Summary

Protocolo para o Desenvolvimento de um Modelo de Osteotomia do Fêmur em Ratos Albinos Wistar

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo para fraturar iatrogenicamente a diáfise do fêmur de ratos albinos Wistar e acompanhar o desenvolvimento do calo. Este modelo de osteotomia do fêmur pode ajudar os pesquisadores a avaliar o processo de cicatrização da fratura e estudar como uma droga pode influenciar a cicatrização da fratura.

Abstract

A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos. As drogas osteoanabólicas têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas têm restrições como altos custos ou efeitos colaterais indesejáveis. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Nosso objetivo era desenvolver um modelo de roedor de osteotomia do fêmur que pudesse ajudar os pesquisadores a entender o desenvolvimento da formação de calos após a fratura da diáfise do fêmur e que pudesse ajudar a estabelecer se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas. Ratos albinos Wistar machos adultos foram utilizados após liberação do Comitê de Ética Animal Institucional. Os roedores foram anestesiados e, em condições assépticas, fraturas transversais completas no terço médio das hastes dos fêmures foram criadas por osteotomia aberta. As fraturas foram reduzidas e fixadas internamente usando fios K intramedulares, e a cicatrização secundária da fratura foi permitida. Após a cirurgia, analgésicos intraperitoneais e antibióticos foram administrados por 5 dias. Raios-x semanais sequenciais avaliaram a formação de calos. Os ratos foram sacrificados com base em pontos de tempo radiologicamente pré-determinados, e o desenvolvimento do calo de fratura foi analisado radiologicamente e usando imuno-histoquímica.

Introduction

O osso é um tecido conjuntivo denso que consiste em células formadoras de osso, os osteoblastos, e células de reabsorção óssea, os osteoclastos. A cicatrização de fraturas é um processo fisiológico que resulta na regeneração de defeitos ósseos pela ação coordenada de osteoblastos e osteoclastos1. Quando há fratura, a atividade osteoblástica e osteoclástica no local da fratura são alguns dos fatores importantes que determinam a cicatrização óssea2. Quando a cicatrização da fratura se desvia de seu curso normal, resulta em uma união atrasada, desunião ou não união. Diz-se que uma fratura está em não união quando há uma falha de união da fratura por 9 meses, sem progressão do reparo nos últimos 3 meses3. Aproximadamente 10%-15% de todas as fraturas experimentam um atraso no reparo que pode progredir para a não união4. A taxa de não consolidação para todas as fraturas é de 5%-10% e varia dependendo do osso envolvido e do local da fratura5.

O regime atual para o tratamento da não consolidação da fratura compreende modalidades cirúrgicas e/ou médicas. Atualmente, a tardia ou não união de fraturas pode ser superada por estratégias cirúrgicas como o enxerto ósseo. No entanto, o enxerto ósseo tem suas limitações e complicações como disponibilidade de tecido do enxerto, dor no local doador, morbidade e infecção6. O tratamento médico compreende drogas osteoanabólicas como proteína morfogenética óssea (BMP) e teriparatida (análogo do paratormônio). Os agentes osteoanabólicos atualmente utilizados têm o potencial de aumentar o reparo de fraturas, mas apresentam restrições como custos exorbitantes ou efeitos colaterais indesejáveis7. Assim, há espaço para identificar alternativas custo-efetivas e não cirúrgicas para a cicatrização óssea. O potencial de cicatrização óssea de uma droga pode inicialmente ser determinado por estudos in vitro , mas estudos in vivo são necessários para a prova final de conceito. Uma droga que é conhecida por melhorar a cicatrização óssea deve ser avaliada in vitro e, se considerada promissora, pode ser usada para estudos in vivo em modelos animais. Se a droga provar promover a formação óssea e a remodelação no modelo in vivo , ela poderá prosseguir para o próximo estágio (ou seja, ensaios clínicos).

Avaliar a cicatrização de fraturas em animais é um passo lógico para avaliar um novo agente introduzido para a cicatrização óssea antes de passar por testes em humanos. Para estudos in vivo de modelos animais de cicatrização de fraturas, os roedores tornaram-se um modelo cada vez mais popular8. Os modelos de roedores têm gerado crescente interesse devido aos baixos custos operacionais, à necessidade limitada de espaço e ao menor tempo necessário para a cicatrização óssea9. Além disso, os roedores possuem um amplo espectro de anticorpos e alvos gênicos, que permitem estudos sobre os mecanismos moleculares de cicatrização e regeneração óssea10. Uma reunião de consenso destacou de forma abrangente vários modelos de cicatrização óssea de pequenos animais e enfocou os diferentes parâmetros que influenciam a cicatrização óssea, além de enfatizar vários modelos e implantes de fraturas de pequenos animais11.

Os modelos básicos de fratura podem ser amplamente divididos em modelos abertos ou fechados. Os modelos de fratura fechada usam uma força de flexão de três ou quatro pontos no osso e não requerem uma abordagem cirúrgica convencional. Levam a fraturas oblíquas ou espirais, assemelhando-se a fraturas de ossos longos em humanos, mas a falta de padronização da localização e das dimensões da fratura pode atuar como fator de confusão nelas12. Os modelos de fratura exposta requerem acesso cirúrgico para osteotomia óssea, ajudam a alcançar um padrão de fratura mais consistente no local da fratura, mas estão associados à cicatrização tardia em comparação com os modelos fechados13. A escolha do osso utilizado para estudar a cicatrização da fratura continua sendo principalmente a tíbia e o fêmur devido às suas dimensões e acessibilidade. A escolha do local da fratura é geralmente a diáfise ou metáfise. A região metafisária é especialmente escolhida nos casos em que a cicatrização da fratura é estudada em indivíduos osteoporóticos, pois a metáfise é mais afetada pela osteoporose14. Vários implantes como pinos intramedulares e fixadores externos podem ser utilizados para estabilizar a fratura11,15.

O objetivo deste estudo foi desenvolver um modelo de roedores simples e fácil de seguir que pudesse ajudar os pesquisadores não apenas a entender o desenvolvimento do calo após a fratura do fêmur, mas também a determinar se uma droga potencial tem propriedades curativas ósseas, entendendo o mecanismo pelo qual ela age.

Protocol

Experimentos com animais foram feitos após aprovação ética do Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC), AIIMS, Nova Delhi, Índia (286/IAEC-1/2021). 1. Procedimento pré-operatório Ratos albinos Wistar machos domésticos de 6 a 8 semanas de idade, pesando entre 150-200 g cada, em uma Central Animal Facility (CAF) em gaiolas individuais separadas. Isso garante que não haja lesão cirúrgica/no local da fratura quando vários ratos compartilham gaiolas….

Representative Results

Este estudo foi realizado para desenvolver um modelo de osteotomia do fêmur em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar a cicatrização óssea, bem como o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização óssea. Precauções e protocolos cirúrgicos padrão foram seguidos. Aventais estéreis, cortinas e equipamentos cirúrgicos foram utilizados para o procedimento (Figura 1). O equipamento (Tabela 1) foi esterilizado 48 h a…

Discussion

Este método descreve com lucidez os detalhes necessários para desenvolver um modelo de osteotomia de fratura em ratos albinos Wistar. Este modelo pode ser usado para avaliar o efeito osteogênico de uma droga osteoanabólica promissora na cicatrização de fraturas, bem como compreender os meandros da cicatrização óssea. A característica saliente deste método é que ele é simples e não precisa de muito tempo ou equipamentos sofisticados. Neste método, ratos albinos Wistar machos adultos foram selecionados como …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores gostariam de agradecer ao Conselho Central de Pesquisa em Homeopatia (CCRH), Ministério da AYUSH, Governo da Índia, pelo financiamento da pesquisa. Os autores são gratos pela ajuda e apoio da Central Animal Facility, AIIMS, Nova Delhi, por sua ajuda e apoio com os experimentos com animais e CMET, AIIMS, Nova Delhi, por sua ajuda e apoio em fotografia e videografia.

Materials

Alcohol Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India MFG/MD/2019/000189 Sterillium hand disinfectant
Artery forceps  Nebula surgical, Gujarat, India G.105.05S 5", straight
Bard-Parker handle  Nebula surgical, Gujarat, India G.103.03 Size number 3
Betadine solution Win-medicare New Delhi, India UP14250000001 10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor  Nebula surgical, Gujarat, India 908.S Small
EDTA Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India 43272 Disodium salt
Eosin Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India 115935 For preparing the staining solution 
Forceps (plain) Nebula surgical, Gujarat, India 115.06 6", plain
Forceps (toothed) Nebula surgical, Gujarat, India 117.06 6", toothed
Formaldehyde Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India 84439 For preparing the neutral buffered formalin 
Haematoxylin Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India 104302 For preparing the staining solution 
Hammer Nebula surgical, Gujarat, India 401.M
Injection Cefuroxime Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India 48/UA/SC/P-2013 Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial 
Injection Ketamine Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India G/28-B/6 Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL 
Injection Xylazine Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India 28/RR/AP/2009/F/G Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India  1308-B 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol  Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India MB/07/500 Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire  Nebula surgical, Gujarat, India 166 (1mm) 12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire ‎Bosch, Germany  06019F70K4 GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors  Nebula surgical, Gujarat, India G.121.06S 6", straight
Needle holder Nebula surgical, Gujarat, India G.108.06 6", straight
Ophthalmic ointment  GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India KTK/28a/467/2001 Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel) Nebula surgical, Gujarat, India 1001.S.10 10 mm, straight
Periosteal elevator  Nebula surgical, Gujarat, India 918.10.S 10 mm, straight
Pliers cum wire cutter Nebula surgical, Gujarat, India 604.65
Reynold’s scissors Nebula surgical, Gujarat, India G.110.06S 6", straight
Standard semi-synthetic diet  Ashirvad Industries, Chandigarh, India No catalog number available Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application Local purchase No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments Local purchase No catalog number available
Sterile gauze Ideal Healthcare Industries, Delhi, India  E(0047)/14/MNB/7951 Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support Local purchase No catalog number available Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)  Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India REF 303060 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)  Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India REF 307749 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)  Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India  334-B(H) 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15) Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA REF MDS15115E Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24) Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA REF MDS15124E Sterile, Single use
Sutures Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India SN 3318 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture 
Wax block in aluminium tray  Locally fabricated No catalog number available 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine Philips India Ltd, Gurugram, Haryana SN19861013 Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 

References

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Aryal, A., Pagaku, P. K., Dey, D., Tyagi, S., Shrivastava, V., Bhattacharya, A., Rani, S., Nayak, D., Khurana, A., Khanna, P., Goyal, A., Mridha, A. R., Garg, B., Sen, S. Protocol for Developing a Femur Osteotomy Model in Wistar Albino Rats. J. Vis. Exp. (186), e63712, doi:10.3791/63712 (2022).

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