Summary
Burada, Caenorhabditis elegans genomik DNA'sının ticari olarak temin edilebilen bir doku kiti kullanılarak bir veya birkaç hayvandan basit ve nispeten hızlı bir şekilde izole edilmesinin bir açıklaması sunulmaktadır. Elde edilen gDNA preparatı PCR için uygun bir şablondur.
Abstract
Tek veya birkaç Caenorhabditis elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu, genotipleme hatları, klonlama ve dizileme için PCR dahil olmak üzere birçok aşağı akış uygulamasına sahiptir. C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonu için geleneksel proteinaz K bazlı yöntemler birkaç saat sürer. C. elegans kütikülünü etkili bir şekilde açan ve genomik DNA'yı çıkaran ticari ekstraksiyon kitleri sınırlıdır. Sınıf ve araştırma uygulamaları için iyi çalışan C. elegans genomik DNA'sını çıkarmak için kolay, daha hızlı (~ 15 dakika) ve uygun maliyetli bir yöntem burada bildirilmiştir. Bu DNA ekstraksiyon yöntemi, PCR gerçekleştirmek için güvenilir bir şablon elde etmek için başlangıç materyali olarak tek veya birkaç geç larva (L4) veya yetişkin nematodları kullanmak üzere optimize edilmiştir. Sonuçlar, DNA kalitesinin, farklı boyutlardaki gen hedeflerini PCR ile yükseltmek için uygun olduğunu ve reaksiyon başına tek bir yetişkinden genomik DNA'nın ellide birine kadar seyreltmelerde bile tek veya birkaç hayvanın genotiplenmesine izin verdiğini göstermektedir. Bildirilen protokoller, PCR tabanlı uygulamalar için tek veya küçük bir C. elegans örneğinden DNA şablonunu hızlı bir şekilde üretmek için güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Introduction
Burada, DNA'yı PCR tabanlı uygulamalar için erişilebilir kılmak amacıyla Caenorhabditis elegans'ın lizisi için iki ilgili protokol sunulmuştur. PCR, diğerlerinin yanı sıra klonlama ve dizileme için DNA fragmanlarının genotiplenmesi ve çoğaltılması da dahil olmak üzere birçok uygulama için kullanılan yaygın olarak kullanılan bir moleküler tekniktir. Küçük (1 mm), serbest yaşayan yuvarlak kurt C. elegans, biyolojik araştırmalar için popüler bir hayvan sistemidir. Tek bir hayvandan veya birkaç hayvandan uygun genomik DNA elde etmek, diziyi PCR ile yükseltmek için yeterlidir. Geç L4 larvaları ve yetişkinleri, utero 1'de sadece ~ 1.000 somatik hücre (bazı çoklu nükleer, poliploid hücreler dahil), germ hücreleri ve (hayvan gravid bir hermafrodit ise) yavru içerir. Bununla birlikte, bu hayvanlar genomik DNA2'yi çıkarmak için bozulması gereken bir kütikül ile korunmaktadır. PCR için nematod genomik DNA şablonu hazırlamak için standart yöntemler birden fazla adım içerir ve birkaç saat sürer. Hayvanlar ilk önce proteinaz K (-70 ° C veya altı) içeren solucan lizis tamponunda en az 15-45 dakika (bazı protokoller tarafından daha uzun süre tavsiye edilir) 3,4,5,6 dondurulur. Bu adım hayvanları açar.
Dondurulduktan sonra, proteinleraz K'nın çalışması için hayvanlar 60-65 ° C'de 1 saat inkübe edilir, daha sonra enzim 95 ° C'de 15-30 dakika boyunca inaktive edilir. Proteinaz K, DNA'yı bozan nükleazları yok eder. PCR'den önce proteinaz K'nın inaktivasyonu, proteinaz K'nın DNA polimerazı bozmasını önlemek için önemlidir. Burada açıklanan iki kit tabanlı protokol, günlük araştırma ve öğretim laboratuar uygulamaları için tek bir hayvandan veya birkaç nematoddan genomik DNA'yı çıkarmak için hızlı, güvenilir ve uygun maliyetli yöntemlerdir. Kullanılan kit başlangıçta üretici tarafından hayvan dokusundan, tükürükten ve saçtan DNA çıkarmak için optimize edildi7. Hücreleri lize etmek ve genomik DNA'yı erişilebilir kılmak için tescilli bir doku hazırlama çözeltisi ve ekstraksiyon çözeltisi kullanır. Tescilli bir nötralizasyon çözeltisi daha sonra PCR'yi inhibe edebilecek bileşenleri nötralize eder (örneğin, tuzlar, iyonlar ve Mg2 + bağlayıcı moleküller).
Genotipleme yaparken, tek bir hayvan test edilebilir. Bir suşun homozigot olup olmadığını belirlerken, tek bir hayvandan altı veya daha fazla yavruyu test etmek, bir çizginin homozigot olup olmadığına dair yüksek güven verir (heterozigot bir ebeveynden altı homozigot mutant soyunun rastgele seçilme şansı% 0.02'dir [(1/4)6 ×% 100 =% 0.02]). Bu yöntem 1) proteinaz K yönteminden daha az adımla basittir ve 2) şablon hazırlama süresini 15 dakikaya düşürür. Bu çalışmadaki sonuçlar, geliştirilen protokolün, PCR de dahil olmak üzere yüksek oranda saflaştırılmış DNA gerektirmeyen aşağı akış uygulamaları için güvenilir bir şekilde kullanılabilen tek veya birkaç solucandan genomik DNA'nın çıkarılmasında sağlam bir şekilde çalıştığını göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. elegans bakımı
NOT: N2 (vahşi tip) ve blmp-1 (tm548) C. elegans suşları standart nematod büyüme ortamı (NGM) plakaları üzerinde 20 °C'de tutulmuştur.
- 23.005 g NGM tozunu 973 mL su içinde 2 L'lik bir şişede çözerek NGM plakalarını hazırlayın. Şişe açıklığını alüminyum folyo (veya havalandırmaya izin veren otoklavlanabilir kapak) ile örtün ve kaplamayı otoklav bantla sabitleyin. Tozu çözmek ve içeriği en az 30 dakikalık bir sterilizasyon döngüsü ile sterilize etmek için otoklav.
- Ortamı bir su banyosunda 60 ° C'ye soğutun.
- Soğutulmuş ortama 25 mL steril 1 M fosfat (KH2PO4) tamponu, pH 6.0 ekleyin; 1 mL 1 M kalsiyum klorür çözeltisi; ve 1 mL 1 M magnezyum sülfat çözeltisi.
- Homojen bir karışım elde etmek ve düzensiz soğutma ve katılaşma (~ 5 dakika) önlemek için ortamı manyetik bir karıştırma plakası üzerinde karıştırın. Karıştırma çubuğunun bir vorteks oluşturacak kadar hızlı döndüğünden, ancak kabarcıkların ortaya çıkacağı kadar hızlı olmadığından emin olun (~ 250-300 rpm).
- Her 10 cm'lik Petri plakasına (toplamda ~ 40 plaka) ortamın ~25 mL'sini dökün. Plakaları gece boyunca oda sıcaklığında (tipik olarak 16-25 ° C) kurulayın.
- Bir Escherichia coli OP50 kolonisini 37 ° C'de gece boyunca 30-50 mL LB suyunda büyütün.
- Her plakayı 500 μL E. coli OP50 kültürü ile tohumlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığında kurumasını bekleyin (tipik olarak 16-25 ° C)8. Plakaları 4 ° C'de 3 haftaya kadar saklayın.
- C. elegans'ı bir tel toplama veya başka bir yöntem kullanarak tohumlanmış plakalara aktarın ve suş için gereken sıcaklıkta L4 veya yetişkin aşamasına büyümelerine izin verin (tipik olarak 16-25 ° C, hayvanlar dauer olarak aç bırakılmışsa 1-2 gün, hayvanlar embriyo olarak kaplanmışsa 3-4 gün)8.
2. Tek solucanlı DNA ekstraksiyonu
NOT: Bu yöntem, DNA'yı tek bir solucandan (toplam hacmin 1,8 μL'sinde bir solucan) çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla solucan lize edilecekse bir ana karışım yapılabilir.
- Bir termosikler, 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).
- Aliquot 0.8 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.2 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
- Diseksiyon mikroskobu altında bir L4 veya yetişkin hayvanı tanımlayın9. L4 hermafroditlerini tanımlamak için, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulva arayın. Yetişkin hermafroditleri, uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilecek plakadaki en büyük hayvanları arayarak tanımlayın.
- Bir platin tel çekme kullanarak, seçilen hayvanı çözelti10'a aktarın.
- Borunun altındaki içeriği toplamak için tüpü oda sıcaklığında kısaca (2-3 sn, ≤6.000 rpm / 2.000 × g) santrifüj yapın.
- Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 2.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.
- Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinin 0.8 μL'sini ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
- Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
- Lisatı PCR için doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir7.
3. Birkaç kişinin DNA ekstraksiyonu
NOT: Bu yöntem, birkaç solucandan DNA çıkarmak için kullanışlıdır. Aynı anda birden fazla suş lize edilecekse bir ana karışım hazırlanabilir.
- Termosikler'i 10 dakika boyunca 55 ° C'de bir döngü için programlayın, ardından 3 dakika boyunca 95 ° C (lizis programı).
- Aliquot 2.0 μL ekstraksiyon çözeltisinin kitinden buz üzerindeki 0.2 mL'lik bir PCR tüpünün iç duvarına kadar. Kitten ekstraksiyon çözeltisinin damlacığına 0.5 μL doku hazırlama çözeltisi ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
- L4 veya yetişkin hayvanları diseksiyon mikroskobu altında tanımlayın9. L4 hermafroditleri, hayvanın ortasında soluk bir yarım daire olarak görülebilen karakteristik bir vulvaya sahiptir. Yetişkin hermafroditler plakadaki en büyük hayvanlardır ve uteruslarında görülebilen oval embriyolara sahip olabilirler.
- Bir platin tel toplama kullanarak, birkaç hayvanı çözeltiye aktarın: 9 hayvan, 0.5 μL lizat başına 1 hayvan eşdeğeri genomik DNA verir ve 16 hayvan, 0.25 μL'de (3.5 nematod / μL) 10'da ~ 1 hayvan eşdeğeri genomik DNA verir.
NOT: Bu hacme 16'dan fazla hayvan aktarmak zordur. - Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
- Tüpü termosikler içine yerleştirin ve Adım 3.1'de ayarlanmış lizis programını çalıştırın.
- Program tamamlandığında, tüpü kısaca santrifüj edin ve buzun üzerine yerleştirin. Kitten karışıma nötralizasyon çözeltisinden 2 μL ekleyin. Pipetleme ile karıştırın.
- Tüpü oda sıcaklığında kısa bir süre santrifüj yapın (2-3 s, ≤6.000 rpm/2.000 × g).
- PCR için lizizi doğrudan kullanın veya ileride kullanmak üzere 4 °C veya -20 °C'de saklayın.
NOT: Ekstrakte edilen DNA, en az 6 ay boyunca 4 °C veya -20 °C'de stabildir7.
4. PCR reaksiyonu
NOT: Bu solucan lizis tekniğinin, hızlı bir polimeraz kullanarak bir delesyon mutasyonunu tespit eden bir aşağı akış uygulaması açıklanmaktadır. İki solucan lizis protokolünün, reaksiyon başına bir solucanın 1 /50'sine kadar seyreltmelerde başarılı PCR için genomik şablon DNA üretmedeki etkinliği de gösterilmiştir.
- Yukarıda Adım 2 ve Adım 3'te açıklandığı gibi, vahşi tip N2 ve mutant suşlar kullanarak tek bir solucandan ve 16 solucandan DNA çıkarın.
- Vahşi tip N2 hayvanlarından tek solucanlı DNA'nın 2, 10, 20 ve 50 kat seyreltilmesini hazırlayın.
- İlgilenilen sıraya özgü primerler ve hot-start PCR ana karışımı kullanarak üreticinin protokolünü izleyerek PCR reaksiyonlarını ayarlayın (Tablo 1 ve Tablo 2). Her reaksiyonda şablon olarak 1 μL seyreltilmemiş DNA veya 2 μL seyreltilmiş DNA kullanın.
