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Biology

कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस जीनोमिक डीएनए के छोटे पैमाने पर निष्कर्षण

Published: June 7, 2022 doi: 10.3791/63716
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, Texas Woman’s University

Summary

यहां प्रस्तुत व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ऊतक किट का उपयोग करके एक या कुछ जानवरों से कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस जीनोमिक डीएनए के सीधे और अपेक्षाकृत तेजी से अलगाव का वर्णन है। परिणामी जीडीएनए तैयारी पीसीआर के लिए एक उपयुक्त टेम्पलेट है।

Abstract

एकल या कुछ कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण में कई डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग हैं, जिनमें जीनोटाइपिंग लाइनों, क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए पीसीआर शामिल है। सी एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण के लिए पारंपरिक प्रोटीनेज के-आधारित तरीकों में कई घंटे लगते हैं । वाणिज्यिक निष्कर्षण किट जो प्रभावी रूप से सी एलिगेंस छल्ली को तोड़ते हैं और जीनोमिक डीएनए निकालते हैं, सीमित हैं। एलिगेंस जीनोमिक डीएनए निकालने की एक आसान, तेज (~ 15 मिनट), और लागत कुशल विधि जो कक्षा और अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए अच्छी तरह से काम करती है, यहां बताई गई है। इस डीएनए निष्कर्षण विधि को पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए एक विश्वसनीय टेम्पलेट प्राप्त करने के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में एकल या कुछ देर से लार्वा (एल 4) या वयस्क नेमाटोड का उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया गया है। परिणामों से संकेत मिलता है कि डीएनए गुणवत्ता पीसीआर द्वारा विभिन्न आकारों के जीन लक्ष्यों को बढ़ाने के लिए उपयुक्त है, जो प्रति प्रतिक्रिया एक वयस्क से जीनोमिक डीएनए के एक-पचासवें हिस्से में कमजोर पड़ने पर भी एकल या कुछ जानवरों के जीनोटाइपिंग की अनुमति देता है। रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल का उपयोग पीसीआर-आधारित अनुप्रयोगों के लिए सी एलिगेंस के एकल या एक छोटे से नमूने से डीएनए टेम्पलेट को जल्दी से उत्पादन करने के लिए मज़बूती से किया जा सकता है।

Introduction

यहां, पीसीआर-आधारित अनुप्रयोगों के लिए डीएनए को सुलभ बनाने के लिए कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस के लाइसिस के लिए दो संबंधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत किए गए हैं। पीसीआर एक आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली आणविक तकनीक है जिसका उपयोग कई अनुप्रयोगों के लिए किया जाता है, जिसमें क्लोनिंग और अनुक्रमण के लिए जीनोटाइपिंग और डीएनए टुकड़ों को बढ़ाना शामिल है। छोटे (1 मिमी), मुक्त रहने वाले राउंडवर्म सी एलिगेंस जैविक अनुसंधान के लिए एक लोकप्रिय पशु प्रणाली है। एक एकल जानवर या कुछ जानवरों से उपयुक्त जीनोमिक डीएनए प्राप्त करना पीसीआर द्वारा अनुक्रम को बढ़ाने के लिए पर्याप्त है। देर से एल 4 लार्वा और वयस्कों में केवल ~ 1,000 दैहिक कोशिकाएं (कुछ बहु-परमाणु, पॉलीप्लोइड कोशिकाएं सहित), रोगाणु कोशिकाएं, और (यदि जानवर एक गुरुत्वाकर्षण हर्माफ्रोडाइट है) गर्भाशय1 में संतान होती है। हालांकि, इन जानवरों को एक छल्ली द्वारा संरक्षित किया जाता है जिसे जीनोमिक डीएनए2 निकालने के लिए बाधित किया जाना चाहिए। पीसीआर के लिए निमेटोड जीनोमिक डीएनए टेम्पलेट तैयार करने के लिए मानक तरीकों में कई कदम शामिल हैं और कई घंटे लगते हैं। जानवरों को पहले कम से कम 15-45 मिनट (कुछ प्रोटोकॉल द्वारा अनुशंसित है) 3,4,5,6 के लिए प्रोटीनेस के (-70 डिग्री सेल्सियस या नीचे) युक्त कृमि लिसिस बफर में जमे हुए हैं। यह कदम दरारें जानवरों को खोलती हैं।

ठंड के बाद, जानवरों को प्रोटीनेज के काम करने के लिए 60-65 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, फिर एंजाइम को 95 डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए निष्क्रिय कर दिया जाता है। प्रोटीनेज के डीएनए को नीचा दिखाने वाले न्यूक्लीज को नष्ट कर देता है। पीसीआर से पहले प्रोटीनेज के की निष्क्रियता प्रोटीनेज के को डीएनए पोलीमरेज़ को नीचा दिखाने से रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। यहां वर्णित दो किट-आधारित प्रोटोकॉल रोजमर्रा के अनुसंधान और शिक्षण प्रयोगशाला अनुप्रयोगों के लिए एक ही जानवर या कुछ नेमाटोड से जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए त्वरित, विश्वसनीय और लागत प्रभावी तरीके हैं। उपयोग की जाने वाली किट मूल रूप से पशु ऊतक, लार और बाल7 से डीएनए निकालने के लिए निर्माता द्वारा अनुकूलित की गई थी। यह लाइस कोशिकाओं के लिए एक मालिकाना ऊतक तैयारी समाधान और निष्कर्षण समाधान का उपयोग करता है और जीनोमिक डीएनए को सुलभ बनाता है। एक मालिकाना तटस्थीकरण समाधान तब उन घटकों को बेअसर करता है जो पीसीआर (जैसे, लवण, आयन, और एमजी2 + -बाध्यकारी अणुओं) को बाधित कर सकते हैं।

जीनोटाइपिंग करते समय, एक एकल जानवर का परीक्षण किया जा सकता है। यह निर्धारित करते समय कि क्या एक तनाव होमोजाइगस है, एक ही जानवर से छह या अधिक संतानों का परीक्षण करने से उच्च आत्मविश्वास मिलता है कि एक रेखा होमोजाइगस है या नहीं (विषमयुग्मजी माता-पिता [(1/4)6 × 100% = 0.02%] से बेतरतीब ढंग से छह होमोजाइगस उत्परिवर्ती संतान को चुनने का 0.02% मौका है)। यह विधि 1) प्रोटीनेज के विधि की तुलना में कम चरणों के साथ सरल है, और 2) टेम्पलेट तैयारी के समय को 15 मिनट तक कम कर देता है। इस काम के परिणाम दर्शाते हैं कि विकसित प्रोटोकॉल एकल या कुछ कीड़े से जीनोमिक डीएनए निकालने में मजबूती से काम करता है, जिसे डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है जिन्हें पीसीआर सहित अत्यधिक शुद्ध डीएनए की आवश्यकता नहीं होती है।

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Protocol

1. सी एलिगेंस रखरखाव

नोट: एन 2 (जंगली प्रकार) और ब्लम्प -1 (टीएम 548) सी एलिगेंस उपभेदों को 20 डिग्री सेल्सियस पर मानक निमेटोड ग्रोथ मीडिया (एनजीएम) प्लेटों पर बनाए रखा गया था।

  1. 2 एल फ्लास्क में 973 एमएल पानी में एनजीएम पाउडर के 23.005 ग्राम भंग करके एनजीएम प्लेटें तैयार करें। एल्यूमीनियम पन्नी (या आटोक्लेवेबल टोपी जो वेंटिंग की अनुमति देता है) के साथ फ्लास्क खोलने को कवर करें और आटोक्लेव टेप के साथ कवर को सुरक्षित करें। पाउडर को भंग करने और कम से कम 30 मिनट के नसबंदी चक्र के साथ सामग्री को निष्फल करने के लिए आटोक्लेव।
  2. पानी के स्नान में मध्यम को 60 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करें।
  3. ठंडा माध्यम के लिए, बाँझ 1 एम फॉस्फेट (केएच 2 पीओ4) बफर, पीएच 6.0 के25एमएल जोड़ें; 1 एम कैल्शियम क्लोराइड समाधान का 1 एमएल; और 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट समाधान के 1 एमएल।
  4. एक सजातीय मिश्रण प्राप्त करने के लिए और असमान शीतलन और ठोसकरण (~ 5 मिनट) को रोकने के लिए एक चुंबकीय हलचल प्लेट पर माध्यम हिलाओ। सुनिश्चित करें कि हलचल बार एक भंवर बनाने के लिए पर्याप्त तेजी से घूमता है लेकिन इतनी तेजी से नहीं कि बुलबुले पेश किए जाते हैं (~ 250-300 आरपीएम)।
  5. प्रत्येक 10 सेमी पेट्री प्लेट (कुल में ~ 40 प्लेटें) में माध्यम के ~ 25 एमएल डालो। रात भर कमरे के तापमान पर प्लेटों को सूखा (आमतौर पर 16-25 डिग्री सेल्सियस)।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एलबी शोरबा के 30-50 एमएल में एस्चेरिचिया कोलाई ओपी 50 की एक कॉलोनी उगाएं।
  7. कोलाई ओपी 50 संस्कृति के 500 μL के साथ प्रत्येक प्लेट बीज और उन्हें उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर सूखने दें (आमतौर पर 16-25 डिग्री सेल्सियस)8. प्लेटों को 4 डिग्री सेल्सियस पर 3 सप्ताह तक स्टोर करें।
  8. एलिगेंस को तार पिक या अन्य विधि का उपयोग करके बीज वाली प्लेटों में स्थानांतरित करें और उन्हें तनाव के लिए आवश्यक तापमान पर एल 4 या वयस्क चरण में बढ़ने दें (आमतौर पर 16-25 डिग्री सेल्सियस, 1-2 दिन अगर जानवरों को डाउर के रूप में भूखा चढ़ाया गया था, 3-4 दिन अगर जानवरों को भ्रूण के रूप में चढ़ाया गया था)8.

2. एकल-कीड़ा डीएनए निष्कर्षण

नोट: यह विधि एक एकल कीड़े (कुल मात्रा के 1.8 μL में एक कृमि) से डीएनए निकालने के लिए उपयोगी है। एक मास्टर मिश्रण बनाया जा सकता है यदि एक समय में कई कीड़े लाइस्ड हो जाएंगे।

  1. 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र के लिए एक थर्मोसाइकिलर प्रोग्राम करें, इसके बाद 3 मिनट (लाइसिस प्रोग्राम) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस।
  2. बर्फ पर 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब की अंदर की दीवार पर किट से निष्कर्षण समाधान के विभाज्य 0.8 μL। निष्कर्षण समाधान की छोटी बूंद के लिए किट से ऊतक तैयारी समाधान के 0.2 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप9 के तहत एक एल 4 या वयस्क जानवर की पहचान करें। एल 4 हर्माफ्रोडाइट्स की पहचान करने के लिए, एक विशेषता वल्वा की तलाश करें जो जानवर के बीच में एक पीले आधे सर्कल के रूप में दिखाई देता है। प्लेट पर सबसे बड़े जानवरों की तलाश करके वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट्स की पहचान करें जिनके गर्भाशय में अंडाकार भ्रूण दिखाई दे सकते हैं।
  4. एक प्लैटिनम तार पिक का उपयोग करके, चयनित जानवर को समाधान10 में स्थानांतरित करें।
  5. ट्यूब के तल पर सामग्री एकत्र करने के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब को संक्षेप में (2-3 एस, ≤6,000 आरपीएम / 2,000 × ग्राम) अपकेंद्रित्र करें।
  6. थर्मोसाइक्लर में ट्यूब रखें और चरण 2.1 पर सेट लिसिस प्रोग्राम चलाएं।
  7. जब कार्यक्रम पूरा हो जाता है, तो संक्षेप में ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और इसे बर्फ पर रखें। मिश्रण के लिए किट से बेअसर समाधान के 0.8 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  8. कमरे के तापमान पर ट्यूब को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें (2-3 एस, ≤6,000 आरपीएम / 2,000 × जी)।
  9. सीधे पीसीआर के लिए लाइसेट का उपयोग करें या भविष्य के उपयोग के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: निकाले गए डीएनए कम से कम 6 महीने7 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।

3. कुछ व्यक्तियों के डीएनए निष्कर्षण

नोट: यह विधि कुछ कीड़े से डीएनए निकालने के लिए उपयोगी है। एक मास्टर मिश्रण तैयार किया जा सकता है यदि एक समय में कई उपभेदों को लाइस्ड किया जाएगा।

  1. 10 मिनट के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर एक चक्र के लिए थर्मोसाइकिलर कार्यक्रम 3 मिनट (लाइसिस कार्यक्रम) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस द्वारा पीछा किया।
  2. बर्फ पर एक 0.2 एमएल पीसीआर ट्यूब की अंदर की दीवार पर किट से निष्कर्षण समाधान के विभाज्य 2.0 μL। निष्कर्षण समाधान की बूंद के लिए किट से ऊतक तैयारी समाधान के 0.5 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  3. एक विदारक माइक्रोस्कोप9 के तहत एल 4 या वयस्क जानवरों की पहचान करें। एल 4 हेर्मैफ्रोडाइट्स में एक विशेषता वल्वा होता है जो जानवर के बीच में एक पीला आधा सर्कल के रूप में दिखाई देता है। वयस्क हेर्मैफ्रोडाइट्स प्लेट पर सबसे बड़े जानवर हैं और उनके गर्भाशय में अंडाकार भ्रूण दिखाई दे सकते हैं।
  4. एक प्लैटिनम तार पिक का उपयोग करके, समाधान में कुछ जानवरों को स्थानांतरित करें: 9 जानवरों को लाइसेट के प्रति 0.5 μL जीनोमिक डीएनए के बराबर 1 पशु उत्पन्न होता है, और 16 जानवरों को 0.25 μL (3.5 नेमाटोड /
    नोट: इस मात्रा में 16 से अधिक जानवरों को स्थानांतरित करना मुश्किल है।
  5. कमरे के तापमान पर ट्यूब को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें (2-3 एस, ≤6,000 आरपीएम / 2,000 × ग्राम)।
  6. थर्मोसाइक्लर में ट्यूब रखें और चरण 3.1 पर सेट लाइसिस प्रोग्राम चलाएं।
  7. जब कार्यक्रम पूरा हो जाता है, तो संक्षेप में ट्यूब को अपकेंद्रित्र करें और इसे बर्फ पर रखें। मिश्रण के लिए किट से तटस्थता समाधान के 2 μL जोड़ें। पाइपिंग द्वारा मिलाएं।
  8. कमरे के तापमान पर ट्यूब को संक्षेप में अपकेंद्रित्र करें (2-3 एस, ≤6,000 आरपीएम / 2,000 × जी)।
  9. सीधे पीसीआर के लिए लिसिस का उपयोग करें या भविष्य के उपयोग के लिए इसे 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    नोट: निकाले गए डीएनए कम से कम 6 महीने7 के लिए 4 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है।

4. पीसीआर प्रतिक्रिया

नोट: इस कृमि लिसिस तकनीक का एक डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोग, एक तेजी से पोलीमरेज़ का उपयोग करके विलोपन उत्परिवर्तन का पता लगाने, वर्णित है। प्रति प्रतिक्रिया एक कीड़े के 1/50वें हिस्से में कमजोर पड़ने पर सफल पीसीआर के लिए जीनोमिक टेम्पलेट डीएनए के उत्पादन में दो कृमि लिसिस प्रोटोकॉल की प्रभावशीलता भी प्रदर्शित की जाती है।

  1. एक एकल कीड़े और जंगली प्रकार एन 2 और उत्परिवर्ती उपभेदों का उपयोग कर 16 कीड़े से डीएनए निकालें, जैसा कि चरण 2 और चरण 3 में ऊपर वर्णित है।
  2. जंगली प्रकार के एन 2 जानवरों से एकल-कीड़ा डीएनए के 2-, 10-, 20-, और 50-गुना कमजोर पड़ने तैयार करें।
  3. ब्याज और गर्म शुरू पीसीआर मास्टर मिश्रण (तालिका 1 और तालिका 2) के अनुक्रम के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके निर्माता के प्रोटोकॉल के बाद पीसीआर प्रतिक्रियाओं को सेट करें। प्रत्येक प्रतिक्रिया में टेम्पलेट के रूप में पतला डीएनए के 1 μL या पतला डीएनए के 2 μL का उपयोग करें।
  4. जेल वैद्युतकणसंचलन और इमेजिंग11 द्वारा पीसीआर उत्पादों की पुष्टि करें।

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Representative Results

इन दो विधियों की प्रभावकारिता की तुलना करने के लिए वाणिज्यिक किट या पारंपरिक लाइसिस प्रोटोकॉल का उपयोग करके एकल या कुछ जंगली प्रकार के वयस्कों से जीनोमिक डीएनए निकाला गया था। इन लाइसेट्स का उपयोग तब पीसीआर के लिए टेम्पलेट्स के रूप में किया गया था ताकि ~ 2,100 बीपी (एन्कोडिंग ब्लैम्प -1) या ~ 500 बीपी ( एसएमए -10 के एक हिस्से को एन्कोडिंग) के एक छोटे लक्ष्य को बढ़ाया जा सके। दोनों विधियों ने सफलतापूर्वक उपयुक्त पीसीआर उत्पादों (चित्रा 1 ए) को प्राप्त किया।

इसके बाद, विभिन्न प्रकार के डीएनए पोलीमरेज़ के लिए टेम्पलेट के रूप में सेवा करने के लिए किट-निकाले गए जीनोमिक डीएनए की क्षमता का प्रदर्शन किया गया था। निकाले गए जीनोमिक डीएनए का उपयोग चार पोलीमरेज़ का उपयोग करके 0.5 केबी उत्पाद को बढ़ाने के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया था, जिसमें विभिन्न क्षमताएं (गति, निष्ठा और उत्पाद आकार सहित) थीं। अपेक्षित आकार के उत्पादों को इन पोलीमरेज़ द्वारा एकल-वयस्क लाइसिस या नौ-वयस्क लाइसिस (चित्रा 1 बी) से टेम्पलेट का उपयोग करके उत्पन्न किया गया था। टेम्पलेट अनुक्रम और पीसीआर पोलीमरेज़ की निष्ठा को सही ढंग से टेम्पलेट अनुक्रम को बढ़ाने के लिए अनुक्रमण (पूरक चित्रा एस 1) द्वारा पुष्टि की जा सकती है। यह परिणाम दर्शाता है कि किट प्रोटोकॉल से निकाले गए जीनोमिक डीएनए पोलीमरेज़ की एक श्रृंखला के लिए एक उपयुक्त टेम्पलेट प्रदान करता है।

पीसीआर प्रभावकारिता वाणिज्यिक किट का उपयोग कर एक ही जानवर से निकाले गए जीनोमिक डीएनए की विभिन्न सांद्रता का उपयोग करके परीक्षण किया गया था। डीएनए को 2-, 10-, 20-, या 50-गुना द्वारा पतला किया गया था, और पीसीआर के लिए प्रति प्रतिक्रिया एक कीड़े के लगभग आधे, एक-दसवें, एक-बीसवें और एक-पचासवें हिस्से के बराबर उपयोग किया गया था। इन डीएनए टेम्पलेट सांद्रता या तो ~ 2.1 केबी के एक बड़े लक्ष्य या ~ 0.5 केबी (चित्रा 1 सी) 12 के एक छोटे लक्ष्य के प्रवर्धन का समर्थन किया। जबकि 0.5 केबी पीसीआर उत्पाद की डीएनए एकाग्रता-निर्भर उपज देखी गई थी, 2.1 केबी पीसीआर उत्पाद उपज सभी प्रतिक्रियाओं में बराबर दिखाई दी।

यह प्रदर्शित करने के लिए कि ये प्रोटोकॉल सी एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए का उत्पादन करते हैं जो पीसीआर जीनोटाइपिंग के लिए उपयुक्त है, जीनोमिक डीएनए को एकल और 16 जंगली-प्रकार और ब्लम्प -1 हानि-ऑफ-फ़ंक्शन म्यूटेंट (ब्लम्प -1 (टीएम 548)) से निकाला गया था। ब्लम्प -1 जीन डिस्टल टिप सेल माइग्रेशन, शरीर के आकार और विकास 12,13,14,15,16 में महत्वपूर्ण भूमिकाओं के साथ एक प्रतिलेखन कारक को एन्कोड करता है। ब्लम्प -1 उत्परिवर्ती में 810 बीपी विलोपन होता है जो एक्सॉन 3 और इंट्रॉन 315 के कुछ हिस्सों को हटा देता है। प्राइमरों को डिज़ाइन किया गया था जिसके परिणामस्वरूप 2,134 बीपी उत्पाद होता है जब जंगली प्रकार के डीएनए टेम्पलेट का उपयोग किया जाता है और 1,324 बीपी उत्पाद यदि ब्लम्प -1 (-) डीएनए का उपयोग किया जाता है। उचित आकार के पीसीआर उत्पादों को या तो एकल-कीड़े (प्रति प्रतिक्रिया लगभग 0.5 कीड़े) या एल 4 चरणबद्ध जानवरों (प्रति प्रतिक्रिया 3.5 कीड़े) (चित्रा 1 डी) से 16-कीड़ा लिसिस के 1 μL का उपयोग करके पता लगाया गया था। इस परिणाम से पता चलता है कि या तो प्रोटोकॉल का उपयोग करके किट-निकाले गए जीनोमिक डीएनए पीसीआर से जीनोटाइप लाइनों के लिए समान रूप से प्रभावी टेम्पलेट्स प्रदान करता है।

