Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

CRISPR-genredigeringsværktøj til analyse af mikroRNA-klynger

Published: April 25, 2022 doi: 10.3791/63704
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Microbiology & Molecular Cell Biology, Leroy T. Canoles Jr. Cancer Research Center, Eastern Virginia Medical School

Summary

Denne protokol beskriver en high-throughput clustered regelmæssigt interspaced short palindromic repeats (CRISPR) genredigeringsarbejdsgang til mikroRNA-klyngenetværksanalyse, der muliggør hurtig generering af et panel af genetisk modificerede cellelinjer, der bærer unikke miRNA-klyngemedlemssletningskombinationer så store som 35 kb inden for et enkelt eksperiment.

Abstract

MicroRNA'er (miRNA'er) er opstået som vigtige cellulære regulatorer (tumorundertrykkere, pro-onkogene faktorer) af kræft og metastase. De fleste offentliggjorte undersøgelser fokuserer på et enkelt miRNA, når de karakteriserer små RNA'ers rolle i kræft. Imidlertid er ~ 30% af humane miRNA-gener organiseret i grupperede enheder, der ofte udtrykkes, hvilket indikerer et komplekst og koordineret system med ikke-kodende RNA-regulering. En klarere underdrivelse af, hvordan grupperede miRNA-netværk fungerer sammen for at regulere tumorvækst, kræftaggressivitet og lægemiddelresistens, er påkrævet, før man oversætter ikke-kodende små RNA'er til klinikken.

Brugen af en high-throughput clustered regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) -medieret genredigeringsprocedure er blevet anvendt til at studere den onkogene rolle af en genomisk klynge af syv miRNA-gener placeret i et locus, der spænder over ~ 35.000 bp i længden i forbindelse med prostatacancer. Til denne fremgangsmåde blev humane kræftcellelinjer inficeret med en lentivirusvektor for doxycyclin (DOX)-inducerbar Cas9-nuklease dyrket i DOX-holdigt medium i 48 timer. Cellerne blev efterfølgende co-transficeret med syntetisk transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) kompleksbundet med genomisk stedsspecifik CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider for at muliggøre hurtig dannelse af kræftcellelinjer, der bærer hele miRNA-klyngens deletion og individuelle eller kombinerede miRNA-genklynge deletioner inden for et enkelt eksperiment.

Fordelene ved dette high-throughput genredigeringssystem er evnen til at undgå tidskrævende DNA-vektorunderkloning, fleksibiliteten i transfektering af celler med unikke guide RNA-kombinationer i et 24-brøndformat og den billigere PCR-genotypning ved hjælp af råcellelysater. Undersøgelser, der bruger denne strømlinede tilgang, lover at afdække funktionelle redundanser og synergistiske / antagonistiske interaktioner mellem miRNA-klyngemedlemmer, hvilket vil hjælpe med at karakterisere de komplekse små ikke-kodende RNA-netværk, der er involveret i menneskelig sygdom og bedre informere fremtidigt terapeutisk design.

Introduction

Der er behov for bedre forskningsværktøjer til at undersøge bidraget fra ikke-kodende RNA'er i human sygdom. MiRNA-dysregulering observeres ofte i humane lidelser såsom kræft, når man sammenligner ekspressionsprofilerne for disse små ikke-kodende RNA'er i væv og kropsvæsker (f.eks. Blod, urin) hos kræftpatienter versus ikke-kræft, raske individer, der anvender mikroarrays, kvantitativ realtids-PCR (qRT-PCR) og næste generations dybe sekventeringsteknologier 1,2 . Nyere arbejde har karakteriseret en stor delmængde af disse miRNA'er som tumorundertrykkende, onkogene og metastasefaktorer, der styrer tumordannelse, sygdomsprogression og lægemiddelresistens. Eksperimentel overekspression og / eller nedregulering / tab af miRNA'er resulterer i funktionelle og pleiotropiske konsekvenser i cellen, hvilket afspejler den brede vifte af kræftrelaterede aktiviteter, som disse ikke-kodende RNA'er koordinerer - vækst, apoptose, differentiering, kromatinombygning, angiogenese, epitel til mesenkymal (EMT) og MET-overgange, metabolisme og immunrespons3.

MiRNA'er kodes som enkeltgener eller befinder sig i genomiske klynger, som transskriberes i kernen og behandles i vid udstrækning, før de genererer de biologisk modne, enkeltstrengede ~ 22 nukleotid (nt) miRNA-arter lokaliseret i cytoplasma4. Disse små RNA'er udøver deres virkninger post-transkriptionelt og fungerer som negative genregulatorer, der binder til messenger RNA (mRNA) mål på en sekvensspecifik måde for at bringe det katalytiske RNA-inducerede hæmningskompleks (RISC) til mRNA-stedet, hvilket resulterer i mRNA-nedbrydning og / eller en blok i proteintranslation. MiRNA'er er en ekstremt rigelig klasse af ikke-kodende RNA'er i dyresystemer, og der findes 2.654 modne miRNA'er i det humane genom (miRBase release 22.1)5. MiRNA'er associeres typisk med ufuldstændig komplementaritet til deres mRNA-mål4. Derfor kan et enkelt miRNA regulere titusinder til hundredvis af forskellige mRNA-mål og funktionelt påvirke en lang række biologiske veje. For at øge kompleksiteten af miRNA-baserede mekanismer kan et enkelt mRNA reguleres af flere, forskellige miRNA'er. Det er således udfordrende at undersøge, hvordan miRNA-dysregulering forstyrrer kroppens homeostatiske balance og fører til menneskelig malignitet.

De fleste offentliggjorte undersøgelser har fokuseret på et enkelt miRNA, når de karakteriserer deres rolle i sygdomshændelser. Imidlertid er ~ 30% af humane miRNA-gener organiseret i grupperede enheder (typisk ~ 10 kilobaser [kb]), der ofte transskriberes i samme orientering og co-udtrykt, hvilket indikerer et koordineret og komplekst system af ikke-kodende RNA-regulering6. Den største polycistriske humane miRNA-klynge er 14q32-klyngen bestående af 54 miRNA-forløbere. En af de mest velundersøgte grupperede miRNA-enheder forbundet med humane kræftformer er miR-17-92 polycistroniske klynge bestående af miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b-1 og miR-92-1 bosiddende inden for intron 3 af det ikke-kodende RNA, c13orf25. MiR-17-92-klyngen forstærkes ofte i hæmatopoietiske maligniteter og overudtrykkes i solide tumorer og har etableret onkogene roller i fremme af cellecyklusprogression, apoptose og angiogenese7. Derudover slettes den tumorundertrykkende miR-15a og miR-16-1-klynge placeret i intronen af det ikke-kodende gen Leu2 ofte i leukæmier og nedreguleres i en lang række kræftformer, der fungerer til at blokere tumorvækst ved at målrette mod det antiapoptotiske gen BCL2 og yderligere cellecyklusprogressionsgener8. MiR-888-klyngen er forhøjet hos patienter med højkvalitets prostatacancer og består af syv miRNA-gener (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b og -891a) placeret på humant kromosom Xq27.3 9,10.

MiR-888-klyngekortene inden for HPCX1-locus (Arvelig prostatacancer, X-bundet 1), der spænder over Xq27-2, som blev identificeret ved koblingsanalyse af arvelig prostatacancerfamilie stamtavler 11,12,13,14,15,29. Funktionel karakterisering af individuelle miR-888-grupperede medlemmer ved hjælp af konventionelle miRNA-fejlekspressionsværktøjer - miRNA-efterligninger og antisense-hæmmere - indikerede, at disse miRNA'er spiller overlappende roller i reguleringen af prostatatumorvækst og invasion 9,10. Disse eksperimentelle metoder egner sig imidlertid ikke let til at studere, hvordan flere miR-888-klyngemedlemmer virker synergistisk eller antagonistisk i et ikke-kodende RNA-netværk for at kontrollere vævshomeostase og kræftprogression. Denne beskrevne strømlinede protokol ved hjælp af CRISPR-genredigeringsteknologi med høj kapacitet modificeres til molekylært at dissekere miRNA-klynger forbundet med humane kræftformer (f.eks. MiR-888-klynge) for at bygge bro over dette videngab.

Bakterielle CRISPR- og CRISPR-associerede (cas) gener formidler adaptiv immunitet mod bakteriofager16. Opdagelsen af dette gamle procaryotiske overvågningssystem blev hurtigt tilpasset som et effektivt videnskabeligt værktøj til let at målrette ethvert ønsket genomisk locus og foretage DNA-sekvensændringer inden for en lang række dyresystemer og celletyper både in vitro og in vivo16,17. Denne teknik har stort løfte som en effektiv metode til at forhøre miRNA-netværk i forbindelse med menneskelig sygdom. Til dette formål er denne CRISPR-genredigeringsprotokol med høj kapacitet til undersøgelse af miR-888-klyngen, der spænder over ~ 35 kb på humant kromosom X i udødeliggjorte humane prostatacancercellelinjer (LNCaP, PC3-ML), konstrueret til at forhøre, hvordan klyngemedlemmer koordinerer kræftprogressionsveje. Denne tilgang kan anvendes til at karakterisere enhver miRNA-klynge og giver efterforskere mulighed for hurtigt at generere humane cellelinjer, der bærer hele miRNA-klyngesleteration og individuelle og kombinerede miRNA-genklyngesletninger inden for et enkelt eksperiment.

I denne procedure etableres stabile cellelinjer med et doxycyclin (DOX)-inducerbart lentiviralt ekspressionssystem, der gør det muligt for investigator at kontrollere Streptococcus pyogenes CRISPR-associeret endonuklease Cas9 (csn1) genekspression gennem den konstitutive DOX-inducerbare promotor TRE3G. Tet-On 3G-todelt system involverer en konstitutiv human forlængelsesfaktor 1 alfa (hEF1alpha) promotor til at drive transkriptionen af både Tet-On 3G-genet og blasticidinresistensgenet (BlastR) som et bicistronisk transkript. Tet-On 3G transaktivatorproteinet binder sig kun til TRE3G-promotoren i nærværelse af DOX, hvilket resulterer i robust Cas9-transkription. I mangel af DOX er der intet eller meget minimalt basalt Cas9-udtryk. Derfor kan investigator inducere høj Cas9-proteinproduktion i celler dyrket i medier suppleret med DOX under CRISPR-genredigeringstrinnene og kontrollere for hurtig CAS9-proteinclearance ved DOX-tilbagetrækning.

