Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لكسر عمود عظم الفخذ من فئران Wistar albino ومتابعة تطور الكالس. يمكن أن يساعد نموذج قطع عظم الفخذ هذا الباحثين في تقييم عملية التئام الكسور ودراسة كيفية تأثير الدواء على التئام الكسور.
Abstract
التئام الكسور هو عملية فسيولوجية تؤدي إلى تجديد عيوب العظام من خلال العمل المنسق لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم. الأدوية الابتنائية العظمية لديها القدرة على زيادة إصلاح الكسور ولكن لها قيود مثل التكاليف المرتفعة أو الآثار الجانبية غير المرغوب فيها. يمكن تحديد إمكانات شفاء العظام للدواء في البداية من خلال الدراسات المختبرية ، ولكن هناك حاجة إلى دراسات في الجسم الحي للإثبات النهائي للمفهوم. كان هدفنا هو تطوير نموذج للقوارض العظمية لعظم الفخذ يمكن أن يساعد الباحثين على فهم تطور تكوين الكالس بعد كسر عمود عظم الفخذ ويمكن أن يساعد في تحديد ما إذا كان الدواء المحتمل له خصائص شفاء العظام. تم استخدام ذكور الفئران البيضاء Wistar albino البالغة بعد تصريح لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية. تم تخدير القوارض ، وفي ظل ظروف معقمة ، تم إنشاء كسور عرضية كاملة في الثلث الأوسط من مهاوي عظم الفخذ باستخدام قطع العظم المفتوح. تم تقليل الكسور وإصلاحها داخليا باستخدام أسلاك K داخل النخاع ، وسمح بحدوث التئام الكسور الثانوية. بعد الجراحة ، تم إعطاء المسكنات داخل الصفاق والمضادات الحيوية لمدة 5 أيام. الأشعة السينية الأسبوعية المتسلسلة تقييم تشكيل الكالس. تم التضحية بالفئران بناء على نقاط زمنية محددة إشعاعيا مسبقا ، وتم تحليل تطور الكالس المكسور إشعاعيا وباستخدام الكيمياء المناعية.
Introduction
العظم هو نسيج ضام كثيف يتكون من الخلايا المكونة للعظام ، وبانيات العظم ، والخلايا الممتصة للعظام ، ناقضات العظم. التئام الكسور هو عملية فسيولوجية تؤدي إلى تجديد عيوب العظام من خلال العمل المنسق لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم1. عندما يكون هناك كسر ، فإن نشاط العظم العظمي والعظم العظمي في موقع الكسر هي بعض العوامل المهمة التي تحدد شفاء العظام2. عندما ينحرف التئام الكسر عن مساره الطبيعي ، فإنه يؤدي إلى تأخر الاتحاد أو سوء الاتحاد أو عدم الاتحاد. يقال إن الكسر يكون في حالة عدم الاتحاد عندما يكون هناك فشل في اتحاد الكسر لمدة 9 أشهر ، مع عدم وجود تقدم في الإصلاح في آخر 3 أشهر3. ما يقرب من 10٪ -15٪ من جميع الكسور تعاني من تأخير في الإصلاح قد يتطور إلى nonunion4. معدل عدم الاتحاد لجميع الكسور هو 5٪ -10٪ ويختلف باختلاف العظم المعني وموقع الكسر5.
يشتمل النظام الحالي لعلاج عدم اتحاد الكسور على طرائق جراحية و / أو طبية. في الوقت الحالي ، يمكن التغلب على الكسور المتأخرة أو غير المنتظمة عن طريق الاستراتيجيات الجراحية مثل تطعيم العظام. ومع ذلك ، فإن تطعيم العظام له حدوده ومضاعفاته مثل توافر أنسجة الكسب غير المشروع ، وألم موقع المتبرع ، والمراضة ، والعدوى6. يشمل العلاج الطبي أدوية الابتنائية العظمية مثل البروتين المورفولوجي العظمي (BMP) وتيريباراتيد (نظير هرمون البارات). عوامل الابتنائية العظمية المستخدمة حاليا لديها القدرة على زيادة إصلاح الكسور ولكن لها قيود مثل التكاليف الباهظة أو الآثار الجانبية غير المرغوب فيها7. وبالتالي ، هناك مجال لتحديد بدائل غير جراحية فعالة من حيث التكلفة لشفاء العظام. يمكن تحديد إمكانات شفاء العظام للدواء في البداية من خلال الدراسات المختبرية ، ولكن هناك حاجة إلى دراسات في الجسم الحي للإثبات النهائي للمفهوم. يجب تقييم الدواء المعروف بتعزيز التئام العظام في المختبر ، وإذا وجد واعدا ، يمكن استخدامه في دراسات النماذج الحيوانية في الجسم الحي . إذا أثبت الدواء أنه يعزز تكوين العظام وإعادة تشكيلها في النموذج الحي ، فيمكن أن ينتقل إلى المرحلة التالية (أي التجارب السريرية).
يعد تقييم التئام الكسور في الحيوانات خطوة منطقية إلى الأمام لتقييم عامل جديد تم تقديمه لشفاء العظام قبل أن يخضع لتجارب بشرية. بالنسبة لدراسات النموذج الحيواني في الجسم الحي لالتئام الكسور ، أصبحت القوارض نموذجاشائعا بشكل متزايد 8. ولدت نماذج القوارض اهتماما متزايدا بسبب انخفاض تكاليف التشغيل ، والحاجة المحدودة للمساحة ، والوقت الأقل اللازم لشفاء العظام9. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي القوارض على مجموعة واسعة من الأجسام المضادة والأهداف الجينية ، والتي تسمح بإجراء دراسات على الآليات الجزيئية لشفاء العظام وتجديدها10. سلط اجتماع توافقي الضوء بشكل شامل على العديد من نماذج شفاء عظام الحيوانات الصغيرة وركز على المعلمات المختلفة التي تؤثر على شفاء العظام ، بالإضافة إلى التأكيد على العديد من نماذج كسور الحيوانات الصغيرة والغرسات11.
يمكن تقسيم نماذج الكسر الأساسية على نطاق واسع إلى نماذج مفتوحة أو مغلقة. تستخدم نماذج الكسور المغلقة قوة ثني من ثلاث أو أربع نقاط على العظم ولا تتطلب نهجا جراحيا تقليديا. أنها تؤدي إلى كسور مائلة أو حلزونية ، تشبه كسور العظام الطويلة في البشر ، ولكن عدم توحيد موقع الكسر وأبعاده قد يكون بمثابة عامل مربك فيها12. تتطلب نماذج الكسور المفتوحة الوصول الجراحي لقطع العظم العظمي ، وتساعد على تحقيق نمط كسر أكثر اتساقا في موقع الكسر ، ولكنها ترتبط بتأخر الشفاء مقارنة بالنماذج المغلقة13. يبقى اختيار العظام المستخدمة لدراسة التئام الكسور بشكل أساسي الساق وعظم الفخذ نظرا لأبعادهما وإمكانية الوصول إليهما. عادة ما يكون اختيار موقع الكسر هو الحجاب الحاجز أو الميتافيزيس. يتم اختيار منطقة metaphyseal خصيصا في الحالات التي يتم فيها دراسة التئام الكسور في مواضيع هشاشة العظام ، حيث أن metaphysis أكثر تأثرا بهشاشة العظام14. يمكن استخدام العديد من الغرسات مثل المسامير داخل النخاع والمثبتات الخارجية لتثبيت الكسر11,15.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج بسيط وسهل المتابعة للقوارض يمكن أن يساعد الباحثين ليس فقط على فهم تطور الكالس بعد كسر عظم الفخذ ولكن يمكن أن يساعد في تحديد ما إذا كان الدواء المحتمل له خصائص شفاء العظام من خلال فهم الآلية التي يعمل بها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء التجارب على الحيوانات بعد الحصول على الموافقة الأخلاقية من لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية (IAEC) ، AIIMS ، نيودلهي ، الهند (286 / IAEC-1/2021).
1. إجراء ما قبل الجراحة
- منزل ذكور فئران Wistar albino من 6-8 أسابيع من العمر ، ويزن كل منها ما بين 150-200 غرام ، في مرفق الحيوانات المركزي (CAF) في أقفاص فردية منفصلة. هذا يضمن عدم وجود إصابة جراحية / كسر في الموقع عندما تشترك الفئران المتعددة في الأقفاص.