इन परिणामों से पता चलता है कि एकल और कई जानवरों से एक वाणिज्यिक ऊतक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके सी एलिगेंस जीनोमिक डीएनए की तैयारी को पीसीआर के लिए टेम्पलेट्स के रूप में मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: एकल नेमाटोड और कई नेमाटोड से एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके डीएनए की तैयारी पीसीआर द्वारा मजबूत प्रवर्धन की अनुमति देती है। पीसीआर उत्पादों को 1x टीएई बफर (5 μL (ए, बी) या 10 μL (C,D) में 1% एगारोज जेल पर लोड किया गया था और 30 मिनट से 2 घंटे के लिए 90-100 वी पर चलाया गया था। सभी जैल के लिए एक 2-लॉग डीएनए सीढ़ी का उपयोग किया गया था। (ए) दो प्राइमर सेट का उपयोग करके टेम्पलेट बनाने के लिए पारंपरिक प्रोटीनेज के तरीकों के लिए किट द्वारा डीएनए लिसिस की तुलना। जंगली प्रकार के वयस्कों को लाइस्ड किया गया था, और एक जानवर के बराबर का उपयोग सभी प्रतिक्रियाओं के लिए टेम्पलेट के रूप में किया गया था। लेन 1-4, 2.1 केबी उत्पाद। लेन 1, प्रोटीनेस के लेन 2 द्वारा एकल-कृमि लिसिस से पीसीआर, किट विधि द्वारा एकल-कृमि लिसिस से पीसीआर। लेन 3, प्रोटीनेज के लेन 4 द्वारा नौ-कृमि कृमि लिसिस से पीसीआर, किट विधि द्वारा नौ-कृमि कृमि लिसिस से पीसीआर। लेन 5-8, 0.5 केबी उत्पाद। लेन 5, प्रोटीनेज के लेन 6 द्वारा एकल-कृमि लिसिस से पीसीआर, किट विधि द्वारा एकल-कृमि लाइसिस से पीसीआर। लेन 7, प्रोटीनेज के लेन 8 द्वारा नौ-कृमि कृमि लिसिस से पीसीआर, किट विधि द्वारा नौ-कृमि कृमि लिसिस से पीसीआर। (बी) डीएनए लाइसिस के लिए किट विधि कई पोलीमरेज़ द्वारा पीसीआर के लिए एक उपयुक्त टेम्पलेट प्रदान करती है। जंगली प्रकार के वयस्कों को किट विधि का उपयोग करके लाइस्ड किया गया था, और एक जानवर के आधे हिस्से के बराबर का उपयोग 0.5 केबी उत्पाद के लिए पीसीआर टेम्पलेट के रूप में किया गया था। पोलीमरेज़ विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें। लेन 1, एक उच्च गति पोलीमरेज़ के साथ एक एकल-कीड़ा लिसिस से पीसीआर। लेन 2, एक उच्च गति पोलीमरेज़ के साथ नौ-कृमि लाइसिस से पीसीआर। लेन 3, एक टैक पोलीमरेज़ के साथ एक एकल-कीड़ा लिसिस से पीसीआर। लेन 4, एक टैक पोलीमरेज़ के साथ नौ-कृमि लिसिस से पीसीआर। लेन 5, एक उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़ के साथ एकल-कृमि लिसिस से पीसीआर। लेन 6, एक उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ के साथ एक नौ-कृमि लिसिस से पीसीआर। लेन 7, एक उच्च गति, उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ के साथ एक एकल-कीड़ा लाइसिस से पीसीआर। लेन 8, एक उच्च गति, उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ के साथ एक नौ-कृमि लिसिस से पीसीआर। (सी) एक जंगली प्रकार के एल 4 वर्म लिसिस के कमजोर पड़ने पीसीआर के लिए टेम्पलेट प्रदान करते हैं। लेन 1-5, 2.1 केबी उत्पाद। लेन 6-10, 0.5 केबी लक्ष्य। लेन 1 और लेन 6, अनियंत्रित डीएनए। लेन 2 और लेन 7, 2 गुना पतला डीएनए। लेन 3 और लेन 8, 10 गुना पतला डीएनए। लेन 4 और लेन 9, 20 गुना पतला डीएनए। लेन 5 और लेन 10, 50 गुना पतला डीएनए। (डी) टेम्पलेट के रूप में एकल- और 16-कृमि डीएनए की तैयारी के 1 μL का उपयोग करके पीसीआर द्वारा ब्लम्प -1 लोकस को जीनोटाइप करना। लेन 1, जंगली-प्रकार के एकल-कीड़ा लिसिस से पीसीआर। लेन 2, बीएमपी -1 (-) एकल-कीड़ा लिसिस से पीसीआर। लेन 3, जंगली-प्रकार 16-कृमि लिसिस से पीसीआर। लेन 4, बीबीएमपी -1 (-) 16-कृमि लिसिस से पीसीआर। संक्षेप: तैयारी = तैयारी की विधि; केबी = किलोबेस; सेंट = सूत्रकृमि चरण; = डीएनए का कमजोर पड़ना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

लक्ष्य प्राइमर का नाम अनुक्रम
blmp-1 आगे GCGTCAGGTAAGटीटीजीटीजीएटीए
उल्टा CAGTTATTGCGCCTGTTGTT
एसएमए -10 आगे AATGTGTGGCAAGGAATCG
उल्टा टीजीटीसीटीजीटीसीसीएसीजीएजीएजीटीजी
अनुक्रमण 1 CACATCCCGGACGCCTTAAT
2 CTAATTGTTTTCTACCTGGC

तालिका 1: प्राइमरों की सूची।

एक। पोल ए, पोल बी, पोल डी पोल ई
पीसीआर मास्टर मिक्स 12.5 μL 12.5 μL
फॉरवर्ड प्राइमर 0.2 μM (अंतिम एकाग्रता) 0.5 μM (अंतिम एकाग्रता)
रिवर्स प्राइमर 0.2 μM (अंतिम एकाग्रता) 0.5 μM (अंतिम एकाग्रता)
टेम्पलेट डीएनए परिवर्तनशील 1 μL
न्यूक्लीज-मुक्त पानी to 25 μL to 25 μL
B. पोल सी
पीसीआर 5x बफर 2.5 μL
10 mM dNTPs 2.0 μL
फॉरवर्ड प्राइमर 0.2 μM (अंतिम एकाग्रता)
रिवर्स प्राइमर 0.2 μM (अंतिम एकाग्रता)
टेम्पलेट डीएनए परिवर्तनशील
पोलीमरेज़ 0.5 μL
न्यूक्लीज-मुक्त पानी to 25 μL
चित्रा 1 बी के लिए उपयोग किए जाने वाले पीसीआर कार्यक्रम
तापमान समय चक्र
98 °C 2 मिनट 1
98 °C 1 मिनट 30
55 °C 1 मिनट
72 °C 1 मिनट
72 °C 1 मिनट 1
4 °C पकड
पूरक चित्रा एस 1 के लिए उपयोग किया जाने वाला डी पीसीआर कार्यक्रम
तापमान समय चक्र
98 °C 30 s 1
98 °C 10 s 30
57 °C 20 s
72 °C 50 s
72 °C 2 मिनट 1
4 °C पकड

तालिका 2: पीसीआर प्रतिक्रिया घटक।

पूरक चित्रा एस 1: एक वाणिज्यिक किट के साथ तैयार जीनोमिक डीएनए की गुणवत्ता की पुष्टि के लिए अनुक्रमण। दो अनुक्रमण प्रतिक्रियाओं के परिणाम पूरी तरह से डीएनए के 1,600 से अधिक न्यूक्लियोटाइड्स के अपेक्षित अनुक्रम से मेल खाते हैं जो 16-कृमि लिसिस (तालिका 1, तालिका 2 ए, और तालिका 2 डी) से उच्च गति, उच्च-निष्ठा पोलीमरेज़ (पोल ई) द्वारा प्रवर्धित होते हैं। अनुक्रमण पढ़ने के सिरों को कम गुणवत्ता वाले आधार पढ़ने को हटाने के लिए छंटनी की गई थी। संरेखण ईएमबीएल-ईबीआई एकाधिक अनुक्रम संरेखण उपकरण मांसपेशी (लॉग-एक्सपेक्टेशन द्वारा मल्टिपल अनुक्रम तुलना) 17 का उपयोग करके किया गया था। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

सी एलिगेंस के जीनोटाइप का निर्धारण करना एक महत्वपूर्ण कदम है जबकि नए सी एलिगेंस उपभेदों को बनाने के लिए आनुवंशिक क्रॉस का प्रदर्शन करना। एक या कुछ सी एलिगेंस का उपयोग करके जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण जीनोटाइपिंग सी एलिगेंस में एक महत्वपूर्ण कदम है। यह प्रोटोकॉल एक वाणिज्यिक किट का उपयोग करके सी एलिगेंस से जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण का वर्णन करता है। यह विधि तेज है और मजबूती से काम करती है। इस विधि का उपयोग करके निकाले गए जीनोमिक डीएनए का उपयोग डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए किया जा सकता है, जिसमें जीनोटाइपिंग, अनुक्रमण और क्लोनिंग शामिल हैं। वर्णित डीएनए निष्कर्षण विधि को डीएनए टेम्पलेट के लिए प्रारंभिक सामग्री के रूप में एकल और कुछ एल 4 या वयस्क जानवरों का उपयोग करके जीनोटाइपिंग सी एलिगेंस जेनेटिक क्रॉस के लिए अनुकूलित किया गया है। 3.5 जानवरों (चित्रा 1 डी) के लिए एक जानवर (चित्रा 1 सी) के एक-पचासवें हिस्से के बराबर पीसीआर द्वारा लक्ष्य डीएनए अनुक्रमों को बढ़ाने के लिए एक उपयुक्त टेम्पलेट प्रदान किया। यह प्रोटोकॉल (कमजोर पड़ने के साथ) एक एकल कीड़े से अधिकतम 45 प्रतिक्रियाओं के लिए और 16 जानवरों से 100 प्रतिक्रियाओं के लिए पर्याप्त टेम्पलेट (2 μL / प्रतिक्रिया पर) उत्पन्न करता है। यहां तक कि प्रति प्रतिक्रिया एक कीड़ा का उपयोग करके, ये प्रोटोकॉल सी एलिगेंस से डीएनए निकालने के लिए एक लागत-कुशल तरीका प्रदान करते हैं। प्रोटोकॉल की सादगी, मजबूती और त्वरितता को देखते हुए, यह अनुसंधान और कक्षा अनुप्रयोगों दोनों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।

चूंकि प्रोटोकॉल में अभिकर्मकों की छोटी मात्रा में पाइपिंग शामिल है, कई प्रतिक्रियाओं, अच्छी पाइपिंग तकनीक के लिए एक मास्टर मिश्रण की तैयारी, और स्थिरता सुनिश्चित करने के लिए अच्छी तरह से कैलिब्रेटेड पिपेट का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। एकल- या 9-16-पशु लाइस से अपरिवर्तित डीएनए टेम्पलेट के 0.5-1 μL का उपयोग करना आमतौर पर एक गर्म-स्टार्ट पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग करके 25 μL पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए काम करता है, लेकिन टेम्पलेट एकाग्रता के अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। अभिकर्मकों को प्रयोग की अवधि के लिए बर्फ पर रखा जाना चाहिए। डीएनए निष्कर्षण समाधानों के बार-बार फ्रीज-विगलन से बचने के लिए, जो एंजाइम प्रदर्शन को कम कर सकता है, यह अनुशंसा की जाती है कि अभिकर्मकों को विभाज्य किया जाए और -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जाए।

पीसीआर की आवश्यकता वाले डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए, एक गर्म-स्टार्ट, उच्च गति पीसीआर मास्टर मिश्रण का उपयोग वाणिज्यिक ऊतक किट में प्रदान किए गए पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण की तुलना में कुल समय को और कम कर देता है। उच्च गति पोलीमरेज़ 5-10 एस में 1 केबी से कम के उत्पादों को बढ़ा सकते हैं (पोलीमरेज़ विवरण के लिए सामग्री और तालिका 2 की तालिका देखें), जबकि किट का पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण ~ 1 केबी / मिनट7 की प्रवर्धन दर के साथ एक टैक डीएनए पोलीमरेज़ का उपयोग करता है। कुछ पीसीआर के उत्पादों को सीधे वैद्युतकणसंचलन के लिए एक एगारोज जेल में लोड किया जा सकता है, आगे चरणों और समय को कम किया जा सकता है। यह प्रतिक्रिया बफर प्रतिबंध एंजाइम पाचन के साथ भी संगत है। उच्च-निष्ठा वाले डीएनए पोलीमरेज़ भी इस प्रोटोकॉल (चित्रा 1 बी) का उपयोग करके निकाले गए डीएनए के साथ मजबूती से काम करते हैं। जबकि उपयोग किए जाने वाले पोलीमरेज़ लगातार किट-निकाले गए टेम्पलेट का उपयोग करके काम करते थे, अन्य पोलीमरेज़ का उपयोग टेम्पलेट, प्राइमर सेट गुणों, उत्पाद आकार और आवश्यक निष्ठा के आधार पर बेहतर परिणाम प्रदान कर सकता है। यदि पीसीआर के बाद समस्याओं का सामना करना पड़ता है, जैसे कि कोई लक्ष्य बैंड प्रवर्धित या अतिरिक्त बैंड प्रवर्धित नहीं होता है, तो प्राइमर काम करने की स्थिति या डीएनए टेम्पलेट एकाग्रता के आगे अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है। यह दृढ़ता से अनुशंसा की जाती है कि जंगली प्रकार के डीएनए टेम्पलेट और प्राइमरों के उपयोग सहित उचित नियंत्रण, जो काम करने के लिए साबित हुए हैं, का उपयोग किया जाना चाहिए।

यह विधि उन अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त नहीं होगी जिनके लिए अत्यधिक शुद्ध या डीएनए टेम्पलेट की उच्च उपज की आवश्यकता होती है। जबकि तैयार किए गए जानवरों की संख्या और प्रतिक्रिया की मात्रा को बढ़ाया जा सकता है, इस विधि का उपयोग करके तैयार डीएनए को जीवीय मलबे से अलग नहीं किया जाता है और पूरे जीनोम अनुक्रमण जैसे अत्यधिक संवेदनशील अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त शुद्ध नहीं हो सकता है।

मौजूदा पारंपरिक जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण विधियों की तुलना में इस विधि के प्रमुख लाभों में कम समय और सरल, आसान कदम शामिल हैं। भविष्य में, इस विधि को बढ़ाया जा सकता है, अन्य डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों के लिए सी एलिगेंस जीनोमिक डीएनए निकालने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और अन्य निमेटोड प्रजातियों से डीएनए निकालने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए ब्याज का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

एन 2 तनाव और ई कोलाई ओपी 50 बैक्टीरिया कैनोरहाब्डिटिस जेनेटिक्स सेंटर (सीजीसी) से प्राप्त किए गए थे, जिसे एनआईएच ऑफिस ऑफ रिसर्च इंफ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम्स (पी 40 ओडी 010440) द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। ब्लम्प -1 (टीएम 548) तनाव राष्ट्रीय जैव संसाधन परियोजना, जापान से प्राप्त किया गया था। लेखक वर्मबेस को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच आर 01 जीएम 097591 द्वारा टीएलजी, टेक्सास वुमन यूनिवर्सिटी द्वारा टीएलजी को आंतरिक वित्त पोषण और टीडब्ल्यूयू के छात्र अनुसंधान केंद्र द्वारा एमएफएल में समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoclave tape Defend 43237-2
aluminium foil, heavy duty Reynolds Wrap 2182934
calcium chloride Millipore Sigma 102382 (CAS 10035-04-8)
Extract-N-Amp kit (includes Tissue Preparation Solution, Extraction Solution, and Neutralization Solution) Sigma-Aldrich Co. LLC XNAT2-1KT
Isotemp hotplate/stirrer Fisher Scientific 11-100-495H
LB media, Lennox, capsules MP Biomedicals, LLC 3002-131
magnesium sulfate, 97% pure, anhydrous Thermo Scientific AC413485000 (CAS 7487-88-9)
microcentrifuge Labnet International, Inc. PrismR, C2500-R
NEB Q5U Hot Start High-Fidelity DNA polymerase New England Biolabs, Inc. M0515S "Pol E" used in Supplemental Figure S1, a high-speed, high-fidelity polymerase (20–30 s/kb)
NGM media powder US Biological Life Sciences N1000
Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer New England Biolabs, Inc. M0531S "Pol D" in Figure 1B, a high-speed, high-fidelity polymerase (15–30 s/kb)
primers Integrated DNA Technologies custom DNA oligos
PrimeSTAR GXL polymerase Takara Bio Inc. R050B "Pol C" in Figure 1B, a high-fidelity polymerase (1 min/kb) for GC-rich templates and templates up to 30 kb
Quick-Load Purple 2-log DNA Ladder (0.1–10.0 kb) New England Biolabs, Inc. N0550S
SapphireAmp Fast PCR Master Mix Takara Bio Inc. RR350A "Pol A" in Figure 1B, polymerase used in Figure 1A, C, D, a high-speed polymerase (10 s/kb) for targets up to 5 kb
Sigma ReadyMix Taq PCR reaction mix Sigma-Aldrich Co. LLC P4600 "Pol B" in Figure 1B, a polymerase (1 min/kb) for targets up to 7 kb
SimpliAmp thermal cycler Applied Biosystems A24812
stir bar Fisher Scientific 14-512-126
vortex mixer Fisher Scientific 2215365
worm pick Genesee Scientific Corporation 59-AWP

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References

  1. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A on Caenorhabditis elegans. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-31 (2015).
  2. Page, A. P., Johnstone, I. L. The cuticle. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook (2007).
  3. Williams, B. D., Schrank, B., Huynh, C., Shownkeen, R., Waterston, R. H. A genetic mapping system in Caenorhabditis elegans based on polymorphic sequence-tagged sites. Genetics. 131, 609-624 (1992).
  4. Lissemore, J. L., Lackner, L. L., Fedoriw, G. D., De Stasio, E. A. Isolation of Caenorhabditis elegans genomic DNA and detection of deletions in the unc-93 gene using PCR. Biochemistry and Molecular Biology Education. 33, 219-226 (2005).
  5. Fay, D., Bender, A. SNPs: introduction and two-point mapping. WormBook. , ed. The C. elegans Community, WormBook 1-10 (2008).
  6. Biron, D. C. elegans: Methods and Applications. Haspel, G. , Humana Press. Totowa, NJ. (2015).
  7. Sigma-Aldrich. Extract-N-Amp Tissue PCR Kit technical bulletin. , Available from: https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/assets/sigmaaldrich/product/documents/249/244/xnat2bul.pdf (2013).
  8. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , ed. The C. Elegans Research Community, Wormbook (2006).
  9. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (27), e1152 (2009).
  10. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2293 (2011).
  11. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (62), e3923 (2012).
  12. Gumienny, T. L., et al. Caenorhabditis elegans SMA-10/LRIG is a conserved transmembrane protein that enhances bone morphogenetic protein signaling. PLoS Genetics. 6, 1000963 (2010).
  13. Nelson, M. D., et al. A bow-tie genetic architecture for morphogenesis suggested by a genome-wide RNAi screen in Caenorhabditis elegans. PLoS Genetics. 7, 1002010 (2011).
  14. Zhang, L., Zhou, D., Li, S., Jin, C. BLMP-1 contributes to collagen-related morphogenesis in C. elegans. Life Science Journal. 9, 1080-1088 (2012).
  15. Horn, M., et al. DRE-1/FBXO11-dependent degradation of BLMP-1/BLIMP-1 governs C. elegans developmental timing and maturation. Developmental Cell. 28, 697-710 (2014).
  16. Huang, T. -F., et al. BLMP-1/Blimp-1 regulates the spatiotemporal cell migration pattern in C. elegans. PLoS Genetics. 10, 1004428 (2014).
  17. Lakdawala, M. F., Madhu, B., Faure, L., Vora, M., Padgett, R. W., Gumienny, T. L. Genetic interactions between the DBL-1/BMP-like pathway and dpy body size-associated genes in Caenorhabditis elegans. Molecular Biology of the Cell. 30, 3151-3160 (2019).
  18. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).

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जीवविज्ञान अंक 184 डीएनए निष्कर्षण कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस कीड़ा लिसिस जीनोटाइपिंग जीनोमिक डीएनए पीसीआर
<em>कैनोरहाब्डिटिस एलिगेंस</em> जीनोमिक डीएनए के छोटे पैमाने पर निष्कर्षण
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Madhu, B., Lakdawala, M. F., Gumienny, T. L. Small-Scale Extraction of Caenorhabditis elegans Genomic DNA. J. Vis. Exp. (184), e63716, doi:10.3791/63716 (2022).

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