Aqui, apresentamos um protocolo para fraturar iatrogenicamente a diáfise do fêmur de ratos albinos Wistar e acompanhar o desenvolvimento do calo. Este modelo de osteotomia do fêmur pode ajudar os pesquisadores a avaliar o processo de cicatrização da fratura e estudar como uma droga pode influenciar a cicatrização da fratura.
A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos. As drogas osteoanabólicas têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas têm restrições como altos custos ou efeitos colaterais indesejáveis. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Nosso objetivo era desenvolver um modelo de roedor de osteotomia do fêmur que pudesse ajudar os pesquisadores a entender o desenvolvimento da formação de calos após a fratura da diáfise do fêmur e que pudesse ajudar a estabelecer se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas. Ratos albinos Wistar machos adultos foram utilizados após liberação do Comitê de Ética Animal Institucional. Os roedores foram anestesiados e, em condições assépticas, fraturas transversais completas no terço médio das hastes dos fêmures foram criadas por osteotomia aberta. As fraturas foram reduzidas e fixadas internamente usando fios K intramedulares, e a cicatrização secundária da fratura foi permitida. Após a cirurgia, analgésicos intraperitoneais e antibióticos foram administrados por 5 dias. Raios-x semanais sequenciais avaliaram a formação de calos. Os ratos foram sacrificados com base em pontos de tempo radiologicamente pré-determinados, e o desenvolvimento do calo de fratura foi analisado radiologicamente e usando imuno-histoquímica.
O osso é um tecido conjuntivo denso que consiste em células formadoras de osso, os osteoblastos, e células de reabsorção óssea, os osteoclastos. A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos1. Quando há fratura, a atividade osteoblástica e osteoclástica no local da fratura são alguns dos fatores importantes que determinam a cicatrização óssea2. Quando a cicatrização da fratura se desvia de seu curso normal, resulta em uma união atrasada, desunião ou não união. Diz-se que uma fratura está em não união quando há uma falha de união da fratura por 9 meses, sem progressão do reparo nos últimos 3 meses3. Aproximadamente 10%-15% de todas as fraturas experimentam um atraso no reparo que pode progredir para a não união4. A taxa de não consolidação para todas as fraturas é de 5%-10% e varia dependendo do osso envolvido e do local da fratura5.
O regime atual para o tratamento da não consolidação da fratura compreende modalidades cirúrgicas e/ou médicas. Atualmente, a tardia ou não união de fraturas pode ser superada por estratégias cirúrgicas como o enxerto ósseo. No entanto, o enxerto ósseo tem suas limitações e complicações como disponibilidade de tecido do enxerto, dor no local doador, morbidade e infecção6. O tratamento médico compreende drogas osteoanabólicas como proteína morfogenética óssea (BMP) e teriparatida (análogo do paratormônio). Os agentes osteoanabólicos atualmente utilizados têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas apresentam restrições como custos exorbitantes ou efeitos colaterais indesejáveis7. Assim, há espaço para identificar alternativas custo-efetivas e não cirúrgicas para a cicatrização óssea. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Uma droga que é conhecida por melhorar a cicatrização óssea deve ser avaliada in vitro e, se considerada promissora, pode ser usada para estudos in vivo em modelos animais. Se a droga provar promover a formação óssea e a remodelação no modelo in vivo , ela poderá prosseguir para o próximo estágio (ou seja, ensaios clínicos).
Avaliar a cicatrização de fraturas em animais é um passo lógico para avaliar um novo agente introduzido para a cicatrização óssea antes de passar por testes em humanos. Para estudos in vivo de modelos animais de cicatrização de fraturas, os roedores tornaram-se um modelo cada vez mais popular8. Os modelos de roedores têm gerado crescente interesse devido aos baixos custos operacionais, à necessidade limitada de espaço e ao menor tempo necessário para a cicatrização óssea9. Além disso, os roedores possuem um amplo espectro de anticorpos e alvos gênicos, que permitem estudos sobre os mecanismos moleculares de cicatrização e regeneração óssea10. Uma reunião de consenso destacou de forma abrangente vários modelos de cicatrização óssea de pequenos animais e enfocou os diferentes parâmetros que influenciam a cicatrização óssea, além de enfatizar vários modelos e implantes de fraturas de pequenos animais11.
Os modelos básicos de fratura podem ser amplamente divididos em modelos abertos ou fechados. Os modelos de fratura fechada usam uma força de flexão de três ou quatro pontos no osso e não requerem uma abordagem cirúrgica convencional. Levam a fraturas oblíquas ou espirais, assemelhando-se a fraturas de ossos longos em humanos, mas a falta de padronização da localização e das dimensões da fratura pode atuar como fator de confusão nelas12. Os modelos de fratura exposta requerem acesso cirúrgico para osteotomia óssea, ajudam a alcançar um padrão de fratura mais consistente no local da fratura, mas estão associados à cicatrização tardia em comparação com os modelos fechados13. A escolha do osso utilizado para estudar a cicatrização da fratura continua sendo principalmente a tíbia e o fêmur devido às suas dimensões e acessibilidade. A escolha do local da fratura é geralmente a diáfise ou metáfise. A região metafisária é especialmente escolhida nos casos em que a cicatrização da fratura é estudada em indivíduos osteoporóticos, pois a metáfise é mais afetada pela osteoporose14. Vários implantes como pinos intramedulares e fixadores externos podem ser utilizados para estabilizar a fratura11,15.
O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de roedores simples e fácil de seguir que pudesse ajudar os pesquisadores não apenas a entender o desenvolvimento do calo após a fratura do fêmur, mas também a determinar se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas, entendendo o mecanismo pelo qual ela age.
Este método descreve com lucidez os detalhes necessários para desenvolver um modelo de osteotomia de fratura em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização de fraturas, bem como compreender os meandros da cicatrização óssea. A característica saliente deste método é que ele é simples e não precisa de muito tempo ou equipamentos sofisticados. Neste método, ratos albinos Wistar machos adultos foram selecionados como …
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Central de Pesquisa em Homeopatia (CCRH), Ministério da AYUSH, Governo da Índia, pelo financiamento da pesquisa. Os autores são gratos pela ajuda e apoio da Central Animal Facility, AIIMS, Nova Delhi, por sua ajuda e apoio com os experimentos com animais e CMET, AIIMS, Nova Delhi, por sua ajuda e apoio em fotografia e videografia.
Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |