Summary
Her presenterer vi en protokoll for å iatrogenisk bryte skaftet på lårbenet til Wistar albino rotter og følge opp utviklingen av callus. Denne femur osteotomi modellen kan hjelpe forskere evaluere prosessen med brudd healing og å studere hvordan et stoff kan påvirke brudd healing.
Abstract
Fraktheling er en fysiologisk prosess som resulterer i regenerering av beindefekter ved koordinert virkning av osteoblaster og osteoklaster. Osteoanabole stoffer har potensial til å øke reparasjonen av brudd, men har begrensninger som høye kostnader eller uønskede bivirkninger. Benhelingspotensialet til et legemiddel kan i utgangspunktet bestemmes av in vitro-studier , men in vivo-studier er nødvendig for det endelige konseptbeviset. Vårt mål var å utvikle en femur osteotomi gnager modell som kunne hjelpe forskere å forstå utviklingen av callus dannelse etter brudd i skaftet av lårbenet og som kan bidra til å fastslå om et potensielt stoff har bein helbredende egenskaper. Voksne mannlige Wistar albino rotter ble brukt etter Institutional Animal Ethics Committee klarering. Gnagerne ble bedøvet, og under aseptiske forhold ble komplette tverrgående brudd i midten en tredjedel av lårbenets aksler opprettet ved hjelp av åpen osteotomi. Frakturene ble redusert og festet innvendig ved hjelp av intramedullære K-ledninger, og sekundær bruddtilheling ble tillatt. Etter operasjonen ble intraperitoneale analgetika og antibiotika gitt i 5 dager. Sekvensielle ukentlige røntgenstråler vurderte callusdannelse. Rottene ble ofret basert på radiologisk forhåndsbestemte tidspunkter, og utviklingen av bruddkallus ble analysert radiologisk og ved hjelp av immunhistokjemi.
Introduction
Ben er et tett bindevev som består av beindannende celler, osteoblaster og beinresorberende celler, osteoklaster. Fraktheling er en fysiologisk prosess som resulterer i regenerering av beindefekter ved koordinert virkning av osteoblaster og osteoklaster1. Når det er et brudd, er osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet på bruddstedet noen av de viktige faktorene som bestemmer beinheling2. Når bruddheling avviker fra sitt normale forløp, resulterer det i en forsinket union, malunion eller nonunion. Et brudd sies å være i nonunion når det er en svikt i foreningen av bruddet i 9 måneder, uten progresjon av reparasjon i de siste 3 månedene3. Omtrent 10% -15% av alle brudd opplever en forsinkelse i reparasjon som kan utvikle seg til nonunion4. Nonunion rate for alle brudd er 5% -10% og varierer avhengig av bein involvert og stedet for brudd5.
Dagens regime for behandling av brudd omfatter kirurgiske og/eller medisinske modaliteter. For tiden kan forsinket eller nonunion av brudd overvinnes ved kirurgiske strategier som beintransplantasjon. Imidlertid har beintransplantasjon sine begrensninger og komplikasjoner som tilgjengelighet av transplantatvev, smerte på donorstedet, sykelighet og infeksjon6. Medisinsk behandling omfatter osteoanabole legemidler som benmorfogenetisk protein (BMP) og teriparatid (parathormonanalog). For tiden brukes osteoanabole midler har potensial til å øke reparasjonen av brudd, men har begrensninger som ublu kostnader eller uønskede bivirkninger7. Derfor er det rom for å identifisere kostnadseffektive, ikke-kirurgiske alternativer for beinheling. Benhelingspotensialet til et legemiddel kan i utgangspunktet bestemmes av in vitro-studier , men in vivo-studier er nødvendig for det endelige konseptbeviset. Et legemiddel som er kjent for å forbedre benhelbredelse, bør evalueres in vitro , og hvis det blir funnet lovende, kan det brukes til in vivo dyremodellstudier. Hvis stoffet viser seg å fremme beindannelse og ombygging i in vivo-modellen , kan det gå videre til neste trinn (dvs. kliniske studier).
Å vurdere bruddheling hos dyr er et logisk skritt fremover for å evaluere et nytt middel introdusert for beinhelbredelse før det gjennomgår menneskelige forsøk. For in vivo dyremodellstudier av bruddheling har gnagere blitt en stadig mer populær modell8. Gnagermodellene har generert økende interesse på grunn av lave driftskostnader, begrenset behov for plass og mindre tid som trengs for beinheling9. I tillegg har gnagere et bredt spekter av antistoffer og genmål, noe som tillater studier på molekylære mekanismer for beinhelbredelse og regenerering10. Et konsensusmøte fremhevet omfattende ulike små dyrebeinshelbredelsesmodeller og fokuserte på de forskjellige parametrene som påvirker beinheling, samt vektlegging av flere smådyrbruddmodeller og implantater11.
Grunnleggende bruddmodeller kan grovt deles inn i åpne eller lukkede modeller. Lukkede bruddmodeller bruker en tre- eller firepunkts bøyekraft på beinet og krever ikke en konvensjonell kirurgisk tilnærming. De fører til skrå eller spiralfrakturer, som ligner lange beinfrakturer hos mennesker, men mangelen på standardisering av bruddplassering og dimensjoner kan fungere som en forstyrrende faktor i dem12. Åpne bruddmodeller krever kirurgisk tilgang for osteotomi av beinet, bidrar til å oppnå et mer konsistent bruddmønster på bruddstedet, men er forbundet med forsinket tilheling sammenlignet med de lukkede modellene13. Valget av bein som brukes til å studere bruddheling forblir hovedsakelig tibia og lårben på grunn av deres dimensjoner og tilgjengelighet. Valget av bruddsted er vanligvis diafysen eller metafysen. Metafyseområdet er spesielt valgt i tilfeller der bruddheling studeres hos osteoporotiske personer, da metafysen er mer påvirket av osteoporose14. Flere implantater som intramedullære pinner og eksterne fiksatorer kan brukes til å stabilisere bruddet11,15.
Målet med denne studien var å utvikle en enkel og lett å følge gnagermodell som kunne hjelpe forskere ikke bare å forstå utviklingen av callus etter brudd på lårbenet, men kunne bidra til å avgjøre om et potensielt stoff har beinhelbredende egenskaper ved å forstå mekanismen som det virker på.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble gjort etter å ha tatt etisk godkjenning fra Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, New Delhi, India (286/IAEC-1/2021).
1. Preoperativ prosedyre
- Hushann Wistar albino rotter 6-8 uker, veier mellom 150-200 g hver, på et Central Animal Facility (CAF) i separate individuelle bur. Dette sikrer ingen kirurgisk/bruddskade når flere rotter deler merder.
- Hold rottene ved en temperatur på 23 °C ± 2 °C i et fuktighetskontrollert miljø med en relativ fuktighet på 50 % ± 5 %, utsett dem for en 12 timers mørk / lys syklus, og gi ad libitum tilgang til mat (standard halvsyntetisk diett): pelletsdiett (tørr) og vann. Sammensetningen av standard halvsyntetisk diett er som følger: stekt bengalsk grammel (60%), hvetemel (22%), kasein (4%), skummet melkepulver (5%), raffinert olje (4%), saltblanding med stivelse (4,8%) og vitaminkolinblanding med stivelse (0,2%).
- Akklimatiser rottene i en periode på minst 48 timer før operasjonen.
- Vei hver rotte på en digital veievekt og noter vekten.
- Administrer intraperitoneale (IP) injeksjoner av cefuroksim (100 mg/kg kroppsvekt), tramadol (25 mg/kg kroppsvekt) og en kombinasjon av ketamin (75 mg/kg kroppsvekt) med xylazin (10 mg/kg kroppsvekt) til rottene 15 minutter før du starter den kirurgiske prosedyren. Påfør oftalmisk salve på begge øynene for å forhindre tørr øye.
- Fjern håret fra høyre underekstremitet, fra flankeområdet opp til kneleddet, med aktuell påføring av en hårfjerningskrem.
MERK: Blod (0,5 ml) kan hentes fra halevenen til hver rotte for baselineanalyse av forskjellige parametere. Blod kan samles igjen hver 2. uke etter operasjonen.
2. Kirurgisk prosedyre for å skape fullstendig tverrgående brudd gjennom åpen osteotomi
MERK: Bruk et eget operasjonsrom med operasjonsbord og optimal omgivelsestemperatur (26 °C) for å utføre prosedyren.
- Plasser voksblokken (aluminiumsbrett 30 cm x 30 cm x 4 cm som inneholder voks opp til en dybde på 2,5 cm) på operasjonsbordet og dekk den med sterile gardiner. Voksblokken forhindrer endring i dyrets stilling under operasjonen.
- Bekreft utbruddet av anestesi (ved å sjekke tap av tåklemme). Plasser den bedøvede rotten på en steril drapering i venstre sidestilling. Be en assistent om å holde høyre underekstremitet (kne og hofte) i forlengelse. Hold en steril hard støtte (marmorblokk) under høyre ben for å støtte lårbenet. Rengjør operasjonsstedet med alkohol og betadin.
- Injiser lokalbedøvelse (0,25 ml 1% lignokain) på snittstedet (lateralt aspekt av høyre lår), kutt et hull i en annen steril drapering, og utsett bare rottes høyre ben gjennom det for kirurgi.
- Gi et vertikalt hudsnitt på 1 cm på siden av høyre lår, og forleng det etter behov med et operasjonsblad nr. 15.
- Utsett vastus lateralis-muskelen ved å skille den dype fascien ved hjelp av Metzenbaum-saks. Del vastus lateralis i tråd med muskelfibrene ved hjelp av arterietang til lårbenet er nådd.
- Frigjør beinet fra musklene som er festet til det ved hjelp av periostealheisen.
- Injiser lokalbedøvelse (0,2 ml 1% lignokain) i og rundt periosteum for å forhindre vasovagal refleks.
- Lag et innrykk i den midterste tredjedelen av lårbenets skaft ved hjelp av operasjonsbladet nr.15, og bryt beinet i den midterste tredjedelen av skaftet (fullstendig brudd) ved å plassere en meisel på innrykket som er laget (slik at meiselen ikke glir) og forsiktig tappe meiselen med en hammer. Bruk den sterile harde støtten (marmorblokken) for å støtte beinet mens du oppsprekker det for å sikre en ren pause.
MERK: Den sterile harde støtten forårsaker vanligvis ikke en betydelig skade på musklene under. - Fest bruddet internt ved hjelp av en steril K-ledning (1,0 mm) holdt ved hjelp av en batteridrevet kraftborer. Pass K-ledningen inn i medulærkanalen i det distale fragmentet gjennom bruddstedet. Bor deretter ut K-ledningen gjennom den distale enden av lårbenet ved hjelp av den batteridrevne kraftboren.
MERK: Desinfiser overflaten på kraftboret med alkohol før bruk. Bytt hansker etter at K-ledningen er festet. - Etter å ha redusert bruddet, gå K-ledningen fra den distale enden inn i kanalen til det proksimale fragmentet til det oppnår kjøp i det trokantære området. Klipp av den distale delen av K-ledningen som stikker ut gjennom huden ved hjelp av en trådkutter.
- Bøy spissen av K-ledningen til rundt 90 ° ved hjelp av tang og bruk en gasbind bandasje gjennomvåt i betadin for pin-site dressing. K-ledningen fungerer som en intramedullær skinne for å holde bruddet i redusert stilling.
- Sørg for fullstendig hemostase før du lukker huden ved hjelp av en 3-0 nylonsutur. Påfør trykk på blødningsområdet ved hjelp av sterilt gasbind eller arterietang for å stoppe blødning.
- Rengjør såret med betadin, og dekk det med sterilt gasbind og mikropore tape.
3. Postoperativ omsorg
- Returner rottene til burene, tillat normal ambulering, og fortsett å gi et standard halvsyntetisk diett til du ofrer dem, samt antibiotika (injeksjon cefuroxim 100 mg / kg) og smertestillende midler (injeksjon tramadol 25 mg / kg / dag i to delte doser) intraperitonealt i 5 dager etter prosedyren.
MERK: Rottene kan deles inn i behandlings- og kontrollgrupper for å teste et bestemt stoff. Hvis stoffet er vannløselig, kan det gis oralt gjennom gavage. Vekten av de enkelte dyrene kan noteres for å beregne dosen av legemidlet som skal brukes. Inklusjons- og eksklusjonskriterier kan følges for å sikre homogenitet i dyregruppene. - Hus dyrene i individuelle bur under lignende forhold som den preoperative perioden. Inspiser operasjonsstedet hver dag for å se etter tegn på postoperativ smerte, sårinfeksjon, glidning av suturer eller hevelse eller ubehag i magen.
- Vurder beinheling ved røntgen av det frakturerte stedet en gang i uken.
4. Radiologisk prosedyre
- Før røntgen, bedøve rottene med en intraperitoneal injeksjon av ketamin (50 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (5 mg / kg kroppsvekt).
- Hold hofteleddet til rotta i bøyd og bortført stilling mens kneleddet holdes halvbøyd for å ta røntgen av det brukne lemmet med følgende eksponeringsinnstillinger: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6,4; og automatiske eksponeringsinnstillinger (Ref. mA = 160).
MERK: Røntgen ble tatt ved baseline (1 dag etter operasjonen) og deretter en gang i uken til ofring eller 5 uker.
5. Dyreavlivning og innhenting av callus
- Ofre rottene ved en overdose karbondioksid (administrer 100% CO2 ved en strømningshastighet på 7-8 l / min i 1 min, etterfulgt av en ventetid på 4-5 minutter), på to tidligere bestemte tidspunkter, basert på det radiologiske utseendet til henholdsvis myke og harde broarmer.
- Snitt huden parallelt med lårbenet og skill de overliggende musklene forsiktig for å unngå skade på callusvevet.
- Brudd beinet mellom hofteleddet og callusvevet ved hjelp av en hammer og meisel. På samme måte brekker beinet mellom callus og kneleddet. Fjern K-ledningen og rengjør beinstykket i saltvann for å fjerne blodpropper og bløtvev.
- Overfør callus umiddelbart til en merket beholder med 10% nøytral bufret formalin (20 ml per prøve) og oppbevar den i 3 dager ved romtemperatur (RT).
6. Avkalkning av bein og callus vev
- Ta callusvevet fra formalin og hold det ved RT i 20% ETDA-løsning, pH 7, for avkalkning av beinvevet.
- Bytt fersk EDTA-oppløsning hver 2. dag i ca. 3 uker, og kontroller for benavkalkning ved å stikke beinet med en nål uten å forstyrre callusvevet. Optimal avkalkning er betegnet ved tap av normal gritty følelse av beinvevet.
- Etter fullstendig avkalkning, kutt sagittaldelen av callus og lag parafinblokker av callusvevet. Skjær 4 μm tykke deler av callusvevet for histopatologisk16 og eventuell annen komparativ analyse17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne studien ble gjennomført for å utvikle en lårbens osteotomi modell i Wistar albino rotter. Denne modellen kan brukes til å evaluere beinhelbredelse, samt den osteogene effekten av et lovende osteoanabole stoff i beinhelbredelse. Standard kirurgiske forholdsregler og protokoller ble fulgt. Sterile kjoler, gardiner og kirurgisk utstyr ble brukt ved inngrepet (figur 1). Utstyret (tabell 1) ble sterilisert 48 timer før operasjon. Bedøvelse, smertestillende og antibiotika ble brukt i henhold til protokollen for å sikre at dyrene ble holdt smerte- og infeksjonsfrie til enhver tid. Blod (0,5 ml) kan hentes fra halevenen til hver rotte for baselineanalyse og sekvensiell kronologisk komparativ oppfølging av forskjellige parametere når bruddtilheling oppstår. Håret ble fjernet fra flankeregionen til kneregionen med hårfjerningskrem (figur 2). Osteotomiprosedyren tok omtrent 10 minutter å fullføre (fra første snitt til suturen). Infeksjon og dødelighet var ubetydelig etter aseptiske forholdsregler. Etter lokalbedøvelse (lignokain) ble det gjort et snitt, og lårbenskaftet ble eksponert etter tilbaketrekking av fibrene i vastus lateralis (figur 3). Et innrykk (spor) ble opprettet i beinet ved hjelp av et kirurgisk blad for å sikre at meiselen ikke gled. Steril hard støtte (marmorblokk) ble brukt til å støtte beinet under oppsprekking for å sikre en ren pause (figur 1). Fullstendig tverrgående brudd ble indusert i den midterste tredjedelen av lårbenskaftet med meisel og hammer (figur 4).
Bruddet ble festet innvendig ved hjelp av en steril K-wire (1,0 mm). K-ledningen ble ført inn i medulærkanalen i det distale fragmentet gjennom bruddstedet. K-wiren ble deretter boret ut gjennom den distale enden av lårbenet. Bruddet ble redusert, og deretter ble K-ledningen avansert fra den distale enden inn i kanalen til det proksimale fragmentet til det oppnådde kjøp i det trokantære området. Den distale delen av K-ledningen som stakk ut gjennom huden ble kuttet av. K-wiren fungerte som en intramedullær skinne for å holde bruddet i redusert stilling (figur 5).
Røntgen av det oppsprukne området ble tatt 1 dag etter operasjonen og deretter ukentlig for å evaluere callusens utseende (begynnende bruddtilheling) og utseende av bridging callus (første tidspunkt da bruddgapet ble helbredet), vurdert av radiologen (figur 6). To radiologiske tidspunkter for komparativ evaluering av bruddtilheling var utseendet (visualiseringen) av den (myke) callus og utseendet til den brodannende (harde) callusen.
Etter ofring ble lårbenet omhyggelig bevart i formalin, etterfulgt av protokollen for benavkalkning (figur 7). K-ledningen ble fjernet under offeret, og passet på å ikke forstyrre callus. Etter fullstendig avkalkning ble beinet kuttet i sagittale seksjoner og bevart i parafinblokker for seksjonering (4 μm tykke seksjoner) etter behov. Hematoksylin- og eosinfarget snitt av frakturstedet og callus bekreftet brusk og ny beindannelse etter 5 uker (figur 8).
Figur 1: Sterile kirurgiske instrumenter oppbevart på operasjonsbordet. Kirurgen er klar til å starte den kirurgiske prosedyren i et sterilt miljø med sterile instrumenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bedøvet rotte holdt på operasjonsbordet. Etter å ha gitt anestesi til rotten og fjernet håret rundt snittstedet, holdes det på operasjonsbordet i venstre sidestilling, og utsetter høyre ben for osteotomi. En annen kirurgisk drapering brukes til å passere høyre ben gjennom et hull i det draperiet for å sikre at bare benet blir utsatt, og dermed minimere sårinfeksjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kirurgisk prosedyre: Eksponering av skaftet på rottelårbenet. Under osteotomi, etter at vastus lateralis er utsatt, splittes den i tråd med muskelfibrene for å eksponere lårbenets aksel. Benet frigjøres fra de vedlagte musklene ved hjelp av periostealheisen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Skaper en komplett tverrgående osteotomi i den midterste tredjedelen av lårbenskaftet ved hjelp av meisel og hammer. Et komplett tverrbrudd opprettes i midten en tredjedel av lårbenets aksel ved å forsiktig tappe meiselen med hammeren. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: K-wire fungerer som en intramedullær skinne for å holde bruddet i redusert stilling. K-ledningen føres inn i medulærkanalen til det distale fragmentet gjennom bruddstedet. K-wiren bores deretter ut gjennom den distale enden av lårbenet. Bruddet reduseres, og deretter føres K-ledningen fra den distale enden inn i kanalen til det proksimale fragmentet til det oppnås kjøp i det trokantære området. Dette gjøres ved hjelp av en batteridrevet kraftbor. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Røntgen av lårbenet til rotta med K-wiren in situ . (A) Før bruddet induseres og (B) 1 dag etter operasjonen. Bruddhelingen overvåkes radiologisk ved å ta sekvensielle ukentlige røntgenbilder av det opererte stedet for radiologisk å vurdere callusdannelse. Bruddet forblir redusert og immobilisert med den intramedullære K-ledningen. De før og etter representative dataene er ikke fra samme dyr. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Bein med callus (etter optimal avkalkning) oppnådd etter ofring av dyret på et forhåndsbestemt tidspunkt. (A) Intakt callus; (B) Sagittal del av callus. Etter å ha ofret dyret, oppnås området på bruddstedet, bevares og avkalkes ved hjelp av den beskrevne metoden. Callus vurderes periodisk for å sikre optimal avkalkning før den evalueres ved hjelp av andre teknikker (referanseskala i centimeter). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Hematoksylin-og-eosin-farget del av bruddstedet som viser en hard callus med dannelse av brusk og nytt bein. (A) Lav forstørrelse; (B) Høy forstørrelse. De hematoksylin-og-eosinfargede delene av bruddstedet viser en hard callus med dannelse av brusk (svarte piler) og nytt bein (gule piler) (A: 40x; B: 100x). Den blå pilen viser bruddenden av beinet, og den røde pilen viser den andre kortikale regionen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden beskriver tydelig detaljene som trengs for å utvikle en bruddosteotomimodell hos Wistar albinorotter. Denne modellen kan brukes til å evaluere den osteogene effekten av et lovende osteoanabole stoff i bruddheling, samt forstå vanskelighetene med beinhelbredelse. Den fremtredende egenskapen til denne metoden er at den er enkel og ikke trenger for mye tid eller sofistikert utstyr. I denne metoden ble voksne mannlige Wistar albino rotter valgt som gnagermodell for forsøkene. Ensartet kjønn ble valgt for å fjerne enhver forstyrrende faktor på beinhelbredelse relatert til kjønnshormonene.
Denne studien fulgte prosedyren for åpen osteotomi, som ligner den som følges av andre grupper, samt andre smådyrmodeller11,18,19. Fordelen med den åpne osteotomien som følges i denne metoden fremfor andre beinhelingsmodeller, er at den skadeinduserte (komplett kortikal beinbrudd) ligner et vanlig langt beinbrudd, og bruddheling i denne metoden ligner på et vanlig brudd, der det er sekundær beinheling (enchondral ossifikasjon) ved callusdannelse, sammenlignet med borehullsbeinskade, der det er primær bentilheling (intramembranøs ossifikasjon)20. Metoden for åpen osteotomi er også bedre enn den lukkede osteotomi eller trepunkts trykkfremkallende metoden, der det er mulighet for beinknusing og stor forskjell i bruddlinjen, noe som fører til forskjellen i bruddheling21. Åpen osteotomi øker sjansen for sårinfeksjon sammenlignet med lukket osteotomi, men i likhet med andre studier observerte vi at sårinfeksjon med riktige forholdsregler var ubetydelig22. Det ble også observert i denne metodikken at å skape et spor (innrykk) på beinet med et blad før det ble brutt med en meisel og hammer, tjente til å skape en jevn bruddlinje og unngå glidning av meiselen på beinet. En annen modifikasjon vi introduserte i denne metoden var å holde en hard, steril blokk under beinet for å bli brukket. Dette ga ikke bare en motkraft mens du skapte bruddet, men bidro også til å unngå knusing, knusing eller en uregelmessig bruddlinje. Dette forårsaker vanligvis ingen betydelig skade på musklene under.
Vår studie brukte røntgenstråler for å bestemme offerpunktene basert på det radiologiske utseendet til callus som første gangpunkt og utseendet til brobroen (hard) callus som andre gangpunkt i dyrene før du starter hele forsøket. Hele sammenligningsgruppen av dyr bør ofres når en behandlings- eller kontrollgruppe når et bestemt tidspunkt for å sammenligne deres træler ved hjelp av immunhistokjemisk analyse av osteoblastiske og osteoklastiske markører. Dette vil sikre upartisk sammenligning mellom de ulike behandlings- og kontrollgruppene. Røntgen av rottenes oppsprukne sted bør tas med ukentlige intervaller, og blodprøver (halevene) bør tas med 2 ukentlige intervaller til de når de respektive offertidspunktene. Ukentlige røntgenstråler ble gjort (under anestesi) for å evaluere callusdannelse av radiologen (som ble blindet for kontroll- og behandlingsgruppene). Røntgenstrålene bidro også til å underbygge og bekrefte de biologiske parametrene for beinhelbredelse.
Denne metoden innebærer påføring av en K-ledning som en intramedullær skinne for å holde bruddet immobilisert i redusert stilling. Intramedullær pinnefiksering gir imidlertid ikke absolutt stabilitet til bruddet, det samme gjør plating og eksterne fiksatorer, og kan til tider være forbundet med komplikasjoner som sårinfeksjon, pinnemigrasjon, perforering av lårakselbarken, etc. Vår studie tyder også på at det er bedre å injisere lignokain i og rundt periosteum, som er ekstremt smertefølsomt. Dette forhindrer alvorlig smerte og muligheten for nevrogent sjokk under osteotomien. Det ble også observert at å holde volumet av intraperitoneale injeksjoner lavt bidro til å minimere påfølgende respiratorisk nød hos rotter. Analgetika og antibiotika ble fortsatt i 5 dager etter operasjonen for å forhindre smerte eller infeksjon. For denne studien ble lårbenet valgt for å indusere brudd, da det var lett tilgjengelig, lett å bryte rent, og på grunn av sin rette kontur, noe som er lettere for K-trådinnsetting. Forsiktighet må utvises når K-ledningen føres inn i det proksimale fragmentet av lårbenet, da det er fare for blødning ved å skade lårarterien. Det ble observert at rotter har en tendens til å trekke ut K-ledningen hvis for mye gjenværende ledning er igjen som stikker ut av huden.
Parametrene for utfallet av beinhelbredelse er osteoblastiske og osteoklastiske markører i blodet og callus av dyrene (av forskjellige grupper og forskjellige tidspunkter). For osteoblastiske markører kunne osteokalsin, Col1A1, RANKL, P1NP og benspesifikk alkalisk fosfatase velges, mens CTX og RANK kunne vurderes for å evaluere osteoklastisk aktivitet. Noen av disse parametrene kan evalueres i serum, mens andre kan evalueres ved immunhistokjemi i callusvev. Disse parametrene gir et helhetlig syn på beinremodellering ved samtidig å evaluere osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet.
Begrensningen av denne studien er at den ikke evaluerer strekkfastheten til callus. Ideelt sett tilfører biomekaniske studier verdi til data. Forsiktighet må utvises under behandling av callus og tilstøtende beinvev for avkalkning, da ufullstendig avkalkning ikke vil gi optimale resultater i immunhistokjemi.
Denne protokollen for å vurdere bruddheling ved hjelp av gnagermodellen vil være nyttig for alle grupper som prøver å evaluere lovende stoffer med osteoanabole aktivitet. Det er en enkel modell for nøyaktig å vurdere bein- og bruddheling i gnagermodellen mens du evaluerer osteoblastisk og osteoklastisk aktivitet og beinremodellering, noe som gir nyttig mekanistisk innsikt. Hvis ressurser og logistikk som dreier seg om antall dyr er tillatt, kan biologiske indikatorer også forsterkes ved radiologisk vurdering av bruddheling, samt sammenligning av strekkfasthet, som vurderer den mekaniske statusen til det helbredede beinet. Studier som belyser virkningsmekanismen foretrekkes fremfor rene observasjonsstudier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av forfatterne har interessekonflikter eller andre økonomiske opplysninger.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Central Council for Research in Homoeopathy (CCRH), Ministry of AYUSH, Govt. of India, for forskningsfinansiering. Forfatterne er takknemlige for hjelp og støtte fra Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi, for deres hjelp og støtte med dyreforsøkene og CMET, AIIMS, New Delhi, for deres hjelp og støtte i fotografering og videografi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