- حافظ على الفئران عند درجة حرارة 23 درجة مئوية ± 2 درجة مئوية في بيئة يتم التحكم فيها بالرطوبة مع رطوبة نسبية تبلغ 50٪ ± 5٪ ، وتعريضها لدورة مظلمة / خفيفة لمدة 12 ساعة ، وإعطاء ad libitum إمكانية الوصول إلى الطعام (النظام الغذائي شبه الاصطناعي القياسي): حمية بيليه (جافة) والماء. تكوين النظام الغذائي شبه الاصطناعي القياسي هو كما يلي: دقيق البنغال المحمص (60 ٪) ، دقيق القمح (22 ٪) ، الكازين (4 ٪) ، مسحوق الحليب الخالي من الدسم (5 ٪) ، الزيت المكرر (4 ٪) ، خليط الملح مع النشا (4.8 ٪) ، وخليط فيتامين الكولين مع النشا (0.2 ٪).
- تأقلم الفئران لمدة لا تقل عن 48 ساعة قبل الجراحة.
- قم بوزن كل فأر على ميزان رقمي ولاحظ الوزن.
- يتم تطبيق حقن سيفوروكسيم داخل الصفاق (100 ملغ/كغ من وزن الجسم)، ترامادول (25 ملغ/كغ من وزن الجسم)، ومزيج من الكيتامين (75 ملغ/كغ من وزن الجسم) مع زيلازين (10 ملغ/كغ من وزن الجسم) للفئران قبل 15 دقيقة من البدء بالعملية الجراحية. ضع مرهم العيون على كلتا العينين لمنع جفاف العين.
- قم بإزالة الشعر من الطرف السفلي الأيمن ، من منطقة الجناح حتى مفصل الركبة ، مع التطبيق الموضعي لكريم إزالة الشعر.
ملاحظة: يمكن جمع الدم (0.5 مل) من الوريد الخلفي لكل فأر لتحليل خط الأساس لمعلمات مختلفة. يمكن جمع الدم مرة أخرى كل 2 أسابيع بعد الجراحة.
2. إجراء جراحي لإنشاء كسر عرضي كامل من خلال قطع العظم المفتوح
ملاحظة: استخدم غرفة عمليات مخصصة مزودة بطاولة عمليات ودرجة حرارة محيطة مثالية (26 درجة مئوية) لتنفيذ الإجراء.
- ضع كتلة الشمع (صينية ألومنيوم 30 سم × 30 سم × 4 سم تحتوي على شمع حتى عمق 2.5 سم) على طاولة العمليات وقم بتغطيتها بستائر معقمة. تمنع كتلة الشمع أي تغيير في وضع الحيوان أثناء الجراحة.
- تأكيد بداية التخدير (عن طريق التحقق من فقدان قرصة إصبع القدم). ضع الجرذ المخدر على ستارة معقمة في الوضع الجانبي الأيسر. اطلب من أحد المساعدين أن يمسك الطرف السفلي الأيمن (الركبة والورك) في التمديد. احتفظ بدعامة صلبة معقمة (كتلة رخامية) أسفل الساق اليمنى لدعم عظم الفخذ. تنظيف موقع الجراحة مع الكحول والبيتادين.
- حقن التخدير الموضعي (0.25 مل من 1٪ lignocaine) في موقع الشق (الجانب الجانبي من الفخذ الأيمن) ، وقطع ثقب في ثنى معقم آخر ، وفضح فقط الساق اليمنى للفأر من خلاله لإجراء عملية جراحية.
- قم بإحداث شق عمودي للجلد بطول 1 سم على الجانب الجانبي من الفخذ الأيمن ، وقم بتمديده حسب الحاجة بشفرة جراحية رقم 15.
- كشف العضلة الوعائية الجانبية عن طريق فصل اللفافة العميقة باستخدام مقص Metzenbaum. قم بتقسيم الأوعية الدموية الجانبية بما يتماشى مع ألياف العضلات باستخدام ملقط الشريان حتى يتم الوصول إلى عمود عظم الفخذ.
- حرر العظم من العضلات المرتبطة به باستخدام مصعد السمحاق.
- حقن التخدير الموضعي (0.2 مل من 1٪ lignocaine) في وحول السمحاق لمنع المنعكس الوعائي المبهمي.
- قم بإنشاء مسافة بادئة في الثلث الأوسط من عمود عظم الفخذ باستخدام الشفرة الجراحية رقم 15 ، وكسر العظم في الثلث الأوسط من العمود (كسر كامل) عن طريق وضع إزميل على المسافة البادئة (بحيث لا ينزلق الإزميل) والنقر برفق على الإزميل بمطرقة. استخدم الدعامة الصلبة المعقمة (كتلة رخامية) لدعم العظم أثناء كسره لضمان كسر نظيف.
ملاحظة: عادة لا يسبب الدعم الصلب المعقم إصابة كبيرة للعضلات الموجودة تحته. - قم بإصلاح الكسر داخليا باستخدام سلك K معقم (1.0 مم) يتم تثبيته بمساعدة مثقاب طاقة يعمل بالبطارية. مرر السلك K إلى القناة النخاعية للجزء البعيد عبر موقع الكسر. بعد ذلك ، قم بحفر سلك K من خلال الطرف البعيد لعظم الفخذ باستخدام مثقاب الطاقة الذي يعمل بالبطارية.
ملاحظة: قم بتطهير سطح المثقاب الكهربائي بالكحول قبل الاستخدام. قم بتغيير القفازات بعد إصلاح سلك K. - بعد تقليل الكسر ، قم بدفع سلك K من الطرف البعيد إلى قناة الجزء القريب حتى يحصل على الشراء في منطقة المدور. اقطع الجزء البعيد من سلك K البارز عبر الجلد باستخدام قاطع الأسلاك.
- ثني طرف السلك K إلى حوالي 90 درجة باستخدام كماشة واستخدم ضمادة شاش مبللة في البيتادين لتضميد موقع الدبوس. يعمل السلك K كجبيرة داخل النخاع للحفاظ على الكسر في وضع منخفض.
- تأكد من الإرقاء الكامل قبل إغلاق الجلد باستخدام خياطة نايلون 3-0. الضغط على منطقة النزيف باستخدام شاش معقم أو ملقط شرياني لوقف أي نزيف.
- تنظيف الجرح مع betadine ، وتغطيته بشاش معقم وشريط لاصق micropore.
3. رعاية ما بعد الجراحة
- أعد الفئران إلى أقفاصها ، واسمح بالتنقل الطبيعي ، واستمر في إعطاء نظام غذائي شبه اصطناعي قياسي حتى التضحية بها ، وكذلك المضادات الحيوية (حقن سيفوروكسيم 100 مجم / كجم) والمسكنات (حقن ترامادول 25 مجم / كجم / يوم في جرعتين مقسمتين) داخل الصفاق لمدة 5 أيام بعد العملية.
ملاحظة: يمكن تقسيم الفئران إلى مجموعات علاج وتحكم لاختبار دواء معين. إذا كان الدواء قابلا للذوبان في الماء ، فيمكن إعطاؤه عن طريق الفم من خلال التزويج. يمكن ملاحظة وزن الحيوانات الفردية لحساب جرعة الدواء المراد استخدامها. يمكن اتباع معايير التضمين والاستبعاد لضمان تجانس المجموعات الحيوانية. - ضع الحيوانات في أقفاص فردية في ظل ظروف مماثلة لفترة ما قبل الجراحة. افحص موقع الجراحة كل يوم للبحث عن أي علامات لألم ما بعد الجراحة أو عدوى الجرح أو انزلاق الغرز أو أي تورم أو إزعاج في البطن.
- تقييم التئام العظام عن طريق الأشعة السينية للموقع المكسور مرة واحدة أسبوعيا.
4. الإجراء الإشعاعي
- قبل الأشعة السينية، تخدير الفئران بحقنة الكيتامين داخل الصفاق (50 مغ/كغ من وزن الجسم) والزيلازين (5 مغ/كغ من وزن الجسم).
- حافظ على مفصل الورك للفأر في وضع مرن ومختطف بينما يتم الاحتفاظ بمفصل الركبة شبه مرن لأخذ الأشعة السينية للطرف المكسور مع إعدادات التعرض التالية: المرجع kVp ≈ 62 ؛ المرجع mAS = 6.4 ؛ وإعدادات التعرض التلقائي (المرجع. مللي أمبير = 160).
ملاحظة: تم أخذ الأشعة السينية عند خط الأساس (1 يوم بعد الجراحة) ثم مرة واحدة أسبوعيا حتى التضحية أو 5 أسابيع.
5. القتل الرحيم للحيوانات واسترجاع الكالس
- التضحية بالفئران بجرعة زائدة من ثاني أكسيد الكربون (إدارة 100٪ CO2 بمعدل تدفق 7-8 لتر / دقيقة لمدة 1 دقيقة ، تليها فترة انتظار من 4-5 دقائق) ، في نقطتين زمنيتين محددتين مسبقا ، بناء على المظهر الإشعاعي للنسيج الناعم والصلب ، على التوالي.
- شق الجلد بالتوازي مع عظم الفخذ وافصل العضلات العلوية بعناية لتجنب تلف أنسجة الكالس.
- كسر العظم بين مفصل الورك وأنسجة الكالس باستخدام مطرقة وإزميل. وبالمثل ، كسر العظم بين الكالس ومفصل الركبة. قم بإزالة السلك K ونظف قطعة العظم في محلول ملحي لإزالة جلطات الدم والأنسجة الرخوة.
- انقل الكالس على الفور إلى حاوية تحمل علامة بها 10٪ فورمالين محايد (20 مل لكل عينة) واحتفظ به لمدة 3 أيام في درجة حرارة الغرفة (RT).
6. إزالة الكلس من العظام وأنسجة الكالس
- خذ نسيج الكالس من الفورمالين واحتفظ به في RT في محلول ETDA بنسبة 20٪ ، الرقم الهيدروجيني 7 ، لإزالة الكلس من الأنسجة العظمية.
- قم بتغيير محلول EDTA الطازج كل 2 أيام لمدة 3 أسابيع تقريبا ، وتحقق من إزالة الكلس العظمي عن طريق دس العظم بإبرة دون إزعاج أنسجة الكالس. يشار إلى إزالة الكلس المثلى بفقدان الإحساس الطبيعي بالرمل للأنسجة العظمية.
- بعد إزالة الكلس بالكامل ، قم بقطع القسم السهمي من الكالس وقم بإعداد كتل البارافين من أنسجة الكالس. قطع أقسام بسمك 4 ميكرومتر من أنسجة الكالس لعلم الأنسجة16 وأي تحليل مقارن آخر17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أجريت هذه الدراسة لتطوير نموذج قطع عظم الفخذ في فئران Wistar albino. يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم التئام العظام ، وكذلك التأثير العظمي لدواء ابتنائي عظمي واعد في التئام العظام. تم اتباع الاحتياطات والبروتوكولات الجراحية القياسية. تم استخدام العباءات المعقمة والستائر والمعدات الجراحية لهذا الإجراء (الشكل 1). تم تعقيم المعدات (الجدول 1) قبل 48 ساعة من الجراحة. تم استخدام التخدير والمسكنات والمضادات الحيوية وفقا للبروتوكول لضمان إبقاء الحيوانات خالية من الألم والعدوى في جميع الأوقات. يمكن جمع الدم (0.5 مل) من الوريد الخلفي لكل فأر لتحليل خط الأساس والمتابعة المقارنة الزمنية المتسلسلة لمعلمات مختلفة عند حدوث التئام الكسور. تمت إزالة الشعر من منطقة الخاصرة إلى منطقة الركبة باستخدام كريم إزالة الشعر (الشكل 2). استغرق إجراء قطع العظم حوالي 10 دقائق لإكماله (من الشق الأول إلى الخياطة). كانت العدوى والوفيات ضئيلة عند اتباع الاحتياطات المعقمة. تم إجراء شق بعد التخدير الموضعي (lignocaine) ، وتم الكشف عن عمود عظم الفخذ بعد سحب ألياف الأوعية الدموية الجانبية (الشكل 3). تم إنشاء مسافة بادئة (أخدود) في العظم باستخدام شفرة جراحية لضمان عدم انزلاق الإزميل. تم استخدام دعامة صلبة معقمة (كتلة رخامية) لدعم العظم أثناء كسره لضمان كسر نظيف (الشكل 1). تم إحداث كسر عرضي كامل في الثلث الأوسط من عمود عظم الفخذ باستخدام إزميل ومطرقة (الشكل 4).
تم إصلاح الكسر داخليا باستخدام سلك K معقم (1.0 مم). تم تمرير السلك K إلى القناة النخاعية للجزء البعيد من خلال موقع الكسر. ثم تم حفر سلك K من خلال الطرف البعيد لعظم الفخذ. تم تقليل الكسر ، ثم تم تقدم السلك K من الطرف البعيد إلى قناة الجزء القريب حتى حصل على شراء في منطقة المدور. تم قطع الجزء البعيد من سلك K الذي برز عبر الجلد. كان السلك K بمثابة جبيرة داخل النخاع للحفاظ على الكسر في وضع منخفض (الشكل 5).