- PCR ürünlerini jel elektroforezi ve görüntüleme11 ile onaylayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tek veya birkaç vahşi tip yetişkinden genomik DNA, bu iki yöntemin etkinliğini karşılaştırmak için ticari kit veya geleneksel lizis protokolü kullanılarak ekstrakte edildi. Bu lizatlar daha sonra PCR'nin ~ 2.100 bp'lik daha büyük bir hedefi (blmp-1'i kodlama) veya ~ 500 bp'lik daha küçük bir hedefi (sma-10'un bir bölümünü kodlama) yükseltmesi için şablonlar olarak kullanıldı. Her iki yöntem de uygun PCR ürünlerini başarıyla vermiştir (Şekil 1A).
Daha sonra, kit ekstrakte edilmiş genomik DNA'nın çeşitli DNA polimerazları için şablon olarak hizmet etme kabiliyeti gösterilmiştir. Ekstrakte edilen genomik DNA, farklı yeteneklere (hız, doğruluk ve ürün boyutu dahil) sahip dört polimeraz kullanarak 0.5 kb'lik bir ürünü yükseltmek için şablon olarak kullanıldı. Beklenen boyutlardaki ürünler, bu polimerazlar tarafından tek yetişkin lizis veya dokuz yetişkin lizisten şablon kullanılarak üretildi (Şekil 1B). Şablon dizisini doğru bir şekilde yükseltmek için PCR polimerazlarının şablon dizisi ve doğruluğu sıralama ile doğrulanabilir (Ek Şekil S1). Bu sonuç, kit protokollerinden ekstrakte edilen genomik DNA'nın bir dizi polimeraz için uygun bir şablon sağladığını göstermektedir.
PCR etkinliği, ticari kit kullanılarak tek bir hayvandan ekstrakte edilen genomik DNA'nın farklı konsantrasyonları kullanılarak test edildi. DNA 2-, 10-, 20- veya 50-kat ile seyreltildi ve reaksiyon başına bir solucanın yaklaşık yarısına, onda, yirmide birine ve ellide birine eşdeğer PCR'ler için kullanıldı. Bu DNA şablonu konsantrasyonları, ~2.1 kb'lik daha büyük bir hedefin veya ~0.5 kb'lik daha küçük bir hedefin amplifikasyonunu destekledi (Şekil 1C)12. 0.5 kb PCR ürününün DNA konsantrasyonuna bağlı bir verimi gözlenirken, 2.1 kb PCR ürün verimi tüm reaksiyonlarda eşdeğer görünüyordu.
Bu protokollerin PCR genotiplemesi için uygun olan C. elegans'tan genomik DNA ürettiğini göstermek için, genomik DNA, tek ve 16 vahşi tip ve blmp-1 fonksiyon kaybı mutantlarından (blmp-1 (tm548)) çıkarıldı. Blmp-1 geni, distal uç hücre göçünde, vücut büyüklüğünde ve gelişiminde önemli rolleri olan bir transkripsiyon faktörünü kodlar 12,13,14,15,16. Blmp-1 mutant, ekzon 3 ve intron 3 15'in parçalarını çıkaran810 bp'lik bir delesyona sahiptir. Primerler, vahşi tip DNA şablonu kullanıldığında 2.134 bp ürünle ve blmp-1 (-) DNA kullanıldığında 1.324 bp ürünle sonuçlanacak şekilde tasarlanmıştır. Uygun boyutlardaki PCR ürünleri, 1 μL tek solucan (reaksiyon başına yaklaşık 0.5 solucan) veya L4 evreli hayvanlardan 16 solucan lizisi (reaksiyon başına 3.5 solucan) kullanılarak tespit edildi (Şekil 1D). Bu sonuç, her iki protokolü de kullanarak kit ekstrakte edilmiş genomik DNA'nın, PCR'den genotip çizgilerine eşit derecede etkili şablonlar sağladığını göstermektedir.
Bu sonuçlar, tek ve çoklu hayvanlardan ticari bir doku DNA ekstraksiyon kiti kullanan C. elegans genomik DNA preparatlarının PCR için şablon olarak güvenilir bir şekilde kullanılabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: Tek nematodlardan ve çoklu nematodlardan ticari bir kit kullanılarak DNA preparatları, PCR ile sağlam amplifikasyona izin verir. PCR ürünleri, 1x TAE tamponunda (5 μL (A, B) veya 10 μL (C,D) içinde% 1 agaroz jeli üzerine yüklendi ve 30 dakika ila 2 saat boyunca 90-100 V'ta çalıştırıldı. Tüm jeller için 2 log'luk bir DNA merdiveni kullanıldı. (A) İki primer seti kullanarak şablon oluşturmak için kit ile DNA lizisinin geleneksel proteinaz K yöntemleriyle karşılaştırılması. Vahşi tip yetişkinler lize edildi ve bir hayvanın eşdeğeri tüm reaksiyonlar için şablon olarak kullanıldı. Şeritler 1-4, 2.1 kb ürün. Şerit 1, proteinaz K. Şerit 2 ile tek solucan lizisinden PCR, kit yöntemi ile tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 3, proteinaz K. Lane 4 ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR, kit yöntemi ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR. Şeritler 5-8, 0.5 kb ürün. Şerit 5, proteinaz K. Lane 6 ile tek solucanlı lizisten PCR, kit yöntemiyle tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 7, proteinaz K. Lane 8 ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR, kit yöntemi ile dokuz solucan solucan lizisinden PCR. (B) DNA lizisi için kit yöntemi, çoklu polimerazlar tarafından PCR için uygun bir şablon sağlar. Vahşi tip yetişkinler kit yöntemi kullanılarak lize edildi ve bir hayvanın yarısına eşdeğeri 0.5 kb'lik bir ürün için PCR şablonu olarak kullanıldı. Polimeraz ayrıntıları için Malzeme Tablosuna bakın. Şerit 1, yüksek hızlı polimeraz ile tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 2, yüksek hızlı polimeraz ile dokuz solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 3, bir Taq polimeraz ile tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 4, bir Taq polimeraz ile dokuz solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 5, yüksek doğrulukta polimeraz içeren tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 6, yüksek doğruluklu polimeraz içeren dokuz solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 7, yüksek hızlı, yüksek doğruluklu polimeraz içeren tek solucanlı bir lizisten PCR. Şerit 8, yüksek hızlı, yüksek doğruluklu polimeraz ile dokuz solucanlı bir lizisten PCR. (C) Bir vahşi tip L4 solucan lizisinin seyreltilmesi, PCR için şablon sağlar. Şeritler 1-5, 2.1 kb ürün. 6-10 arası şeritler, 0,5 kb hedefi. Şerit 1 ve şerit 6, seyreltilmemiş DNA. Şerit 2 ve şerit 7, 2 kat seyreltilmiş DNA. Şerit 3 ve şerit 8, 10 kat seyreltilmiş DNA. Şerit 4 ve şerit 9, 20 kat seyreltilmiş DNA. Şerit 5 ve şerit 10, 50 kat seyreltilmiş DNA. (D) Blmp-1 lokusunun PCR ile 1 μL tek ve 16 solucanlı DNA preparatlarını şablon olarak kullanarak genotipleştirilmesi. Şerit 1, vahşi tip tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 2, blmp-1 (-) tek solucanlı lizisten PCR. Şerit 3, vahşi tip 16 solucanlı lizisten PCR. Şerit 4, blmp-1 (-) 16 solucanlı lizisten PCR. Kısaltmalar: prep = hazırlama yöntemi; kb = kilobaz; st. = nematod aşaması; dil. = DNA'nın seyreltilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Hedef | Astar adı | Sıra | ||
| blmp-1 | iletmek | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| ters | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| sma-10 | iletmek | AATGTGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| ters | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| sıralama | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
Tablo 1: Astarların listesi.