Denne protokol beskriver også designet af syntetiske CRISPR RNA (crRNA) oligonukleotider rettet mod regioner, der flankerer hele miRNA-klyngen, individuelle miRNA-hårnåle (premiRNA) regioner og / eller undergrupper af miRNA-gener i klyngen. Hvert designet crRNA indeholder en unik 5'-terminal 20 nt-guidesekvens (komplementær til den genomiske sekvens af interesse, der skal målrettes), efterfulgt af en invariant 22 nt S. pyogenes-gentagelsessekvens (5'-XXXXXXXXXXXXXXXXXXXX-GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG-3'), der muliggør baseparring med det universelle transaktiverende CRISPR RNA (tracrRNA) oligonukleotider18. Sammen fungerer det udglødede crRNA og tracrRNA (blandet 1: 1-forhold) som det vejledende RNA for denne protokol (figur 1A). I hvert eksperiment transinficeres to syntetiske guide RNA'er til DOX-inducerede celler for at associere og eskortere det bakterielle Cas9-protein til de genomiske DNA-steder (5 'og 3'), der flankerer miRNA-klyngeområdet, der er målrettet til fjernelse (figur 1B).

En protospacer tilstødende motiv (PAM) sekvens (5'-NGG-3' for vildtype S. pyogenes Cas9) skal være til stede i cellegenomet og placeret umiddelbart ved siden af 20 nt DNA-sekvensen målrettet af guide RNA17. PAM-sekvensen fungerer som et bindende signal og placerer det katalytiske område af endonuklease Cas9-enzymet på det målrettede genomiske DNA-sted, hvilket efterfølgende fører til rettet, dobbeltstrenget (ds) DNA-spaltning placeret ~ 3 nt opstrøms for PAM. Cellens DNA-reparationsmaskiner reparerer de spaltede DNA-ender, hvilket kan resultere i perfekt ligering, men ofte forekommer ikke-homologisk endesammenføjning (NHEJ), hvilket forårsager små indsættelser eller deletioner (indels) på reparationsstedet. Da miRNA'er er ikke-kodende gener, der ofte er placeret inden for intergene og introniske regioner, har disse indels en lav risiko for at skabe uønskede nonsens / missense-mutationer.

Ved at anvende syntetiske RNA-oligonukleotider (udglødet crRNA og tracrRNA, 1: 1 molforhold), der koder for guide RNA-komplekset i disse eksperimenter, undgår denne gen knockout-strategi tidskrævende DNA-vektorunderkloning og giver mulighed for enorm fleksibilitet i transfektering af unikke guide RNA-kombinationer til celler i et 24-brøndformat. Forberedelse af råcellelysater til PCR-genotypescreening undgår også dyre og tidskrævende DNA-oprensningsmetoder, samtidig med at der gives mulighed for strømlinet enkeltkolonicellelinjegenerering og fænotypisk analyse. Faktisk er denne CRISPR-genredigeringsprotokol med høj kapacitet blevet brugt med succes til at transfektere dyrkede prostatacancercellelinjer (LNCaP, PC3-ML) med 32 unikke guide RNA-kombinationer i et enkelt eksperiment og generere knockout-linjer, der bærer deletioner for hele ~ 35 kb miR-888-klyngeområdet; mindre sletningskombinationer for miR-888-klyngemedlemmer, der tilhører familierne miR-743 og miR-891a; samt sletninger for individuelle miRNA-medlemmer inden for miR-888-klyngen. Undersøgelser som disse vil give en klarere underdrivelse af, hvordan grupperede miRNA'er fungerer sammen for at regulere tumorvækst, aggressivitet og lægemiddelresistens, før de oversættes miRNA'er til klinikken som terapeutiske og diagnostiske værktøjer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Forberedelse til CRISPR-genredigering og guide RNA-design til at generere miRNA-cluster knockout-cellelinjer

  1. Opret en DNA-fil, der indeholder den komplette genomiske sekvens af miRNA-klyngeområdet af interesse (intergen, intronisk) og mindst 1 kB af omgivende genomiske regioner ved hjælp af et DNA-sekvensannoteringssoftwareprogram19.
    1. Brug et funktionsredigeringsværktøj i den oprettede DNA-fil til at markere det målrettede miRNA-cluster locus (intergent, intronisk) og hver enkelt miRNA-hårnålsekvens, der tilhører miRNA-klyngen, samt notere andre nærliggende kodende og ikke-kodende gener og / eller regulatoriske funktioner 5,20,21,22.
    2. Sørg for, at de miRNA-regioner, der er målrettet mod deletion, ikke utilsigtet forstyrrer nærliggende proteinkodende gener, ikke-kodende gener eller vigtige regulatoriske DNA-elementer.
      BEMÆRK: Overvej den genomiske kompleksitet (f.eks. Kromosomduplikationer / fusioner) af cellelinjen, der anvendes i denne protokol.
  2. Design syntetiske crRNA'er rettet mod 20 nt genomisk DNA-sekvens, der flankerer hele miRNA-klyngen, individuelle miRNA-hårnåle (pre-miRNA) regioner og / eller undergrupper af miRNA-gener i klyngen ved hjælp af et bioinformatisk guide RNA-designsoftwareværktøj (f.eks.23). Sørg for, at det passende Cas9-enzym er noteret i guide RNA-designværktøjet (dvs. S. pyogenes Cas9).
    BEMÆRK: Det syntetiserede crRNA vil indeholde denne unikke 5'-terminale 20 nt-guidesekvens (komplementær til DNA-mål) efterfulgt af en invariant 22 nt S. pyogenes gentag sekvens for at tillade baseparring med det syntetiserede universelle tracrRNA oligonukleotid. Udglødet sammen vil de fungere som guide RNA i denne protokol.
    1. Med henvisning til den oprettede DNA-fil (trin 1.1.) skal du indtaste ~ 150 nt DNA-sekvens, der er bosiddende umiddelbart opstrøms (5') eller nedstrøms (3') af miRNA-hårnålen / cluster-locus, der er målrettet til sletning i det bioinformatiske guide RNA-designsoftwareværktøj23.
      BEMÆRK: Designværktøjet identificerer unikke 20 nt-sekvenser til crRNA-oligonukleotiddesign, der ligger umiddelbart ved siden af PAM-sekvensen (på den ikke-målrettede DNA-streng) (f.eks . S. pyogenes Cas9 PAM-sekvens NGG). Nedenfor er et eksempel på crRNA-design rettet mod et sted umiddelbart opstrøms (5') af mir-891a-genlokus (specifikt 5A (891a), der er diskuteret i afsnittet om repræsentative resultater og tabel 1).
      1. Åbn guide RNA design software værktøj23.
      2. Indtast navnet 5A(891a) i vinduet Indtast navn .
      3. I vinduet Indtast en DNA-sekvens skal du indtaste 150 nt genomisk sekvens, der befinder sig umiddelbart opstrøms (5') af mir-891a-forløbergenet : 5'-AAGAAAATATACATGCTGATAGTTACACAGG
        TTGTGAATAGTAAATTAGTATGTCATTTATTT
        TAGGTATTCAATGTTGCATAGTCATATTATA
        ATTACGTAGCTTCTTTGTTTTTTTTCTAGGTT
        CCCAAAGAGTCTACAAATGTTGTCT-3'
      4. Marker afkrydsningsfeltet Aktivér specificitetskontrol for at udelukke websteder, der ikke er målrettet, og som er registreret beregningsmæssigt af programmet. Vælg den passende organisme (dvs . Human [Homo sapiens]).
      5. Angiv det korrekte Cas9-enzym PAM, der anvendes til undersøgelserne, i dette tilfælde Streptococcus pyogenes Cas9-PAM: NGG, for at generere følgende standardindstillinger: PAM i forhold til målet: Efter; Gentag sekvens: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG; I forhold til guide: 3; Målsekvens længde: 20; Klip i forhold til mål 5' start: Sense 17 Anti-sense 17.
      6. Klik på knappen Næste for at se resultaterne for syntetisk crRNA-syntese.
        BEMÆRK: I dette eksempel vil det foreslåede crRNA, der skal syntetiseres, genkende DNA-målet ATACATGCTGATAGTTACAC og vil være placeret ved siden af PAM: AGG.
    2. Henvis til DNA-filen (oprettet i trin 1.1.) for at bestemme de bedste kandidat crRNA 20 nt-målsekvenser, der ligger tættest på miRNA-locus, der skal slettes og har den højeste specificitet for det tilsigtede genomiske mål.
      1. Brug beregningsmæssige off-targeting analyseværktøjer til at evaluere kandidat crRNA-specificiteten og forudsige potentielle off-targeting-steder i genomiske loci, der ikke er relateret til den målrettede miRNA-klyngeregion af interesse (f.eks. 24,25,26,27).
      2. Registrer potentielle off-targeting-resultater til senere reference ved genotypebestemmelse af CRISPR-kloncellelinjer med en koloni ved PCR (trin 4.2.6.).
        BEMÆRK: Omfanget af sekvenskomplementaritet, der deles mellem det designede crRNA-oligonukleotid og den genomiske målsekvens, vil diktere, hvor selektivt Cas9-enzymet spalter genomet på det pågældende sted. Da guide-RNA-udgløderne til det genomiske mål i en 3' til 5' retning, vil mismatch i 5'-enden af DNA-målsekvensen (de første 8-10 baser) ofte blokere Cas9-medieret spaltning. Hvis den genomiske målsekvens deler homologi med et andet genomisk locus, undtagen inden for de første otte baser af DNA-sekvensen, forudsiges dette guide-RNA at have en lav chance for off-targeting på dette sted.
      3. Design fire unikke crRNA'er for hvert målrettet miRNA-locus: to designede crRNA'er til at målrette komplementære DNA-sekvenser straks 5' af miRNA-hårnålen /-klyngen (5'A, 5'B) og to designede crRNA'er til at målrette komplementære DNA-sekvenser straks 3' af miRNA-hårnålen / klyngen (3'A, 3'B).
        BEMÆRK: Ved udførelse af CRISPR-transfektioner (i afsnit 3) vil fire mulige 5' og 3' guide RNA-parkombinationer (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B) blive testet for hvert målrettet miRNA-locus for at øge sandsynligheden for at generere vellykkede miRNA locus-deletioner i et enkelt eksperiment.
      4. Brug et funktionsredigeringsværktøj i den oprettede DNA-fil (trin 1.1.) til at markere DNA-målsekvensen (med tilstødende PAM) for hvert designet crRNA, der skal syntetiseres.
  3. Design og syntetisere PCR-primere (fremad, omvendt), der flankerer de målrettede miRNA-klyngeområder til genotypebestemmelse af CRISPR-cellelinjer (og mærk primerne i den oprettede DNA-fil).
    1. Til genotypning af cellelinjer, der bærer små genomiske deletioner til tæt grupperede eller individuelle miRNA'er, design PCR-primere (fremad, omvendt), der er bosiddende ca. 150 bp på hver side af Cas9-spaltningsstedet / knockout-regionen, der muliggør påvisning af både vildtype (~ 600 bp) og knockout (~ 300 bp) DNA-fragmenter i en enkelt PCR-reaktion via gelelektroforese.
    2. Til genotypning af cellelinjer, der bærer store genomiske deletioner for miRNA-forløberkombinationer eller hele miRNA-klyngen, skal du igen designe PCR-primere (fremad, omvendt), der er bosiddende ca. 150 bp på hver side af Cas9-spaltnings- / knockout-stedet. Bemærk, at hvis den målrettede miRNA-klyngesletning strækker sig over >4 kb i længden, vil PCR-reaktionen sandsynligvis kun detektere det mindre (~ 300 bp) knockout-DNA-fragment, men ikke wildtype DNA-fragmentet. Design derfor yderligere PCR-primere (fremad, omvendt), der kan detektere tilstedeværelsen eller fraværet af interne miRNA-klyngegener for at hjælpe screeningsprocessen og validere for homozygote knockout-cellelinjer.