تم أخذ الأشعة السينية للمنطقة المكسورة بعد 1 يوم من الجراحة وأسبوعيا بعد ذلك لتقييم مظهر الكالس (بداية التئام الكسر) وظهور الكالس الجسور (النقطة الأولى التي تلتئم فيها فجوة الكسر) ، كما تم تقييمها من قبل أخصائي الأشعة (الشكل 6). كانت نقطتان زمنيتان إشعاعيتان للتقييم المقارن لالتئام الكسور هما ظهور (تصور) الكالس (اللين) وظهور الكالس (الصلب).
بعد التضحية ، تم الحفاظ على عظم الفخذ بعناية في الفورمالين ، متبوعا ببروتوكول إزالة الكلس العظمي (الشكل 7). تمت إزالة سلك K أثناء التضحية ، مع الحرص على عدم إزعاج الكالس. بعد إزالة الكلس بالكامل ، تم تقطيع العظم إلى أقسام سهمية وحفظه في كتل البارافين للتقسيم (أقسام بسمك 4 ميكرومتر) عند الحاجة. أكد قسم ملطخ بالهيماتوكسيلين ويوزين من موقع الكسر والكالس الغضروف وتكوين عظام جديدة في نهاية 5 أسابيع (الشكل 8).
الشكل 1: أدوات جراحية معقمة محفوظة على الستارة الجراحية على طاولة العمليات. الجراح جاهز لبدء العملية الجراحية في بيئة معقمة بأدوات معقمة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الفئران المخدرة أبقى على طاولة العمليات. بعد إعطاء التخدير للفأر وإزالة الشعر حول موقع الشق ، يتم الاحتفاظ به على طاولة العمليات في وضع جانبي أيسر ، مما يعرض الساق اليمنى لقطع العظم. يتم استخدام ثنى جراحي آخر لتمرير الساق اليمنى من خلال ثقب في تلك الستارة لضمان تعرض الساق فقط ، وبالتالي تقليل التهابات الجروح. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: الإجراء الجراحي: تعرض عمود عظم الفخذ الفئران. أثناء قطع العظم ، بعد تعرض الأوعية الدموية الجانبية ، يتم تقسيمها بما يتماشى مع ألياف العضلات لكشف عمود عظم الفخذ. يتم تحرير العظم من العضلات المرفقة باستخدام المصعد السمحاق. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 4: تكوين بضع عظم عرضي كامل في الثلث الأوسط من عمود عظم الفخذ باستخدام إزميل ومطرقة. يتم إنشاء كسر عرضي كامل في الثلث الأوسط من عمود عظم الفخذ عن طريق النقر بلطف على الإزميل بالمطرقة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 5: يعمل السلك K كجبيرة داخل النخاع للحفاظ على الكسر في وضع منخفض. يتم تمرير السلك K إلى القناة النخاعية للجزء البعيد من خلال موقع الكسر. ثم يتم حفر سلك K من خلال الطرف البعيد لعظم الفخذ. يتم تقليل الكسر ثم يتم دفع سلك K من الطرف البعيد إلى قناة الجزء القريب حتى يتم شراؤه في منطقة المدور. يتم ذلك باستخدام مثقاب طاقة يعمل بالبطارية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 6: الأشعة السينية لعظم الفخذ للفأر مع وجود السلك K في الموقع . (أ) قبل إحداث الكسر و (ب) 1 يوم بعد الجراحة. تتم مراقبة التئام الكسر إشعاعيا عن طريق أخذ أشعة سينية أسبوعية متسلسلة للموقع الذي تم تشغيله لتقييم تكوين الكالس إشعاعيا. يبقى الكسر منخفضا وثابتا باستخدام سلك K داخل النخاع. البيانات التمثيلية قبل وبعد ليست من نفس الحيوان. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 7: العظام مع الكالس (بعد إزالة الكلس الأمثل) التي تم الحصول عليها بعد التضحية بالحيوان في نقطة زمنية محددة مسبقا. (أ) الكالس السليم؛ ب: المقطع السهمي من الكالس. بعد التضحية بالحيوان ، يتم الحصول على منطقة موقع الكسر والحفاظ عليها وإزالة الكلس منها باستخدام المنهجية الموصوفة. يتم تقييم الكالس بشكل متقطع لضمان إزالة الكلس المثلى قبل تقييمه بأي تقنيات أخرى (مقياس مرجعي بالسنتيمتر). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 8: مقطع ملطخ بالهيماتوكسيلين ويوزين من موقع الكسر يظهر الكالس الصلب مع تكوين الغضروف والعظام الجديدة. (أ) تكبير منخفض؛ (ب) التكبير العالي. تظهر الأجزاء الملطخة بالهيماتوكسيلين واليوزين من موقع الكسر الكالس الصلب مع تكوين الغضروف (السهام السوداء) والعظام الجديدة (الأسهم الصفراء) (A: 40x ؛ ب: 100x). يوضح السهم الأزرق نهاية كسر العظم، ويوضح السهم الأحمر المنطقة القشرية الثانية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تصف هذه الطريقة بوضوح التفاصيل اللازمة لتطوير نموذج قطع العظم للكسر في فئران Wistar albino. يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم التأثير العظمي لدواء ابتنائية عظمي واعد في التئام الكسور ، وكذلك فهم تعقيدات التئام العظام. الميزة البارزة لهذه الطريقة هي أنها بسيطة ولا تحتاج إلى الكثير من الوقت أو المعدات المتطورة. في هذه الطريقة ، تم اختيار ذكور الفئران البيضاء Wistar البالغة كنموذج للقوارض للتجارب. تم اختيار الجنس الموحد لإزالة أي عامل مربك على شفاء العظام المتعلق بالهرمونات الجنسية.
اتبعت هذه الدراسة إجراء قطع العظم المفتوح ، والذي يشبه الإجراء الذي تتبعه المجموعات الأخرى ، بالإضافة إلى نماذج الحيوانات الصغيرة الأخرى11،18،19. ميزة قطع العظم المفتوح المتبع في هذه الطريقة على نماذج شفاء العظام الأخرى هي أن الإصابة الناجمة (كسر العظم القشري الكامل) يشبه كسر عظمي طويل منتظم ، ويشبه التئام الكسر في هذه الطريقة كسر منتظم ، حيث يوجد شفاء عظمي ثانوي (تعظم غضروفي) عن طريق تكوين الكالس ، مقارنة بإصابة عظم ثقب الحفر ، حيث يوجد شفاء عظمي أولي (تعظم داخل الغشاء)20. طريقة قطع العظم المفتوح هي أيضا أفضل من العظم المغلق أو الطريقة التي تحفز الضغط بثلاث نقاط ، حيث توجد إمكانية لتحطيم العظام وتباين واسع في خط الكسر ، مما يؤدي إلى الاختلاف في التئام الكسور21. يزيد قطع العظم المفتوح من فرصة الإصابة بعدوى الجرح مقارنة بقطع العظم المغلق ، ولكن ، على غرار الدراسات الأخرى ، لاحظنا أنه مع الاحتياطات المناسبة ، كانت عدوى الجرح ضئيلة22. وقد لوحظ أيضا في هذه المنهجية أن إنشاء أخدود (مسافة بادئة) على العظم بشفرة قبل كسره بإزميل ومطرقة عمل على إنشاء خط كسر موحد وتجنب انزلاق الإزميل على العظم. تعديل آخر أدخلناه في هذه الطريقة هو الحفاظ على كتلة صلبة ومعقمة أسفل العظم المراد كسرها. لم يوفر هذا قوة مضادة أثناء إنشاء الكسر فحسب ، بل ساعد أيضا في تجنب التحطم أو التكسير أو خط الكسر غير المنتظم. هذا عادة لا يسبب أي إصابة كبيرة للعضلات تحتها.
استخدمت دراستنا الأشعة السينية لتحديد النقاط الزمنية للتضحية بناء على المظهر الإشعاعي للكالس كنقطة زمنية أولى وظهور الكالس (الصلب) كنقطة زمنية ثانية في الحيوانات قبل بدء التجربة الكاملة. يجب التضحية بالمجموعة المقارنة بأكملها من الحيوانات عندما تصل أي مجموعة علاج أو مجموعة تحكم إلى نقطة زمنية معينة لمقارنة النسيج باستخدام التحليل الكيميائي المناعي لعلامات العظم العظمي والعظمي. سيضمن ذلك مقارنة غير متحيزة بين مجموعات العلاج والمراقبة المختلفة. يجب إجراء الأشعة السينية للموقع المكسور للفئران على فترات أسبوعية ، ويجب أخذ عينات الدم (الوريد الذيل) على فترات أسبوعية 2 حتى تصل إلى النقاط الزمنية المعنية للتضحية. تم إجراء الأشعة السينية الأسبوعية (تحت التخدير) لتقييم تكوين الكالس من قبل أخصائي الأشعة (الذي أعمى عن مجموعات التحكم والعلاج). ساعدت الأشعة السينية أيضا في إثبات وتأكيد المعلمات البيولوجية لشفاء العظام.