| A. | Pol A, Pol B, Pol D | Pol E |
| PCR Master Karışımı | 12,5 μL | 12,5 μL |
| İleri astar | 0.2 μM (son konsantrasyon) | 0.5 μM (nihai konsantrasyon) |
| Ters astar | 0.2 μM (son konsantrasyon) | 0.5 μM (nihai konsantrasyon) |
| şablon DNA | değişken | 1 μL |
| Nükleaz içermeyen su | 25 μL'ye kadar | 25 μL'ye kadar |
| B. | Pol C |
| PCR 5x tampon | 2,5 μL |
| 10 mM dNTP'ler | 2,0 μL |
| İleri astar | 0.2 μM (son konsantrasyon) |
| Ters astar | 0.2 μM (son konsantrasyon) |
| şablon DNA | değişken |
| Polimeraz | 0,5 μL |
| Nükleaz içermeyen su | 25 μL'ye kadar |
| C. Şekil 1B için kullanılan PCR programı | ||
| sıcaklık | Saat | Döngü |
| 98 °C | 2 dk | 1 |
| 98 °C | 1 dk | 30 |
| 55 °C | 1 dk | |
| 72 °C | 1 dk | |
| 72 °C | 1 dk | 1 |
| 4 °C | tutmak | |
| D. Ek Şekil S1 için kullanılan PCR programı | ||
| sıcaklık | Saat | Döngü |
| 98 °C | 30 Saniye | 1 |
| 98 °C | 10 Saniye | 30 |
| 57 °C | 20 Saniye | |
| 72 °C | 50 Saniye | |
| 72 °C | 2 dk | 1 |
| 4 °C | tutmak | |
Tablo 2: PCR reaksiyonu bileşenleri.
Ek Şekil S1: Ticari bir kit ile hazırlanan genomik DNA'nın kalitesinin doğrulanması için dizileme. İki dizileme reaksiyonundan elde edilen sonuçlar, 16 solucanlı bir lizisten yüksek hızlı, yüksek doğruluklu bir polimeraz (Pol E) ile güçlendirilmiş 1.600'den fazla DNA nükleotidinin beklenen dizisiyle tamamen eşleşmektedir (Tablo 1, Tablo 2A ve Tablo 2D). Sıralama okuma uçları, düşük kaliteli temel okumaları kaldırmak için kesildi. Hizalama, EMBL-EBI çoklu dizi hizalama aracı MUSCLE (Log-Beklenti ile MUltiple Dizi Karşılaştırması)17 kullanılarak gerçekleştirildi. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
C. elegans'ın genotiplerini belirlemek, yeni C. elegans suşları oluşturmak için genetik haçlar gerçekleştirirken önemli bir adımdır. Tek veya birkaç C. elegans kullanılarak genomik DNA ekstraksiyonu, C. elegans'ın genotiplendirilmesinde çok önemli bir adımdır. Bu protokol, ticari bir kit kullanarak C. elegans'tan genomik DNA ekstraksiyonunu tanımlar. Bu yöntem hızlıdır ve sağlam çalışır. Bu yöntem kullanılarak ekstrakte edilen genomik DNA, genotipleme, dizileme ve klonlama dahil olmak üzere aşağı akış uygulamaları için kullanılabilir. Tanımlanan DNA ekstraksiyon yöntemi, DNA şablonu için başlangıç materyali olarak tek ve birkaç L4 veya yetişkin hayvan kullanarak C. elegans genetik haçlarını genotiplemek için optimize edilmiştir. Bir hayvanın ellide birinin (Şekil 1C) 3.5 hayvana (Şekil 1D) eşdeğeri, hedef DNA dizilerini PCR ile yükseltmek için uygun bir şablon sağlamıştır. Bu protokol (seyreltme ile), tek bir solucandan maksimum 45 reaksiyon ve 16 hayvandan 100 reaksiyon için yeterli şablon (2 μL / reaksiyonda) verir. Reaksiyon başına bir solucan kullansa bile, bu protokoller C. elegans'tan DNA çıkarmak için uygun maliyetli bir yol sağlar. Protokolün basitliği, sağlamlığı ve çabukluğu göz önüne alındığında, hem araştırma hem de sınıf uygulamaları için çok uygundur.
Protokol küçük hacimli reaktiflerin pipetlenmesini içerdiğinden, tutarlılığı sağlamak için çoklu reaksiyonlar için bir ana karışımın hazırlanması, iyi pipetleme tekniği ve iyi kalibre edilmiş pipetlerin kullanılması önerilir. Tek veya 9-16 hayvan lizlerinden 0.5-1 μL seyreltilmemiş DNA şablonunun kullanılması, genellikle sıcak başlangıçlı bir PCR ana karışımı kullanılarak 25 μL'lik bir PCR reaksiyonu için çalışır, ancak şablon konsantrasyonunun optimizasyonu gerekebilir. Reaktifler deney süresince buz üzerinde tutulmalıdır. Enzim performansını azaltabilecek DNA ekstraksiyon çözeltilerinin tekrar tekrar dondurularak çözülmesini önlemek için, reaktiflerin aliquoted edilmesi ve -20 ° C'de depolanması önerilir.
PCR gerektiren aşağı akış uygulamaları için, sıcak başlatmalı, yüksek hızlı bir PCR ana karışımının kullanılması, ticari doku kitinde sağlanan PCR reaksiyon karışımına kıyasla toplam süreyi daha da azaltır. Yüksek hızlı polimerazlar, 5-10 sn'de 1 kb'den daha az olan ürünleri yükseltebilir (polimeraz açıklamaları için Malzeme Tablosu ve Tablo 2'ye bakınız), kitin PCR reaksiyon karışımı ise ~ 1 kb / dak7 amplifikasyon hızına sahip bir Taq DNA polimeraz kullanır. Bazı PCR'lerden elde edilen ürünler, elektroforez için doğrudan bir agaroz jeline yüklenebilir, bu da adımları ve zamanı daha da azaltır. Bu reaksiyon tamponu, kısıtlama enzimi sindirimi ile de uyumludur. Yüksek doğrulukta DNA polimerazları da bu protokol kullanılarak ekstrakte edilen DNA ile sağlam bir şekilde çalışır (Şekil 1B). Kullanılan polimerazlar sürekli olarak kit ekstrakte edilmiş şablon kullanılarak çalışırken, diğer polimerazların kullanımı şablona, astar seti özelliklerine, ürün boyutuna ve gereken uygunluğa bağlı olarak daha iyi sonuçlar sağlayabilir. PCR'yi takiben, hedef bandın yükseltilmemesi veya ek bantların yükseltilmemesi gibi sorunlarla karşılaşılırsa, primer çalışma koşullarının veya DNA şablon konsantrasyonunun daha fazla optimizasyonu gerekebilir. Vahşi tip DNA şablonu ve çalıştığı kanıtlanmış primerlerin kullanımı da dahil olmak üzere uygun kontrollerin kullanılması şiddetle tavsiye edilir.
Bu yöntem, yüksek oranda saflaştırılmış veya yüksek DNA şablonu verimi gerektiren uygulamalar için uygun olmayacaktır. Hazırlanan hayvan sayısı ve reaksiyon hacmi artırılabilirken, bu yöntem kullanılarak hazırlanan DNA organizma kalıntılarından ayrılmaz ve tüm genom dizilimi gibi oldukça hassas uygulamalar için yeterince saf olmayabilir.
Bu yöntemin mevcut geleneksel genomik DNA ekstraksiyon yöntemlerine kıyasla en büyük avantajları, daha kısa süre ve daha basit, daha kolay adımları içerir. Gelecekte, bu yöntem ölçeklendirilebilir, diğer aşağı akış uygulamaları için C. elegans genomik DNA'sını çıkarmak için uyarlanabilir ve diğer nematod türlerinden DNA çıkarmak için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
N2 suşu ve E. coli OP50 bakterileri, NIH Araştırma Altyapı Programları Ofisi (P40 OD010440) tarafından finanse edilen Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) elde edildi. Blmp-1 (tm548) suşu Japonya Ulusal Biyokaynak Projesi'nden elde edildi. Yazarlar WormBase'e teşekkür ediyor. Bu çalışma NIH R01GM097591 tarafından T.L.G.'ye, Texas Woman's University tarafından T.L.G.'ye ve TWU'nun Öğrenci Araştırma Merkezi'nin M.F.L.'ye sağladığı iç finansman tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
