Summary
Burada, Wistar albino sıçanlarının femurunun şaftını iyatrojenik olarak kırmak ve nasır gelişimini takip etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu femur osteotomi modeli, araştırmacıların kırık iyileşme sürecini değerlendirmelerine ve bir ilacın kırık iyileşmesini nasıl etkileyebileceğini incelemelerine yardımcı olabilir.
Abstract
Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir. Osteoanabolik ilaçlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak yüksek maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Amacımız, araştırmacıların femur şaftının kırılmasını takiben nasır oluşumunun gelişimini anlamalarına yardımcı olabilecek ve potansiyel bir ilacın kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek bir femur osteotomi kemirgen modeli geliştirmekti. Yetişkin erkek Wistar albino sıçanları, Kurumsal Hayvan Etik Kurulu izninden sonra kullanıldı. Kemirgenler anestezi altına alındı ve aseptik koşullar altında, açık osteotomi kullanılarak femurların şaftlarının ortada üçte birinde tam enine kırıklar oluşturuldu. Kırıklar intramedüller K-teller kullanılarak azaltıldı ve internal olarak sabitlendi ve sekonder kırık iyileşmesinin gerçekleşmesine izin verildi. Ameliyattan sonra 5 gün boyunca intraperitoneal analjezikler ve antibiyotikler verildi. Sıralı haftalık röntgenler nasır oluşumunu değerlendirdi. Sıçanlar radyolojik olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarına göre kurban edildi ve kırık nasır gelişimi radyolojik olarak ve immünohistokimya kullanılarak analiz edildi.
Introduction
Kemik, kemik oluşturan hücrelerden, osteoblastlardan ve kemik emici hücrelerden, osteoklastlardan oluşan yoğun bir bağ dokusudur. Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir1. Kırık olduğunda, kırık bölgesinde osteoblastik ve osteoklastik aktivite kemik iyileşmesini belirleyen önemli faktörlerden bazılarıdır2. Kırık iyileşmesi normal seyrinden saptığında, gecikmiş bir birleşme, malunion veya birleşmeme ile sonuçlanır. 9 ay boyunca kırığın birleşme başarısızlığı olduğunda, son 3 ay içinde onarımın ilerlemesi olmadan bir kırığın birleşmediği söylenir3. Tüm kırıkların yaklaşık %10-15'inde nonunion 4'e kadar ilerleyebilecek bir onarım gecikmesiyaşanır. Tüm kırıklarda birleşmeme oranı %5-%10'dur ve tutulan kemiğe ve kırık bölgesine bağlı olarak değişir5.
Kırık kaynamamasının tedavisinde mevcut rejim cerrahi ve/veya tıbbi modaliteleri içermektedir. Şu anda, gecikmiş veya kırıkların birleşmemesi, kemik grefti gibi cerrahi stratejilerle aşılabilir. Bununla birlikte, kemik greftlemenin greft dokusunun mevcudiyeti, donör bölge ağrısı, morbidite ve enfeksiyon gibi sınırlamaları ve komplikasyonları vardır6. Tıbbi tedavi, kemik morfogenetik proteini (BMP) ve teriparatid (parathormon analogu) gibi osteoanabolik ilaçları içerir. Şu anda kullanılan osteoanabolik ajanlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak fahiş maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir7. Bu nedenle, kemik iyileşmesi için uygun maliyetli, cerrahi olmayan alternatifleri belirleme kapsamı vardır. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Kemik iyileşmesini arttırdığı bilinen bir ilaç in vitro olarak değerlendirilmeli ve umut verici bulunursa in vivo hayvan modeli çalışmaları için kullanılabilir. İlaç in vivo modelde kemik oluşumunu ve yeniden şekillenmesini teşvik ettiğini kanıtlarsa, bir sonraki aşamaya (yani klinik çalışmalara) geçebilir.
Hayvanlarda kırık iyileşmesini değerlendirmek, insan denemelerinden geçmeden önce kemik iyileşmesi için tanıtılan yeni bir ajanı değerlendirmek için ileriye doğru atılmış mantıklı bir adımdır. Kırık iyileşmesi ile ilgili in vivo hayvan modeli çalışmaları için, kemirgenler giderek daha popüler bir model haline gelmiştir8. Kemirgen modelleri, düşük işletme maliyetleri, sınırlı alan ihtiyacı ve kemik iyileşmesi için daha az zaman harcanması nedeniyle artan ilgi yaratmıştır9. Ek olarak, kemirgenler, kemik iyileşmesi ve yenilenmesinin moleküler mekanizmaları üzerine çalışmalara izin veren geniş bir antikor ve gen hedefleri spektrumuna sahiptir10. Bir fikir birliği toplantısı, çeşitli küçük hayvan kemik iyileştirme modellerini kapsamlı bir şekilde vurguladı ve kemik iyileşmesini etkileyen farklı parametrelere odaklandı, ayrıca birkaç küçük hayvan kırığı modeli ve implantı vurguladı11.
Temel kırılma modelleri genel olarak açık veya kapalı modellere ayrılabilir. Kapalı kırık modelleri, kemik üzerinde üç veya dört noktalı bir bükme kuvveti kullanır ve geleneksel bir cerrahi yaklaşım gerektirmez. İnsanlarda uzun kemik kırıklarına benzeyen eğik veya spiral kırıklara yol açarlar, ancak kırık yerinin ve boyutlarının standardizasyonunun olmaması bunlarda kafa karıştırıcı bir faktör olarak hareket edebilir12. Açık kırık modelleri, kemiğin osteotomisi için cerrahi erişim gerektirir, kırık bölgesinde daha tutarlı bir kırık paterni elde edilmesine yardımcı olur, ancak kapalı modellere kıyasla gecikmiş iyileşme ile ilişkilidir13. Kırık iyileşmesini incelemek için kullanılan kemik seçimi, boyutları ve erişilebilirlikleri nedeniyle esas olarak tibia ve femur olarak kalır. Kırık yerinin seçimi genellikle diyafiz veya metafizdir. Metafiz bölgesi, osteoporotik deneklerde kırık iyileşmesinin çalışıldığı durumlarda özel olarak seçilir, çünkü metafiz osteoporozdan daha fazla etkilenir14. İntramedüller pimler ve eksternal fiksatörler gibi çeşitli implantlar kırık 11,15'i stabilize etmek için kullanılabilir.
Bu çalışmanın amacı, araştırmacıların sadece femur kırığını takiben nasır gelişimini anlamalarına yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda potansiyel bir ilacın hareket ettiği mekanizmayı anlayarak kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek basit ve takip edilmesi kolay bir kemirgen modeli geliştirmekti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi (IAEC), AIIMS, Yeni Delhi, Hindistan'dan (286/IAEC-1/2021) etik onay alındıktan sonra yapılmıştır.
1. Preoperatif prosedür
- Ev erkek Wistar albino sıçanları, her biri 150-200 g ağırlığında, ayrı ayrı kafeslerde bir Merkezi Hayvan Tesisi'nde (CAF) 6-8 haftalıktır. Bu, birden fazla sıçan kafesleri paylaştığında cerrahi / kırık bölgesi yaralanması olmamasını sağlar.
- Sıçanları% 50 ±% 5 bağıl neme sahip nem kontrollü bir ortamda 23 ° C ± 2 ° C sıcaklıkta tutun, 12 saatlik karanlık / açık döngüye maruz bırakın ve gıdaya (standart yarı sentetik diyet) ad libitum erişimi verin: pelet diyeti (kuru) ve su. Standart yarı sentetik diyetin bileşimi aşağıdaki gibidir: kavrulmuş Bengal gram unu (% 60), buğday unu (% 22), kazein (% 4), yağsız süt tozu (% 5), rafine yağ (% 4), nişasta ile tuz karışımı (% 4.8) ve nişasta ile vitamin kolin karışımı (% 0.2).
- Sıçanları ameliyattan önce en az 48 saatlik bir süre boyunca iklimlendirin.
- Her sıçanı dijital bir tartım terazisinde tartın ve ağırlığı not edin.
- Cerrahi işleme başlamadan 15 dakika önce sıçanlara intraperitoneal (IP) sefuroksim (100 mg / kg vücut ağırlığı), tramadol (25 mg / kg vücut ağırlığı) ve ketamin (75 mg / kg vücut ağırlığı) ile ksilazin (10 mg / kg vücut ağırlığı) kombinasyonu enjeksiyonları uygulayın. Göz kuruluğunu önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın.
- Saçları sağ alt ekstremiteden, yan bölgeden diz eklemine kadar, topikal bir epilasyon kremi uygulamasıyla çıkarın.
NOT: Farklı parametrelerin temel analizi için her sıçanın kuyruk damarından kan (0,5 mL) toplanabilir. Ameliyattan sonra her 2 haftada bir tekrar kan toplanabilir.
2. Açık osteotomi yoluyla tam transvers kırık oluşturmak için cerrahi prosedür
NOT: İşlemi gerçekleştirmek için ameliyat masası ve optimum ortam sıcaklığı (26 °C) ile belirlenmiş bir ameliyathane kullanın.
- Balmumu bloğunu (2,5 cm derinliğe kadar balmumu içeren 30 cm x 30 cm x 4 cm'lik alüminyum tepsi) ameliyat masasına yerleştirin ve steril örtülerle örtün. Balmumu bloğu, ameliyat sırasında hayvanın pozisyonunda herhangi bir değişikliği önler.
- Anestezinin başlangıcını onaylayın (ayak parmağı sıkışma kaybını kontrol ederek). Anestezi uygulanan sıçanı sol lateral pozisyonda steril bir örtü üzerine yerleştirin. Bir asistandan sağ alt ekstremiteyi (diz ve kalça) uzatmada tutmasını isteyin. Femuru desteklemek için sağ bacağın altında steril sert bir destek (mermer blok) bulundurun. Cerrahi bölgeyi alkol ve betadin ile temizleyin.
- Kesi bölgesine (sağ uyluğun lateral yönü) lokal anestezi (0.25 mL% 1 lignokain) enjekte edin, başka bir steril örtüde bir delik açın ve ameliyat için sıçanın sadece sağ bacağını maruz bırakın.
- Sağ uyluğun lateral tarafına 1 cm'lik dikey bir deri kesisi verin ve 15 numaralı cerrahi bıçakla ihtiyaca göre uzatın.
- Metzenbaum makası kullanarak derin fasyayı ayırarak vastus lateralis kasını açığa çıkarın. Vastus lateralis'i, femur şaftına ulaşılana kadar arter forseps kullanarak kas lifleri doğrultusunda bölün.
- Kemiği, periosteal asansörü kullanarak ona bağlı kaslardan kurtarın.
- Vazovagal refleksi önlemek için periost içine ve çevresine lokal anestezi (0.2 mL% 1 lignokain) enjekte edin.
- No.15 cerrahi bıçağı kullanarak femur şaftının orta üçte birinde bir girinti oluşturun ve yapılan girintiye bir keski yerleştirerek (keski kaymasın diye) ve keskiye bir çekiçle hafifçe dokunarak şaftın orta-üçte birinde kemiği kırın (tam kırık). Temiz bir kırılma sağlamak için kemiği kırarken kemiği desteklemek için steril sert desteği (mermer blok) kullanın.
NOT: Steril sert destek genellikle altındaki kaslarda önemli bir yaralanmaya neden olmaz. - Pille çalışan bir elektrikli matkap yardımıyla tutulan steril bir K-teli (1,0 mm) kullanarak kırığı dahili olarak sabitleyin. K-telini kırık bölgesinden distal fragmanın medüller kanalına geçirin. Ardından, pille çalışan elektrikli matkabı kullanarak K-telini femur distal ucundan delin.
NOT: Kullanmadan önce elektrikli matkabın yüzeyini alkolle dezenfekte edin. K-teli sabitlendikten sonra eldivenleri değiştirin. - Kırığı indirgedikten sonra, K-telini distal uçtan proksimal parçanın kanalına doğru trokanterik bölgede satın alınana kadar ilerletin. Bir tel kesici kullanarak deriden çıkıntı yapan K-telinin distal kısmını kesin.
- Pense kullanarak K-telinin ucunu yaklaşık 90 ° 'ye bükün ve pim bölgesi pansumanı için betadin'e batırılmış bir gazlı bez bandajı kullanın. K-teli, kırığı azaltılmış bir konumda tutmak için intramedüller bir atel görevi görür.
- 3-0 naylon dikiş kullanarak cildi kapatmadan önce tam hemostaz sağlayın. Herhangi bir kanamayı durdurmak için steril gazlı bez veya arter forseps kullanarak kanama bölgesine baskı uygulayın.
- Yarayı betadin ile temizleyin ve steril gazlı bez ve mikrogözenek yapışkan bant ile örtün.
3. Postoperatif bakım
- Sıçanları kafeslerine geri döndürün, normal ambulasyona izin verin ve işlemden sonraki 5 gün boyunca intraperitoneal olarak antibiyotikler (enjeksiyon sefuroksim 100 mg / kg) ve analjezikler (enjeksiyon tramadol 25 mg / kg / gün) feda edilene kadar standart bir yarı sentetik diyet vermeye devam edin.
NOT: Sıçanlar, belirli bir ilacı test etmek için tedavi ve kontrol gruplarına ayrılabilir. İlaç suda çözünürse, gavage yoluyla oral olarak verilebilir. Kullanılacak ilacın dozunu hesaplamak için bireysel hayvanların ağırlığı not edilebilir. Hayvan gruplarının homojenliğini sağlamak için dahil etme ve dışlama kriterleri takip edilebilir. - Hayvanları ameliyat öncesi döneme benzer koşullar altında bireysel kafeslerde barındırın. Ameliyat sonrası ağrı, yara enfeksiyonu, dikişlerin kayması veya herhangi bir karın şişmesi veya rahatsızlığı belirtisi aramak için her gün cerrahi bölgeyi kontrol edin.
- Kemik iyileşmesini haftada bir kez kırık bölgenin röntgeni ile değerlendirin.
4. Radyolojik prosedür
- X-ışınından önce, sıçanları intraperitoneal ketamin (50 mg / kg vücut ağırlığı) ve ksilazin (5 mg / kg vücut ağırlığı) enjeksiyonu ile uyuşturun.
- Aşağıdaki maruz kalma ayarlarıyla kırık uzuvun röntgenini çekmek için diz eklemi yarı esnek tutulurken, sıçanın kalça eklemini bükülmüş ve kaçırılmış bir pozisyonda tutun: Ref. kVp ≈ 62; Referans mAS = 6.4; ve otomatik pozlama ayarları (Referans mA=160).
NOT: X-ışınları başlangıçta (ameliyattan 1 gün sonra) ve daha sonra kurban edilene veya 5 haftaya kadar haftada bir kez alındı.
5. Hayvan ötenazisi ve nasır alımı
- Sıçanları, sırasıyla yumuşak ve sert köprüleme nasırlarının radyolojik görünümüne dayanarak, daha önce belirlenmiş iki zaman noktasında, aşırı dozda karbondioksit (1 dakika boyunca 7-8 L / dak akış hızında% 100 CO2 uygulayın, ardından 4-5 dakikalık bir bekleme süresi uygulayın) feda edin.
- Cildi femura paralel olarak kesin ve nasır dokusuna zarar vermemek için üstteki kasları dikkatlice ayırın.
- Kalça eklemi ve nasır dokusu arasındaki kemiği çekiç ve keski kullanarak kırın. Benzer şekilde, nasır ve diz eklemi arasındaki kemiği kırın. K-telini çıkarın ve kan pıhtılarını ve yumuşak dokuyu çıkarmak için kemik parçasını tuzlu suda temizleyin.
- Nasırı hemen% 10 nötr tamponlu formalin (numune başına 20 mL) içeren etiketli bir kaba aktarın ve oda sıcaklığında (RT) 3 gün boyunca saklayın.
6. Kemik ve nasır dokusunun kireçlenmesi
- Nasır dokusunu formalinden alın ve kemik dokusunun dekalsifikasyonu için% 20 ETDA çözeltisinde, pH 7'de RT'de tutun.
- Yaklaşık 3 hafta boyunca her 2 günde bir taze EDTA solüsyonunu değiştirin ve nasır dokusunu rahatsız etmeden kemiği bir iğneyle dürterek kemik dekalsifikasyonunu kontrol edin. Optimal dekalsifikasyon, kemik dokusunun normal kumlu hissinin kaybı ile gösterilir.
- Tamamen kireçlenmeden sonra, nasırın sagital bölümünü kesin ve nasır dokusunun parafin bloklarını hazırlayın. Histopatolojik16 ve diğer karşılaştırmalı analizler17 için nasır dokusunun 4 μm kalınlığındaki kesitlerini kesin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu çalışma Wistar albino sıçanlarında femur osteotomi modeli geliştirmek amacıyla yapılmıştır. Bu model, kemik iyileşmesini ve umut verici bir osteoanabolik ilacın kemik iyileşmesinde osteojenik etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Standart cerrahi önlemler ve protokoller takip edildi. İşlem için steril önlükler, perdeler ve cerrahi ekipmanlar kullanıldı (Şekil 1). Ekipman (Tablo 1) ameliyattan 48 saat önce sterilize edildi. Hayvanların her zaman ağrısız ve enfeksiyonsuz tutulmasını sağlamak için protokole göre anestezik, analjezik ve antibiyotikler kullanıldı. Kırık iyileşmesi gerçekleştikçe farklı parametrelerin başlangıç analizi ve sıralı kronolojik karşılaştırmalı takibi için her sıçanın kuyruk damarından kan (0.5 mL) toplanabilir. Saçlar yan bölgeden diz bölgesine epilasyon kremi kullanılarak alındı (Şekil 2). Osteotomi prosedürünün tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürdü (ilk kesiden dikişe kadar). Aseptik önlemlerin alınmasıyla enfeksiyon ve mortalite ihmal edilebilir düzeydeydi. Lokal anestezi (lignokain) sonrası insizyon yapıldı ve vastus lateralis lifleri geri çekildikten sonra femur şaftı açığa çıkarıldı (Şekil 3). Keskinin kaymamasını sağlamak için cerrahi bir bıçak kullanılarak kemikte bir girinti (oluk) oluşturuldu. Steril sert destek (mermer blok) kemiği desteklerken temiz bir kopuş sağlamak için kırıldı (Şekil 1). Femur şaftının orta üçte birinde keski ve çekiç kullanılarak tam bir enine kırık indüklendi (Şekil 4).
Kırık, steril bir K-teli (1.0 mm) kullanılarak dahili olarak sabitlendi. K-teli, kırık bölgesinden distal fragmanın medüller kanalına geçirildi. K-teli daha sonra femur distal ucundan delindi. Kırık azaldı ve daha sonra K-teli, trokanterik bölgede satın alınana kadar distal uçtan proksimal parçanın kanalına ilerletildi. K-telinin deriden çıkıntı yapan distal kısmı kesildi. K-teli, kırığı azaltılmış bir pozisyonda tutmak için intramedüller bir atel görevi gördü (Şekil 5).
Radyolog tarafından değerlendirildiği gibi, nasırın görünümünü (kırık iyileşmesinin başlangıcı) ve köprüleme nasırının görünümünü (kırık boşluğunun iyileştiği ilk zaman noktası) değerlendirmek için ameliyattan 1 gün sonra ve sonrasında haftalık olarak kırık bölgenin röntgeni çekildi (Şekil 6). Kırık iyileşmesinin karşılaştırmalı değerlendirilmesi için iki radyolojik zaman noktası, (yumuşak) nasırın görünümü (görselleştirilmesi) ve köprüleme (sert) nasırın görünümüdür.
Kurban edildikten sonra, femur formalin içinde dikkatlice korundu, ardından kemik dekalsifikasyonu protokolü izledi (Şekil 7). K-teli, kurban sırasında nasır rahatsız etmemeye özen gösterilerek çıkarıldı. Tam dekalsifikasyondan sonra, kemik sagital kesitler halinde kesildi ve gerektiğinde kesitleme için parafin bloklarda (4 μm kalınlığında kesitler) korundu. Kırık bölgesinin hematoksilin ve eozin boyalı bir bölümü ve nasır 5 haftanın sonunda kıkırdak ve yeni kemik oluşumunu doğruladı (Şekil 8).
Resim 1: Ameliyat masasındaki cerrahi örtü üzerinde tutulan steril cerrahi aletler. Cerrah steril aletlerle steril bir ortamda cerrahi işleme başlamaya hazırdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Anestezi uygulanan sıçan ameliyat masasında tutuldu. Sıçana anestezi verildikten ve kesi yerinin etrafındaki kıllar çıkarıldıktan sonra, ameliyat masasında sol lateral pozisyonda tutulur ve sağ bacağı osteotomi için açığa çıkarır. Başka bir cerrahi örtü, sadece bacağın maruz kalmasını sağlamak için sağ bacağı bu örtüdeki bir delikten geçirmek için kullanılır, böylece yara enfeksiyonlarını en aza indirir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Cerrahi prosedür: Sıçan femurunun şaftının maruz kalması. Osteotomi sırasında, vastus lateralis açığa çıktıktan sonra, femur şaftını açığa çıkarmak için kas lifleri ile aynı hizada bölünür. Kemik, periosteal asansör kullanılarak bağlı kaslardan serbest bırakılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir keski ve çekiç kullanarak femur milinin orta üçte birinde tam bir enine osteotomi oluşturulması. Femur şaftının üçte birinin ortasında, çekiçle keskiye hafifçe dokunularak tam bir enine kırık oluşturulur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: K-teli, kırığı azaltılmış bir konumda tutmak için intramedüller bir atel görevi görür. K-teli, kırık bölgesinden distal fragmanın medüller kanalına geçirilir. K-teli daha sonra femur distal ucundan delinir. Kırık azalır ve daha sonra K-teli, trokanterik bölgede satın alınana kadar distal uçtan proksimal fragmanın kanalına ilerletilir. Bu, pille çalışan bir elektrikli matkap kullanılarak yapılır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Sıçanın femurunun K-teli in situ ile röntgeni. (A) Kırığı indüklemeden önce ve (B) ameliyattan 1 gün sonra. Kırık iyileşmesi, radyolojik olarak nasır oluşumunu değerlendirmek için ameliyat edilen bölgenin sıralı haftalık röntgenleri alınarak radyolojik olarak izlenir. Kırık, intramedüller K-tel ile küçültülmüş ve hareketsiz kalır. Öncesi ve sonrası temsili veriler aynı hayvandan değildir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Hayvanı önceden belirlenmiş bir zaman noktasında kurban ettikten sonra elde edilen nasırlı kemik (optimal kireçlenmeden sonra). (A) Sağlam nasır; (B) Nasırın Sagital bölümü. Hayvanı kurban ettikten sonra, kırık bölgesinin alanı tarif edilen metodoloji kullanılarak elde edilir, korunur ve kireçten arındırılır. Nasır, başka tekniklerle (santimetre cinsinden referans ölçeği) değerlendirilmeden önce optimum kireç çözmeyi sağlamak için aralıklı olarak değerlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: Kırık bölgesinin hematoksilin ve eozin lekeli kesitinde kıkırdak ve yeni kemik oluşumu ile sert bir nasır görülmektedir. (A) Düşük büyütme; (B) Yüksek büyütme. Kırık bölgesinin hematoksilin ve eozin lekeli kesitlerinde kıkırdak (siyah oklar) ve yeni kemik (sarı oklar) oluşumu ile sert bir nasır görülür (A: 40x; B: 100x). Mavi ok kemiğin kırık ucunu gösterir ve kırmızı ok ikinci kortikal bölgeyi gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntem, Wistar albino sıçanlarında kırık osteotomi modeli geliştirmek için gereken ayrıntıları açıkça açıklamaktadır. Bu model, umut verici bir osteoanabolik ilacın kırık iyileşmesindeki osteojenik etkisini değerlendirmek ve kemik iyileşmesinin inceliklerini anlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin göze çarpan özelliği, basit olması ve çok fazla zamana veya sofistike ekipmana ihtiyaç duymamasıdır. Bu yöntemde, deneyler için kemirgen modeli olarak yetişkin erkek Wistar albino sıçanları seçilmiştir. Cinsiyet hormonları ile ilgili kemik iyileşmesi üzerindeki kafa karıştırıcı faktörleri ortadan kaldırmak için tek tip cinsiyet seçildi.
Bu çalışma, diğer grupların yanı sıra diğer küçük hayvan modelleri11,18,19 tarafından takip edilene benzer olan açık osteotomi prosedürünü takip etti. Bu yöntemde izlenen açık osteotominin diğer kemik iyileşme modellerine göre avantajı, yaralanmaya bağlı (tam kortikal kemik kırığı) normal bir uzun kemik kırığına benzemesi ve bu yöntemdeki kırık iyileşmesinin, matkap deliği kemik hasarına kıyasla, nasır oluşumu ile ikincil kemik iyileşmesinin (enchondral ossifikasyon) olduğu düzenli bir kırığa benzemesidir. primer kemik iyileşmesinin olduğu yerlerde (intramembranöz ossifikasyon)20. Açık osteotomi yöntemi, kırık hattında kemik parçalanması ve geniş eşitsizlik olasılığının olduğu kapalı osteotomi veya üç noktalı basınç indükleyici yöntemden daha iyidir, böylece kırık iyileşmesinde farklılığa yol açar21. Açık osteotomi, kapalı osteotomiye kıyasla yara enfeksiyonu olasılığını arttırır, ancak diğer çalışmalara benzer şekilde, uygun önlemlerle yara enfeksiyonunun ihmal edilebilir olduğunu gözlemledik22. Bu metodolojide, bir keski ve çekiçle kırılmadan önce bir bıçakla kemik üzerinde bir oluk (girinti) oluşturmanın, düzgün bir kırılma çizgisi oluşturmaya ve keskinin kemik üzerinde kaymasını önlemeye hizmet ettiği de gözlenmiştir. Bu yöntemde sunduğumuz bir diğer değişiklik, kırılacak kemiğin altında sert, steril bir blok tutmaktı. Bu sadece kırığı oluştururken bir karşı kuvvet sağlamakla kalmadı, aynı zamanda parçalanma, ezilme veya düzensiz bir kırılma hattından kaçınmaya da yardımcı oldu. Bu genellikle altındaki kaslarda önemli bir yaralanmaya neden olmaz.
Çalışmamızda, tam deneye başlamadan önce nasırın ilk zaman noktası olarak radyolojik görünümüne ve köprü (sert) nasırın hayvanlarda ikinci zaman noktası olarak ortaya çıkmasına dayanarak kurban zaman noktalarını belirlemek için X-ışınları kullanılmıştır. Herhangi bir tedavi veya kontrol grubu, osteoblastik ve osteoklastik belirteçlerin immünohistokimyasal analizini kullanarak nasırlarını karşılaştırmak için belirli bir zaman noktasına ulaştığında tüm karşılaştırmalı hayvan grubu feda edilmelidir. Bu, farklı tedavi ve kontrol grupları arasında tarafsız bir karşılaştırma sağlayacaktır. Sıçanların kırık bölgesinin röntgeni haftalık aralıklarla yapılmalı ve kan örnekleri (kuyruk damarı) ilgili kurban zaman noktalarına ulaşana kadar 2 haftalık aralıklarla alınmalıdır. Nasır oluşumunu değerlendirmek için radyolog (kontrol ve tedavi gruplarına kör olan) tarafından haftalık röntgenler (anestezi altında) yapıldı. X-ışınları ayrıca kemik iyileşmesinin biyolojik parametrelerini doğrulamaya ve doğrulamaya yardımcı oldu.
Bu yöntem, kırığı azaltılmış bir pozisyonda hareketsiz tutmak için bir K-telinin intramedüller bir atel olarak uygulanmasını içerir. Bununla birlikte, intramedüller pin fiksasyonu, kaplama ve eksternal fiksatörler gibi kırığa mutlak stabilite sağlamaz ve zaman zaman yara enfeksiyonu, pin göçü, femur mili korteksinin delinmesi gibi komplikasyonlarla ilişkili olabilir. Çalışmamız ayrıca, son derece ağrıya duyarlı olan periostun içine ve çevresine lignokain enjekte etmenin daha iyi olduğunu göstermektedir. Bu, şiddetli ağrıyı ve osteotomi sırasında nörojenik şok olasılığını önler. Ayrıca, intraperitoneal enjeksiyonların hacminin düşük tutulmasının, sıçanlarda sonraki solunum sıkıntısını en aza indirmeye yardımcı olduğu gözlenmiştir. Herhangi bir ağrı veya enfeksiyonu önlemek için ameliyattan sonra 5 gün boyunca analjezikler ve antibiyotikler devam ettirildi. Bu çalışma için femur, erişimi kolay, temiz kırılması kolay ve K-tel yerleştirme için daha kolay olan düz konturu nedeniyle kırığı indüklemek için seçildi. K-teli femur proksimal fragmanına ilerletildiğinde dikkatli olunmalıdır, çünkü femoral artere zarar vererek kanama riski vardır. Sıçanların, deriden çıkıntı yapan çok fazla artık tel bırakılırsa, K-telini çıkarma eğiliminde oldukları gözlenmiştir.
Kemik iyileşmesinin sonucunun parametreleri, hayvanların kanındaki ve nasırlarındaki osteoblastik ve osteoklastik belirteçlerdir (çeşitli gruplardan ve farklı zaman noktalarından). Osteoblastik belirteçler için osteokalsin, Col1A1, RANKL, P1NP ve kemiğe özgü alkalen fosfataz seçilebilirken, osteoklastik aktiviteyi değerlendirmek için CTX ve RANK değerlendirilebilir. Bu parametrelerin bir kısmı serumda, bir kısmı ise nasır dokusunda immünohistokimya ile değerlendirilebilir. Bu parametreler, osteoblastik ve osteoklastik aktiviteyi aynı anda değerlendirerek kemik yeniden şekillenmesinin bütünsel bir görünümünü verir.
Bu çalışmanın kısıtlılığı, nasırın gerilme mukavemetini değerlendirmemesidir. İdeal olarak, biyomekanik çalışmalar verilere değer katar. Nasır ve bitişik kemik dokusunu dekalsifikasyon için işlerken dikkatli olunmalıdır, çünkü eksik dekalsifikasyon immünohistokimyada optimal sonuçlar vermeyecektir.
Kemirgen modelini kullanarak kırık iyileşmesini değerlendirmek için bu protokol, osteoanabolik aktiviteye sahip umut verici ilaçları değerlendirmeye çalışan tüm gruplar için yararlı olacaktır. Kemirgen modelinde kemik ve kırık iyileşmesini doğru bir şekilde değerlendirirken, osteoblastik ve osteoklastik aktiviteyi ve kemik yeniden şekillenmesini değerlendirmek için basit bir modeldir, bu da yararlı mekanik bilgiler verir. Hayvan sayısı etrafında dönen kaynaklara ve lojistiğe izin verilirse, biyolojik göstergeler, kırık iyileşmesinin radyolojik değerlendirmesi ve iyileşen kemiğin mekanik boyunu değerlendiren çekme mukavemetinin karşılaştırılmasıyla da güçlendirilebilir. Etki mekanizmasını aydınlatan çalışmalar tamamen gözlemsel çalışmalara tercih edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların hiçbirinde çıkar çatışması veya başka finansal açıklamalar bulunmamaktadır.
Acknowledgments
Yazarlar, araştırma finansmanı için Hindistan Hükümeti AYUSH Bakanlığı, Homeopati Araştırmaları Merkez Konseyi'ne (CCRH) teşekkür eder. Yazarlar, Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi'nin hayvan deneylerine olan yardımları ve destekleri için ve CMET, AIIMS, Yeni Delhi'nin fotoğraf ve videografideki yardım ve destekleri için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