تتضمن هذه الطريقة تطبيق سلك K كجبيرة داخل النخاع للحفاظ على الكسر ثابتا في وضع منخفض. ومع ذلك ، فإن تثبيت الدبوس داخل النخاع لا يوفر ثباتا مطلقا للكسر ، كما هو الحال مع الطلاء والمثبتات الخارجية ، وقد يترافق في بعض الأحيان مع مضاعفات مثل عدوى الجرح ، وهجرة الدبوس ، وانثقاب قشرة عمود الفخذ ، وما إلى ذلك. تشير دراستنا أيضا إلى أنه من الأفضل حقن اللجنوكايين في السمحاق وحوله ، وهو حساس للغاية للألم. هذا يمنع الألم الشديد وإمكانية حدوث صدمة عصبية أثناء قطع العظم. ولوحظ أيضا أن الحفاظ على حجم الحقن داخل الصفاق منخفض ساعد في تقليل الضائقة التنفسية اللاحقة في الفئران. استمرت المسكنات والمضادات الحيوية لمدة 5 أيام بعد الجراحة لمنع أي ألم أو عدوى. في هذه الدراسة ، تم اختيار عظم الفخذ لإحداث كسر حيث كان من السهل الوصول إليه ، ومن السهل كسره بشكل نظيف ، وبسبب محيطه المستقيم ، وهو أسهل لإدخال سلك K. يجب توخي الحذر عند تقدم سلك K في الجزء القريب من عظم الفخذ ، حيث يوجد خطر حدوث نزيف عن طريق إصابة الشريان الفخذي. وقد لوحظ أن الفئران تميل إلى سحب سلك K إذا ترك الكثير من الأسلاك المتبقية بارزة من الجلد.
معلمات نتائج شفاء العظام هي علامات عظمية وعظمية في الدم والكالس للحيوانات (من مجموعات مختلفة ونقاط زمنية مختلفة). بالنسبة لعلامات بانيات العظم ، يمكن اختيار أوستيوكالسين ، Col1A1 ، RANKL ، P1NP ، والفوسفاتيز القلوي الخاص بالعظام ، بينما يمكن تقييم CTX و RANK لتقييم نشاط العظم. يمكن تقييم بعض هذه المعلمات في المصل ، بينما يمكن تقييم البعض الآخر عن طريق الكيمياء المناعية في أنسجة الكالس. تعطي هذه المعلمات نظرة شاملة لإعادة تشكيل العظام من خلال تقييم نشاط بانيات العظم والعظم في وقت واحد.
الحد من هذه الدراسة هو أنها لا تقيم قوة الشد من الكالس. من الناحية المثالية ، تضيف الدراسات الميكانيكية الحيوية قيمة إلى البيانات. يجب توخي الحذر أثناء معالجة الكالس والأنسجة العظمية المجاورة لإزالة الكلس ، لأن إزالة الكلس غير الكاملة لن تعطي نتائج مثالية في الكيمياء المناعية.
سيكون هذا البروتوكول لتقييم التئام الكسور باستخدام نموذج القوارض مفيدا لجميع المجموعات التي تحاول تقييم الأدوية الواعدة ذات النشاط العظمي. إنه نموذج بسيط لتقييم التئام العظام والكسور بدقة في نموذج القوارض أثناء تقييم نشاط الأرومات العظمية والعظمية وإعادة تشكيل العظام ، والتي تعطي رؤى ميكانيكية مفيدة. إذا كانت الموارد والخدمات اللوجستية التي تدور حول عدد الحيوانات مسموح بها ، فيمكن أيضا تعزيز المؤشرات البيولوجية من خلال التقييم الإشعاعي لالتئام الكسور ، وكذلك مقارنة قوة الشد ، التي تقيم القامة الميكانيكية للعظم الملتئم. تفضل الدراسات التي توضح آلية العمل على الدراسات القائمة على الملاحظة البحتة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح أو أي إفصاحات مالية أخرى.
Acknowledgments
يود المؤلفون أن يشكروا المجلس المركزي للبحوث في المعالجة المثلية (CCRH) ، وزارة AYUSH ، حكومة الهند ، على تمويل البحوث. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمساعدة ودعم مرفق الحيوان المركزي ، AIIMS ، نيودلهي ، لمساعدتهم ودعمهم في التجارب على الحيوانات و CMET ، AIIMS ، نيودلهي ، لمساعدتهم ودعمهم في التصوير الفوتوغرافي والفيديو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