2. Generering af stabile lentivirale cellelinjer, der bærer den DOX-inducerbare Cas9-ekspressionskassette

BEMÆRK: Udfør alt cellekultur- og virusarbejde i en certificeret biosikkerhedshætte ved hjælp af BSL2-procedurer og aseptisk teknik.

  1. Bestem den passende cellelinjetype til CRISPR-undersøgelserne og foretrukne vækstmedier.
    BEMÆRK: Denne protokol blev udviklet til humane prostatacancercellelinjer LNCaP (foretrukket medium: RPMI, 10% føtalt bovint serum [FBS]) og PC3-ML (foretrukket medium: DMEM, 10% FBS).
  2. Udfør en blasticidin "død" kurve for at bestemme den optimale lægemiddelkoncentration, der skal vælges for lentivirusinficerede celler, der bærer blasticidinresistensgenkassetten (trin 2.3.).
    1. Pladeceller i 11 brønde af en 24-brøndplade og vokser ved 37 ° C, 5% CO2 i det foretrukne medium indtil ca. 75% sammenløb.
    2. Blasticidin (arbejdsmateriale 1 mg/ml) fortyndes i det foretrukne substrat med en slutkoncentration fra 0, 1 til 10 μg/ml og fortyndes i trin på 1 μg/ml.
    3. Mærk brøndene på den frøede 24-brøndplade fra 1 til 11. Fjern vækstmediet fra brøndene og udskift med passende blasticidinkoncentrationer.
    4. Skift mediet med de passende blasticidinkoncentrationer hver anden dag i 7-10 dage.
    5. Undersøg cellerne dagligt i løbet af tidsforløbet og bestem den mindste blasticidinkoncentration, der kræves for at dræbe alle cellerne inden for 5-7 dage.
      BEMÆRK: En blasticidin "kill" kurve skal udføres for hver specifik cellelinje, der anvendes til CRISPR-genredigeringseksperimenterne.
  3. Inficere cellerne med lentivirus, der bærer den DOX-inducerbare Cas9-ekspressionskassette, og udfør blasticidinvalg ved hjælp af den optimale koncentration bestemt i trin 2.2.
    1. I tre brønde af en 6-brønds plade × frø 5 104 celler pr. Brønd og vokse i det foretrukne medium ved 37 ° C, 5% CO2 natten over (ON).
    2. Den næste dag optøs lentivirusekspressionsvektoren for DOX-inducerbar Cas9 (Lenti-iCas9) på is. Bland forsigtigt (ikke hvirvelviruspartikler).
      BEMÆRK: Opbevar lentivirus i aliquoter ved -80 ° C for at undgå flere fryse- / optøningscyklusser, hvilket vil reducere virale titere og infektionseffektivitet.
    3. Beregn det volumen, der er nødvendigt for at transducere 5 × 104 celler med virus ved en multiplikation af infektion på 0,3 (MOI = 0,3) baseret på virustitrekoncentrationen.
    4. Det passende virusvolumen pipetteres til 250 μL (pr. brønd) serumfrit og antibiotikafrit foretrukket medium suppleret med 0,8 μg/ml hexadimethrinbromid. Bland forsigtigt.
      BEMÆRK: Hexadimethrinbromid er en kationisk polymer, der viser sig at øge viral adsorption og infektionseffektivitet.
    5. Fjern mediet. 250 μL fremstillet transduktionsmedium tilsættes med Lenti-iCas9-virus (MOI = 0,3) til cellerne, og ON inkuberes ved 37 °C, 5 % CO2. (Forkort inkubationstiden til 4-6 timer, hvis cellerne udviser virusrelaterede toksiske virkninger.)
    6. Udskift mediet med frisk foretrukket medium og lad cellerne komme sig i 1-2 dage.
    7. Udfør blasticidinvalg på de inficerede celler i 10-14 dage ved hjælp af den optimale blasticidinkoncentration afledt af "kill" -kurven beskrevet i trin 2.2.
      1. Parallelt vokser de uinficerede celler i medium med den optimale blasticidinkoncentration, der skal anvendes som en positiv kontrol for viral selektion.
    8. Skift mediet suppleret med den optimale blasticidinkoncentration hver 3. dag i løbet af udvælgelsestidsforløbet for at fjerne døde celler.
      BEMÆRK: Kun celler, der overlever blasticidinvalg, vil have integreret den lentivirale vektor.
    9. Udvid de blasticidin-valgte Lenti-iCas9-cellelinjer.
      BEMÆRK: Registrer cellepassagenummeret ved hver udvidelse.
      1. Frys en del af Lenti-iCas9-cellerne i foretrukket medium suppleret med 10% dimethylsulfoxid (DMSO) til langvarig kryovis opbevaring.
      2. En del af Lenti-iCas9-cellerne analyseres ved western blot9 for at identificere cellelinjen, der udviser de mest robuste DOX-inducerbare Cas9-proteinniveauer (se trin 2.3.).
  4. Udfør en doxycyclinkoncentrationskurve på nyetablerede Lenti-iCas9-cellelinjer for at bestemme de optimale betingelser for Cas9-proteininduktion.
    1. Opsæt fire uafhængige 6-brønds plader for hver cellelinje, der testes for at udføre dette DOX-koncentrationstidskursus. Plade 5 × 104 celler pr. brønd af hver 6-brøndplade og vokse ved 37 ° C, 5% CO2 i det foretrukne medium i 24 timer.
    2. Dox (arbejdslager 1 mg/ml) fortyndes i det foretrukne substrat med en endelig DOX-koncentrationskurve fra 0, 50, 100, 150, 250 til 500 ng/ml.
    3. Mærk brøndene på hver podet 6-brøndplade fra 1 til 6. Fjern mediet og udskift med de passende DOX-koncentrationer. Udvid plader 1-4 indtil følgende tidspunkter: 24 h, 48 h og 72 h DOX induktion; og 120 timer efter DOX-tilbagetrækning (oprindeligt 72 h DOX-induceret).
    4. Høst pladens brønde på hvert tidspunkt ved hjælp af passende metoder (f.eks. Trypsinisering). Cellepillerne opbevares ved -80 °C. Behandle cellepillerne i RIPA-buffer til lysatisolering og Cas9 western blot-analyse.
      1. Kør 40 μg cellelysat for hver prøve af DOX-induktionstidsforløbet ved hjælp af en denaturerende 4% -12% Bis-Tris gel og overfør proteinerne til en immunoblotmembran.
      2. Hybridiser immunblotmembranen med et primært antistof mod Cas9 for at detektere 160 kDa-proteinet. Normaliser Cas9-niveauer ved hjælp af et husholdningsgen som GAPDH (37 kDa).
    5. Baseret på western blot-resultaterne skal du bestemme den optimale DOX-koncentration for at inducere Cas9 i Lenti-iCas9-cellelinjerne.
      BEMÆRK: Dette tidskursus vil også afsløre, hvor stramt Cas9-udtryk er reguleret ved 120 h efter DOX-fjernelse.
    6. Etablere enkeltcellekolonier for Lenti-iCas9-cellelinjerne, der viser robust Cas9-proteinekspression for at optimere CRISPR-transfektionerne (i afsnit 3).

3. Udførelse af CRISPR-reaktioner ved Cas9-induktion og syntetisk guide RNA-transfektion af celler ved hjælp af et format med høj kapacitet

BEMÆRK: Et arbejdsgangsdiagram er vist i figur 1.

  1. På papir skal du kortlægge crRNA-parkombinationerne, der vil blive transficeret i hver brønd i en 24-brønds plade rettet mod hele miRNA-klyngen, forskellige grupperede miRNA-genkombinationer samt individuelle miRNA-klyngemedlemmer.
    1. På kortet skal du mærke fire brønde pr. Målrettet miRNA-locus. Lad hver brønd repræsentere en transfektionsreaktion med to unikke crRNA'er placeret 5 'og 3' af det ønskede miRNA knockout genomiske locus og tracrRNA (udglødet 1: 1 molforhold).
    2. Sørg for, at hver af de fire mærkede brønde repræsenterer et unikt crRNA-par til transfektion (f.eks. 5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
      BEMÆRK: Designet af to 5' crRNA'er og to 3' crRNA'er, der flankerer hvert målrettet miRNA-locus (afsnit 1), muliggør generering af fire mulige 5' og 3' guide RNA-par i transfektionsreaktionen.
  2. Lenti-iCas9-cellelinjen plades ved 5 x 104 celler/brønd af en 24-brønds plade i det foretrukne medium indeholdende den optimerede DOX-koncentration (bestemt i trin 2.4.). Dyrk cellerne i 24-48 timer ved 37 °C, 5% CO2 for at inducere Cas9-proteinekspression.
  3. Transfektér Lenti-iCas9-cellerne med de forberedte 5' og 3' guide RNA'er.
    1. Rekonstituere det syntetiserede crRNA og tracrRNA oligonukleotider med nukleasefrit vand til en lagerkoncentration på 10 μM. Opbevares ved -80 °C på lang sigt.
    2. Mærk fire 1,5 ml mikrocentrifugerør pr. målrettet miRNA-locus baseret på det eksperimentelle kort designet i trin 3.1., der repræsenterer de fire mulige 5' og 3' crRNA-parkombinationer (5'A + 3'A; 5'A + 3'B; 5'B + 3'A; 5'B + 3'B).
    3. I hvert rør blandes et 1: 1 molforhold mellem tracrRNA og unikke crRNA'er (5 'og 3') sammen for at danne 2 μM guide RNA-komplekset ved anvendelse af følgende reaktion (endeligt volumen på 10 μL):
      1. Der tilsættes 2,5 μL tracrRNA (10 μM-lager), 1,25 μL af det 5' placerede crRNA (10 μM-lager), 1,25 μL af det 3' placerede crRNA (10 μM-lager) og 5 μL 10 mM TRIS-HCL pH 7,5 til et 1,5 ml centrifugerør. Mikrocentrifuge i 30 s ved 16.000 × g at blande. Inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 5 min.
    4. Til hvert rør tilsættes 40 μL reduceret serummedium (f.eks. Opti-MEM) til 10 μL guide RNA-kompleks reaktion (50 μL totalvolumen). Bland forsigtigt ved at pipettere op og ned.
    5. I et rent 1,5 ml centrifugeglas blandes 2 μL transfektionsreagens28 (se NOTE 3.3.5.1) og 48 μL reduceret serummedium (f.eks. Opti-MEM, slutvolumen på 50 μL) forsigtigt ved pipettering op og ned. Inkuberes ved RT i 5 min.
      1. Der fremstilles en hovedblanding af transfektionsreagenset ved at gange reagensmængden (2 μL) og det reducerede serummedium (f.eks. Opti-MEM, 48 μL) med antallet af huller, der skal transinficeres, plus 10 % ekstra volumen for at tage højde for mindre pipetteringsfejl.
        BEMÆRK: Vælg et transfektionsreagens, der er optimeret til små RNA- og CRISPR RNA-oligonukleotidtransfektioner samt til cellelinjetype28.
    6. Til hvert rør, der indeholder 50 μL guide RNA-blanding (fra trin 3.3.4), tilsættes 50 μL af det fortyndede transfektionsreagens (fra trin 3.3.5). Rør blandingen langsomt op og ned en gang for at blande. Inkuberes på RT i 20 min.
    7. Der tilsættes 400 μL antibiotikafrit medium suppleret med DOX (optimal koncentration) til hvert rør indeholdende 100 μL af guide RNA/transfektionsblandingen. Pipette forsigtigt for at blande.
  4. Fjern mediet fra de DOX-inducerede Lenti-iCas9-celler (trin 3.2.). Der tilsættes 500 μL media/DOX/guide RNA/transfection mix baseret på 24-brønds pladeeksperimentkortet (trin 3.1.). De transinficerede celler inkuberes i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  5. Udskift mediet med det friske foretrukne medium uden DOX (for at fjerne Cas9-protein fra cellerne). Lad cellerne komme sig i yderligere 24-48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
  6. Høst de transinficerede celler (trypsinisering) og forbered genotypning og enkeltcellefortyndinger.
    BEMÆRK: Celler repræsenterer en blandet population, der indeholder transinficerede CRISPR-genredigerede og utransficerede vildtypeceller. Dette trin bestemmer effektiviteten af CRISPR-redigering, før du investerer tid / ressourcer i udvidelse af encellekoloni.
    1. Cellerne vaskes 1x med 1 ml fosfatbufferet saltvand (PBS). Cellerne inkuberes i 100 μL trypsin i 5 minutter ved 37 °C, 5 % CO2 , og cellerne overføres til et rent 1,5 ml centrifugeglas indeholdende 1 ml medium.
    2. Inverter for at blande og mikrocentrifuge cellerne i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C. Fjern mediet, og resuspender cellepillen i 1 ml PBS.
    3. Mikrocentrifuge de vaskede celler i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C. PBS fjernes, og cellepillen resuspenderes i 150 μL af det foretrukne medium.
  7. Bestem celletallet pr. mikroliter af 150 μL resuspenderede celler ved hjælp af et hæmocytometer eller automatiseret celletællingsinstrument.
  8. Adskil de 150 μL resuspenderede celler i tre dele.
    1. 1/3 transinficerede celler (50 μL) fryses i medium plus 10% DMSO (slutvolumen på 150 μL) i kryovirale midler til fremtidig ekspansion/langtidsopbevaring.
    2. Overfør 1/3 transinficerede celler (50 μL) til et rent 0,2 ml PCR-rør til genotypning.
      1. Mikrocentrifuge cellerne i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C og fjern mediet.
      2. Resuspender cellepillen i 100 μL PBS.
      3. Mikrocentrifuge cellerne i 5 minutter ved 200 × g ved 4 °C og fjern PBS. Cellepiller med blandet population opbevares på lang sigt ved -80 °C.
      4. Behandl cellepillen til genotypebestemmelse ved hjælp af arbejdsgangen i afsnit 4.
    3. Forbered den endelige 1/3 af cellerne (50 μL) til fortynding og plettering i et 96-brønds pladeformat for at generere enkeltcellekolonier.
      1. På grundlag af celletallet i trin 3.7 beregnes de fortyndinger, der kræves for at opnå 10, 5, 2 og 1 celle(r) i 100 μL medium pr. brønd af en 96-brøndplade.
      2. Ved hjælp af en 12-kanals multipipettor og et sterilt reagensreservoir tilsættes 100 μL fortyndede celler pr. brønd til to rækker af pladen (24 brønde i alt) for hver fortynding (10, 5, 2 eller 1 celle pr. Brønd). Tillad 4-6 uger for cellerne at vokse til sammenløb for enkeltcellekoloniudvidelse. Observer cellerne ugentligt under et lysmikroskop og bemærk, om kolonierne repræsenterer enkelt- eller flercellekolonier.
      3. Saml ~ 10-15 enkeltcellekolonier til genotypning (afsnit 4). Identificer mindst tre uafhængige, knockout, enkeltcellede kolonilinjer for hvert målrettet miRNA-sted. Bevar vildtype-enkeltcellelinjer som kontrolelementer.
        BEMÆRK: Screeningsnummeret afhænger af cellelinjetypen og virkningen af miRNA knockout-fænotype på cellevækst / levedygtighed.

4. PCR-genotypning af CRISPR-cellelinjer ved hjælp af rå cellelysater

  1. Høst individuelle, enkeltcellede kolonier fra næsten sammenflydende brønde af en 96-brøndplade.
    BEMÆRK: Fjernelsen af medium/PBS, der er beskrevet i disse trin, kan udføres manuelt ved hjælp af en vakuumsuger i biosikkerhedsskabet, men vær forsigtig med at undgå krydskontaminering. Brug en ny steril "gul" 200 μL pipettespids til hver brønd på pladen med 96 brønde, når du aspirerer, hvor hver udskiftet gul spids er fastgjort i enden af en steril glasgræspipette fastgjort til vakuumsugeren.
    1. Brøndene vaskes 1x med 100 μL PBS. Aspirere PBS.
    2. Der tilsættes 50 μL trypsin og inkuberes i 2-5 min ved 37 °C, 5 % CO2.
    3. Rør forsigtigt op og ned og overfør de resuspenderede celler til et 1,5 ml centrifugerør indeholdende 1 ml medium.
    4. Inverter for at blande og forsigtigt pelletere cellerne i en mikrocentrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C.
    5. Fjern mediet, og tilsæt 1 ml PBS. Svirp forsigtigt røret for at forstyrre pelleten og inverter flere gange for at blande.
    6. Mikrocentrifuge i 5 minutter ved 200 × g ved 20 °C for at pelletere cellerne.
    7. PBS fjernes, og pelleten sættes igen i 300 μL frisk PBS.
    8. 300 μL-prøven opdeles i to dele.
      1. Overfør 200 μL af cellerne (2/3 af pelleten) til en brønd af en 24-brønds plade indeholdende 1 ml af det foretrukne medium. Når genotypen er valideret, skal du bruge disse celler til at udvide de CRISPR-medierede knockout-cellelinjer til funktionel analyse.
      2. Overfør 100 μL af cellerne (1/3 af pelleten) til et 0,2 ml PCR-rør. Mikrocentrifuge i 5 minutter ved 3.000 x g ved 4 °C. Fjern PBS. Pelleten opbevares ved -80 °C.
  2. Der fremstilles rå cellelysater til genotypning og sekvensanalyse ved hjælp af PCR-primere designet i trin 1.3. Inkluder cellelysater fremstillet af utransficerede celler i disse eksperimenter til brug som vildtype positive kontroller.
    1. Resuspender cellepillen i 4 μL 5x DNA-polymerasebuffer (se materialetabellen, slutkoncentration 1x), 1 μL proteinase K (20 ng / ml lager), 1 μL RNase A (10 ng / ml lager) og nukleasefrit vand op til et samlet volumen på 20 μL.
    2. Lys cellerne i en termocycler ved hjælp af et PCR-program: 56 °C i 30 min og 96 °C i 5 min. Cellelysaterne opbevares ved -20 °C.
    3. Udfør en PCR-reaktion ved hjælp af de designede PCR-primere (fremad, omvendt), der flankerer guide RNA 5 'og 3' guide RNA-målrettede steder (tabel 1).
      BEMÆRK: DNA-polymerasebufferen og termocyclerbetingelserne afhænger af Taq DNA-polymeraseenzymet, der anvendes til PCR-reaktionen. Denne protokol blev optimeret til en Phusion HF DNA Polymerase.
      1. Opsæt PCR-reaktionsblandingen på is: 5 μL 5x DNA-polymerasebuffer, 0,5 μL fremadGÅENDE PCR-primer (10 μM-lager), 0,5 μL omvendt PCR-primer (10 μM-lager), 0,5 μL 10 mM dNTP'er, 0,25 μL DNA-polymerase, 1-4 μL cellelysat og nukleasefrit vand op til et samlet volumen på 25 μL.
      2. Kør PCR-reaktionen i en termocyklist ved hjælp af programmet: 98 ° C i 3 minutter og 35 cyklusser på 98 ° C i 10 s, 62 ° C i 15 s, 72 ° C i 15 s og derefter 72 ° C i 10 min. Hold i 4 °C. Se NOTE 4.2.3. ovenover.
    4. Læg PCR-produkterne på en 1% agarosegel til elektroforeseanalyse.
    5. Uddrag DNA fra de isolerede PCR-fragmenter af den forudsagte molekylære størrelse for knockout (og vildtype) genotyper. Forbered prøverne til DNA-sekventering.
    6. Valider, at CRISPR-reaktionen var vellykket, og udfør DNA-sekventering af de isolerede PCR-fragmenter for at identificere Cas9-spaltningsstedet og bekræfte sletning af miRNA-locus.
      1. Isoler mindst tre uafhængige knockout-cellelinjer for hvert miRNA-sted, der er målrettet mod CRISPR. Bevar vildtype (og heterozygote) cellelinjer til brug som kontroller i downstream funktionelle undersøgelser.
      2. Udfør qRT-PCR- eller northern blot-analyse for at bekræfte, at knockout-cellelinjerne ikke udtrykker modent miRNA for det slettede sted.
        BEMÆRK: Helgenomsekventering (WGS) er den mest definitive metode til validering af CRISPR-genredigering og off-targeting.
      3. Test for CRISPR off-targeting effekter af PCR, som blev forudsagt beregningsmæssigt (trin 1.2.3.) 24,25,26,27.
      4. Hvis omfattende enkeltcellekoloniscreening kun resulterer i heterozygote genotyper, gentages den vejledende RNA-transfektion i de heterozygote enkeltcellelinjer.
        BEMÆRK: Manglende evne til at opnå homozygote knockout-cellelinjer kan indikere dødelige virkninger på grund af miRNA-tab eller iboende genomisk kompleksitet (f.eks. Kromosomduplikationer / fusioner) af forældrecellelinjen, der kræver yderligere analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne CRISPR-sletningsprotokol med høj kapacitet blev med succes anvendt ved hjælp af transfektion af Cas9-inducerbare LNCaP- og PC3-ML humane kræftcellelinjer med syntetiske oligonukleotidguideRNA'er rettet mod miR-888-klyngen, som blev undersøgt i forbindelse med prostatacancer. MiR-888-klyngen blev oprindeligt identificeret i en ekspressionsprofileringsskærm som forhøjet hos prostatacancerpatienter med højgradig sygdom sammenlignet med patienter med lav kvalitet og ikke-kræft 9,10. MiR-888-klyngen, der spænder over 35.124 bp, består af syv miRNA'er (miR-892c, -890, -888, -892a, -892b, -891b og -891a) på humant kromosom Xq27.3 (figur 2A). Dette sted ligger inden for HPCX1 (Arvelig prostatakræft, X-bundet 1, Xq27-28), som er forbundet med arvelig prostatacancer 11,12,13,14,15,29. miR-888, -890, -892a, -892b og -892c deler sekvenshomologi og tilhører den pattedyrbevarede miR-743-familie. Klyngemedlemmer miR-891a og miR-891b deler kun sekvenshomologi med hinanden og tilhører den primatspecifikke miR-891-familie. Den genomiske organisering af miR-888-klyngen bevares på tværs af primater, hvilket indebærer funktionel bevarelse af et vigtigt signalnetværk30.

Tidligere arbejde ved hjælp af eksperimentelle overekspression (miRNA-efterligninger) og hæmning (antisense oligonukleotider) undersøgelser til evaluering af individuel miR-888 klyngemedlemsaktivitet afslørede en overlappende rolle for alle miR-888-klyngemedlemmer for at fremme prostatacancercelleinvasivitet ved hjælp af Matrigel Boyden-kammerassays 9,10. Mest bemærkelsesværdigt fungerede miR-888 og miR-891a på samme måde for at inducere prostatacellevækst (WST-1-assays), fremskynde prostatatumorbelastning i musexenotransplantater og regulere fælles mål (f.eks. TIMP-2)9,10. Dette arbejde antydede imidlertid et mere komplekst samspil mellem miR-888-klyngemedlemmerne. For eksempel viste miR-888 og miR-891a synergistiske virkninger ved fremme af PC3-N prostatacelleproliferation, mens både miR-890 og miR-892c viste hæmmende væksteffekter ved hjælp af WST-1-assays9. Derfor blev denne CRISPR-protokol med høj kapacitet anvendt til genetisk at forhøre miR-888-klyngenetværket i forbindelse med prostatacancer.

Den beskrevne arbejdsgang for CRISPR Cas9-genredigering (figur 1) tillod test af 32 unikke CRISPR-guide RNA-transfektionsreaktioner i et enkelt eksperiment ved hjælp af et 24-brøndformat. Denne protokol resulterede i en vellykket identifikation af et panel af humane prostatacancer knockout-cellelinjer, der bærer deletioner for hele miR-888-klyngen, specifikke miRNA-klyngemedlemskombinationer og individuelle miRNA-medlemmer. Genereringen af stabile inducerbare Cas9-cellelinjer blev først etableret. Kort fortalt blev PC3-ML og LNCaP humane prostatacancerceller inficeret med en DOX-inducerbar Streptococcus pyogenes Cas9 lentivirusvektor (Lenti-iCas9; EditR Inducerbar Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuklease partikler; MOI 0,3) i 6 timer (LNCaP) eller natten over (PC3-ML), afhængigt af iboende cellelinjefølsomhed for virustoksicitet.

De inficerede cellelinjer gennemgik efterfølgende blasticidinudvælgelse (7,5 μg / ml) og encellekoloniudvidelse. Western blot-undersøgelser blev brugt til at vælge enkeltkoloni PC3-ML og LNCaP Lenti-iCas9 cellelinjer, der udviser det mest robuste Cas9-udtryk baseret på et DOX-induktionstidsforløb (figur 2A). Dette lentivirale Cas9-inducerbare system blev stramt kontrolleret, og ved DOX-tilbagetrækning i 120 timer blev det meste af Cas9-proteinet fjernet fra cellerne (figur 2A). En DOX-koncentrationskurve fastslog, at 250 ng / ml DOX var den optimale dosis til at inducere robust Cas9-proteinekspression i disse Lenti-iCas9 prostatacellelinjer (figur 2B). Ved hjælp af et online crRNA-designværktøj23 blev der designet unikke crRNA'er (to 5' og to 3' crRNA'er, der flankerede hvert planlagt miRNA-knockout-sted for at give mulighed for fire mulige 5' og 3' guide RNA-kombinationer), der målrettede hele ~ 35 kb miR-888-klyngeregionen; mindre klyngekombinationer inden for miR-743-familien eller miR-891-familien; samt individuelle miRNA-deletioner (miR-888, -891a) (figur 3A). Ved udførelse af CRISPR-eksperimenterne blev human prostatacancer Lenti-iCas9 cellelinjer dyrket i medium suppleret med 250 ng / ml DOX i 48 timer for at inducere Cas9-ekspression.

Cellerne blev derefter transficeret i et 24-brønds pladeformat med det syntetiske universelle tracrRNA-kompleksbundet (1: 1 molforhold) med et unikt sæt 5 'og 3' genomiske stedspecifikke crRNA'er (tabel 2). DOX blev fjernet fra cellekulturmediet 48 timer efter transfektion for at fjerne Cas9-protein fra prostatacancercellerne. Brøndene blev høstet 48 timer senere (96 timer efter transfektion), og en tredjedel af hver høstet cellepellet blev forberedt til PCR-genotypning ved hjælp af råcellelysater (tabel 3). Gelelektroforeseanalyse af PCR-reaktionerne indikerede, at den forudsagte DNA-fragmentstørrelse, der repræsenterer knockout-genotypen, blev amplificeret for hver CRISPR-transfektion (figur 3B). DNA-sekventering af disse isolerede knockout-PCR-fragmenter bekræftede, at de transinficerede 5' og 3' guide RNA'er rettede Cas9-spaltning/ligering ~3 nt opstrøms for PAM-stederne og validerede genomisk tab af det målrettede miRNA-locus (repræsentativt eksempel vist i figur 4C). Da miR-888-klyngen befinder sig i en intergen region af kromosom X (langt fra nogen proteinkodende gener), var det ikke forventet, at knockout-cellelinjer, som ofte havde INDEL'er på Cas9-spaltningsstedet på grund af NHEJ, ville forårsage nedstrøms artefaktvirkninger.

Selvom CRISPR-transfektionsreaktionerne var vellykkede (figur 3B), repræsenterede de transinficerede celler en blandingscellepopulation af transinficerede (knockout) og utransficerede (vildtype) celler. Denne population repræsenterede også en blanding af celler, der bærer homozygote og heterozygote deletioner for det målrettede miRNA-locus. LNCaP og PC3 prostatacancer cellelinjer er afledt af mænd, der besidder unormale karyotyper, der omfatter to X-kromosomer31,32. Derfor blev en del af hver celletransfektionsreaktion serielt fortyndet i et 96-brønds pladeformat for at opnå enkeltcellekolonilinjer. Disse kolonier blev screenet af PCR for at vælge homozygote cellelinjer, der manglede alle kopier af det målrettede miRNA-locus.

Denne procedure var vigtig at følge rettidigt, da tidligere data har indikeret en rolle for miR-888-klyngen i at fremme tumorcellevækst og sygdoms aggressivitet. Kræftceller, der bærer CRISPR-deletioner for miR-888-klyngemedlemmerne, blev forudsagt at vokse langsommere end vildtypeceller. En gyldig bekymring var, at de guide RNA-transinficerede brønde, der indeholder en blandet population af miRNA-knockout og vildtypeceller, over tid ville resultere i, at vildtypeceller hurtigt udkonkurrerede de kompromitterede mutante celler i kultur. Dette blev bemærket at forekomme og var især udtalt i eksperimenter ved hjælp af de meget aggressive PC3-ML-cellelinjer. Således blev trin, der involverede serielle fortyndinger til generering af enkeltcellekolonilinjer eller celleforberedelse til kryoostori, udført inden for 48-72 timer efter udførelse af CRISPR-transfektionseksperimenterne for at bevare knockout-cellerne i de blandede populationsprøver.

Den mest besværlige del af CRISPR-arbejdsgangen for miR-888-klyngen var dannelsen af homozygote, enkeltcellede koloni miRNA-deletioner. En udfordring i denne proces var, at de dyrkede LNCaP- og PC3-ML-celler typisk ikke trivedes godt, når de blev belagt med enkeltcelletætheder. Derudover syntes cellevækst at være fænotypisk kompromitteret ved kombinatorisk tab af miR-888 klyngemedlemmer (og korreleret med aggressivitet af cellelinjen). For nogle af transfektionsreaktionerne rettet mod visse miRNA locus-kombinationer var der derfor behov for yderligere cellefortyndinger (ved hjælp af et 96-brøndformat) for at generere nok enkeltcellekolonilinjer til genotypning. Ved screening af genotyperne af enkeltcellekolonierne ved elektroforesegelbilleddannelse var det nyttigt at sammenligne båndintensiteten af vildtypen sammenlignet med knockout-PCR-fragmenterne og afgøre, om cellelinjen var heterozygot (lige båndintensitet) eller repræsenterede en flercellekoloni (ulige båndintensitet), som ville drage fordel af yderligere runder af enkeltcellefortyndinger. Hvis cellekolonier blev noteret at have PCR-fragmenter af unormal størrelse og uforenelige med vildtype- eller knockout-genotyper, blev disse linjer elimineret fra undersøgelsen.

DNA-sekventering af isolerede PCR-fragmenter, der er konsistente for vildtype- og knockout-genotyperne, blev forlænget for hver etableret enkeltcellekoloni og bekræftet ved hjælp af uafhængige metoder (dvs. qRT-PCR, WGS). Med hensyn til den typiske effektivitet ved at generere homozygote nulcellelinjer i disse eksperimenter varierede dette med det målrettede miRNA-locus og den anvendte celletype. For eksempel var effektiviteten ved opnåelse af enkeltkoloni mir-891a knockout-linjer ved hjælp af LNCaP 30%, men faldt til ~ 7% i PC3-ML-celler. Denne forskel kan skyldes iboende celletypeforskelle (f.eks. HAR PC3-ML-celler højere divisionshastigheder / metastatisk potentiale end LNCaP-celler). CRISPR-effektivitetsforskelle kan også afspejle den funktionelle virkning af miRNA-tab (f.eks. MiR-891a fremmer cellevækst og aggressivitet 9,10), og knockout-fænotyper kan således forstørres i mere aggressive cellelinjer såsom PC3-ML. Opnåelse af enkeltkolonilinjer til større miRNA locus deletioner af miR-888-klyngen udviste reducerede effektivitetsgevinster. Vi var ikke i stand til at afgøre, om dette skyldtes at slå større regioner af DNA'et ud eller understregede de væsentlige og overlappende funktionelle roller af miR-888-medlemmer i prostatacancerceller.

Detaljeret beskrivelse og fænotypisk analyse af de enkeltcellekoloniudvidede knockout miR-888 klyngecellelinjer genereret fra denne arbejdsgang er i gang og vil blive offentliggjort andetsteds. Som et repræsentativt resultat af miRNA-deletioner genereret i disse CRISPR-genredigeringsundersøgelser vises resultaterne for LNCaP prostatacancerceller, der bærer en individuel mir-891a-deletion. Enkeltcellekolonier blev genotypet ved PCR og sekvensverificeret (figur 4A-C). Cellelinjer, der udviser PCR-fragmenter af unormal størrelse, blev ikke analyseret (f.eks. Klon L14 H7 vist i figur 4D). Når knockout og vildtype enkeltcellekolonier blev opnået for mir-891a locus, blev funktionelle undersøgelser udført. Tidligere arbejde har vist, at overekspression af miR-891a (miRNA mimic lentiviral vector) inducerer prostatacellevækst9, og det blev derfor forudsagt, at miR-891a tab ville vise gensidige virkninger. WST-1 proliferationsassays, der sammenlignede mir-891a knockout og vildtypeceller, bekræftede denne hypotese, og miR-891a-tab resulterede i nedsat vækst (figur 4D, E).

Figure 1
Figur 1: CRISPR-genredigeringsworkflow til generering af miRNA-klyngesletninger. (A) Guide-RNA'et består af det udglødede syntetiske crRNA og tracrRNA-oligonukleotider (blandet 1:1 molforhold). CrRNA oligonukleotid er designet til at indeholde en unik 5'-terminal 20 nt guidesekvens (gul) komplementær til det målrettede genomiske DNA-sted og efterfølges af en invariant 22 nt Streptococcus pyogenes gentagelsessekvens (grøn), der basepar med tracrRNA oligonukleotid. Røde pile angiver Cas9-enzymets dobbeltstrengede DNA-spaltningssteder, der typisk er placeret 3 nt opstrøms for PAM. (B) Denne eksperimentelle arbejdsgang viser en enkelt brønd af en 24-brøndplade. Celler inficeret med en DOX-inducerbar Cas9 lentivirusvektor (Lenti-iCas9, MOI 0.3) dyrkes i medium med DOX i 48 timer for at inducere Cas9-proteinekspression. To syntetiske guide RNA'er (blandet 1: 1 molforhold mellem crRNA: : tracrRNA) transficeret til Cas9-inducerede celler. Guide-RNA'erne eskorterer Cas9 til de genomiske DNA-steder (5' og 3'), der flankerer miRNA-klyngeområdet, der er målrettet til fjernelse. Celler fremstilles 48 timer efter transfektion til fortynding ved anvendelse af et 96-brøndformat til dannelse af enkeltcellekolonier til PCR-genotypning og nedstrøms fænotypiske analyser. Forkortelser: CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; miRNA = mikroRNA; crRNA = CRISPR RNA; tracrRNA = transaktiverende CRISPR RNA; nt = nukleotid; Cas9 = CRISPR-associeret endonuklease; PAM = protospacer tilstødende motiv; DOX = doxycyclin; MOI = mangfoldighed af infektion. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Kræftcellelinjer, der bærer en doxycyclin-inducerbar Cas9 lentiviral kassette, der udviser stram Cas9-proteinregulering. (A) Western blot-analyse viste, at human prostatacancer PC3-ML-cellelinjer inficeret med Lenti-iCas9-vektoren (EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, MOI 0.3) og dyrket i 48 timer i medium indeholdende 250 ng / ml DOX udtrykte optimale Cas9-proteinniveauer. Cas9-udtryk blev normaliseret til GAPDH-udtryk. (B) PC3-ML-celler dyrket i medium med 250 ng / ml DOX i 48 timer og 120 timer (+ DOX) viste robust Cas9-proteinekspression. FJERNELSE AF DOX fra mediet (-DOX) i 120 timer (120 h post) resulterede i Cas9 proteinclearance, målt ved western blot-analyse. Lignende resultater blev opnået ved generering af LNCaP Lenti-iCas9 cellelinjen (ikke vist). Forkortelser: CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; Cas9 = CRISPR-associeret endonuklease; DOX = doxycyclin; MOI = mangfoldighed af infektion; GAPDH = glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Crispr-eksperimentelt design med høj kapacitet til at generere flere miR-888-klyngesletningskombinationer i et enkelt eksperiment. (A) Diagram over miR-888-klyngen placeret på humant kromosom Xq27.3, der angiver de pattedyrbevarede miR-743-familiemedlemmer mir-892c, -890, -888, -892a og -892b (blå kasser) og de primatspecifikke miR-891 familiemedlemmer miR-891a og -891b (rødbrune kasser). Unikke syntetiske crRNA oligonukleotider (grønne pile) blev brugt til at generere miR-888 cluster knockout kombinationer. Fremadgående og omvendte PCR-primere (små røde rektangler) blev designet til at genotype celler og skærm for knockouts. (B) Dette repræsentative resultat viser 25 CRISPR-reaktioner i transinficerede PC3-ML-celler (Lenti-iCas9), der var målrettet mod en række miR-888 cluster knockout-kombinationer i et enkelt eksperiment. Hver transficeret brønd af en 24-brøndplade indeholdt to unikke gRNA'er, der flankerede 5'- og 3'-siden af det målrettede miRNA-genomiske locus (Δ) (som anført i tabel 2). Råcellelysater blev fremstillet for hver CRISPR-reaktion og PCR-genotypet. Isolerede PCR-fragmenter, der migrerede ved de forudsagte knockout-størrelser ved gelelektroforese, blev DNA-sekventeret og valideret til målrettet fjernelse af Cas9-spaltning og miRNA-locus. Forudsagte WT PCR-fragment bp-størrelser er angivet i parentes, og de ønskede CRISPR KO PCR-fragmentstørrelser vises i bunden af gelen. Forkortelser: CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; Cas9 = CRISPR-associeret endonuklease; gRNA = guide RNA; DOX = doxycyclin; bp = basepar; WT = vildtype; KO = knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Prostatacancerceller slettet for mir-891a ved hjælp af CRISPR-genredigering, der udviser undertrykt proliferation. (A) Design af PCR-primere (lilla) og de to 5' og to 3' guide RNA'er (orange) rettet mod genomiske sekvenser, der flankerer mir-891a-genet (grøn). (B) PCR-genotypning af transinficerede LNCaP-celler med angivne 5' og 3' vejledende RNA'er bekræftede, at der blev opnået Δmir-891a-deletioner for alle fire guide RNA-kombinationer. Cellelysater blev fremstillet af blandede cellepopulationer 48 timer efter transfektion. (C) PCR-fragmenter blev sekventeret og valideret. Et repræsentativt eksempel viser DNA-sekvensen af transinficerede celler behandlet med 5A (891a) og 3B (891a) guide RNA'er, hvilket resulterer i det forudsagte Cas9-spaltningssted (3 nt opstrøms forPAM-stedet) og CRISPR Δ mir-891a-sletning. (D) Enkeltcellekolonier blev opnået og PCR-genotypet. Klon L14 G9 blev sekvensvalideret som en KO og klon L14 G9 som en WT for mir-891a genet . (E) miR-891a blev tidligere vist at inducere prostatacancercellevækst, og derfor blev miR-891a-tab forudsagt at have den gensidige fænotype. WST-1-assays af prostatacancerceller slettet for mir-891a (L14 G9 [KO], blå) viste undertrykt proliferation sammenlignet med WT-celler (L14 G9 [WT], rød). Forkortelser: CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; Cas9 = CRISPR-associeret endonuklease; WT = vildtype; KO = knockout; WST-1 = vandopløseligt tetrazolium salt-1. Klik her for at se en større version af denne figur.

PCR-reaktion er sat op på is.
Komponent 25 μL reaktion Endelig koncentration
5x DNA-polymerase buffer 5 μL 1x
FremadGÅENDE PCR-primer (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
Omvendt PCR-primer (10 μM) 0,5 μL 0,2 μM
10 mM dNTP'er 0,5 μL 200 μM
DNA-polymerase (2 U/μL) 0,25 μL 0,125 U/ 25 μL
Rå cellelysat 1 - 4 μL variabel
Nukleasefrit vand op til 25 μL
Thermocycler betingelser for PCR reaktion:
Skridt Temperatur Tidspunkt
Indledende denaturering 98 °C 3 minutter
98 °C 10 s
35 cyklusser 62 °C 15 s
72 °C 15 s
Endelig udvidelse 72 °C 10 minutter
Holde 4 °C

Tabel 1: PCR-reaktionsbetingelser for genotypning af rålysat. Forkortelse: dNTP = deoxynukleotider.

CRISPR-målrettet sletningswebsted Guide RNA-kombination Vildtype (bp) Knockout (bp) PCR Primer par
∆Fuld klynge 5A(891a)+3A(892c)
5B(891a)+3A(892c)
5A(891a)+3B(892c)
5B(891a)+3B(892c)		 35,664 389
496
378
485		 891a FWD
892c REV
∆892c/890/888 5A'(888)+3A(892c)
5B'(888)+3A(892c)
5A'(888)+3B(892c)
5B'(888)+3B(892c)		 2,739 478
487
467
476		 888 FWD
892c REV
∆892c/890 3A'(888)+3A(892c)
3B'(888)+3A(892c)
3A'(888)+3B(892c)
3B'(888)+3B(892c)		 2,739 710
754
699
743		 888 FWD
892c REV
∆892b/892a 5A'(888)+5A(892b)
5B'(888)+5A(892b)
5A'(888)+5B(892b)
5B'(888)+5B(892b)		 2,938 554
547
573
566		 892b FWD
888 REV
∆892b/892a/888 5A(892b)+3A'(888)
5A(892b)+3B'(888)
5B(892b)+3A'(888)		 2,938 322
278
341		 892b FWD
888 REV
∆743 Familie 5A(892b)+3A(892c)
5B(892b)+3A(892c)
5A(892b)+3B(892c)
5B(892b)+3B(892c)		 5,015 370
389
359
378		 892b FWD
892c REV
∆891 Familie 5A(891a)+3A(891b)
5B(891a)+3A(891b)		 27,294 330
270		 891a FWD
891b REV
∆891a 5A(891a)+3A(891a)
5A(891a)+3B(891a)
5B(891a)+3A(891a)
5B(891a)+3B(891a)		 554 333
273
454
394		 891a FWD
891a REV

Tabel 2: CRISPR guide RNA'er, der bruges til at generere miR-888-klynge knockout-kombinationer. Forkortelser: CRISPR = grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser; bp = basepar; FWD = fremad; REV = omvendt.

Primer Sekvens Tm (°C)
888 FWD AGGCATCCTCAAGATAAGTTAAG 52.2
888 REV CTGGATGATGGCCAAGACAAG 55.9
891a FWD TGGGAAGTCGGAATTCTTACAA 53.9
891a REV TTCATCTTGCTGCTACCTGTC 54.8
891b REV TCATCTTGCTGCTATACGTCCT 55.6
892b FWD GCTCCTGTCAATCATCTAGGTA 53.5
892b REV CTCTATGTTTACCCAGTGATTGC 53.5
892c FWD TGTGAGCACCTACAGGTTAG 53.9
892c REV KAKTUS KAKTUSTGGCTTCATG 53.5

Tabel 3: PCR-primere anvendt til genotypning. Forkortelser: FWD = fremad; REV = omvendt; Tm = smeltetemperatur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne CRISPR-genredigeringsprocedure gør det muligt for efterforskeren hurtigt at generere et helt panel af cellelinjer, der bærer unikke kombinationer af miRNA-klyngesletning. Transfektionen af syntetiske guide RNA'er sammensat af 5' og 3' genomiske stedsspecifikke crRNA'er udglødet med syntetisk tracrRNA (1: 1 molforhold) i denne protokol undgår tidskrævende plasmidvektorunderkloning og giver mulighed for et mere fleksibelt eksperimentelt design med høj kapacitet ved hjælp af et 24-brøndformat. Dannelsen af cellelinjer, der bærer en DOX-inducerbar Cas9 lentiviral kassette muliggør tæt DOX-reguleret og robust Cas9-ekspression under celletransfektionen af guide RNA'er og hurtig clearance af dette bakterielle protein ved DOX-tilbagetrækning fra kulturmediet i efterfølgende trin. Denne procedure er også afhængig af rå cellelysater til PCR-genotypning, som kræver minimalt cellemateriale til analyse og undgår brugen af dyre og arbejdskrævende silicakolonne-DNA-oprensningsmetoder eller behovet for at måle nukleinsyrekoncentrationer ved hjælp af et spektrofotometer, hvilket yderligere strømliner metoderne for efterforskeren.

Faktisk viste de repræsentative resultater, der blev delt her, vellykket tilpasning af denne metode til at transfektere humane prostatacancercellelinjer med 32 unikke guide RNA-kombinationer i et enkelt eksperiment og generere flere enkeltcellekoloni knockout-linjer, der bærer deletioner for hele ~ 35 kb miR-888 klyngeregionen; mindre sletningskombinationer for miR-888-klyngemedlemmer, der tilhører familierne miR-743 og miR-891a; samt sletninger for individuelle miRNA-medlemmer inden for miR-888-klyngen. Denne arbejdsgang genererede en værdifuld cellelinjeressource til at begynde molekylært at dissekere miR-888-klyngenetværket i forbindelse med human prostata sygdom og bestemme, hvordan miR-888-klyngemedlemmer funktionelt overlapper eller interagerer synergistisk / antagonistisk med hinanden for at regulere prostatatumorvækst, kræftaggressivitet og lægemiddelresistens (skal offentliggøres andetsteds). Disse undersøgelser vil være afgørende, da denne forskning bevæger sig mod diagnostiske og terapeutiske anvendelser til behandling af patienter med avancerede og metastatiske former for prostatacancer.

Der er flere kritiske trin i denne CRISPR-genredigeringsprotokol med høj kapacitet, som efterforskere nøje bør overveje, når de tilpasser denne metode til at studere yderligere miRNA-klyngenetværk i andre sygdomssammenhænge. For det første er det vigtigste trin i denne proces det omhyggelige design af guide-RNA'erne, der flankerer miRNA-klyngen til CRISPR-medicineret fjernelse, samt yderligere guide-RNA'er til at slette individuelle miRNA'er eller kombinationer af miRNA-klyngemedlemmer. Investigator bør nøje overveje ikke at forstyrre de omgivende gener eller regulatoriske elementer, især hvis miRNA-klyngen befinder sig i en genintron eller er placeret antisense til et andet gen. Der er CRISPR off-targeting forudsigelsesressourcer 24,25,26,27 tilgængelige, der kan hjælpe forskeren, når han vælger de mest diskriminerende crRNA oligonukleotider til at syntetisere. Denne arbejdsgang beskriver designet af to 5' og to 3' crRNA'er, der flankerer hvert målrettet miRNA-locus, der gør det muligt at teste fire unikke guide-RNA-kombinationer i CRISPR-transfektionstrinnet og øge chancerne for at generere den ønskede knockout-cellelinje. Imidlertid har forskeren kun brug for en af disse guide RNA-kombinationer for at arbejde med succes for at forstyrre et bestemt miRNA-genlokus.

For det andet bør investigator beslutte den mest hensigtsmæssige metode til levering af Cas9 til cellerne til CRISPR-genredigering. Denne procedure anvendte det DOX-inducerbare Cas9 lentivirale ekspressionssystem, men alternative tilgange til Cas9-proteinproduktion (f.eks. Cas9-rekombinant protein, Cas9 mRNA-levering eller brugen af konventionelle Cas9-ekspressionsplasmidvektorsystemer) kan let tilpasses til denne protokol. For eksempel kan eksperimentelle overvejelser diktere brugen af Cas9 forbigående ekspression versus generering af stabile lentivirale ekspressionscellelinjer, promotoren, der bruges til at drive Cas9 (allestedsnærværende, celletypespecifik, inducerbar) og inkorporering af positive / negative selektionssystemer for at sikre Cas9-ekspressionsvektorlevering til cellerne af interesse (dvs. antibiotikaresistens).

For det tredje er det vigtigt hurtigt at genotype transinficerede celler med blandet population inden for 48-72 timer efter guide RNA-levering i tilfælde af, at tab af miRNA-klyngen kan påvirke cellernes levedygtighed / vækst negativt. For eksempel, når man sletter tumorfremmende faktorer som miR-891a i prostatacancercellelinjer, blev det bemærket, at disse mir-891a knockout-celler voksede langsommere end ubehandlede celler, og efterfølgende overtog vildtypecellerne hurtigt cellepopulationen. Endelig er det afgørende at integrere yderligere valideringsmetoder for at sikre fjernelse af miRNA-locus under den genotypiske screeningsproces, især for større genomiske deletioner. Disse foranstaltninger omfatter anvendelse af interne PCR-genotypekontroller, der kun detekteres, hvis vildtype allelen er til stede, og udførelse af qRT-PCR-analyse på enkeltcellekolonier for at sikre, at knockout-cellelinjer ikke udtrykker de målrettede miRNA'er. Alle disse overvejelser vil sikre vellykkede resultater for efterforskeren.

Der var nogle åbenlyse begrænsninger, der opstod, når man inkorporerede denne CRISPR-teknik i laboratoriet. For eksempel, på trods af den høje gennemstrømningskarakter af de guide RNA-transfektionstrin, der er beskrevet i denne protokol for hurtigt at generere flere miRNA-klyngesletionskombinationer, var det hastighedsbegrænsende trin i denne procedure genotypescreeningen og udvidelsen af enkeltkolonicellelinjer for hver CRISPR-medieret miRNA-deletion. Indarbejdelsen af positive udvælgelsesstrategier i denne protokol ville være en fordel; det ville dog stadig tage ~ 3-4 uger at udvide en linje fra en enkeltcellekoloni dyrket i et 96-brøndformat. Faktisk vil indsamlingen af mindst tre uafhængige enkeltkolonicellelinjer pr. miRNA locus knockout plus vildtypeceller bidrage til at sikre, at de analyserede fænotyper ikke skyldes artefakt / off-targeting effekter, men dette tilføjer igen den tidskrævende karakter af denne procedure. Investigatoren kan også være nødt til at udføre flere runder af CRISPR-genredigering for at opnå homozygote nulcellelinjer. Dette er især udtalt i undersøgelser ved hjælp af etablerede udødeliggjorte kræftcellelinjer, der ofte besidder et komplekst genomisk landskab af kromosomale omlejringer og unormale karyotyper.

For eksempel brugte denne repræsentative undersøgelse LNCaP- og PC3-afledte humane prostatacancercellelinjer til at generere deletioner for miR-888-klyngen og kortlægge på X-kromosomet. Det var vigtigt at erkende, at disse mandlige afledte prostatacancercellelinjer har unormale karyotyper og havde to X-kromosomer (og PC3-celler har også delvise X-kromosomtranslokationer på andre autosomer)31,32. På trods af disse forhold var CRISPR-genredigering robust nok til at generere homozygote knockouts ved hjælp af disse prostatacellelinjer. Der kan dog være tilfælde, hvor en efterforskers cellelinje med en unormal karyotype (f.eks. Indsættelser, deletioner, inversioner, dubletter) kan indeholde "usynlige mutationer", der vil skjule påvisning af anden (eller flere) kopier af det målrettede genlokus på grund af manglende elementer, der er nødvendige for vellykket påvisning ved hjælp af de designede PCR-primere / guide RNA'er. Dette understreger vigtigheden af at verificere de homozygote nul CRISPR-cellelinjer ved hjælp af uafhængige metoder (dvs. qRT-PCR, northern blot, WGS), inden der udføres funktionelle assays. Endelig er denne protokol designet til kun at slå miRNA-klyngekombinationer ud, der kortlægger ved siden af hinanden. Hvis en efterforsker ønsker at slå miRNA'er ud, der er adskilt mellem andre miRNA-gener, vil der være behov for flere runder CRISPR-transfektioner, hvilket kræver omhyggelig genotypning og validering.

På trods af disse udfordringer er evnen til hurtigt at generere et komplet panel af miRNA-sletningskombinationer for en given miRNA-klynge ved hjælp af denne beskrevne protokol en enorm fordel i forhold til de eksisterende metoder i miRNA-forskningsværktøjskassen. Overekspressionsundersøgelser ved hjælp af miRNA-efterligninger til at karakterisere ikke-kodende RNA-funktion kan føre til utilsigtede artefakter eller celletoksiciteter. Ligeledes kan brugen af antisense antimir oligonukleotidhæmmere til bestemmelse af funktionstabsfænotyper være vanskelig, da antimirer normalt resulterer i en knockdown og ikke en fuldstændig eliminering af miRNA-aktivitet. Forsøg på at bruge kombinationer af miRNA-efterligninger eller miRNA-antimirer til at belyse miRNA-klyngenetværkssignalering har vist sig besværlig og vanskelig at fortolke. Derfor vil inkorporeringen af CRISPR-genredigeringsteknologi til at forhøre, hvordan miRNA-medlemmer interagerer inden for en given ikke-kodende genomisk klynge, gøre det muligt for forskere at få en klarere forståelse af, hvordan ikke-kodende RNA'er påvirker sygdomssignaleringsveje og lover at have enorme konsekvenser inden for diagnostiske og lægemiddelopdagelsesfelter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

PC3-ML cellelinjer blev venligt leveret af Mark Stearn (Drexel University College of Medicine). Justin Toxey hjalp med PCR-genotypning. Dette arbejde blev støttet af et Breedan Adams Foundation Grant, en Ryan Translational Research Fund og et Commonwealth Health Research Board Grant (CHRB-274-11-20) til AE-K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 mL PCR tubes, flat cap Fisher 14-230-225 Plasticware
1.5 mL Microcentrifuge Tubes Seal-Rite 1615-5500 Plasticware
24-well tissue culture plate Corning Costar  09761146 Plasticware
5x Phusion HF Buffer Thermo Scientific F-518L PCR reagent, genotyping
6-well tissue culture plate Fisher FB012927 Plasticware
96-well tissue culture plate Falcon 08-772-2C Plasticware
Anti-CRISPR-Cas9 antibody [7A9-3A3], Mouse monoclonal AbCam ab191468 Western blot reagent; 160 kDa; dilution 1:200
Antibiotic-Antimycotic (100x) Gibco 15240062 Tisuue culture reagent
BLAST nucleotide search engine National Center for Biotechnology Information NA Freeware; website: blast.ncbi.nlm.nih.gov
Blasticidin S, Hydrochloride, Streptomyces griseochromogenes Calbiochem CAS 589205 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL in water
Countess 3 Automated Cell Counter Invitrogen A50298 Equipment; Cell counter
Cryogenic tubes Thermo Scientific 50001012 Plasticware
Dharmacon CRISPR Design Tool Horizon Discovery Ltd. NA Freeware; website: horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer
DharmaFECT siRNA Transfection Reagent #2 Dharmacon, Inc. T-2002-02 Transfection reagent; LNCaP and PC3-ML cell lines
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Fisher  BP231100 Tisuue culture reagent
DMEM Medium with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate Corning MT10013CV Tisuue culture reagent; Media for PC3-ML cells
Doxycycline Hydrochloride, Ready Made Solution Sigma-Aldrich D3072-1ML CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 1 mg/mL stock in water
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190144 Tisuue culture reagent
Edit-R CRISPR-Cas9 Synthetic tracrRNA, 20 nmol, designed Dharmacon, Inc. U-002005-20 CRISPR reagent; Universal tracrRNA oligonucleotides
Edit-R Modified Synthetic crRNA,
desalted/deprotected, 2 nmol		 Dharmacon, Inc. crRNA-460XXX CRISPR reagent; Designed crRNA oligonucleotides
EditR Inducible Lentiviral hEF1aBlastCas9 Nuclease Particles, 50 μL, 107 TU/mL Dharmacon, Inc. VCAS11227 CRISPR reagent; Lenti-iCas9; Doxycycline-inducible lentiviral Streptococcus pyogenes Cas9 vector system
Ensembl genomic viewer Ensembl NA Freeware; website: [ensembl.org] Use: Genome browser to identify a nucleotide seuqnces containing the miRNA cluster and surrounding gene/regulatory sequences.
GAPDH Antibody (FL-335), rabbit polyclonal Santa Cruz Biotechnology sc25778 Western blot reagent; 37 kDa; dilution 1:500
Gel/PCR DNA Fragment Extraction Kit IBI Scientific IB47010 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Gibco Fetal Bovine Serum, certified Gibco 16000044 Tisuue culture reagent
Hexadimethrine bromide MilliporeSigma H9268 CRISPR reagent; Chemical, Working stock = 0.8 mg/mL
Immobilon-FL PVDF Membrane MilliporeSigma IPFL10100 Western blot reagent; nitrocellulose
Intercept (TBS) Blocking Buffer LI-COR 927-60001 Western blot reagent
IRDye 680RD Goat anti-Mouse IgG Secondary Antibody LI-COR 926-68070 Western blot reagent
IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody LI-COR 926-32211 Western blot reagent
Microcentrifuge Eppendorf  5425 R Plasticware
miRBase microRNA viewer miRBase NA Freeware; website: [mirbase.org] Use: Borowser lists all annotated miRNA hairpins, mature miRNA sequences and associated clustered miRNAs mapping within 10 kb.
NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 10-well Invitrogen NP0321BOX Western blot reagent
Odyssey CLx Imaging System LI-COR CLx Equipment; Western blot imaging
Opti-MEM Reduced Serum Medium Gibco 31985062 Transfection reagent
Owl D2 Wide-Gel Electrophoresis System Owl D2-BP Equipment; Nucleic acid gel electrophoresis system
PCR Primers, designed (single-stranded DNA oligonucleotides) Integrated DNA Technology NA PCR reagent, genotyping
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) Thermo Scientific F530S PCR reagent, genotyping
RIPA Lysis Buffer 10x MilliporeSigma 20-188 Western blot reagent
Proteinase K Solution (20 mg/mL), RNA grade Invitrogen 25530049 PCR reagent, genotyping
RNase A, DNase and protease-free (10 mg/mL) Thermo Scientific EN0531 PCR reagent, genotyping
RPMI 1640 Medium Gibco MT10041CV Tisuue culture reagent; Media for LNCaP cells
SnapGene Viewer Snap Gene NA Freeware; website: [snapgene.com] Use: DNA sequence annotation software program to create a DNA file for gRNA design and which  highlights the miRNA cluster locus (intergenic, intronic), each individual miRNA hairpin sequence belonging to the miRNA cluster, and other nearby coding and non-coding genes and/or regulatory features
TrypLE Select Enzyme (1x), no phenol red Gibco 12563029 Tisuue culture reagent; Recombinant trypsin
UltraPure Agarose Invitrogen 16500100 Nucleic acid gel electrophoresis reagent
Veriti 96-Well Fast Thermal Cycler ThermoFisher Scientific 4375305 Equipment
XCell SureLock Mini-Cell Electrophoresis System Invitrogen EI0001 Equipment; Protein gel electrophoresis system

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hasegawa, T., Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Translating MicroRNAs to the Clinic. Laurence, J. , Academic Press. 329-369 (2017).
  2. Lewis, H., Esquela-Kerscher, A. Systems Biology of Cancer. Thiagalingam, S. , Cambridge University Press. Ch. 9 134-153 (2015).
  3. Esquela-Kerscher, A., Slack, F. J. Oncomirs - microRNAs with a role in cancer. Nature Reviews Cancer. 6 (4), 259-269 (2006).
  4. Breving, K., Esquela-Kerscher, A. The complexities of microRNA regulation: mirandering around the rules. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 42 (8), 1316-1329 (2010).
  5. Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucleic Acids Research. 36, Database issue 154-158 (2008).
  6. Kabekkodu, S. P., et al. Clustered miRNAs and their role in biological functions and diseases. Biological Reviews. 93 (4), 1955-1986 (2018).
  7. Xiang, J., Wu, J. Feud or friend? The role of the miR-17-92 cluster in tumorigenesis. Current Genomics. 11 (2), 129-135 (2010).
  8. Aqeilan, R. I., Calin, G. A., Croce, C. M. miR-15a and miR-16-1 in cancer: discovery, function and future perspectives. Cell Death & Differentiation. 17 (2), 215-220 (2010).
  9. Hasegawa, T., et al. Characterization and evidence of the miR-888 cluster as a novel cancer network in prostate. Molecular Cancer Research. , (2018).
  10. Lewis, H., et al. miR-888 is an expressed prostatic secretions-derived microRNA that promotes prostate cell growth and migration. Cell Cycle. 13 (2), 227-239 (2014).
  11. Xu, J., et al. Evidence for a prostate cancer susceptibility locus on the X chromosome. Nature Genetics. 20 (2), 175-179 (1998).
  12. Schleutker, J., et al. A genetic epidemiological study of hereditary prostate cancer (HPC) in Finland: frequent HPCX linkage in families with late-onset disease. Clinical Cancer Research. 6 (12), 4810-4815 (2000).
  13. Farnham, J. M., Camp, N. J., Swensen, J., Tavtigian, S. V., Albright, L. A. Confirmation of the HPCX prostate cancer predisposition locus in large Utah prostate cancer pedigrees. Human Genetics. 116 (3), 179-185 (2005).
  14. Brown, W. M., et al. Hereditary prostate cancer in African American families: linkage analysis using markers that map to five candidate susceptibility loci. British Journal Of Cancer. 90 (2), 510-514 (2004).
  15. Bochum, S., et al. Confirmation of the prostate cancer susceptibility locus HPCX in a set of 104 German prostate cancer families. Prostate. 52 (1), 12-19 (2002).
  16. Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
  17. Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), (2018).
  18. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  19. SnapGene® software (from Insightful Science; available at snapgene.com). , Available from: https://www.snapgene.com (2022).
  20. Ensembl Release 104 genome browser (from EMBL-EBI). , Available from: https://www.ensembl.org (2022).
  21. Howe, K. L., et al. Ensembl 2021. Nucleic Acids Research. 49, 884-891 (2021).
  22. miRBase: the microRNA database, Release 22.1 (from Griffiths-Jones laboratory). , Available from: https://www.mirbase.org (2022).
  23. Dharmacon CRISPR Design Tool (from Dharmacon). , Available from: https://www.horizondiscovery.com/en/ordering-and-calculation-tools/crispr-dna-region-designer (2022).
  24. Tools for Guide Design and Off-Target Prediction (MIT CRISPR Design Tool from the Zhang Lab). , Available from: http://crispr.mit.edu (2022).
  25. Sangsu Bae, J. P., Kim, J. -S. Cas-OFFinder (from Sangsu Bae, Jeongbin Park, Jin-Soo Kim). , Available from: http://www.rgenome.net/cas-offinder/ (2022).
  26. Off-Spotter (Venetia Pliatsika & Isidore Rigoutsos of the Jefferson Computational Medicine Center). , Available from: https://cm.jefferson.edu/Off-Spotter/ (2022).
  27. Bao, X. R., Pan, Y., Lee, C. M., Davis, T. H., Bao, G. Tools for experimental and computational analyses of off-target editing by programmable nucleases. Nature Protocols. 16 (1), 10-26 (2021).
  28. Dharmacon DharmaFECT Transfection Reagent Cell Type Guide. Choose Dharmacon DharmaFECT 1, 2, 3, or 4 for optimal transfection of siRNA or miRNA reagents. , Available from: https://horizondiscovery.com/-/media-Files/Horizon/resources/Selection-guides/dharmafect-cell-type-guidelines.pdf (2022).
  29. Baffoe-Bonnie, A. B., et al. A major locus for hereditary prostate cancer in Finland: localization by linkage disequilibrium of a haplotype in the HPCX region. Human Genetics. 117 (4), 307-316 (2005).
  30. Zhang, R., Peng, Y., Wang, W., Su, B. Rapid evolution of an X-linked microRNA cluster in primates. Genome Research. 17 (5), 612-617 (2007).
  31. Ohnuki, Y., Marnell, M. M., Babcock, M. S., Lechner, J. F., Kaighn, M. E. Chromosomal analysis of human prostatic adenocarcinoma cell lines. Cancer Research. 40 (3), 524-534 (1980).
  32. Beheshti, B., Karaskova, J., Park, P. C., Squire, J. A., Beatty, B. G. Identification of a high frequency of chromosomal rearrangements in the centromeric regions of prostate cancer cell lines by sequential giemsa banding and spectral karyotyping. Molecular Diagnosis. 5 (1), 23-32 (2000).

Tags

Biologi udgave 182 CRISPR inducerbar Cas9 microRNA knockout miR-888 klynge
CRISPR-genredigeringsværktøj til analyse af mikroRNA-klynger
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chambers, C., Quan, L., Yi, G.,… More

Chambers, C., Quan, L., Yi, G., Esquela-Kerscher, A. CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63704, doi:10.3791/63704 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter