Summary
מוצג כאן תיאור של הבידוד הישיר והמהיר יחסית של דנ"א גנומי של Caenorhabditis elegans מבעל חיים אחד או כמה בעלי חיים באמצעות ערכת רקמה זמינה מסחרית. הכנת ה-gDNA המתקבלת היא תבנית מתאימה ל-PCR.
Abstract
למיצוי דנ"א גנומי מ-Caenorhabditis elegans יחידים או מכמה סוגים של Caenorhabditis יש יישומים רבים במורד הזרם, כולל PCR עבור קווי גנוטיפ, שיבוט וריצוף. השיטות המסורתיות המבוססות על פרוטאינאז K למיצוי דנ"א גנומי מ- C. elegans אורכות מספר שעות. ערכות מיצוי מסחריות שפותחות ביעילות את הקוטיקולה C. elegans ומוציאות דנ"א גנומי מוגבלות. שיטה קלה, מהירה יותר (כ-15 דקות) וחסכונית לחילוץ דנ"א גנומי של C. elegans שעובדת היטב עבור יישומי כיתה ומחקר מדווחת כאן. שיטת מיצוי דנ"א זו ממוטבת לשימוש בזחל יחיד או בכמה נמטודות מאוחרות (L4) או נמטודות בוגרות כחומר התחלתי לקבלת תבנית אמינה לביצוע PCR. התוצאות מצביעות על כך שאיכות הדנ"א מתאימה להגברת מטרות גנים בגדלים שונים על ידי PCR, ומאפשרת גנוטיפ של בעלי חיים בודדים או כמה גם בדילולים עד חמישים מהדנ"א הגנומי ממבוגר יחיד לכל תגובה. ניתן להשתמש בפרוטוקולים המדווחים באופן אמין כדי לייצר במהירות תבנית דנ"א מדגימה אחת או קטנה של C. elegans עבור יישומים מבוססי PCR.
Introduction
כאן, שני פרוטוקולים קשורים מוצגים עבור lysis של Caenorhabditis elegans כדי להפוך את הדנ"א נגיש עבור יישומים מבוססי PCR. PCR היא טכניקה מולקולרית נפוצה המשמשת ליישומים רבים, כולל גנוטיפ והגברת מקטעי דנ"א לשיבוט וריצוף, בין היתר. התולעת העגולה הקטנה (1 מ"מ), החיה בחופשיות C. elegans היא מערכת פופולרית של בעלי חיים למחקר ביולוגי. די בהשגת דנ"א גנומי מתאים מבעל חיים יחיד או מכמה בעלי חיים כדי להגביר את הרצף על ידי PCR. זחלי L4 מאוחרים ובוגרים מכילים רק כ-1,000 תאים סומטיים (כולל כמה תאים רב-גרעיניים, פוליפלואידים), תאי נבט, וצאצאים (אם החיה היא הרמפרודיט גרבידי) ברחם1. עם זאת, בעלי חיים אלה מוגנים על ידי קוטיקולה שיש לשבש כדי לחלץ את הדנ"א הגנומי2. שיטות סטנדרטיות להכנת תבנית דנ"א גנומית נמטודה ל-PCR כרוכות במספר שלבים ונמשכות מספר שעות. בעלי החיים מוקפאים לראשונה במאגר ליזה של תולעים המכיל פרוטאינאז K (−70 מעלות צלזיוס ומטה) למשך 15-45 דקות לפחות (יותר זמן מומלץ על ידי פרוטוקולים מסוימים)3,4,5,6. שלב זה פותח את החיות.
לאחר ההקפאה, בעלי החיים מודגרים במשך שעה אחת ב 60-65 מעלות צלזיוס עבור פרוטאינז K לעבוד, ואז האנזים מומת במשך 15-30 דקות ב 95 °C (65 °F). הפרוטאינאז K הורס את הנוקלאזות שמפרקות את הדנ"א. ההשבתה של פרוטאינאז K לפני PCR חשובה כדי למנוע מהפרוטאינאז K לפרק את ה-DNA פולימראז. שני הפרוטוקולים מבוססי הערכה המתוארים כאן הם שיטות מהירות, אמינות וחסכוניות לחילוץ דנ"א גנומי מבעל חיים יחיד או מכמה נמטודות לצורך מחקר יומיומי וליישומי מעבדה. הערכה שבה נעשה שימוש הותאמה במקור על ידי היצרן כדי לחלץ דנ"א מרקמת בעלי חיים, רוק ושיער7. הוא משתמש בתמיסת הכנת רקמות קניינית ובתמיסת מיצוי כדי ליזום תאים ולהנגיש את הדנ"א הגנומי. תמיסת נטרול קניינית מנטרלת את הרכיבים שעלולים לעכב PCR (למשל, מלחים, יונים ומולקולות קושרות Mg2+).
בעת גנוטיפ, ניתן לבחון בעל חיים יחיד. כאשר קובעים אם זן מסוים הוא הומוזיגוטי, בדיקת שישה צאצאים או יותר מבעל חיים אחד נותנת ביטחון גבוה שהקו הוא הומוזיגוטי או לא (יש סיכוי של 0.02% לבחור באופן אקראי שישה צאצאים מוטנטיים הומוזיגוטיים מהורה הטרוזיגוטי [(1/4)6 × 100% = 0.02%]). שיטה זו 1) היא פשוטה, עם פחות שלבים משיטת הפרוטאינאז K, ו-2) מקטינה את זמן הכנת התבנית ל-15 דקות. התוצאות בעבודה זו מדגימות כי הפרוטוקול שפותח פועל באופן חזק בחילוץ דנ"א גנומי מתולעים בודדות או מכמה תולעים, אשר ניתן להשתמש בהן באופן אמין עבור יישומים במורד הזרם שאינם דורשים דנ"א מטוהר מאוד, כולל PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. C. elegans תחזוקה
הערה: N2 (סוג פראי) ו blmp-1(tm548) C. elegans זנים נשמרו על לוחות סטנדרטיים של מדיית גדילת נמטודה (NGM) בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.
- הכן צלחות NGM על ידי המסת 23.005 גרם של אבקת NGM ב 973 מ"ל של מים בבקבוקון 2 ליטר. מכסים את פתח הבקבוקון בנייר אלומיניום (או מכסה אוטוקלאב המאפשר אוורור) ומהדקים את הכיסוי באמצעות סרט אוטוקלאב. Autoclave כדי להמיס את האבקה ולעקר את התוכן עם מחזור עיקור של לפחות 30 דקות.
- מקררים את הבינוני עד 60 מעלות צלזיוס באמבט מים.
- למדיום המקורר, הוסף 25 מ"ל של חיץ סטרילי 1 M פוספט (KH2PO4), pH 6.0; 1 מ"ל של 1 M תמיסת סידן כלוריד; ו-1 מ"ל של תמיסת 1 M מגנזיום גופרתית.
- מערבבים את המדיום על צלחת ערבוב מגנטית כדי לקבל תערובת הומוגנית ולמנוע קירור והתמצקות לא אחידים (כ-5 דקות). ודאו שמוט ההתעוררות מסתובב מספיק מהר כדי ליצור מערבולת, אך לא כל כך מהר עד שהבועות מוצגות (כ-250-300 סל"ד).
- יוצקים כ-25 מ"ל מהמדיום לכל צלחת פטרי באורך 10 ס"מ (כ-40 צלחות בסך הכל). מייבשים את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך הלילה (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס).
- לגדל מושבה של Escherichia coli OP50 ב 30-50 מ"ל של מרק LB לילה ב 37 °C (64 °F).
- זרעו כל צלחת עם 500 μL של תרבית E. coli OP50 ותנו להם להתייבש בטמפרטורת החדר לפני השימוש (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס)8. אחסנו את הצלחות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד 3 שבועות.
- העבר את C. elegans לצלחות שנזרעו באמצעות פיק חוטים או שיטה אחרת ותן להם לגדול ל-L4 או לשלב הבוגר בטמפרטורה הנדרשת לזן (בדרך כלל 16-25 מעלות צלזיוס, 1-2 ימים אם בעלי חיים היו מצופים מורעבים כדאורים, 3-4 ימים אם בעלי חיים היו מצופים כעוברים)8.
2. מיצוי דנ"א של תולעת בודדת
הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מתולעת בודדת (תולעת אחת ב-1.8 μL של הנפח הכולל). ניתן ליצור תערובת מאסטר אם תולעים מרובות יוטלו בו זמנית.
- תכנת תרמוציקלר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
- Aliquot 0.8 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.2 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפה של תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
- זהה בעל חיים L4 או בעל חיים בוגר תחת מיקרוסקופ ניתוח9. כדי לזהות הרמפרודיטים L4, חפשו פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. זהה הרמפרודיטים בוגרים על ידי חיפוש אחר בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת שעשויים להיות להם עוברים סגלגלים הנראים ברחם שלהם.
- באמצעות בחירת חוט פלטינה, העבר את החיה שנבחרה לתוך הפתרון10.
- צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם) בטמפרטורת החדר כדי לאסוף את התכולה בתחתית הצינור.
- מקם את הצינור בתרמוציקלר והפעל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 2.1.
- כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. מוסיפים 0.8 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
- צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
- השתמש ישירות בליזאט עבור PCR או אחסן אותו בטמפרטורה של 4 °C או −20 °C לשימוש עתידי.
הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות.
3. מיצוי דנ"א של כמה פרטים
הערה: שיטה זו שימושית לחילוץ דנ"א מכמה תולעים. ניתן להכין תערובת מאסטר אם יסקרו מספר זנים בו זמנית.
- תכנת את התרמוצילר למחזור אחד בטמפרטורה של 55 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות (תוכנית ליזיס).
- Aliquot 2.0 μL של תמיסת החילוץ מהערכה אל הקיר הפנימי של צינור PCR 0.2 מ"ל על קרח. מוסיפים 0.5 μL של תמיסת הכנת הרקמה מהערכה לטיפת תמיסת המיצוי. מערבבים על ידי צנרת.
- זהה L4 או בעלי חיים בוגרים תחת מיקרוסקופ ניתוח9. להרמפרודיטים L4 יש פות אופייני הנראה כחצי עיגול חיוור במרכז החיה. הרמפרודיטים בוגרים הם בעלי החיים הגדולים ביותר בצלחת וייתכן שיש להם עוברים אליפטיים הנראים ברחם שלהם.
- באמצעות פיק חוט פלטינה, העבירו כמה בעלי חיים לתמיסה: 9 בעלי חיים מניבים חיה אחת המקבילה לדנ"א גנומי לכל 0.5 μL של ליזאט, ו-16 בעלי חיים מניבים כ-1 בעלי חיים המקבילים לדנ"א גנומי ב-0.25 μL (3.5 נמטודות/μL)10.
הערה: קשה להעביר יותר מ -16 בעלי חיים לנפח זה. - צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/ 2,000 × גרם).
- מקם את הצינור בתרמוציפל והפעיל את תוכנית הליזיס שנקבעה בשלב 3.1.
- כאשר התוכנית הושלמה, צנטריפוגה לזמן קצר את הצינור והנח אותו על קרח. הוסיפו 2 μL של תמיסת הנטרול מהערכה לתערובת. מערבבים על ידי צנרת.
- צנטריפוגה של הצינור לזמן קצר בטמפרטורת החדר (2-3 שניות, ≤6,000 סל"ד/2,000 × גרם).
- השתמש ישירות בליזה עבור PCR או אחסן אותה בטמפרטורה של 4 ° C או − 20 ° C לשימוש עתידי.
הערה: הדנ"א שחולץ יציב בטמפרטורה של 4 °C (4 °F) או −20 °C (7 °F) למשך 6 חודשים לפחות.
4. תגובת PCR
הערה: מתואר יישום אחד במורד הזרם של טכניקת ליזיס תולעת זו, זיהוי מוטציית מחיקה באמצעות פולימראז מהיר. כמו כן, מוכחת היעילות של שני פרוטוקולי ליזיס התולעת בייצור דנ"א בתבנית גנומית ל-PCR מוצלח בדילולים עד 1/50th של תולעת לכל תגובה.
- חלץ דנ"א מתולעת בודדת ומ-16 תולעים באמצעות זנים מסוג N2 ומוטאנטים מסוג בר, כמתואר לעיל בשלב 2 ובשלב 3.
- הכינו דילולים של פי 2, 10, 20 ו-50 של דנ"א של תולעת בודדת מחיות N2 מסוג בר.
- הגדר תגובות PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן באמצעות פריימרים ספציפיים לרצף העניין ולתערובת המאסטר של PCR עם התחלה חמה (טבלה 1 וטבלה 2). השתמש ב-1 μL של דנ"א לא מדולל או 2 μL של דנ"א מדולל כתבנית בכל תגובה.
- אשרו את מוצרי ה-PCR על ידי אלקטרופורזה של ג'ל והדמיה11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
דנ"א גנומי של בוגרים יחידים או כמה בוגרים מסוג פרא הופק באמצעות הערכה המסחרית או פרוטוקול ליזה מסורתי כדי להשוות את היעילות של שתי השיטות הללו. ליאסטים אלה שימשו לאחר מכן כתבניות עבור PCR כדי להגביר מטרה גדולה יותר של ~ 2,100 bp (קידוד blmp-1) או יעד קטן יותר של ~ 500 bp (קידוד חלק מ - sma-10). שתי השיטות הניבו בהצלחה מוצרי PCR מתאימים (איור 1A).
לאחר מכן, הודגמה היכולת של דנ"א גנומי שחולץ על ידי קיט לשמש כתבנית למגוון פולימראזות DNA. דנ"א גנומי מופק שימש כתבנית להגברת מוצר של 0.5 קילובייט באמצעות ארבע פולימראזות בעלות יכולות שונות (כולל מהירות, נאמנות וגודל המוצר). תוצרים בגדלים צפויים נוצרו על-ידי פולימראזות אלה באמצעות תבנית מתוך תזה של מבוגר יחיד או מתזה של תשעה מבוגרים (איור 1B). ניתן לאשר את רצף התבניות ואת הנאמנות של פולימראזות ה-PCR להגברה נכונה של רצף התבניות על ידי ריצוף (איור משלים S1). תוצאה זו מדגימה כי הדנ"א הגנומי שחולץ מפרוטוקולי הערכה מספק תבנית מתאימה למגוון של פולימראזות.
יעילות ה-PCR נבדקה באמצעות ריכוזים שונים של הדנ"א הגנומי שחולצו מבעל חיים יחיד באמצעות הערכה המסחרית. הדנ"א מדולל פי 2, 10, 20 או 50, והשווה ערך לכמחצית, עשירית, עשירית, עשירית, עשירית וחמישים מתולעת לכל תגובה שימש עבור PCRs. ריכוזי תבניות הדנ"א האלה תמכו בהגברה של מטרה גדולה יותר של ~2.1 קילובייט או של מטרה קטנה יותר של ~0.5 קילובייט (איור 1C)12. בעוד שנצפתה תפוקה תלוית ריכוז דנ"א של מוצר PCR של 0.5 קילובייט, תפוקת המוצר PCR של 2.1 קילובייט נראתה שוות ערך בכל התגובות.
כדי להדגים שפרוטוקולים אלה מייצרים דנ"א גנומי מ-C. elegans המתאים לגנוטיפ PCR, הדנ"א הגנומי הופק ממוטנטים בודדים ו-16 מוטנטים מסוג בר ו-blmp-1 לאובדן תפקוד (blmp-1(tm548)). הגן blmp-1 מקודד גורם שעתוק עם תפקידים חשובים בנדידת תאי קצה דיסטליים, גודל הגוף והתפתחות 12,13,14,15,16. למוטנט blmp-1 יש מחיקה של 810 bp המסירה חלקים של אקסון 3 ואינטרון 315. פריימרים תוכננו וכתוצאה מכך נוצר מוצר של 2,134 bp כאשר נעשה שימוש בתבנית הדנ"א מסוג wild- ו- 1,324 bp מוצר אם נעשה שימוש ב- blmp-1(-) DNA. תוצרי PCR בגדלים המתאימים זוהו באמצעות 1 μL של תולעת בודדת (כ-0.5 תולעים לכל תגובה) או תזה של תולעת 16 מבעלי חיים בשלבי L4 (3.5 תולעים לכל תגובה) (איור 1D). תוצאה זו מראה כי דנ"א גנומי שחולץ על ידי קיט באמצעות אחד הפרוטוקולים מספק תבניות יעילות באותה מידה עבור PCR לקווי גנוטיפ.
תוצאות אלה מראות כי תכשירי דנ"א גנומיים של C. elegans באמצעות ערכת מיצוי דנ"א מסחרית של רקמות מבעלי חיים בודדים ומרובים יכולים לשמש באופן אמין כתבניות ל-PCR.
איור 1: תכשירי דנ"א באמצעות ערכה מסחרית מנמטודות בודדות ומנמטודות מרובות מאפשרים הגברה חזקה על ידי PCR. מוצרי PCR הועמסו על ג'ל אגרוז 1% ב-1x BUFFER TAE (5 μL (A,B) או 10 μL (C,D) והופעלו ב-90-100 וולט למשך 30 דקות עד 2 שעות. סולם דנ"א בן 2 לוגים שימש לכל הג'לים. (A) השוואה של תזת דנ"א לפי ערכה לשיטות מסורתיות של פרוטאינאז K ליצירת תבנית באמצעות שתי קבוצות פריימר. בוגרים מסוג פרא היו שחוקים, והמקבילה של חיה אחת שימשה כתבנית לכל התגובות. נתיבים 1-4, 2.1 קילו מוצר. נתיב 1, PCR מתזה של תולעת בודדת על ידי פרוטאינאז K. Lane 2, PCR מתזה של תולעת בודדת בשיטת הערכה. נתיב 3, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה על ידי פרוטאינאז K. Lane 4, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה בשיטת הערכה. נתיבים 5-8, 0.5 קילו מוצר. ליין 5, PCR מליזיס של תולעת בודדת על ידי פרוטאינאז K. Lane 6, PCR מליזיס של תולעת בודדת בשיטת הערכה. נתיב 7, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה על ידי פרוטאינאז K. Lane 8, PCR מתולעת תשע תולעים ליזה בשיטת הערכה. (B) שיטת הערכה לתזת DNA מספקת תבנית מתאימה ל-PCR על ידי פולימראזות מרובות. בוגרים מסוג בר שוכבו בשיטת הערכה, והמקבילה של מחצית מבעל חיים שימשה כתבנית PCR למוצר של 0.5 קילובייט. ראה את טבלת החומרים לפרטי פולימראז. נתיב 1, PCR מתזה של תולעת בודדת עם פולימראז במהירות גבוהה. נתיב 2, PCR מליזיס של תשע תולעים עם פולימראז במהירות גבוהה. נתיב 3, PCR מתזה של תולעת בודדת עם טאק פולימראז. ליין 4, PCR מליזיס של תשע תולעים עם טאק פולימראז. נתיב 5, PCR מליזיס תולעת בודדת עם פולימראז בנאמנות גבוהה. ליין 6, PCR מליזיס של תשע תולעים עם פולימראז בעל נאמנות גבוהה. נתיב 7, PCR מליזיס של תולעת בודדת עם פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה. נתיב 8, PCR מליזיס של תשע תולעים עם פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה. (C) דילולים של תזה אחת של תולעת L4 מסוג בר מספקים תבנית ל-PCR. נתיבים 1-5, 2.1 קילו מוצר. נתיבים 6-10, 0.5 kb יעד. נתיב 1 ומסלול 6, דנ"א לא מדולדל. נתיב 2 ונתיב 7, דנ"א מדולל פי 2. נתיב 3 ומסלול 8, דנ"א מדולל פי 10. נתיב 4 ומסלול 9, דנ"א מדולל פי 20. נתיב 5 ונתיב 10, דנ"א מדולל פי 50. (D) גנוטיפ של לוקוס blmp-1 על ידי PCR באמצעות 1 μL של תכשירי DNA של תולעת בודדת ו-16 תולעים כתבנית. נתיב 1, PCR מליזיס תולעת בודדת מסוג פראי. נתיב 2, PCR מתוך blmp-1(-) ליזה של תולעת בודדת. נתיב 3, PCR מתוך ליזיס תולעת מסוג 16 פראי. נתיב 4, PCR מ blmp-1(-) 16-תולעת ליזיס. קיצורים: הכנה = שיטת הכנה; kb = קילו-בייס; st. = שלב נמטודה; dil. = דילול של דנ"א. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| יעד | שם פריימר | רצף | ||
| blmp-1 | קדימה | GCGTCAGGTAAGTTGTGATA | ||
| הפוך | CAGTTATTGCGGCTGTTGTT | |||
| sma-10 | קדימה | AATGTGTGGCAAGGAATCG | ||
| הפוך | TGTCTGTCCAACGAGAAGTG | |||
| רצף | 1 | CACATCCCGGACGCCTTAAT | ||
| 2 | CTAATTGTTTTCTACCTGGC | |||
טבלה 1: רשימת פריימרים.
| A. | פול א', פול ב', פול ד' | פול א |
| PCR מאסטר מיקס | 12.5 μL | 12.5 μL |
| פריימר קדמי | 0.2 מיקרומטר (ריכוז סופי) | 0.5 מיקרומטר (ריכוז סופי) |
| פריימר הפוך | 0.2 מיקרומטר (ריכוז סופי) | 0.5 מיקרומטר (ריכוז סופי) |
| תבנית דנ"א | משתנה | 1 μL |
| מים ללא נוקלאז | עד 25 מיקרול | עד 25 מיקרול |
| B. | פול סי |
| מאגר PCR 5x | 2.5 μL |
| 10 mM dNTPs | 2.0 μL |
| פריימר קדמי | 0.2 מיקרומטר (ריכוז סופי) |
| פריימר הפוך | 0.2 מיקרומטר (ריכוז סופי) |
| תבנית דנ"א | משתנה |
| פולימראז | 0.5 μL |
| מים ללא נוקלאז | עד 25 מיקרול |
| ג. תוכנית PCR המשמשת באיור 1B | ||
| טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| 98 °C | 2 דק' | 1 |
| 98 °C | 1 דק' | 30 |
| 55 °C (55 °F) | 1 דק' | |
| 72 °C | 1 דק' | |
| 72 °C | 1 דק' | 1 |
| 4 °C | אחז | |
| ד. תוכנית PCR המשמשת לתוספת איור S1 | ||
| טמפרטורה | זמן | מחזורים |
| 98 °C | 30 שניות | 1 |
| 98 °C | 10 שניות | 30 |
| 57 °C (57 °F) | 20 שניות | |
| 72 °C | 50 שניות | |
| 72 °C | 2 דק' | 1 |
| 4 °C | אחז | |
טבלה 2: רכיבי תגובת PCR.
איור משלים S1: ריצוף לאישור איכות הדנ"א הגנומי המוכן באמצעות ערכה מסחרית. התוצאות משתי תגובות ריצוף תואמות לחלוטין את הרצף הצפוי של יותר מ-1,600 נוקלאוטידים של דנ"א המוגברים על-ידי פולימראז במהירות גבוהה ובנאמנות גבוהה (Pol E) מתוך ליזה של 16 תולעים (טבלה 1, טבלה 2A וטבלה 2D). קצות הקריאה של ריצוף נחתכו כדי להסיר קריאות בסיס באיכות נמוכה. היישור בוצע באמצעות כלי יישור הרצפים המרובים EMBL-EBI MUSCLE (השוואת רצפי MUltiple לפי Log-Expectation)17. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
קביעת הגנוטיפים של C. elegans היא צעד חשוב בעת ביצוע הצלבות גנטיות ליצירת זנים חדשים של C. elegans . מיצוי דנ"א גנומי באמצעות C. elegans יחיד או מעטים הוא שלב מכריע בגנוטיפ C. elegans. פרוטוקול זה מתאר מיצוי דנ"א גנומי מ-C. elegans באמצעות ערכה מסחרית. שיטה זו מהירה ופועלת בחוזקה. הדנ"א הגנומי שחולץ בשיטה זו יכול לשמש ליישומים במורד הזרם, כולל גנוטיפ, ריצוף ושיבוט. שיטת מיצוי הדנ"א המתוארת עברה אופטימיזציה לגנוטיפ של צלבים גנטיים של C. elegans תוך שימוש בבעלי חיים בודדים ומעט L4 או בוגרים כחומר מוצא לתבנית הדנ"א. המקבילה של חמישים מבעל חיים (איור 1C) ל-3.5 בעלי חיים (איור 1D) סיפקה תבנית מתאימה להגברת רצפי הדנ"א של המטרה על-ידי PCR. פרוטוקול זה (עם דילול) מניב תבנית מספקת (ב-2 μL/תגובה) עבור מקסימום 45 תגובות מתולעת בודדת ועבור 100 תגובות מ-16 בעלי חיים. אפילו באמצעות תולעת אחת לכל תגובה, פרוטוקולים אלה מספקים דרך חסכונית לחלץ דנ"א מ- C. elegans. בהתחשב בפשטות, בחוסן ובמהירות של הפרוטוקול, הוא מתאים היטב הן למחקר והן ליישומים בכיתה.
מכיוון שהפרוטוקול כולל צנרת כמויות קטנות של ריאגנטים, מומלץ להכין תערובת מאסטר לתגובות מרובות, טכניקת צנרת טובה ושימוש בפיפטות מכויילות היטב כדי להבטיח עקביות. שימוש ב-0.5-1 μL של תבנית דנ"א לא מדוללת מתוך ליסים של בעלי חיים בודדים או 9-16 פועל בדרך כלל לתגובת PCR של 25 μL באמצעות תערובת מאסטר של PCR עם התחלה חמה, אך ייתכן שיידרש אופטימיזציה של ריכוז התבנית. יש לשמור את הריאגנטים על הקרח למשך כל הניסוי. כדי למנוע הפשרה חוזרת ונשנית של תמיסות מיצוי הדנ"א, שעשויות להפחית את ביצועי האנזים, מומלץ להיעזר בריאגנטים ולאחסן אותם בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס.
עבור יישומים במורד הזרם הדורשים PCR, השימוש בתערובת מאסטר PCR במהירות גבוהה עם התחלה חמה ומהירה מפחית עוד יותר את הזמן הכולל בהשוואה לתמהיל תגובת ה-PCR המסופק בערכת הרקמות המסחרית. פולימראזות מהירות יכולות להגביר תוצרים של פחות מ-1 קילובייט ב-5-10 שניות (ראו את טבלת החומרים ואת טבלה 2 לתיאורי פולימראז), בעוד שתערובת התגובה של ה-PCR של הערכה משתמשת ב-Taq DNA פולימראז עם קצב הגברה של כ-1 קילו-בייט לדקה7. מוצרים מכמה PCRs ניתן לטעון ישירות לתוך ג'ל agarose עבור אלקטרופורזה, מה שמפחית עוד יותר את השלבים והזמן. מאגר תגובה זה תואם גם לעיכול אנזים הגבלה. פולימראזות דנ"א בעלות נאמנות גבוהה פועלות היטב גם עם דנ"א שחולץ באמצעות פרוטוקול זה (איור 1B). בעוד שהפולימראזות שבהן נעשה שימוש באופן עקבי עבדו באמצעות תבנית שחולצה על-ידי ערכה, השימוש בפולימראזות אחרות עשוי לספק תוצאות טובות יותר בהתאם לתבנית, לתכונות ערכת הפריימרים, לגודל המוצר ולנאמנות הנדרשים. אם נתקלים בבעיות בעקבות PCR, כגון היעדר פס מטרה מוגבר או הגברת רצועות נוספות, ייתכן שיהיה צורך באופטימיזציה נוספת של תנאי העבודה של הפריימר או ריכוז תבנית הדנ"א. מומלץ מאוד להשתמש בבקרות מתאימות, כולל תבנית דנ"א מסוג פראי ושימוש בפריימרים שהוכחו כעובדים.
שיטה זו לא תתאים ליישומים הדורשים מטוהרים מאוד או תפוקה גבוהה של תבנית DNA. בעוד שמספר בעלי החיים שהוכנו ונפח התגובה עשויים להיות מוגדלים, הדנ"א שהוכן בשיטה זו אינו מופרד מפסולת אורגניזמית וייתכן שאינו טהור מספיק עבור יישומים רגישים ביותר כגון ריצוף גנום שלם.
היתרונות העיקריים של שיטה זו בהשוואה לשיטות מיצוי הדנ"א הגנומיות המסורתיות הקיימות כוללים את הזמן הקצר יותר ואת הצעדים הפשוטים והקלים יותר. בעתיד, ניתן יהיה להרחיב את השיטה הזו, להתאים אותה לחילוץ דנ"א גנומי של C. elegans עבור יישומים אחרים במורד הזרם, ולהשתמש בה כדי לחלץ דנ"א ממיני נמטודות אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
זן N2 וחיידקי E. coli OP50 התקבלו מהמרכז לגנטיקה של Caenorhabditis (CGC), הממומן על ידי המשרד לתוכניות תשתית מחקר של NIH (P40 OD010440). זן blmp-1(tm548) התקבל מפרויקט הביו-ורסורס הלאומי, יפן. המחברים מודים ל-WormBase. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01GM097591 ל- T.L.G., מימון פנימי של אוניברסיטת טקסס לנשים ל- T.L.G, והמרכז לחקר סטודנטים של TWU ל- M.F.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| autoclave tape | Defend | 43237-2 | |
| aluminium foil, heavy duty | Reynolds Wrap | 2182934 | |
| calcium chloride | Millipore Sigma | 102382 (CAS 10035-04-8) | |
| Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) | Sigma-Aldrich Co. LLC | XNAT2-1KT | |
| Isotemp hotplate/stirrer | Fisher Scientific | 11-100-495H | |
| LB media, Lennox, capsules | MP Biomedicals, LLC | 3002-131 | |
| magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous | Thermo Scientific | AC413485000 (CAS 7487-88-9) | |
| microcentrifuge | Labnet International, Inc. | PrismR, C2500-R | |
| NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase | New England Biolabs, Inc. | M0515S | "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb) |
| NGM media powder | US Biological Life Sciences | N1000 | |
| Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer | New England Biolabs, Inc. | M0531S | "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb) |
| primers | Integrated DNA Technologies | custom DNA oligos | |
| PrimeSTAR GXL polymerase | Takara Bio Inc. | R050B | "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb |
| Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) | New England Biolabs, Inc. | N0550S | |
| SapphireAmp Fast PCR Master Mix | Takara Bio Inc. | RR350A | "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb |
| Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix | Sigma-Aldrich Co. LLC | P4600 | "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb |
| SimpliAmp thermal cycler | Applied Biosystems | A24812 | |
| stir bar | Fisher Scientific | 14-512-126 | |
| vortex mixer | Fisher Scientific | 2215365 | |
| worm pick | Genesee Scientific Corporation | 59-AWP |
References
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
- Page, A. P., Johnstone, I. L.
- Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
- Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
- Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
- Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
- Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
- Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
- Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
- Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
- Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
- Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
- Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
- Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
