 nt DNA-sekvens som styrs-RNA17 riktar sig till. PAM-sekvensen fungerar som en bindande signal och placerar den katalytiska regionen för endonukleas Cas9-enzymet på det riktade genomiska DNA-stället, vilket därefter leder till riktad, dubbelsträngad (ds) DNA-klyvning belägen ~ 3 nt uppströms PAM. Cellens DNA-reparationsmaskiner reparerar de klyvda DNA-ändarna, vilket kan resultera i perfekt ligering, men ofta uppstår icke-homolog slutfogning (NHEJ), vilket orsakar små infogningar eller raderingar (indels) på reparationsplatsen. Eftersom miRNA är icke-kodande gener som ofta finns inom intergeniska och introniska regioner, har dessa indels en låg risk att skapa oönskade nonsens / missense-mutationer.

Genom att använda syntetiska RNA-oligonukleotider (glödgat crRNA och tracrRNA, 1: 1 molförhållande) kodning för guide RNA-komplexet i dessa experiment, undviker denna gen knockout-strategi tidskrävande DNA-vektorsubkloning och möjliggör enorm flexibilitet vid transfektering av unika guide-RNA-kombinationer till celler i ett 24-brunnsformat. Beredning av råcellslysater för PCR-genotypscreening undviker också dyra och tidskrävande DNA-reningsmetoder, samtidigt som det möjliggör strömlinjegenerering av en koloni och fenotypisk analys. Faktum är att detta CRISPR-genredigeringsprotokoll med hög genomströmning har använts framgångsrikt för att transfektera odlade prostatacancercellinjer (LNCaP, PC3-ML) med 32 unika guide-RNA-kombinationer i ett enda experiment och generera knockout-linjer som bär deletioner för hela ~ 35 kb miR-888-klusterregionen; mindre raderingskombinationer för miR-888-klustermedlemmar som tillhör familjerna miR-743 och miR-891a; samt raderingar för enskilda miRNA-medlemmar inom miR-888-klustret. Studier som dessa kommer att ge en tydligare underskattning av hur klustrade miRNA fungerar tillsammans för att reglera tumörtillväxt, aggressivitet och läkemedelsresistens innan miRNA översätts till kliniken som terapeutiska och diagnostiska verktyg.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Förberedelse för CRISPR-genredigering och guide RNA-design för att generera miRNA-kluster knockout-cellinjer

  1. Skapa en DNA-fil som innehåller den fullständiga genomiska sekvensen av miRNA-klusterregionen av intresse (intergenisk, intronisk) och minst 1 kB av omgivande genomiska regioner med hjälp av ett DNA-sekvensannoteringsprogram19.
    1. Använd ett funktionsredigeringsverktyg i den skapade DNA-filen för att markera det riktade miRNA-klusterlokuset (intergeniskt, introniskt) och varje enskild miRNA-hårnålsekvens som tillhör miRNA-klustret, samt att notera andra närliggande kodande och icke-kodande gener och / eller reglerande funktioner 5,20,21,22.
    2. Se till att miRNA-regionerna som är inriktade på radering inte oavsiktligt stör närliggande proteinkodande gener, icke-kodande gener eller viktiga reglerande DNA-element.
      OBS: Tänk på den genomiska komplexiteten (t.ex. kromosomduplikationer / fusioner) hos cellinjen som används i detta protokoll.
  2. Designa syntetiska crRNA som riktar sig mot 20 nt av genomisk DNA-sekvens som flankerar hela miRNA-klustret, enskilda miRNA-hårnålsregioner (pre-miRNA) och / eller delmängder av miRNA-gener i klustret med hjälp av ett bioinformatiskt guide-RNA-designprogramvaruverktyg (t.ex.23). Se till att lämpligt Cas9-enzym är noterat i guide-RNA-designverktyget (dvs. S. pyogenes Cas9).
    OBS: Det syntetiserade crRNA kommer att innehålla denna unika 5'-terminala 20 nt guidesekvens (komplementär till DNA-mål) följt av en invariant 22 nt S. pyogenes upprepa sekvens för att möjliggöra basparning med den syntetiserade universella tracrRNA-oligonukleotiden. Glödgade tillsammans kommer de att fungera som guide-RNA i detta protokoll.
    1. Genom att referera till den skapade DNA-filen (steg 1.1.), ange ~ 150 nt AV DNA-sekvensen som ligger omedelbart uppströms (5 ') eller nedströms (3 ') av miRNA-hårnålen / klusterlokusen som är inriktad på radering i det bioinformatiska guide-RNA-designprogramvaruverktyget23.
      OBS: Designverktyget kommer att identifiera unika 20 nt-sekvenser för crRNA-oligonukleotiddesign som ligger omedelbart intill PAM-sekvensen (på den icke-riktade DNA-strängen) (t.ex . S. pyogenes Cas9 PAM-sekvens NGG). Nedan ges ett exempel på crRNA-design riktad mot en plats omedelbart uppströms (5 ') av mir-891a-genlokusen (specifikt 5A (891a) som diskuteras i avsnittet om representativa resultat och tabell 1).
      1. Öppna guiden RNA-designprogramvaruverktyg23.
      2. Ange namnet 5A(891a) i fönstret Ange namn .
      3. I fönstret Enter a DNA-sekvens anger du 150 nt genomisk sekvens som bor omedelbart uppströms (5 ') av mir-891a-prekursorgenen : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3"
      4. Markera rutan Aktivera specificitetskontroll för att utesluta webbplatser utanför inriktningen som upptäcks beräkningsmässigt av programmet. Välj lämplig organism (dvs . människa [Homo sapiens]).
      5. Ange rätt Cas9-enzym PAM som används för studierna, i detta fall Streptococcus pyogenes Cas9-PAM:NGG, för att generera följande standardinställningar: PAM i förhållande till målet: Efter; Upprepa sekvens: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; I förhållande till guide: 3; Målsekvensens längd: 20; Klipp i förhållande till mål 5' start: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Klicka på nästa för att se resultaten för syntetisk crRNA-syntes.
        OBS: I det här exemplet kommer det föreslagna crRNA som ska syntetiseras att känna igen DNA-målet ATACATGCTGATAGTTACAC och kommer att ligga intill PAM: AGG.
    2. Referera till DNA-filen (skapad i steg 1.1.) för att bestämma den bästa kandidaten crRNA 20 nt-målsekvenser som ligger närmast miRNA-locus som ska raderas och har den högsta specificiteten för det avsedda genomiska målet.
      1. Använda beräkningsbaserade off-targeting-analysverktyg för att utvärdera kandidatens crRNA-specificitet och förutsäga potentiella off-targeting-platser i genomiska loci som inte är relaterade till den riktade miRNA-klusterregionen av intresse (t.ex. 24,25,26,27).
      2. Registrera potentiella off-targeting-resultat för senare referens vid genotypning av CRISPR-klonala cellinjer med en koloni med PCR (steg 4.2.6.).
        OBS: Omfattningen av sekvenskomplementaritet som delas mellan den designade crRNA-oligonukleotiden och den genomiska målsekvensen kommer att diktera hur selektivt Cas9-enzymet klyver genomet vid det locuset. Eftersom styr-RNA-glödgningarna till det genomiska målet i en 3 'till 5' riktning, kommer felmatchningar vid 5'-änden av DNA-målsekvensen (de första 8-10 baserna) ofta att blockera Cas9-medierad klyvning. Om den genomiska målsekvensen delar homologi med en annan genomisk locus, förutom inom de första åtta baserna i DNA-sekvensen, förutspås denna guide RNA ha en låg chans att off-targeting på denna plats.
      3. Designa fyra unika crRNA för varje riktad miRNA-locus: två designade crRNA för att rikta in sig på komplementära DNA-sekvenser omedelbart 5 'av miRNA-hårnålen / klustret (5'A, 5'B) och två designade crRNA för att rikta komplementära DNA-sekvenser omedelbart 3 'av miRNA-hårnålen / klustret (3'A, 3'B).
        OBS: Vid utförande av CRISPR-transfektionerna (i avsnitt 3) kommer fyra möjliga 5 'och 3' guide-RNA-parkombinationer (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) att testas för varje riktad miRNA-locus för att öka sannolikheten för att generera framgångsrika miRNA-locus-deletioner i ett enda experiment.
      4. Använd ett funktionsredigeringsverktyg i den skapade DNA-filen (steg 1.1.) för att markera DNA-målsekvensen (med intilliggande PAM) för varje designat crRNA som ska syntetiseras.
  3. Designa och syntetisera PCR-primers (framåt, bakåt) som flankerar de riktade miRNA-klusterregionerna för genotypning av CRISPR-cellinjer (och märk primers i den skapade DNA-filen).
    1. För genotypning av cellinjer som bär små genomiska deletioner för nära klustrade eller enskilda miRNA, designa PCR-primers (framåt, bakåt) som bor cirka 150 bp på varje sida av Cas9-klyvningsstället / knockoutregionen som möjliggör detektion av både vildtypen (~ 600 bp) och knockout (~ 300 bp) DNA-fragment i en enda PCR-reaktion via gelelektrofores.
    2. För genotypning av cellinjer som bär stora genomiska deletioner för miRNA-prekursorkombinationer eller hela miRNA-klustret, designa igen PCR-primers (framåt, bakåt) som bor cirka 150 bp på varje sida av Cas9-klyvnings- / knockout-platsen. Observera att om den riktade miRNA-klusterraderingen sträcker sig över >4 kb i längd, kommer PCR-reaktionen sannolikt bara att upptäcka det mindre (~ 300 bp) knockout-DNA-fragmentet men inte wildtype DNA-fragmentet. Designa därför ytterligare PCR-primers (framåt, bakåt) som kan detektera närvaron eller frånvaron av interna miRNA-klustergener för att underlätta screeningprocessen och validera för homozygota knockout-cellinjer.

2. Generering av stabila lentivirala cellinjer som bär den DOX-inducerbara Cas9-uttryckskassetten

OBS: Utför allt cellodlings- och virusarbete i en certifierad biosäkerhetshuv med BSL2-procedurer och aseptisk teknik.

  1. Bestäm lämplig cellinjetyp för CRISPR-studierna och föredragna tillväxtmedier.
    OBS: Detta protokoll utvecklades för humana prostatacancercellinjer LNCaP (föredraget medium: RPMI, 10% fetalt bovint serum [FBS]) och PC3-ML (föredraget medium: DMEM, 10% FBS).
  2. Utför en blasticidin "död" -kurva för att bestämma den optimala läkemedelskoncentrationen att välja för lentivirusinfekterade celler som bär blasticidinresistensgenkassetten (Steg 2.3.).
    1. Platta celler till 11 brunnar på en 24-brunnsplatta och växa vid 37 ° C, 5%CO2 i det föredragna mediet tills cirka 75% sammanflöde.
    2. Späd blasticidin (arbetsstock 1 mg/ml) i önskat medium med en slutlig koncentration från 0, 1 till 10 μg/ml och späd i steg om 1 μg/ml.
    3. Märk brunnarna på den sådda 24-brunnsplattan från 1 till 11. Ta bort tillväxtmediet från brunnarna och ersätt med lämpliga blasticidinkoncentrationer.
    4. Byt medium med lämpliga blasticidinkoncentrationer varannan dag i 7-10 dagar.
    5. Undersök cellerna dagligen under tidsförloppet och bestäm den minsta blasticidinkoncentrationen som krävs för att döda alla celler inom 5-7 dagar.
      OBS: En blasticidin "kill" -kurva måste utföras för varje specifik cellinje som används för CRISPR-genredigeringsexperimenten.
  3. Infektera cellerna med lentivirus som bär den DOX-inducerbara Cas9-uttryckskassetten och utför blasticidinval med den optimala koncentrationen bestämd i steg 2.2.
    1. I tre brunnar på en 6-brunnsplatta × 104 celler per brunn och växer i önskat medium vid 37 °C, 5 %CO2 över natten (ON).
    2. Nästa dag, tina lentivirusuttrycksvektorn för DOX-inducerbar Cas9 (Lenti-iCas9) på is. Blanda försiktigt (inte virvelviruspartiklar).
      OBS: Förvara lentiviruset i alikvoter vid -80 °C för att undvika flera frys-/upptiningscykler, vilket minskar virustiter och infektionseffektivitet.
    3. Beräkna volymen som behövs för att transducera 5 × 104 celler med virus vid en mängd infektion av 0,3 (MOI = 0,3) baserat på viral titerkoncentration.
    4. Pipettera lämplig virusvolym till 250 μl (per brunn) serumfritt och antibiotikafritt föredraget medium kompletterat med 0,8 μg/ml hexadimetrinbromid. Blanda försiktigt.
      OBS: Hexadimetrinbromid är en katjonisk polymer som visat sig öka viral adsorption och infektionseffektivitet.
    5. Ta bort mediet. Tillsätt 250 μL berett transduktionsmedium med Lenti-iCas9-virus (MOI = 0,3) till cellerna och inkubera ON vid 37 °C, 5 %CO2. (Förkorta inkubationstiden till 4-6 timmar om cellerna uppvisar virusrelaterade toxiska effekter.)
    6. Byt ut mediet med färskt föredraget medium och låt cellerna återhämta sig i 1-2 dagar.
    7. Utför blasticidinval på de infekterade cellerna i 10-14 dagar med hjälp av den optimala blasticidinkoncentrationen härledd från "kill" -kurvan som beskrivs i steg 2.2.
      1. Parallellt växer de oinfekterade cellerna i medium med den optimala blasticidinkoncentrationen som ska användas som en positiv kontroll för viral selektion.
    8. Byt medium kompletterat med den optimala blasticidinkoncentrationen var 3: e dag under urvalstidsförloppet för att ta bort döda celler.
      OBS: Endast celler som överlever blasticidinval kommer att ha integrerat den lentivirala vektorn.
    9. Expandera de blasticidin-valda Lenti-iCas9-cellinjerna.
      OBS: Anteckna cellpassagenumret vid varje expansion.
      1. Frys en del av Lenti-iCas9-cellerna i föredraget medium kompletterat med 10% dimetylsulfoxid (DMSO) för långvarig kryovial lagring.
      2. Analysera en del av Lenti-iCas9-cellerna med western blot9 för att identifiera cellinjen som uppvisar de mest robusta DOX-inducerbara Cas9-proteinnivåerna (se steg 2.3.).
  4. Utför en doxycyklinkoncentrationskurva på nyetablerade Lenti-iCas9-cellinjer för att bestämma de optimala förhållandena för Cas9-proteininduktion.
    1. Ställ in fyra oberoende 6-brunnsplattor för varje testad cellinje för att utföra denna DOX-koncentrationstidskurs. Platta 5 × 104 celler per brunn på varje 6-brunnsplatta och växa vid 37 °C, 5%CO2 i det föredragna mediet i 24 timmar.
    2. Späd DOX (arbetslager 1 mg/ml) i önskat medium med en slutlig DOX-koncentrationskurva från 0, 50, 100, 150, 250 till 500 ng/ml.
    3. Märk brunnarna på varje sådd 6-brunnsplatta från 1 till 6. Ta bort mediet och ersätt med lämpliga DOX-koncentrationer. Odla plattor 1-4 tills följande tidpunkter: 24 h, 48 h och 72 h DOX-induktion; och 120 h efter DOX-uttag (initialt 72 h DOX-inducerad).
    4. Skörda plattans brunnar vid varje tidpunkt med lämpliga metoder (t.ex. trypsinisering). Förvara cellpellets vid -80 °C. Bearbeta cellpellets i RIPA-buffert för lysatisolering och Cas9 western blot-analys.
      1. Kör 40 μg celllysat för varje prov av DOX-induktionstidskursen med en denaturerande 4% -12% Bis-Tris-gel och överför proteinerna till ett immunoblotmembran.
      2. Hybridisera immunblotmembranet med en primär antikropp mot Cas9 för att detektera 160 kDa-proteinet. Normalisera Cas9-nivåer med hjälp av en hushållningsgen som GAPDH (37 kDa).
    5. Baserat på resultaten från Western Blot, bestäm den optimala DOX-koncentrationen för att inducera Cas9 i Lenti-iCas9-cellinjerna.
      OBS: Den här gången kommer kursen också att avslöja hur tätt Cas9-uttryck regleras vid 120 h efter BORTTAGNING AV DOX.
    6. Etablera encellskolonier för Lenti-iCas9-cellinjerna som visar robust Cas9-proteinuttryck för att optimera CRISPR-transfektionerna (i avsnitt 3).

3. Utföra CRISPR-reaktioner genom Cas9-induktion och syntetisk guide-RNA-transfektion av celler med hjälp av ett high-throughput-format

Ett arbetsflödesdiagram visas i figur 1.

  1. På papper, kartlägg crRNA-parkombinationerna som kommer att transfekteras till varje brunn i en 24-brunnsplatta riktad mot hela miRNA-klustret, olika klustrade miRNA-genkombinationer samt enskilda miRNA-klustermedlemmar.
    1. På kartan, märk fyra brunnar per riktad miRNA-locus. Låt varje brunn representera en transfektionsreaktion, med två unika crRNA placerade 5 'och 3' av det önskade miRNA-knockout-genomiska locuset och tracrRNA (glödgat 1: 1 molförhållande).
    2. Se till att var och en av de fyra märkta brunnarna representerar ett unikt crRNA-par för transfektion (t.ex. 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      OBS: Utformningen av två 5 'crRNA och två 3' crRNA som flankerar varje riktad miRNA -locus (avsnitt 1) möjliggör generering av fyra möjliga 5 'och 3' styr -RNA -par i transfektionsreaktionen.
  2. Platta Lenti-iCas9-cellinjen vid 5 x 104 celler/brunn på en 24-brunnsplatta i det föredragna mediet som innehåller den optimerade DOX-koncentrationen (bestämd i steg 2.4.). Odla cellerna i 24-48 timmar vid 37 °C, 5% CO2 för att inducera Cas9-proteinuttryck.
  3. Transfektera Lenti-iCas9-cellerna med de beredda 5 'och 3' guide-RNA.
    1. Rekonstituera de syntetiserade crRNA- och tracrRNA-oligonukleotiderna med nukleasfritt vatten till en stamkoncentration av 10 μM. Förvara vid -80 °C på lång sikt.
    2. Märk fyra 1,5 ml mikrocentrifugrör per riktad miRNA-locus baserat på experimentkartan utformad i steg 3.1., som representerar de fyra möjliga 5 'och 3' crRNA-parkombinationerna (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. Blanda i varje rör ett 1: 1 molförhållande av tracrRNA och unika crRNA (5 'och 3') tillsammans för att bilda 2 μM styr-RNA-komplexet med användning av följande reaktion (slutlig volym på 10 μL):
      1. Tillsätt 2,5 μl tracrRNA (10 μM lager), 1,25 μL av 5'positionerat crRNA (10 μM stock), 1,25 μL av 3' positionerat crRNA (10 μM stock) och 5 μL 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 till ett 1,5 ml centrifugrör. Mikrocentrifug i 30 s vid 16 000 × g för att blanda. Inkubera vid rumstemperatur (RT) i 5 min.
    4. Tillsätt 40 μl reducerat serummedium (t.ex. Opti-MEM) till 10 μL styr-RNA-komplexreaktion (50 μL total volym) till varje rör. Blanda försiktigt genom att pipettera upp och ner.
    5. Blanda försiktigt 2 μL av transfektionsreagenset28 (se ANMÄRKNING 3.3.5.1) och 48 μL reducerat serummedium (t.ex. Opti-MEM, slutlig volym på 50 μL) i ett rent 1,5 ml centrifugrör och 48 μl reducerat serummedium (t.ex. Opti-MEM, slutlig volym på 50 μl) genom att pipettera upp och ner. Inkubera vid RT i 5 min.
      1. Bered en huvudblandning av transfektionsreagenset genom att multiplicera reagenset (2 μl) och det reducerade serummediet (t.ex. Opti-MEM, 48 μL) med antalet brunnar som ska transfekteras, plus 10 % extra volym för att ta hänsyn till små pipetterande felaktigheter.
        OBS: Välj ett transfektionsreagens som är optimerat för små RNA- och CRISPR-RNA-oligonukleotidtransfektioner, liksom för cellinjetyp28.
    6. Tillsätt 50 μl av styr-RNA-blandningen (från steg 3.3.4) till 50 μl av det utspädda transfektionsreagenset (från steg 3.3.5). Pipettera blandningen långsamt upp och ner en gång för att blanda. Inkubera vid RT i 20 min.
    7. Tillsätt 400 μl antibiotikafritt medium kompletterat med DOX (optimal koncentration) till varje rör som innehåller 100 μL av styr-RNA/transfektionsblandningen. Pipettera försiktigt för att blanda.
  4. Ta bort mediet från de DOX-inducerade Lenti-iCas9-cellerna (steg 3.2). Tillsätt 500 μL media/DOX/styr-RNA/transfektionsblandning baserat på experimentkartan med 24 brunnar (steg 3.1). Inkubera de transfekterade cellerna i 48 timmar vid 37 °C, 5 %CO2.
  5. Byt ut mediet mot det färska föredragna mediet utan DOX (för att rensa Cas9-protein från cellerna). Låt cellerna återhämta sig i ytterligare 24-48 timmar vid 37 °C, 5% CO2.
  6. Skörda de transfekterade cellerna (trypsinisering) och förbered dig för genotypning och encellsutspädningar.
    OBS: Celler representerar en blandad population som innehåller transfekterade CRISPR-genredigerade och otransfekterade vildtypsceller. Detta steg kommer att avgöra effektiviteten för CRISPR-redigering innan du investerar tid / resurser i encellskoloniutvidgning.
    1. Tvätta cellerna 1x med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Inkubera cellerna i 100 μl trypsin i 5 minuter vid 37 °C, 5 %CO2 och överför cellerna till ett rent 1,5 ml centrifugrör innehållande 1 ml medium.
    2. Invertera för att blanda och mikrocentrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 × g vid 20 °C. Ta bort mediet och återsuspendera cellpelleten i 1 ml PBS.
    3. Mikrocentrifugera de tvättade cellerna i 5 minuter vid 200 × g vid 20 °C. Ta bort PBS och återsuspendera cellpelleten i 150 μL av det föredragna mediet.
  7. Bestäm cellnumret per mikroliter av de 150 μl återsuspenderade cellerna med hjälp av en hemocytometer eller ett automatiserat cellräkningsinstrument.
  8. Separera 150 μL av återsuspenderade celler i tre delar.
    1. Frys 1/3 av transfekterade celler (50 μl) i medium plus 10% DMSO (slutlig volym på 150 μL) i kryomedialer för framtida expansion / långtidslagring.
    2. Överför 1/3 av transfekterade celler (50 μL) till ett rent 0,2 ml PCR-rör för genotypning.
      1. Mikrocentrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 × g vid 4 °C och avlägsna mediet.
      2. Resuspendera cellpelleten i 100 μL PBS.
      3. Mikrocentrifugera cellerna i 5 minuter vid 200 × g vid 4 °C och avlägsna PBS. Förvara cellpellets med blandad population på lång sikt vid -80 °C.
      4. Bearbeta cellpelleten för genotypning med hjälp av arbetsflödet i avsnitt 4.
    3. Förbered de sista 1/3 av cellerna (50 μL) för utspädning och plätering i ett 96-brunnsplattformat för att generera encellskolonier.
      1. Baserat på cellantalet i steg 3.7 beräknar du de utspädningar som krävs för att uppnå 10, 5, 2 och 1 cell(er) i 100 μl medium per brunn på en 96-brunnsplatta.
      2. Använd en 12-kanals multipipettor och en steril reagensbehållare, tillsätt 100 μL utspädda celler per brunn till två rader på plattan (totalt 24 brunnar) för varje utspädning (10, 5, 2 eller 1 cell per brunn). Tillåt 4-6 veckor för cellerna att växa till sammanflöde för encellskoloniutvidgning. Observera cellerna varje vecka under ett ljusmikroskop och notera om kolonierna representerar en- eller flercellskolonier.
      3. Samla ~ 10-15 encelliga kolonier för genotypning (avsnitt 4). Identifiera minst tre oberoende, knockout, encelliga kolonilinjer för varje riktad miRNA-locus. Behåll encellslinjer av vild typ som kontroller.
        OBS: Screeningnumret beror på cellinjetypen och effekten av miRNA-knockoutfenotyp på celltillväxt / livskraft.

4. PCR-genotypning av CRISPR-cellinjer med hjälp av råcellslysater

  1. Skörda enskilda, encelliga kolonier från nära sammanflytande brunnar på en 96-brunnsplatta.
    OBS: Avlägsnandet av medium / PBS som beskrivs i dessa steg kan utföras manuellt med hjälp av en vakuumaspirator i biosäkerhetsskåpet, men var försiktig så att du undviker korskontaminering. Använd en ny steril "gul" 200 μL pipetmanspets för varje brunn på 96-brunnsplattan när du aspirerar, där varje utbytta gul spets är ordentligt placerad i slutet av en steril glasbetespipett fäst vid vakuumaspiratorn.
    1. Tvätta brunnarna 1x med 100 μL PBS. Aspirera PBS.
    2. Tillsätt 50 μl trypsin och inkubera i 2-5 min vid 37 °C, 5 %CO2.
    3. Pipettera försiktigt upp och ner och överför de återsuspenderade cellerna till ett 1,5 ml centrifugrör som innehåller 1 ml medium.
    4. Invertera för att blanda och försiktigt pelletera cellerna i en mikrocentrifug i 5 minuter vid 200 × g vid 20 °C.
    5. Ta bort mediet och tillsätt 1 ml PBS. Vrid försiktigt röret för att störa pelleten och invertera flera gånger för att blanda.
    6. Mikrocentrifugera i 5 minuter vid 200 × g vid 20 °C för att pelletera cellerna.
    7. Ta bort PBS och återsuspendera pelleten i 300 μL färsk PBS.
    8. Dela upp provet på 300 μl i två delar.
      1. Överför 200 μl av cellerna (2/3 av pelleten) till en brunn av en 24-brunnsplatta innehållande 1 ml av det föredragna mediet. När genotypen har validerats använder du dessa celler för att expandera de CRISPR-medierade knockout-cellinjerna för funktionell analys.
      2. Överför 100 μL av cellerna (1/3 av pelleten) till ett 0,2 ml PCR-rör. Mikrocentrifugera i 5 min vid 3 000 x g vid 4 °C. Ta bort PBS. Förvara pelleten vid -80 °C.
  2. Förbered råcellslysater för genotypning och sekvensanalys med hjälp av PCR-primers som utformats i steg 1.3. Inkludera celllysat framställda från otransfekterade celler i dessa experiment för att använda som positiva kontroller av vild typ.
    1. Resuspendera cellpelleten i 4 μL 5x DNA-polymerasbuffert (se materialtabellen, slutkoncentration 1x), 1 μL proteinas K (20 ng / ml lager), 1 μl RNasE A (10 ng / ml lager) och nukleasfritt vatten upp till en total volym av 20 μL.
    2. Borra cellerna i en termocykling med hjälp av ett PCR-program: 56 °C i 30 min och 96 °C i 5 min. Förvara celllysaterna vid -20 °C.
    3. Utför en PCR-reaktion med hjälp av de designade PCR-primrarna (framåt, bakåt) som flankerar styr-RNA 5 'och 3' styr-RNA-riktade platser (tabell 1).
      OBS: DNA-polymerasbufferten och termocyklerförhållandena beror på Taq DNA-polymerasenzymet som används för PCR-reaktionen. Detta protokoll optimerades för ett Phusion HF DNA-polymeras.
      1. Ställ in PCR-reaktionsblandningen på is: 5 μl 5x DNA-polymerasbuffert, 0,5 μl framåtriktad PCR-primer (10 μM lager), 0,5 μL omvänd PCR-primer (10 μM lager), 0,5 μL 10 mM dNTP, 0,25 μL DNA-polymeras, 1-4 μl lysatcell och nukleasfritt vatten upp till en total volym på 25 μL.
      2. Kör PCR-reaktionen i en termocykler med programmet: 98 °C i 3 min och 35 cykler med 98 °C i 10 s, 62 °C i 15 s, 72 °C i 15 s och sedan 72 °C i 10 min. Håll i 4 °C. Se ANMÄRKNING 4.2.3. över.
    4. Ladda PCR-produkterna på en 1% agarosgel för elektroforesanalys.
    5. Extrahera DNA från de isolerade PCR-fragmenten av den förutsagda molekylstorleken för knockout (och vildtyp) genotyper. Förbered proverna för DNA-sekvensering.
    6. Validera att CRISPR-reaktionen var framgångsrik och utföra DNA-sekvensering av de isolerade PCR-fragmenten för att identifiera Cas9-klyvningsstället och bekräfta miRNA-locus-radering.
      1. Isolera minst tre oberoende knockout-cellinjer för varje miRNA-locus som CRISPR riktar sig mot. Behåll vilda (och heterozygota) cellinjer för att använda som kontroller i nedströms funktionella studier.
      2. Utför qRT-PCR- eller northern blot-analys för att bekräfta att knockout-cellinjerna inte uttrycker moget miRNA för det borttagna locuset.
        OBS: Helgenomsekvensering (WGS) är den mest definitiva metoden för att validera CRISPR-genredigering och off-targeting.
      3. Test för CRISPR off-targeting-effekter av PCR, som förutspåddes beräkningsmässigt (Steg 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Om omfattande encellskoloniscreening endast resulterar i heterozygota genotyper, upprepa guiden RNA-transfektion i de encelliga heterozygota linjerna.
        OBS: Oförmåga att erhålla homozygota knockout-cellinjer kan indikera dödliga effekter på grund av miRNA-förlust eller inneboende genomisk komplexitet (t.ex. kromosomduplikationer / fusioner) av föräldracellinjen som kräver ytterligare analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta CRISPR-raderingsprotokoll med hög genomströmning användes framgångsrikt med hjälp av transfektion av Cas9-inducerbara LNCaP- och PC3-ML humana cancercellinjer med syntetisk oligonukleotidguide RNA riktade mot miR-888-klustret, som studerades i samband med prostatacancer. MiR-888-klustret identifierades initialt i en uttrycksprofileringsskärm som förhöjt hos prostatacancerpatienter med höggradig sjukdom jämfört med låggradiga och icke-cancerpatienter 9,10. MiR-888-klustret, som sträcker sig över 35 124 bp, består av sju miRNA (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b och -891a) på human kromosom Xq27.3 (figur 2A). Denna plats ligger inom HPCX1 (ärftlig prostatacancer, X-länkad 1, Xq27-28), som är associerad med ärftlig prostatacancer 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b och -892c delar sekvenshomologi och tillhör den däggdjurskonserverade miR-743-familjen. Klustermedlemmar miR-891a och miR-891b delar endast sekvenshomologi med varandra och tillhör den primatspecifika miR-891-familjen. Den genomiska organisationen av miR-888-klustret bevaras över primater, vilket innebär funktionell bevarande av ett viktigt signalnätverk30.

Tidigare arbete med experimentella överuttryck (miRNA-mimiker) och hämning (antisense oligonukleotider) studier för att utvärdera enskilda miR-888 klustermedlemsaktivitet avslöjade en överlappande roll för alla miR-888-klustermedlemmar för att främja prostatacancercellinvasivitet med hjälp av Matrigel Boyden-kammaranalyser 9,10. Framför allt fungerade miR-888 och miR-891a på samma sätt för att inducera prostatacelltillväxt (WST-1-analyser), påskynda prostatatumörbelastningen hos musxenografter och reglera vanliga mål (t.ex. TIMP-2) 9,10. Detta arbete föreslog dock en mer komplex interaktion mellan miR-888-klustermedlemmarna. Till exempel visade miR-888 och miR-891a synergistiska effekter för att främja PC3-N prostatacellproliferation, medan både miR-890 och miR-892c visade hämmande tillväxteffekter med WST-1-analyser9. Därför användes detta CRISPR-protokoll med hög genomströmning för att genetiskt förhöra miR-888-klusternätverket i samband med prostatacancer.

Det beskrivna arbetsflödet för CRISPR Cas9-genredigering (figur 1) möjliggjorde testning av 32 unika CRISPR-guide RNA-transfektionsreaktioner i ett enda experiment med ett 24-brunnsformat. Detta protokoll resulterade i en framgångsrik identifiering av en panel av humana knockout-cellinjer för prostatacancer som bär deletioner för hela miR-888-klustret, specifika miRNA-klustermedlemskombinationer och enskilda miRNA-medlemmar. Genereringen av stabila inducerbara Cas9-cellinjer etablerades först. Kortfattat infekterades PC3-ML och LNCaP humana prostatacancerceller med en DOX-inducerbar Streptococcus pyogenes Cas9 lentivirusvektor (Lenti-iCas9; EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nukleaspartiklar; MOI 0.3) i 6 timmar (LNCaP) eller över natten (PC3-ML), beroende på inneboende cellinjekänslighet för virustoxicitet.

De infekterade cellinjerna genomgick därefter blasticidinval (7,5 μg / ml) och encellskoloniexpansion. Western blot-studier användes för att välja enkoloni PC3-ML och LNCaP Lenti-iCas9-cellinjer som uppvisar det mest robusta Cas9-uttrycket baserat på en DOX-induktionstidskurs (figur 2A). Detta lentivirala Cas9-inducerbara system kontrollerades tätt, och vid DOX-uttag i 120 timmar rensades det mesta av Cas9-proteinet från cellerna (figur 2A). En DOX-koncentrationskurva bestämde att 250 ng/ml DOX var den optimala dosen för att inducera robust Cas9-proteinuttryck i dessa Lenti-iCas9 prostatacellinjer (figur 2B). Med hjälp av ett online crRNA-designverktyg23 utformades unika crRNA (två 5 'och två 3' crRNA som flankerar varje planerat miRNA-knockout-locus för att möjliggöra fyra möjliga 5'- och 3' guide-RNA-kombinationer) som riktade sig till hela ~ 35 kb miR-888-klusterregionen; mindre klusterkombinationer inom miR-743-familjen eller miR-891-familjen; såväl som individuella miRNA-deletioner (miR-888, -891a) (Figur 3A). Vid utförandet av CRISPR-experimenten odlades human prostatacancer Lenti-iCas9 cellinjer i medium kompletterat med 250 ng / ml DOX i 48 timmar för att inducera Cas9-uttryck.

Cellerna transfekterades sedan i ett 24-brunnsplattformat med det syntetiska universella tracrRNA-komplexet (1: 1 molförhållande) med en unik uppsättning 5 'och 3' genomiska platsspecifika crRNA (tabell 2). DOX avlägsnades från cellodlingsmediet 48 timmar efter transfektion för att rensa Cas9-protein från prostatacancercellerna. Brunnarna skördades 48 timmar senare (96 timmar efter transfektion) och en tredjedel av varje skördad cellpellets bereddes för PCR-genotypning med hjälp av råcellslysater (tabell 3). Gelelektroforesanalys av PCR-reaktionerna indikerade att den förutsagda DNA-fragmentstorleken som representerar knockout-genotypen förstärktes för varje CRISPR-transfektion (figur 3B). DNA-sekvensering av dessa isolerade knockout PCR-fragment bekräftade att de transfekterade 5 'och 3' guide-RNA riktade Cas9-klyvning / ligering ~ 3 nt uppströms PAM-platserna och validerade genomisk förlust av det riktade miRNA-locuset (representativt exempel visas i figur 4C). Eftersom miR-888-klustret ligger i en intergenisk region av kromosom X (långt ifrån några proteinkodande gener), förväntades det inte att knockout-cellinjer, som ofta hade INDELs vid Cas9-klyvningsplatsen på grund av NHEJ, skulle orsaka nedströms artefaktiska effekter.

Även om CRISPR-transfektionsreaktionerna var framgångsrika (figur 3B), representerade de transfekterade cellerna en blandad cellpopulation av transfekterade (knockout) och otransfekterade (vildtyp) celler. Denna population representerade också en blandning av celler som bär homozygota och heterozygota deletioner för det riktade miRNA-locuset. LNCaP- och PC3-prostatacancercellinjer härrör från män som har onormala karyotyper som inkluderar två X-kromosomer31,32. Därför späddes en del av varje celltransfektionsreaktion seriellt i ett 96-brunnsplattformat för att erhålla encelliga kolonilinjer. Dessa kolonier screenades av PCR för att välja för homozygota cellinjer som saknade alla kopior av det riktade miRNA-locuset.

Denna procedur var viktig att följa i tid eftersom tidigare data har indikerat en roll för miR-888-klustret för att främja tumörcellstillväxt och sjukdomsaggressivitet. Cancerceller som bär CRISPR-deletioner för miR-888-klustermedlemmarna förutspåddes växa långsammare än celler av vild typ. En giltig oro var att de RNA-transfekterade brunnarna med tiden, som innehåller en blandad population av miRNA-knockout och vildtypsceller, skulle resultera i att celler av vild typ snabbt konkurrerar ut de komprometterade mutantcellerna i odling. Detta noterades inträffa och var särskilt uttalat i experiment med de mycket aggressiva PC3-ML-cellinjerna. Således utfördes steg som involverade seriella utspädningar för att generera encelliga kolonilinjer eller cellberedning för kryotorage inom 48-72 timmar efter att ha utfört CRISPR-transfektionsexperimenten för att bevara knockoutcellerna i de blandade befolkningsproverna.

Den mest mödosamma delen av CRISPR-arbetsflödet för miR-888-klustret var genereringen av homozygota, encelliga kolonimiRNA-deletioner. En utmaning i denna process var att de odlade LNCaP- och PC3-ML-cellerna vanligtvis inte trivdes bra när de pläterades vid encellstätheter. Dessutom verkade celltillväxten vara fenotypiskt komprometterad vid kombinatorisk förlust av miR-888-klustermedlemmar (och korrelerad med cellinjens aggressivitet). För några av transfektionsreaktionerna riktade mot vissa miRNA-locuskombinationer krävdes därför ytterligare cellutspädningar (med användning av ett 96-brunnsformat) för att generera tillräckligt med encelliga kolonilinjer för genotypning. Vid screening av genotyperna hos encellskolonierna genom elektroforesgelavbildning var det till hjälp att jämföra vildtypens bandintensitet jämfört med knockout-PCR-fragmenten och avgöra om cellinjen var heterozygot (lika bandintensitet) eller representerade en flercellskoloni (ojämn bandintensitet), som skulle dra nytta av ytterligare omgångar av encellsutspädningar. Om cellkolonier noterades ha PCR-fragment av onormal storlek och inkonsekventa med genotyper av vild typ eller knockout, eliminerades dessa linjer från studien.

DNA-sekvensering av isolerade PCR-fragment som är konsekventa för vildtyps- och knockout-genotyperna validerades för varje etablerad encellskoloni och bekräftades med oberoende metoder (dvs. qRT-PCR, WGS). När det gäller den typiska effektiviteten att generera homozygota nollcellinjer i dessa experiment varierade detta med det riktade miRNA-locuset och den använda celltypen. Till exempel var effektiviteten för att erhålla knockout-linjer med en koloni mir-891a med LNCaP 30% men sjönk till ~ 7% i PC3-ML-celler. Denna skillnad kan bero på inneboende celltypsskillnader (t.ex. PC3-ML-celler har högre delningshastigheter / metastatisk potential än LNCaP-celler). CRISPR-effektivitetsskillnader kan också återspegla den funktionella effekten av miRNA-förlust (t.ex. miR-891a främjar celltillväxt och aggressivitet 9,10) och därmed kan knockout-fenotyper förstoras i mer aggressiva cellinjer som PC3-ML. Att erhålla enkolonilinjer för större miRNA-locus-deletioner av miR-888-klustret uppvisade minskad effektivitet. Vi kunde inte avgöra om detta berodde på att slå ut större regioner i DNA eller underströk de väsentliga och överlappande funktionella rollerna för miR-888-medlemmar i prostatacancerceller.

Detaljerad beskrivning och fenotypisk analys av de encelliga koloniexponerade knockout miR-888-klustercellinjerna som genereras från detta arbetsflöde pågår och kommer att publiceras någon annanstans. Som ett representativt resultat av miRNA-deletioner som genererats i dessa CRISPR-genredigeringsstudier visas resultaten för LNCaP-prostatacancerceller som bär en individuell mir-891a-radering. Encellskolonier genotypades av PCR och sekvensverifierades (figur 4A-C). Cellinjer som uppvisar onormalt stora PCR-fragment analyserades inte (t.ex. klon L14 H7 som visas i figur 4D). När knockout och vildtyp encelliga kolonier erhölls för mir-891a locus, utfördes funktionella studier. Tidigare arbete har visat att överuttryck av miR-891a (miRNA efterliknar lentiviral vektor) inducerar prostatacelltillväxt9 och därför förutspåddes att miR-891a-förlust skulle visa ömsesidiga effekter. WST-1-spridningsanalyser som jämförde mir-891a knockout och celler av vild typ bekräftade denna hypotes, och miR-891a-förlusten resulterade i långsammare tillväxt (figur 4D, E).

Figure 1
Figur 1: CRISPR-genredigeringsarbetsflöde för att generera miRNA-klusterraderingar. CrRNA-oligonukleotiden är utformad för att innehålla en unik 5'-terminal 20 nt guidesekvens (gul) som kompletterar det riktade genomiska DNA-stället och följs av en invariant 22 nt Streptococcus pyogenes-upprepningssekvens (grön) som baspar med tracrRNA-oligonukleotiden. Röda pilar indikerar Cas9-enzym dubbelsträngade DNA-klyvningsställen som vanligtvis ligger 3 nt uppströms PAM. Celler infekterade med en DOX-inducerbar Cas9 lentivirusvektor (Lenti-iCas9, MOI 0.3) odlas i medium med DOX i 48 timmar för att inducera Cas9-proteinuttryck. Två syntetiska styr-RNA (blandat 1: 1 molförhållande av crRNA: : tracrRNA) transfekteras till Cas9-inducerade celler. Guiden RNA eskorterar Cas9 till de genomiska DNA-platserna (5 'och 3') som flankerar miRNA-klusterregionen som är avsedd för borttagning. Celler framställs 48 timmar efter transfektion för utspädning med användning av ett 96-brunnsformat för att generera encellskolonier för PCR-genotypning och nedströms fenotypiska analyser. Förkortningar: CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; miRNA = mikroRNA; crRNA = CRISPR-RNA; tracrRNA = transaktiverande CRISPR-RNA; nt = nukleotid; Cas9 = CRISPR-associerat endonukleas; PAM = protospacer intilliggande motiv; DOX = doxycyklin; MOI = multiplicitet av infektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Cancercellinjer som bär en doxycyklininducerbar Cas9 lentiviral kassett som uppvisar tät Cas9-proteinreglering. Cas9-uttryck normaliserades till GAPDH-uttryck. (B) PC3-ML-celler odlade i medium med 250 ng/ml DOX i 48 timmar och 120 timmar (+DOX) visade robust Cas9-proteinuttryck. Dox-avlägsnande från media (-DOX) i 120 timmar (120 h efter) resulterade i Cas9-proteinclearance, mätt med western blot-analys. Liknande resultat erhölls vid generering av LNCaP Lenti-iCas9-cellinjen (visas inte). Förkortningar: CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; Cas9 = CRISPR-associerat endonukleas; DOX = doxycyklin; MOI = multiplicitet av infektion; GAPDH = glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Crispr-experimentell design med hög genomströmning för att generera flera miR-888-klusterraderingskombinationer i ett enda experiment. Unika syntetiska crRNA-oligonukleotider (gröna pilar) användes för att generera miR-888-kluster knockout-kombinationerna. Framåt och bakåt PCR-primers (små röda rektanglar) utformades för att genotypa celler och skärma för knockouts. (B) Detta representativa resultat visar 25 CRISPR-reaktioner i transfekterade PC3-ML-celler (Lenti-iCas9) som riktade sig mot en rad miR-888 kluster knockout-kombinationer i ett enda experiment. Varje transfekterad brunn på en 24-brunnsplatta innehöll två unika gRNA som flankerade 5 ' och 3 ' sidorna av det riktade miRNA-genomiska locuset (Δ) (som anges i tabell 2). Råcellslysater framställdes för varje CRISPR-reaktion och PCR-genotypades. Isolerade PCR-fragment som migrerade vid de förutsagda knockoutstorlekarna genom gelelektrofores dna-sekvenserades och validerades för riktad Cas9-klyvning och miRNA-locusavlägsnande. Förutsagda BP-storlekar för WT PCR-fragment anges inom parentes, och de önskade CRISPR KO PCR-fragmentstorlekarna visas längst ner på gelén. Förkortningar: CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; Cas9 = CRISPR-associerat endonukleas; gRNA = styr-RNA; DOX = doxycyklin; bp = baspar; WT = vild typ; KO = knockout. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Prostatacancerceller raderade för mir-891a med CRISPR-genredigering som uppvisar undertryckt proliferation. (B) PCR-genotypning av transfekterade LNCaP-celler med indikerade 5 'och 3' guide-RNA bekräftade att Δmir-891a-deletioner erhölls för alla fyra guide-RNA-kombinationer. Celllysater gjordes från blandade cellpopulationer 48 timmar efter transfektion. (C) PCR-fragment sekvenserades och validerades. Ett representativt exempel visar DNA-sekvensen för transfekterade celler behandlade med 5A (891a) och 3B (891a) guide-RNA, vilket resulterar i den förutsagda Cas9-klyvningsstället (3 nt uppströms PAM-platsen) och CRISPR Δmir-891a-radering. (D) Encellskolonier erhölls och PCR-genotypades. Klon L14 G9 sekvensvaliderades som en KO och klon L14 G9 som en WT för mir-891a-genen. (E) miR-891a visade sig tidigare inducera celltillväxt av prostatacancer och därför förutspåddes miR-891a-förlust ha den ömsesidiga fenotypen. WST-1-analyser av prostatacancerceller raderade för mir-891a (L14 G9 [KO], blå) visade undertryckt proliferation jämfört med WT-celler (L14 G9 [WT], röd). Förkortningar: CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; Cas9 = CRISPR-associerat endonukleas; WT = vild typ; KO = knockout; WST-1 = vattenlösligt tetrazoliumsalt-1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

PCR-reaktionen sätts upp på is.
Komponent 25 μl reaktion Slutlig koncentration
5x DNA-polymerasbuffert 5 μl 1x
Framåtriktad PCR Primer (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM
Omvänd PCR Primer (10 μM) 0,5 μl 0,2 μM
10 mM dNTP 0,5 μl 200 μM
DNA-polymeras (2 U/μl) 0,25 μl 0,125 U/ 25 μl
Råcellslysat 1 - 4 μl variabel
Nukleasfritt vatten upp till 25 μl
Termocyklerbetingelser för PCR-reaktion:
Steg Temperatur Tid
Initial denaturering 98 °C 3 minuter
98 °C 10 s
35 cykler 62 °C 15 s
72 °C 15 s
Slutlig förlängning 72 °C 10 minuter
Hålla 4 °C

Tabell 1: PCR-reaktionsförhållanden för rålysatgenotypning. Förkortning: dNTP = deoxinukleotider.

CRISPR-riktad borttagningsplats Guide RNA-kombination Vild typ (bp) Knockout (bp) PCR Primer-par
∆ Fullständigt kluster 5A(891a)+3A(892c)
5B(891a)+3A(892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B(891a)+3B(892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a FWD
892c REV
∆892c/890/888 5A'(888)+3A(892c)
5B'(888)+3A(892c)
5A'(888)+3B(892c)
5B'(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 FWD
892c REV
∆892c/890 3A'(888)+3A(892c)
3B'(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B'(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 FWD
892c REV
∆892b/892a 5A'(888)+5A(892b)
5B'(888)+5A(892b)
5A'(888)+5B(892b)
5B'(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b FWD
888 REV
∆892b/892a/888 5A(892b)+3A'(888)
5A(892b)+3B'(888)
5B(892b)+3A'(888)		 2,938 322
278
341		 892b FWD
888 REV
∆743 Familj 5A(892b)+3A(892c)
5B(892b)+3A(892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B(892b)+3B(892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b FWD
892c REV
∆891 Familj 5A(891a)+3A(891b)
5B(891a)+3A(891b)		 27,294 330
270		 891a FWD
891b REV
∆891a 5A(891a)+3A(891a )
5A(891a)+3B(891a)
5B(891a)+3A(891a)
5B(891a)+3B(891a )		 554 333
273
454
394		 891a FWD
891a Rev

Tabell 2: CRISPR-guide RNA som används för att generera miR-888 kluster knockout-kombinationer. Förkortningar: CRISPR = grupperade regelbundet interspaced korta palindromiska upprepningar; bp = baspar; FWD = framåt; REV = omvänd.

Abc-bok Sekvens Tm (°C)
888 FWD AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG 52.2
888 REV CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a FWD TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a Rev TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b REV TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b FWD GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b REV CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c FWD TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c REV CACTCTCACTTGGCTTCATG 53.5

Tabell 3: PCR-primers som används för genotypning. Förkortningar: FWD = framåt; REV = omvänd; Tm = smälttemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna CRISPR-genredigeringsprocedur gör det möjligt för utredaren att snabbt generera en hel panel av cellinjer med unika miRNA-klusterraderingskombinationer. Transfektionen av syntetiska guide-RNA som består av 5 'och 3' genomiska platsspecifika crRNA glödgade med syntetiskt tracrRNA (1: 1 molförhållande) i detta protokoll undviker tidskrävande plasmidvektorsubklonning och möjliggör en mer flexibel och högkapacitets experimentell design med ett 24-brunnsformat. Genereringen av cellinjer som bär en DOX-inducerbar Cas9 lentiviral kassett möjliggör tätt DOX-reglerat och robust Cas9-uttryck under celltransfektionen av guide-RNA och snabb clearance av detta bakterieprotein vid DOX-uttag från odlingsmediet i efterföljande steg. Denna procedur förlitar sig också på råcellslysater för PCR-genotypning, vilket kräver minimalt cellmaterial för analys och undviker användning av kostsamma och arbetsintensiva DNA-reningsmetoder för kiseldioxidkolonner eller behovet av att mäta nukleinsyrakoncentrationer med hjälp av en spektrofotometer, vilket ytterligare effektiviserar metoderna för utredaren.

Faktum är att de representativa resultaten som delades här visade framgångsrik anpassning av denna metod för att transfektera humana prostatacancercellinjer med 32 unika guide-RNA-kombinationer i ett enda experiment och generera flera knockout-linjer för encellskolonier som bär deletioner för hela ~ 35 kb miR-888-klusterregionen; mindre raderingskombinationer för miR-888-klustermedlemmar som tillhör familjerna miR-743 och miR-891a; samt raderingar för enskilda miRNA-medlemmar inom miR-888-klustret. Detta arbetsflöde genererade en värdefull cellinjeresurs för att börja molekylärt dissekera miR-888-klusternätverket i samband med mänsklig prostatasjukdom och bestämma hur miR-888-klustermedlemmar funktionellt överlappar eller interagerar synergistiskt / antagonistiskt med varandra för att reglera prostatatumörtillväxt, canceraggressivitet och läkemedelsresistens (publiceras någon annanstans). Dessa studier kommer att vara avgörande när denna forskning går mot diagnostiska och terapeutiska tillämpningar för behandling av patienter med avancerade och metastatiska former av prostatacancer.

Det finns flera kritiska steg i detta CRISPR-genredigeringsprotokoll med hög kapacitet som utredare bör överväga när de anpassar denna metod för att studera ytterligare miRNA-klusternätverk i andra sjukdomssammanhang. För det första är det viktigaste steget i denna process den noggranna utformningen av guide-RNA som flankerar miRNA-klustret för CRISPR-medicinsk borttagning, samt ytterligare guide-RNA för att ta bort enskilda miRNA eller kombinationer av miRNA-klustermedlemmar. Utredaren bör noga överväga att inte störa de omgivande generna eller reglerande elementen, särskilt om miRNA-klustret finns i en genintron eller ligger antisense mot en annan gen. Det finns CRISPR off-targeting prediktionsresurser 24,25,26,27 tillgängliga som kan hjälpa forskaren när man väljer de mest diskriminerande crRNA-oligonukleotiderna att syntetisera. Detta arbetsflöde beskriver utformningen av två 5 'och två 3' crRNA som flankerar varje riktad miRNA -locus som gör att fyra unika guide -RNA -kombinationer kan testas i CRISPR -transfektionssteget och öka chanserna att generera önskad knockout -cellinje. Utredaren behöver dock bara en av dessa guide-RNA-kombinationer för att fungera framgångsrikt för att störa en viss miRNA-genplats.

För det andra bör prövaren besluta om den lämpligaste metoden för att leverera Cas9 till cellerna för CRISPR-genredigering. Denna procedur använde det DOX-inducerbara Cas9 lentivirala uttryckssystemet, men alternativa metoder för Cas9-proteinproduktion (t.ex. Cas9-rekombinant protein, Cas9 mRNA-leverans eller användning av konventionella Cas9-uttrycksplasmidvektorsystem) kan enkelt anpassas för detta protokoll. Till exempel kan experimentella överväganden diktera användningen av Cas9-transientuttryck kontra att generera stabila lentivirala uttryckscellinjer, promotorn som används för att driva Cas9 (allestädes närvarande, celltypspecifik, inducerbar) och införlivandet av positiva / negativa urvalssystem för att säkerställa Cas9-uttrycksvektorleverans till cellerna av intresse (dvs antibiotikaresistens).

För det tredje är det viktigt att snabbt genotypa transfekterade celler med blandad population inom 48-72 timmar efter guide RNA-leverans i händelse av att förlust av miRNA-klustret kan påverka cellernas livskraft / tillväxt negativt. Till exempel, när man raderade tumörfrämjande faktorer som miR-891a i prostatacancercellinjer, noterades att dessa mir-891a knockout-celler växte långsammare än obehandlade celler och därefter övertog vildtypscellerna snabbt cellpopulationen. Slutligen är det viktigt att integrera ytterligare valideringsmetoder för att säkerställa borttagning av miRNA-locus under den genotypiska screeningprocessen, särskilt för större genomiska deletioner. Dessa åtgärder inkluderar att använda interna PCR-genotypningskontroller som endast detekteras om vildtypsallelen är närvarande och utföra qRT-PCR-analys på encellskolonier för att säkerställa att knockout-cellinjer inte uttrycker de riktade miRNA. Alla dessa överväganden kommer att säkerställa framgångsrika resultat för utredaren.

Det fanns några uppenbara begränsningar som uppstod när man införlivade denna CRISPR-teknik i laboratoriet. Till exempel, trots den höga genomströmningskaraktären hos guide-RNA-transfektionsstegen som beskrivs i detta protokoll för att snabbt generera flera miRNA-klusterraderingskombinationer, var det hastighetsbegränsande steget i denna procedur genotypscreening och expansion av enkolonicellinjer för varje CRISPR-medierad miRNA-radering. Införlivandet av positiva urvalsstrategier i detta protokoll skulle vara en fördel; det skulle dock fortfarande ta ~ 3-4 veckor att expandera en linje från en encellskoloni odlad i ett 96-brunnsformat. Faktum är att samlingen av minst tre oberoende enkolonicellinjer per miRNA-locus knockout plus celler av vild typ kommer att bidra till att säkerställa att fenotyperna som analyseras inte beror på artefakt/ off-targeting-effekter, men detta bidrar återigen till den tidskrävande karaktären av denna procedur. Utredaren kan också behöva utföra flera omgångar av CRISPR-genredigering för att erhålla homozygota nollcellinjer. Detta är särskilt uttalat i studier med etablerade odödliga cancercellinjer som ofta har ett komplext genomiskt landskap av kromosomala omarrangemang och onormala karyotyper.

Till exempel använde denna representativa studie LNCaP och PC3-härledda humana prostatacancercellinjer för att generera deletioner för miR-888-klustret, kartläggning på X-kromosomen. Det var viktigt att inse att dessa manligt härledda prostatacancercellinjer har onormala karyotyper och hade två X-kromosomer (och PC3-celler har också partiella X-kromosomtranslokationer på andra autosomer)31,32. Trots dessa förhållanden var CRISPR-genredigering tillräckligt robust för att generera homozygota knockouts med hjälp av dessa prostatacellinjer. Det kan dock finnas fall där en utredares cellinje med en onormal karyotyp (t.ex. infogningar, raderingar, inversioner, dupliceringar) kan innehålla "osynliga mutationer" som kommer att dölja detekteringen av andra (eller fler) kopior av den riktade genlokusen på grund av saknade element som krävs för framgångsrik detektion med hjälp av de designade PCR-primers / guide RNA. Detta understryker vikten av att verifiera de homozygota null CRISPR-cellinjerna med oberoende metoder (dvs. qRT-PCR, northern blot, WGS) innan funktionella analyser utförs. Slutligen är detta protokoll utformat för att endast slå ut miRNA-klusterkombinationer som kartläggs intill varandra. Om en utredare vill slå ut miRNA som är separerade mellan andra miRNA-gener, kommer flera omgångar av CRISPR-transfektioner att behövas, vilket kräver noggrann genotypning och validering.

Trots dessa utmaningar är förmågan att snabbt generera en komplett panel av miRNA-deletionskombinationer för ett givet miRNA-kluster med hjälp av detta beskrivna protokoll en stor fördel jämfört med de befintliga metoderna i miRNA-forskningsverktygslådan. Överuttrycksstudier med miRNA-mimik för att karakterisera icke-kodande RNA-funktion kan leda till oavsiktliga artefakter eller celltoxiciteter. På samma sätt kan användningen av antisense antimir oligonukleotidhämmare för att bestämma förlust av funktionsfenotyper vara svårt eftersom antimirer vanligtvis resulterar i en knockdown och inte en fullständig eliminering av miRNA-aktivitet. Att försöka använda kombinationer av miRNA-mimiker eller miRNA-antimirer för att belysa miRNA-klusternätverkssignalering har visat sig vara mödosamt och svårtolkat. Därför kommer införlivandet av CRISPR-genredigeringsteknik för att undersöka hur miRNA-medlemmar interagerar inom ett givet icke-kodande genomiskt kluster att göra det möjligt för forskare att få en tydligare förståelse för hur icke-kodande RNA påverkar sjukdomssignaleringsvägar och lovar att få enorma konsekvenser inom diagnostik- och läkemedelsupptäcktsfälten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.

Acknowledgments

PC3-ML cellinjer tillhandahölls vänligt av Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey hjälpte till med PCR-genotypning. Detta arbete stöddes av ett Breedan Adams Foundation Grant, en Ryan Translational Research Fund och ett Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) till AE-K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Tags

Biologi utgåva 182 CRISPR inducerbar Cas9 mikroRNA-knockout miR-888-kluster
CRISPR-genredigeringsverktyg för mikroRNA-klusternätverksanalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter