Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll, um den Femurschaft von Wistar-Albinoratten iatrogen zu brechen und die Entwicklung des Kallus zu verfolgen. Dieses Femurosteotomiemodell kann Forschern helfen, den Prozess der Frakturheilung zu bewerten und zu untersuchen, wie ein Medikament die Frakturheilung beeinflussen könnte.
Abstract
Frakturheilung ist ein physiologischer Prozess, der zur Regeneration von Knochendefekten durch die koordinierte Wirkung von Osteoblasten und Osteoklasten führt. Osteoanabole Medikamente haben das Potenzial, die Reparatur von Frakturen zu verbessern, haben aber Einschränkungen wie hohe Kosten oder unerwünschte Nebenwirkungen. Das Knochenheilungspotenzial eines Medikaments kann zunächst durch In-vitro-Studien bestimmt werden, für den endgültigen Machbarkeitsnachweis sind jedoch In-vivo-Studien erforderlich. Unser Ziel war es, ein Femurosteotomie-Nagetiermodell zu entwickeln, das Forschern helfen könnte, die Entwicklung der Kallusbildung nach einer Fraktur des Femurschaftes zu verstehen und festzustellen, ob ein potenzielles Medikament knochenheilende Eigenschaften hat. Erwachsene männliche Wistar-Albinoratten wurden nach Freigabe durch das Institutional Animal Ethics Committee verwendet. Die Nagetiere wurden betäubt, und unter aseptischen Bedingungen wurden vollständige Querfrakturen am mittleren Drittel der Oberschenkelknochenschaft mittels offener Osteotomie erzeugt. Die Frakturen wurden reduziert und innerlich mit intramedullären K-Drähten fixiert, und die sekundäre Frakturheilung konnte stattfinden. Nach der Operation wurden intraperitoneale Analgetika und Antibiotika für 5 Tage verabreicht. Sequentielle wöchentliche Röntgenaufnahmen beurteilten die Kallusbildung. Die Ratten wurden basierend auf radiologisch vorgegebenen Zeitpunkten geopfert, und die Entwicklung des Frakturkallus wurde radiologisch und immunhistochemisch analysiert.
Introduction
Knochen ist ein dichtes Bindegewebe, das aus knochenbildenden Zellen, den Osteoblasten, und knochenresorbierenden Zellen, den Osteoklasten, besteht. Frakturheilung ist ein physiologischer Prozess, der zur Regeneration von Knochendefekten durch die koordinierte Wirkung von Osteoblasten und Osteoklasten führt1. Bei einer Fraktur sind osteoblastische und osteoklastische Aktivität an der Frakturstelle einige der wichtigen Faktoren, die die Knochenheilung bestimmen2. Wenn die Frakturheilung von ihrem normalen Verlauf abweicht, führt dies zu einer verzögerten Vereinigung, Malunion oder Nichtvereinigung. Eine Fraktur wird als nicht vereint bezeichnet, wenn die Vereinigung der Fraktur für 9 Monate fehlschlägt, ohne dass die Reparatur in den letzten 3 Monaten fortschreitet3. Bei etwa 10%-15% aller Frakturen kommt es zu einer Verzögerung der Reparatur, die zu einer Nichtvereinigung führen kann4. Die Nichtvereinigungsrate für alle Frakturen beträgt 5% -10% und variiert je nach Knochen und Frakturstelle5.
Das derzeitige Regime für die Behandlung der Nichtvereinigung von Frakturen umfasst chirurgische und / oder medizinische Modalitäten. Derzeit können verzögerte oder fehlende Frakturen durch chirurgische Strategien wie Knochentransplantation überwunden werden. Die Knochentransplantation hat jedoch ihre Einschränkungen und Komplikationen wie die Verfügbarkeit von Transplantatgewebe, Schmerzen an der Spenderstelle, Morbidität und Infektion6. Die medizinische Behandlung umfasst osteoanabole Medikamente wie Knochenmorphogenetisches Protein (BMP) und Teriparatid (Parathormonanalogon). Derzeit verwendete osteoanabole Mittel haben das Potenzial, die Reparatur von Frakturen zu verstärken, haben jedoch Einschränkungen wie exorbitante Kosten oder unerwünschte Nebenwirkungen7. Daher besteht Spielraum für die Identifizierung kostengünstiger, nicht-chirurgischer Alternativen für die Knochenheilung. Das Knochenheilungspotenzial eines Medikaments kann zunächst durch In-vitro-Studien bestimmt werden, für den endgültigen Machbarkeitsnachweis sind jedoch In-vivo-Studien erforderlich. Ein Medikament, von dem bekannt ist, dass es die Knochenheilung verbessert, sollte in vitro bewertet werden und, wenn es sich als vielversprechend erweist, für In-vivo-Tiermodellstudien verwendet werden. Wenn sich herausstellt, dass das Medikament die Knochenbildung und den Umbau im In-vivo-Modell fördert, könnte es zur nächsten Stufe (d. H. Klinische Studien) übergehen.
Die Beurteilung der Frakturheilung bei Tieren ist ein logischer Schritt nach vorne, um einen neuartigen Wirkstoff zu bewerten, der für die Knochenheilung eingeführt wurde, bevor er am Menschen getestet wird. Für in vivo Tiermodellstudien zur Frakturheilung sind Nagetiere zu einem immer beliebteren Modell8 geworden. Die Nagetiermodelle haben aufgrund der niedrigen Betriebskosten, des begrenzten Platzbedarfs und der geringeren Zeit für die Knochenheilung zunehmendes Interesse geweckt9. Darüber hinaus verfügen Nagetiere über ein breites Spektrum an Antikörpern und Gentargets, die Untersuchungen zu den molekularen Mechanismen der Knochenheilung und -regeneration ermöglichen10. Eine Konsensussitzung hob verschiedene Knochenheilungsmodelle für Kleintiere umfassend hervor und konzentrierte sich auf die verschiedenen Parameter, die die Knochenheilung beeinflussen, sowie mehrere Kleintierfrakturmodelle und Implantate11.
Grundlegende Bruchmodelle können grob in offene oder geschlossene Modelle unterteilt werden. Geschlossene Frakturmodelle verwenden eine Drei- oder Vierpunktbiegekraft auf den Knochen und erfordern keinen konventionellen chirurgischen Ansatz. Sie führen zu schrägen oder spiralförmigen Frakturen, die langen Knochenbrüchen beim Menschen ähneln, aber die fehlende Standardisierung von Frakturort und -dimensionen kann bei ihnen als Störfaktor wirken12. Offene Frakturmodelle erfordern einen chirurgischen Zugang für die Osteotomie des Knochens, helfen, ein konsistenteres Frakturmuster an der Frakturstelle zu erreichen, sind aber im Vergleich zu den geschlossenen Modellen mit einer verzögerten Heilung verbunden13. Die Wahl des Knochens, der zur Untersuchung der Frakturheilung verwendet wird, bleibt aufgrund ihrer Abmessungen und Zugänglichkeit hauptsächlich die Tibia und der Femur. Die Wahl der Frakturstelle ist in der Regel die Diaphyse oder Metaphyse. Die metaphysäre Region wird speziell in Fällen gewählt, in denen die Frakturheilung bei osteoporotischen Probanden untersucht wird, da die Metaphyse stärker von Osteoporose betroffen ist14. Mehrere Implantate wie Markstifte und externe Fixateure können zur Stabilisierung der Fraktur11,15 verwendet werden.
Das Ziel dieser Studie war es, ein einfaches und leicht verständliches Nagetiermodell zu entwickeln, das Forschern helfen könnte, nicht nur die Entwicklung des Kallus nach einer Femurfraktur zu verstehen, sondern auch zu bestimmen, ob ein potenzielles Medikament knochenheilende Eigenschaften hat, indem es den Mechanismus versteht, durch den es wirkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tierversuche wurden nach ethischer Genehmigung des Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), AIIMS, Neu-Delhi, Indien (286/IAEC-1/2021) durchgeführt.
1. Präoperatives Verfahren
- Männliche Wistar-Albinoratten im Alter von 6 bis 8 Wochen mit einem Gewicht zwischen 150 und 200 g in einer zentralen Tiereinrichtung (CAF) in separaten Einzelkäfigen. Dies stellt sicher, dass keine chirurgische / Frakturstelle verletzt wird, wenn sich mehrere Ratten Käfige teilen.
- Halten Sie die Ratten bei einer Temperatur von 23 °C ± 2 °C in einer feuchtigkeitskontrollierten Umgebung mit einer relativen Luftfeuchtigkeit von 50% ± 5%, setzen Sie sie einem 12-stündigen Dunkel-/Lichtzyklus aus und geben Sie ad libitum Zugang zu Nahrung (halbsynthetische Standarddiät): Pelletdiät (trocken) und Wasser. Die Zusammensetzung der halbsynthetischen Standarddiät ist wie folgt: geröstetes bengalisches Gramm Mehl (60%), Weizenmehl (22%), Kasein (4%), Magermilchpulver (5%), raffiniertes Öl (4%), Salzmischung mit Stärke (4,8%) und Vitamincholinmischung mit Stärke (0,2%).
- Akklimatisieren Sie die Ratten für einen Zeitraum von mindestens 48 Stunden vor der Operation.
- Wiegen Sie jede Ratte auf einer digitalen Waage und notieren Sie das Gewicht.
- Verabreichen Sie den Ratten 15 Minuten vor Beginn des chirurgischen Eingriffs intraperitoneale (IP) Injektionen von Cefuroxim (100 mg/kg Körpergewicht), Tramadol (25 mg/kg Körpergewicht) und einer Kombination von Ketamin (75 mg/kg Körpergewicht) mit Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht). Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um trockene Augen zu verhindern.
- Entfernen Sie die Haare von der rechten unteren Extremität, von der Flankenregion bis zum Kniegelenk, mit topischer Anwendung einer Haarentfernungscreme.
HINWEIS: Blut (0,5 ml) kann aus der Schwanzvene jeder Ratte für die Baseline-Analyse verschiedener Parameter entnommen werden. Blut kann alle 2 Wochen nach der Operation wieder entnommen werden.
2. Chirurgisches Verfahren zur Herstellung einer vollständigen Querfraktur durch offene Osteotomie
HINWEIS: Verwenden Sie einen ausgewiesenen Operationssaal mit einem Operationstisch und optimaler Umgebungstemperatur (26 °C) für die Durchführung des Eingriffs.
- Legen Sie den Wachsblock (Aluminiumschale 30 cm x 30 cm x 4 cm mit Wachs bis zu einer Tiefe von 2,5 cm) auf den OP-Tisch und decken Sie ihn mit sterilen Abdecktüchern ab. Der Wachsblock verhindert jede Veränderung der Position des Tieres während der Operation.
- Bestätigen Sie den Beginn der Anästhesie (durch Überprüfung des Verlusts der Zehenklemme). Legen Sie die betäubte Ratte auf einen sterilen Vorhang in der linken Seitenlage. Bitten Sie einen Assistenten, die rechte untere Extremität (Knie und Hüfte) in Streckung zu halten. Halten Sie eine sterile harte Stütze (Marmorblock) unter dem rechten Bein, um den Femur zu stützen. Reinigen Sie die Operationsstelle mit Alkohol und Betadin.
- Injizieren Sie Lokalanästhesie (0,25 ml 1% Lignocain) an der Inzisionsstelle (lateraler Aspekt des rechten Oberschenkels), schneiden Sie ein Loch in einen anderen sterilen Vorhang und legen Sie nur das rechte Bein der Ratte für die Operation frei.
- Geben Sie einen 1 cm langen vertikalen Hautschnitt an der seitlichen Seite des rechten Oberschenkels und verlängern Sie ihn nach Bedarf mit einer chirurgischen Klinge Nr. 15.
- Legen Sie den Musculus vastus lateralis frei, indem Sie die tiefe Faszie mit der Metzenbaum-Schere trennen. Teilen Sie den Vastus lateralis mit einer Arterienzange in Linie mit den Muskelfasern, bis der Schaft des Femurs erreicht ist.
- Befreien Sie den Knochen mit dem Periost-Aufzug von den daran befestigten Muskeln.
- Injizieren Sie eine Lokalanästhesie (0,2 ml 1% Lignocain) in und um das Periost, um einen vasovagalen Reflex zu verhindern.
- Erstellen Sie eine Vertiefung im mittleren Drittel des Femurschaftes mit der chirurgischen Klinge Nr. 15 und brechen Sie den Knochen im mittleren Drittel des Schaftes (vollständige Fraktur), indem Sie einen Meißel auf die Vertiefung legen (damit der Meißel nicht verrutscht) und den Meißel vorsichtig mit einem Hammer klopfen. Verwenden Sie die sterile harte Stütze (Marmorblock), um den Knochen zu stützen, während Sie ihn brechen, um einen sauberen Bruch zu gewährleisten.
HINWEIS: Die sterile harte Stütze verursacht normalerweise keine signifikante Verletzung der darunter liegenden Muskeln. - Fixieren Sie den Bruch intern mit einem sterilen K-Draht (1,0 mm), der mit Hilfe einer batteriebetriebenen Bohrmaschine gehalten wird. Führen Sie den K-Draht durch die Bruchstelle in den Markkanal des distalen Fragments. Bohren Sie dann den K-Draht mit der batteriebetriebenen Bohrmaschine durch das distale Ende des Femurs.
HINWEIS: Desinfizieren Sie die Oberfläche der Bohrmaschine vor Gebrauch mit Alkohol. Wechseln Sie die Handschuhe, nachdem der K-Draht befestigt ist. - Nachdem Sie die Fraktur reduziert haben, schieben Sie den K-Draht vom distalen Ende in den Kanal des proximalen Fragments, bis er in der Trochanterregion gekauft wird. Schneiden Sie den distalen Teil des K-Drahtes, der durch die Haut ragt, mit einem Drahtschneider ab.
- Biegen Sie die Spitze des K-Drahtes mit einer Zange um etwa 90° und verwenden Sie eine mit Betadin getränkte Mullbinde zum Pin-Site-Dressing. Der K-Draht wirkt als Markschiene, um die Fraktur in einer reduzierten Position zu halten.
- Stellen Sie eine vollständige Blutstillung sicher, bevor Sie die Haut mit einer 3-0-Nylonnaht schließen. Üben Sie Druck auf den Blutungsbereich mit steriler Gaze oder Arterienzange aus, um Blutungen zu stoppen.
- Reinigen Sie die Wunde mit Betadin und bedecken Sie sie mit steriler Gaze und Mikroporenklebeband.
3. Nachsorge
- Bringen Sie die Ratten in ihre Käfige zurück, lassen Sie eine normale Gehfähigkeit zu und geben Sie weiterhin eine halbsynthetische Standarddiät, bis sie geopfert werden, sowie Antibiotika (Injektion Cefuroxim 100 mg / kg) und Analgetika (Injektion Tramadol 25 mg / kg / Tag in zwei geteilten Dosen) intraperitoneal für 5 Tage nach dem Eingriff.
HINWEIS: Die Ratten können in Behandlungs- und Kontrollgruppen eingeteilt werden, um ein bestimmtes Medikament zu testen. Wenn das Medikament wasserlöslich ist, kann es oral durch Gavage verabreicht werden. Das Gewicht der einzelnen Tiere kann notiert werden, um die Dosis des zu verwendenden Arzneimittels zu berechnen. Ein- und Ausschlusskriterien können befolgt werden, um die Homogenität der Tiergruppen zu gewährleisten. - Unterbringung der Tiere in Einzelkäfigen unter ähnlichen Bedingungen wie in der präoperativen Phase. Untersuchen Sie die Operationsstelle jeden Tag, um nach Anzeichen von postoperativen Schmerzen, Wundinfektionen, Verrutschen von Nähten oder Bauchschwellungen oder Beschwerden zu suchen.
- Beurteilen Sie die Knochenheilung einmal wöchentlich durch Röntgenaufnahme der gebrochenen Stelle.
4. Radiologisches Verfahren
- Vor dem Röntgen werden die Ratten mit einer intraperitonealen Injektion von Ketamin (50 mg/kg Körpergewicht) und Xylazin (5 mg/kg Körpergewicht) betäubt.
- Halten Sie das Hüftgelenk der Ratte in einer gebeugten und abduktiven Position, während das Kniegelenk halb gebeugt gehalten wird, um die Röntgenaufnahme der gebrochenen Extremität mit den folgenden Belichtungseinstellungen zu machen: Ref. kVp ≈ 62; mAS = 6,4; und automatische Belichtungseinstellungen (Ref. mA=160).
HINWEIS: Röntgenaufnahmen wurden zu Studienbeginn (1 Tag nach der Operation) und dann einmal wöchentlich bis zum Opfer oder 5 Wochen gemacht.
5. Tiereuthanasie und Kallusentnahme
- Opfern Sie die Ratten durch eine Überdosis Kohlendioxid (Verabreichung von 100%CO2 bei einer Flussrate von 7-8 l / min für 1 Minute, gefolgt von einer Wartezeit von 4-5 Minuten) zu zwei zuvor festgelegten Zeitpunkten, basierend auf dem radiologischen Erscheinungsbild von weichen bzw. harten Überbrückungsschwielen.
- Schneiden Sie die Haut parallel zum Femur und trennen Sie die darüber liegenden Muskeln vorsichtig, um eine Schädigung des Hornhautgewebes zu vermeiden.
- Brechen Sie den Knochen zwischen Hüftgelenk und Hornhautgewebe mit Hammer und Meißel. Ebenso brechen Sie den Knochen zwischen dem Kallus und dem Kniegelenk. Entfernen Sie den K-Draht und reinigen Sie das Knochenstück in Kochsalzlösung, um Blutgerinnsel und Weichteile zu entfernen.
- Den Hornhaut sofort in einen beschrifteten Behälter mit 10% neutralem gepuffertem Formalin (20 ml pro Probe) geben und 3 Tage bei Raumtemperatur (RT) aufbewahren.
6. Entkalkung von Knochen- und Kallusgewebe
- Nehmen Sie das Hornhautgewebe aus Formalin und halten Sie es bei RT in 20% ETDA-Lösung, pH 7, zur Entkalkung des Knochengewebes.
- Wechseln Sie die frische EDTA-Lösung alle 2 Tage für ca. 3 Wochen und überprüfen Sie die Knochenentkalkung, indem Sie den Knochen mit einer Nadel anstoßen, ohne das Hornhautgewebe zu stören. Eine optimale Entkalkung wird durch den Verlust des normalen körnigen Gefühls des Knochengewebes bezeichnet.
- Nach vollständiger Entkalkung schneiden Sie den sagittalen Abschnitt des Kallus ab und bereiten Paraffinblöcke des Kallusgewebes vor. Schneiden Sie 4 μm dicke Abschnitte des Hornhautgewebes für histopathologische16 und jede andere vergleichende Analyse17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diese Studie wurde durchgeführt, um ein Femurosteotomiemodell bei Wistar-Albinoratten zu entwickeln. Dieses Modell kann verwendet werden, um die Knochenheilung sowie die osteogene Wirkung eines vielversprechenden osteoanabolen Medikaments bei der Knochenheilung zu bewerten. Die üblichen chirurgischen Vorsichtsmaßnahmen und Protokolle wurden befolgt. Für den Eingriff wurden sterile Kittel, Abdecktücher und chirurgische Geräte verwendet (Abbildung 1). Das Gerät (Tabelle 1) wurde 48 Stunden vor der Operation sterilisiert. Anästhetika, Analgetika und Antibiotika wurden gemäß dem Protokoll verwendet, um sicherzustellen, dass die Tiere jederzeit schmerz- und infektionsfrei gehalten wurden. Blut (0,5 ml) kann aus der Schwanzvene jeder Ratte zur Baseline-Analyse und sequentiellen chronologischen vergleichenden Nachverfolgung verschiedener Parameter entnommen werden, wenn die Frakturheilung auftritt. Die Haare wurden von der Flankenregion bis zur Knieregion mit einer Haarentfernungscreme entfernt (Abbildung 2). Die Osteotomie dauerte ca. 10 Minuten (vom ersten Schnitt bis zur Naht). Infektion und Mortalität waren nach aseptischen Vorsichtsmaßnahmen vernachlässigbar. Nach örtlicher Betäubung (Lignocain) wurde ein Schnitt gemacht, und der Femurschaft wurde freigelegt, nachdem die Fasern des Vastus lateralis zurückgezogen wurden (Abbildung 3). Mit einer chirurgischen Klinge wurde eine Vertiefung (Rille) im Knochen erzeugt, um sicherzustellen, dass der Meißel nicht verrutschte. Eine sterile harte Stütze (Marmorblock) wurde verwendet, um den Knochen zu stützen, während er gebrochen wurde, um einen sauberen Bruch zu gewährleisten (Abbildung 1). Im mittleren Drittel des Femurschaftes wurde mit Meißel und Hammer ein vollständiger Querbruch induziert (Abbildung 4).
Der Bruch wurde intern mit einem sterilen K-Draht (1,0 mm) fixiert. Der K-Draht wurde durch die Bruchstelle in den Markkanal des distalen Fragments geführt. Der K-Draht wurde dann durch das distale Ende des Femurs gebohrt. Die Fraktur wurde reduziert, und dann wurde der K-Draht vom distalen Ende in den Kanal des proximalen Fragments vorgeschoben, bis er in der Trochanterregion gekauft wurde. Der distale Teil des K-Drahtes, der durch die Haut ragte, wurde abgeschnitten. Der K-Draht wirkte als Markschiene, um die Fraktur in einer reduzierten Position zu halten (Abbildung 5).
Eine Röntgenaufnahme des gebrochenen Bereichs wurde 1 Tag nach der Operation und danach wöchentlich gemacht, um das Aussehen des Kallus (Beginn der Frakturheilung) und das Auftreten des überbrückenden Kallus (der erste Zeitpunkt, zu dem die Frakturlücke geheilt wurde) zu beurteilen, wie vom Radiologen bewertet (Abbildung 6). Zwei radiologische Zeitpunkte zur vergleichenden Beurteilung der Frakturheilung waren das Auftreten (Visualisierung) des (weichen) Kallus und das Auftreten des überbrückenden (harten) Kallus.
Nach dem Opfer wurde der Femur sorgfältig in Formalin konserviert, gefolgt von dem Protokoll zur Knochenentkalkung (Abbildung 7). Der K-Draht wurde während des Opfers entfernt, wobei darauf geachtet wurde, die Hornhaut nicht zu stören. Nach vollständiger Entkalkung wurde der Knochen in sagittale Abschnitte geschnitten und bei Bedarf in Paraffinblöcken zum Schneiden (4 μm dicke Abschnitte) konserviert. Ein Hämatoxylin- und Eosin-gefärbter Abschnitt der Frakturstelle und des Kallus bestätigte Knorpel- und Knochenneubildung nach Ablauf von 5 Wochen (Abbildung 8).
Abbildung 1: Sterile chirurgische Instrumente, die auf dem OP-Tuch auf dem Operationstisch aufbewahrt werden. Der Chirurg ist bereit, den chirurgischen Eingriff in einer sterilen Umgebung mit sterilen Instrumenten zu beginnen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Anästhesierte Ratte auf dem Operationstisch. Nach der Anästhesie der Ratte und dem Entfernen der Haare um die Inzisionsstelle wird sie in einer linken seitlichen Position auf dem Operationstisch aufbewahrt, wobei das rechte Bein für die Osteotomie freigelegt wird. Ein weiterer chirurgischer Tuch wird verwendet, um das rechte Bein durch ein Loch in diesem Vorhang zu führen, um sicherzustellen, dass nur das Bein freiliegt, wodurch Wundinfektionen minimiert werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Chirurgischer Eingriff: Freilegung des Schaftes des Rattenfemurs. Während der Osteotomie, nachdem der Vastus lateralis freigelegt wurde, wird er in Linie mit den Muskelfasern gespalten, um den Schaft des Femurs freizulegen. Der Knochen wird mit dem Periostlift von den anhaftenden Muskeln befreit. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Erstellung einer vollständigen Querosteotomie im mittleren Drittel des Femurschaftes mit Meißel und Hammer. Ein vollständiger Querbruch wird im mittleren Drittel des Femurschaftes erzeugt, indem der Meißel vorsichtig mit dem Hammer geschlagen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: K-Draht wirkt als Markschiene, um die Fraktur in einer reduzierten Position zu halten. Der K-Draht wird durch die Bruchstelle in den Markkanal des distalen Fragments geleitet. Der K-Draht wird dann durch das distale Ende des Femurs ausgebohrt. Die Fraktur wird reduziert und dann wird der K-Draht vom distalen Ende in den Kanal des proximalen Fragments vorgeschoben, bis er in der Trochanterregion gekauft wird. Dies geschieht mit einer batteriebetriebenen Bohrmaschine. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 6: Röntgenaufnahme des Oberschenkelknochens der Ratte mit dem K-Draht in situ . (A) Vor der Einleitung der Fraktur und (B) 1 Tag nach der Operation. Die Frakturheilung wird radiologisch überwacht, indem sequentielle wöchentliche Röntgenaufnahmen der operierten Stelle durchgeführt werden, um die Kallusbildung radiologisch zu beurteilen. Die Fraktur bleibt reduziert und mit dem intramedullären K-Draht immobilisiert. Die repräsentativen Vorher-Nachher-Daten stammen nicht vom selben Tier. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 7: Knochen mit Kallus (nach optimaler Entkalkung), der nach dem Opfern des Tieres zu einem vorher festgelegten Zeitpunkt erhalten wurde. (A) Intakter Kallus; (B) Sagittaler Abschnitt des Kallus. Nach dem Opfern des Tieres wird der Bereich der Bruchstelle mit der beschriebenen Methodik gewonnen, konserviert und entkalkt. Der Kallus wird intermittierend beurteilt, um eine optimale Entkalkung zu gewährleisten, bevor er mit anderen Techniken (Referenzskala in Zentimetern) bewertet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 8: Hämatoxylin- und Eosin-gefärbter Abschnitt der Frakturstelle mit hartem Kallus unter Bildung von Knorpel und neuem Knochen. (A) Geringe Vergrößerung; (B) Hohe Vergrößerung. Die Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Abschnitte der Frakturstelle zeigen einen harten Kallus mit der Bildung von Knorpel (schwarze Pfeile) und neuem Knochen (gelbe Pfeile) (A: 40x; B: 100x). Der blaue Pfeil zeigt das Frakturende des Knochens und der rote Pfeil zeigt die zweite kortikale Region. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Diese Methode beschreibt klar die Details, die für die Entwicklung eines Frakturosteotomiemodells bei Wistar-Albinoratten erforderlich sind. Dieses Modell kann verwendet werden, um die osteogene Wirkung eines vielversprechenden osteoanabolen Medikaments bei der Frakturheilung zu bewerten und die Feinheiten der Knochenheilung zu verstehen. Das hervorstechende Merkmal dieser Methode ist, dass sie einfach ist und nicht zu viel Zeit oder anspruchsvolle Ausrüstung benötigt. Bei dieser Methode wurden erwachsene männliche Wistar-Albinoratten als Nagetiermodell für die Experimente ausgewählt. Das einheitliche Geschlecht wurde gewählt, um Störfaktoren für die Knochenheilung im Zusammenhang mit den Sexualhormonen zu beseitigen.
Diese Studie folgte dem Verfahren der offenen Osteotomie, das dem anderer Gruppen sowie anderer Kleintiermodelle ähnelt11,18,19. Der Vorteil der offenen Osteotomie, die bei dieser Methode gegenüber anderen Knochenheilungsmodellen verfolgt wird, besteht darin, dass die verletzungsinduzierte (vollständige kortikale Knochenfraktur) einem regelmäßigen langen Knochenbruch ähnelt und die Frakturheilung bei dieser Methode der einer regelmäßigen Fraktur ähnelt, bei der eine sekundäre Knochenheilung (enchondrale Ossifikation) durch Kallusbildung stattfindet, verglichen mit einer Bohrlochknochenverletzung. bei primärer Knochenheilung (intramembranöse Ossifikation)20. Die Methode der offenen Osteotomie ist auch besser als die geschlossene Osteotomie oder die Dreipunkt-Druckinduzierende Methode, bei der die Möglichkeit eines Knochenbruchs und einer großen Disparität in der Frakturlinie besteht, was zu einem Unterschied in der Frakturheilung führt21. Die offene Osteotomie erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Wundinfektion im Vergleich zur geschlossenen Osteotomie, aber ähnlich wie in anderen Studien beobachteten wir, dass die Wundinfektion bei geeigneten Vorsichtsmaßnahmen vernachlässigbar war22. Es wurde auch bei dieser Methodik beobachtet, dass das Erzeugen einer Rille (Vertiefung) auf dem Knochen mit einer Klinge vor dem Brechen mit einem Meißel und Hammer dazu diente, eine gleichmäßige Bruchlinie zu erzeugen und ein Verrutschen des Meißels auf dem Knochen zu vermeiden. Eine weitere Modifikation, die wir bei dieser Methode eingeführt haben, bestand darin, einen harten, sterilen Block unter dem Knochen zu halten, der gebrochen werden sollte. Dies stellte nicht nur eine Gegenkraft bei der Entstehung des Bruchs dar, sondern half auch, Splitter, Quetschungen oder eine unregelmäßige Bruchlinie zu vermeiden. Dies verursacht normalerweise keine signifikanten Verletzungen der darunter liegenden Muskeln.
Unsere Studie verwendete Röntgenstrahlen, um die Zeitpunkte des Opfers basierend auf dem radiologischen Erscheinungsbild des Kallus als erster Zeitpunkt und dem Auftreten des überbrückenden (harten) Kallus als zweiter Zeitpunkt bei den Tieren zu bestimmen, bevor das vollständige Experiment begann. Die gesamte Vergleichsgruppe von Tieren sollte geopfert werden, wenn eine Behandlungs- oder Kontrollgruppe einen bestimmten Zeitpunkt erreicht, um ihre Schwielen mittels immunhistochemischer Analyse osteoblastischer und osteoklastischer Marker zu vergleichen. Dies gewährleistet einen unvoreingenommenen Vergleich zwischen den verschiedenen Behandlungs- und Kontrollgruppen. Die Röntgenaufnahme der gebrochenen Stelle der Ratten sollte in wöchentlichen Abständen durchgeführt werden, und Blutproben (Schwanzvene) sollten in Abständen von 2 Wochen entnommen werden, bis sie die jeweiligen Opferzeitpunkte erreichen. Wöchentliche Röntgenaufnahmen wurden (unter Narkose) durchgeführt, um die Hornhautbildung durch den Radiologen (der für die Kontroll- und Behandlungsgruppen blind war) zu beurteilen. Die Röntgenstrahlen halfen auch, die biologischen Parameter der Knochenheilung zu untermauern und zu bestätigen.
Diese Methode beinhaltet die Anwendung eines K-Drahtes als intramedulläre Schiene, um die Fraktur in einer reduzierten Position immobilisiert zu halten. Die intramedulläre Stiftfixierung bietet jedoch keine absolute Stabilität der Fraktur, ebenso wie die Beschichtung und externe Fixatoren, und kann manchmal mit Komplikationen wie Wundinfektion, Pinmigration, Perforation des Femurschaftkortex usw. verbunden sein. Unsere Studie legt auch nahe, dass es besser ist, Lignocain in und um das Periost zu injizieren, das extrem schmerzempfindlich ist. Dies verhindert starke Schmerzen und die Möglichkeit eines neurogenen Schocks während der Osteotomie. Es wurde auch beobachtet, dass eine geringe Begrenzung des Volumens der intraperitonealen Injektionen dazu beitrug, nachfolgende Atemnot bei den Ratten zu minimieren. Analgetika und Antibiotika wurden 5 Tage nach der Operation fortgesetzt, um Schmerzen oder Infektionen zu vermeiden. Für diese Studie wurde der Femur für die Induktion von Frakturen ausgewählt, da er leicht zugänglich, leicht sauber zu brechen und wegen seiner geraden Kontur, die für das Einführen von K-Draht einfacher ist, leicht zu brechen war. Vorsicht ist geboten, wenn der K-Draht in das proximale Fragment des Femurs vorgeschoben wird, da die Gefahr von Blutungen durch Verletzung der Oberschenkelarterie besteht. Es wurde beobachtet, dass Ratten dazu neigen, den K-Draht herauszuziehen, wenn zu viel Restdraht aus der Haut herausragt.
Die Parameter für das Ergebnis der Knochenheilung sind osteoblastische und osteoklastische Marker im Blut und Kallus der Tiere (verschiedener Gruppen und verschiedener Zeitpunkte). Für osteoblastische Marker konnten Osteocalcin, Col1A1, RANKL, P1NP und knochenspezifische alkalische Phosphatase ausgewählt werden, während CTX und RANK zur Bewertung der osteoklastischen Aktivität bewertet werden konnten. Einige dieser Parameter können im Serum ausgewertet werden, während andere durch Immunhistochemie in Kallusgewebe ausgewertet werden können. Diese Parameter geben einen ganzheitlichen Blick auf den Knochenumbau durch gleichzeitige Bewertung der osteoblastischen und osteoklastischen Aktivität.
Die Einschränkung dieser Studie besteht darin, dass sie die Zugfestigkeit des Kallus nicht bewertet. Im Idealfall schaffen biomechanische Studien einen Mehrwert für Daten. Bei der Verarbeitung des Kallus und des angrenzenden Knochengewebes zur Entkalkung ist Vorsicht geboten, da eine unvollständige Entkalkung in der Immunhistochemie keine optimalen Ergebnisse liefert.
Dieses Protokoll zur Beurteilung der Frakturheilung anhand des Nagetiermodells wird für alle Gruppen nützlich sein, die versuchen, vielversprechende Medikamente mit osteoanaboler Aktivität zu bewerten. Es ist ein einfaches Modell, um die Knochen- und Frakturheilung im Nagetiermodell genau zu beurteilen und gleichzeitig die osteoblastische und osteoklastische Aktivität und den Knochenumbau zu bewerten, die nützliche mechanistische Erkenntnisse liefern. Wenn Ressourcen und Logistik rund um die Anzahl der Tiere zulässig sind, können biologische Indikatoren auch durch die radiologische Beurteilung der Frakturheilung sowie den Vergleich der Zugfestigkeit, der die mechanische Statur des verheilten Knochens beurteilt, verstärkt werden. Studien, die den Wirkmechanismus aufklären, werden rein beobachtenden Studien vorgezogen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keiner der Autoren hat Interessenkonflikte oder andere finanzielle Offenlegungen.
Acknowledgments
Die Autoren danken dem Central Council for Research in Homoeopathy (CCRH), Ministry of AYUSH, Govt. of India, für die Forschungsförderung. Die Autoren sind dankbar für die Hilfe und Unterstützung der Central Animal Facility, AIIMS, Neu-Delhi, für ihre Hilfe und Unterstützung bei den Tierversuchen und CMET, AIIMS, Neu-Delhi, für ihre Hilfe und Unterstützung bei Fotografie und Videografie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
References
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W.
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. Sioud, M. , Humana Press. Totowa, NJ. (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 5 Suppl 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
