Summary
Vi presenterar ett protokoll för implementering av interferensreflektionsmikroskopi och total-intern-reflektion-fluorescensmikroskopi för samtidig avbildning av dynamiska mikrotubuli och fluorescerande märkta mikrotubuliassocierade proteiner.
Abstract
Flera tekniker har använts för direkt visualisering av cytoskelettfilament och deras associerade proteiner. Total-intern-reflektion-fluorescens (TIRF) mikroskopi har ett högt signal-till-bakgrundsförhållande, men det lider av fotoblekning och fotoskada av de fluorescerande proteinerna. Etikettfria tekniker som interferensreflektionsmikroskopi (IRM) och interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT) kringgår problemet med fotoblekning men kan inte lätt visualisera enskilda molekyler. Detta dokument presenterar ett protokoll för att kombinera IRM med ett kommersiellt TIRF-mikroskop för samtidig avbildning av mikrotubuliassocierade proteiner (MAPs) och dynamiska mikrotubuli in vitro. Detta protokoll möjliggör höghastighetsobservation av MAPs som interagerar med dynamiska mikrotubuli. Detta förbättrar befintliga tvåfärgade TIRF-inställningar genom att eliminera både behovet av mikrotubulimärkning och behovet av flera ytterligare optiska komponenter, såsom en andra excitationslaser. Båda kanalerna avbildas på samma kamerachip för att undvika problem med bildregistrering och ramsynkronisering. Denna inställning demonstreras genom att visualisera enstaka kinesinmolekyler som går på dynamiska mikrotubuli.
Introduction
Total-intern-reflektion-fluorescens (TIRF) mikroskopi används ofta för visualisering av enstaka fluorescerande molekyler. Jämfört med epifluorescensavbildning uppnår TIRF överlägsen bakgrundsundertryckning, vilket möjliggör högupplöst lokalisering och spårning av enstaka fluoroforer. Av denna anledning är TIRF den föredragna metoden för att visualisera fluorescerande märkta mikrotubuliassocierade proteiner och används ofta för att avbilda mikrotubuli 1,2.
För att undersöka regleringen av mikrotubulidynamik av MAPs är det ofta nödvändigt att avbilda både mikrotubuli och MAPs samtidigt. De flesta befintliga metoder för detta ändamål är dyra eller lider av tekniska nackdelar. Samtidig tvåfärgad TIRF kräver till exempel två excitationslasrar och två kameror. Förutom den höga kostnaden utgör behovet av separata kameror ramsynkroniserings- och bildregistreringsproblem. Detta behov kan kringgås om en roterande filterkub används för att fysiskt växla mellan excitationslasrar i på varandra följande bildrutor3. I en sådan inställning kan ett enda kamerachip användas, och ramarna växlar mellan bilder av mikrotubuli och MAPs. Denna teknik begränsas dock av filterbytets hastighet, vilket vanligtvis begränsar bildhastigheten till mindre än 0,5 bildrutor per sekund3 (fps). En sådan bildhastighet är otillräcklig för att lösa snabba dynamiska processer, såsom krympning av en mikrotubuli som uppträder med en hastighet av upp till 500 nm / s, gång av ett kinesin med en hastighet i storleksordningen 800 nm / s, eller diffusion av en MAP som uppträder med diffusionskoefficienter som överstiger 0,3 μm2 / s4. Detta är särskilt problematiskt när man spårar de relativa positionerna för två rörliga mål i varje kanal, såsom positionen för en MAP i förhållande till positionen för en rörlig mikrotubulispets5.
Förutom dessa optiska begränsningar kräver tvåfärgad TIRF-mikroskopi att MAPs och mikrotubuli ska märkas med olika fluoroforer vars emissionsspektra är tillräckligt separerade. Fluorescerande märkning av tubulin kan förändra mikrotubulidynamik6, och fotoblekning av fluoroforer begränsar bildhastigheten7. På grund av dessa problem har etikettfria bildtekniker utvecklats för att visualisera mikrotubuli. Dessa inkluderar interferometrisk spridningsmikroskopi (iSCAT)8,9, roterande koherent-spridningsmikroskopi (ROCS)10, spatial ljusinterferensmikroskopi (SLIM)11 och interferensreflektionsmikroskopi (IRM)12,13. Dessa tekniker möjliggör snabb etikettfri avbildning av mikrotubuli utan nackdelarna med fluorescensavbildning, men de kan inte användas för att visualisera enskilda MAPs.
Av dessa etikettfria tekniker sticker IRM ut för sin låga kostnad och sina blygsamma krav på instrumentering. Vi har nyligen presenterat ett protokoll för att kombinera IRM med ett kommersiellt TIRF-mikroskop, vilket gör att mikrotubuli och fluorescerande MAPs kan avbildas i alternerande ramar 3,13. Detta dokument presenterar ett protokoll för att ändra denna inställning för att samtidigt fånga TIRF- och IRM-bilder på ett enda kamerachip. Detta innebär tillsats av en billig stråldelare i excitationsvägen för att samtidigt belysa provet med en TIRF-laser och en IRM LED-ljuskälla. En modifierad kommersiell bilddelare används för att spektralt separera TIRF- och IRM-signalerna och projicera dem på separata halvor av samma kamerachip. Vi använder också ett mikrofluidiskt system som möjliggör snabbt utbyte av reagens under avbildning. Detta protokoll beskriver hur denna inställning kan användas för att avbilda dynamiska mikrotubuli och MAPs. Apparatens förmåga demonstreras genom att presentera den första visualiseringen av kinesin-1-proteiner som går på krympande mikrotubuli, som fångas med en bildhastighet av 10 s-1.
Protocol
1. Beredning av flödeskamrar
OBS: Mikrofluidiska flödeskammare kommer att konstrueras genom att fästa polydimetylsiloxan (PDMS) mikrokanaler till ett rengjort och funktionaliserat täckglas. Mikrokanalerna kommer att gjutas i en huvudform.
-
Förberedelse av PDMS-kanaler
- Förbered rengjorda och/eller funktionaliserade täckglas med ytkemi som är lämplig för den specifika analys som avbildas.
OBS: För kinesinmotilitetsanalyser används piranha-rengjorda silaniserade täckglas. Dessa framställs enligt beskrivningen i Gell et. al.1 Alternativt är ett enklare förfarande att sonikat täcka glasögon i isopropanol följt av metanol i 3x 20 min cykler. - För att förbereda en huvudform, skär remsor av ensidig stationär tejp till önskad flödeskanalstorlek. Fäst remsorna i botten av en 10 cm petriskål och ordna dem sida vid sida med minst 1 cm avstånd mellan remsorna.
OBS: Om exakta kanaldimensioner krävs kan formen tillverkas på kiselskivor med fotolitografi14. - För att förbereda PDMS-polymeren, kombinera härdningsmedlet och baselastomeren i ett massförhållande på 1:10. Blanda i 2 min.
OBS: Detta blandningsförhållande kan varieras för att ställa in polymerens styvhet. Ett högre förhållande mellan bas och härdningsmedel resulterar i en mjukare polymer. - Avgasa blandningen i en vakuumkammare tills alla bubblor försvinner.
- Häll blandningen på huvudformen i ett ~ 0,5 cm tjockt lager, var noga med att undvika att skapa bubblor.
- Grädda blandningen i en förvärmd ugn vid 70 ° C i 40 minuter.
OBS: En längre härdningstid kan krävas om PDMS-blocket är tjockt (>1 cm). Fortsätt värma i steg om 5 minuter tills den är helt härdad. - Skär ut polymerens strukturerade områden. Stansa hål i varje ände av kanalen med en PDMS-puncher.
OBS: I detta protokoll är håldiametern inställd på 0,75 mm och kan justeras enligt de önskade flödeshastigheterna. PDMS-kanaler kan lagras i torra miljöer under längre perioder men bör rengöras före användning. - Rengör den strukturerade sidan av PDMS-blocket. Använd stationär tejp för att ta bort stora partiklar. Skölj med isopropanol och sedan metanol. Upprepa dessa sköljningar 3x, skölj med ultrarent vatten och föna ytan.
- Plasma rengör PDMS med syre eller luftplasma.
OBS: I detta protokoll används 18 W luftplasma. - Placera det plasmarenade PDMS-systemet på ett lämpligt rengjort täckglas och värm på en värmeplatta vid 80 °C i 15 minuter.
OBS: Epoxiharts kan appliceras på sidorna av PDMS-blocket för att bättre fästa det på täckglaset. - Sätt in slangar av polyeten (LDPE) i lämplig storlek i hålen. Anslut utloppsslangen till en 0,5 ml spruta.
OBS: I detta protokoll är rör med en innerdiameter på 0,023 tum anslutna till PDMS via en metalladapter med 0,025 i ytterdiameter. - Flödeslösningar in i mikrokanalerna genom att nedsänka inloppsröret i lösningen och dra den önskade volymen med sprutan.
- Förbered rengjorda och/eller funktionaliserade täckglas med ytkemi som är lämplig för den specifika analys som avbildas.
2. Optisk inställning
-
Modifiering av mikroskopet (figur 1)
- Ändra ett TIRF-mikroskop för att aktivera IRM-avbildning13. Byt ut 50/50 (Reflectance (R)/Transmission (T)) stråldelaren som används i mikroskopets filterhjul mot en 10/90 (R/T) stråldelare.
- Sätt i en bilddelare mellan kameran och mikroskopet.
- I filterkuben på bilddelaren sätter du in en 10/90 (R/T) stråldelare. Placera ett 600 nm långpassfilter framför den reflekterade strålen och ett lämpligt fluorescensemissionsfilter framför den överförda strålen.
OBS: Stråldelare med olika R / T-förhållanden kan användas för att ställa in fraktionerna av IRM- och TIRF-emissionsljuset som samlas in. - Rikta in bilddelaren enligt tillverkarens specifikationer för att rumsligt separera TIRF- och IRM-signalerna på kamerachipet.
OBS: Rumslig separation av signalerna krävs eftersom TIRF-signalen för typiska fluoroforer är mycket svagare än IRM-signalen för en mikrotubuli och inte skulle kunna detekteras om de två signalerna överlagrades.
3. Avbildning av dynamiska mikrotubuli och enstaka Kinesin-molekyler
- Ytfunktionalisering och passivering
- Flöde BRB80-buffert (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mMMgCl2, titrerad till pH 7,8 med NaOH) in i reaktionskammaren.
- Flöde antibiotinlösning utspädd till 0,025 mg / ml i BRB80 och inkubera vid rumstemperatur i 10 min.
- Tvätta kanalen med BRB80.
- Flöde i F-127-lösning (1% Pluronic F-127 (w / v) upplöst i BRB80 över natten) och inkubera i minst 20 minuter för ytpassivering.
OBS: Om lätt rengjorda täckglas används istället för silaniserade täckglas, passivera med 2 mg / ml kasein i BRB80 i >20 minuter vid rumstemperatur. - Tvätta kanalen med BRB80.
- Förberedelse för avbildning
- Om temperaturkontroll krävs, använd en objektiv värmare och ställ in den på rätt temperatur.
OBS: I detta protokoll utförs alla experiment vid 28 °C. - Placera provet på mikroskopsteget och slå på epiilluminationsljuskällan (>600 nm) för IRM-avbildning.
OBS: I detta protokoll används en vit LED-ljuskälla med ett 600 nm långpassfilter. - Fokusera mikroskopet på provytan. Leta efter rätt fokalplan nära PDMS-lösningens gränssnitt.
OBS: I IRM bör kanalens vattenhaltiga inre se mycket ljusare ut än PDMS-polymeren. - Välj ett synfält nära mitten av kanalen.
- Bered en lösning av 0,1 μm fluorescerande mikropärlor i BRB80 (densitet: 109 pärlor/ml, vilket motsvarar en 200-faldig utspädning för de pärlor som används i detta protokoll).
- Flöda i minst en kanalvolym av mikroblösningen.
- Övervaka reaktionen via IRM. Vänta tills mikroberna gradvis "landar" på ytan. När den önskade densiteten av mikrober uppnås, tvätta ut överskottet med BRB80.
- Om temperaturkontroll krävs, använd en objektiv värmare och ställ in den på rätt temperatur.
- Växande biotinylerat guanylyl 5'-α,β-metylendifosfonat (GMPCPP)-stabiliserade mikrotubulifrön
- I ett 0,6 ml centrifugrör, förbered 50 μL av en lösning innehållande 1 mM GMPCPP, 1 mMMgCl2 och 2 μM biotinylerat tubulin (5-10% märkning stökiometri) i BRB80.
OBS: Korrekt märkning stökiometri kan uppnås genom att kombinera biotinylerat tubulin med hög densitet med omärkta nötkreatur i rätt förhållande. - Inkubera lösningen på is i 5 minuter och inkubera sedan vid 37 °C i 12,5 minuter.
OBS: Fröns längd kan styras genom att ställa in polymerisationstiden. - Stoppa polymerisationen genom att tillsätta 100 μl rumstemperatur BRB80.
- Snurra ner lösningen i en ultracentrifug vid rumstemperatur (126 000 x g, 5 min). Kassera supernatanten genom att använda en pipett för att ta bort opolymeriserat tubulin.
OBS: I detta protokoll används en luftdriven ultracentrifug. - Tillsätt 200 μL rumstemperatur BRB80 till pelleten. Resuspendera pelleten genom att pipettera försiktigt men noggrant. Använd en 200 μL pipett med en skuren spets för att minska skjuvningen av mikrotubuli.
- I ett 0,6 ml centrifugrör, förbered 50 μL av en lösning innehållande 1 mM GMPCPP, 1 mMMgCl2 och 2 μM biotinylerat tubulin (5-10% märkning stökiometri) i BRB80.
- Växande dynamisk guanosindifosfat (BNP) -tubulin "förlängningar"
OBS: Fröna kommer att immobiliseras på flödeskanalens antibiotinyta. Dynamiska GTP / BNP "förlängningar" kommer att odlas från ändarna av de immobiliserade frön.- Späd frön 20x i BRB80. Flöda de utspädda frön i reaktionskammaren.
- Övervaka reaktionen via IRM. Vänta tills fröna gradvis "landar" på ytan och binder till den. När den önskade densiteten av frön uppnås, tvätta ut överskottet med BRB80.
- Förbered en mikrotubuliförlängningsblandning: 12 μM omärkt tubulin, 1 mM GTP, 5 mM ditiotreitol (DTT) i BRB80-buffert.
- Flöde i minst en kanalvolym av förlängningsblandningen. Se till att reaktionstemperaturen är 28 °C.
- Vänta tills mikrotubuliförlängningarna växer från fröna över tiden.
OBS: Steady-state-längden uppnås vanligtvis på mindre än 20 minuter. - Använd de dynamiska mikrotubuli för avbildning. Lägg till och visualisera fluorescerande MAPs på mikrotubuli, enligt beskrivningen i steg 3.5 för kinesin-1.
OBS: Eftersom mikrotubuli är ytbundna är de lätt synliga av TIRF.
- Kinesin motilitetsanalys
OBS: Detta steg beskriver ett protokoll för visualisering av rörligt grönt fluorescerande protein (GFP) -märkt kinesin-1 på krympande mikrotubuli. En stympad råttkinesin-1-konstruktion smält till eGFP (rKin430-eGFP) uttrycktes och renades, som tidigare beskrivits15,16.- Förbered motilitetsbuffert: 1 mM ATP och 0,2 mg / ml kasein i BRB80.
- Späd kinesin-eGFP i motilitetsbuffert till 10 nM.
- Förbered en 2x syrerensningslösning för att motverka oxidativ fotoblekning (80 mM glukos, 80 mg / ml glukosoxidas, 32 mg / ml katalas, 0,2 mg / ml kasein, 20 mM DTT) kompletterat med 2 mM ATP.
- Kombinera 10 delar syreavskiljare, 9 delar BRB80 och 1 del 10 nM kinesin-eGFP för en slutlig kinesinkoncentration på 0,5 nM.
OBS: Den totala volymen bör vara minst 1,5 gånger större än kanalvolymen. - Ställ in bildinställningarna på mikroskopprogramvaran.
OBS: I detta protokoll spelas videor in med 10 fps med 100 ms exponeringstid. Laserintensiteten är ~0,05 kW/cm2. - Börja avbilda och flöda kinesinlösningen in i kammaren.
- När mätningen är klar spelar du in en kort (~ 5 s) video där scenen långsamt översätts i en cirkulär eller lateral rörelse. Använd medianprojektionen för den här videon som bakgrundsbild och subtrahera den från råmätningarna.
4. Bildbehandling och analys
OBS: Bildbehandling utfördes med NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Ett makro utvecklades för att automatisera delningen och inriktningen av TIRF- och IRM-kanalerna. Det här makrot kräver att plugin-programmet GaussFit_OnSpot installeras (tillgängligt på ImageJ-plugin-arkivet).
- Från bakgrundsinspelningen skapar du en medianprojektion i ImageJ genom att klicka på Bild | Staplar | Z-projektet.
- Subtrahera medianbakgrundsprojektionen från råbilddata genom att klicka på Process | Bildkalkylator.
OBS: Se till att markera alternativet "32-bitars (float) resultat". - För bildregistrering, välj en samling mikropärlor nära mikrotubuli av intresse och använd dem för att justera TIRF- och IRM-bilderna.
- För varje pärla i den här samlingen använder du flerpunktsvalsverktyget för att markera den ungefärliga platsen i TIRF-kanalen och sedan motsvarande plats i IRM-kanalen.
OBS: Om det till exempel finns två pärlor (1 och 2) skulle flerpunktsvalet ha fyra punkter i följande ordning: (1) pärla 1 i TIRF, (2) pärla 1 i IRM, (3) pärla 2 i TIRF, (4) pärla 2 i IRM. - Kör det angivna ImageJ-makrot (ImageSplitterRegistration.ijm).
OBS: Detta automatiserar följande steg: i) uppskattning av mittplatsen för varje pärla genom att passa till en Gaussian; ii) för varje pärla, beräkning av förskjutningsvektorn som skiljer mitten i TIRF-kanalen från mitten i IRM-kanalen; iii) medelvärde för denna förskjutningsvektor över alla pärlor; iv) dela upp TIRF- och IRM-kanalerna i separata bilder; v) översätta TIRF-bilden med den genomsnittliga förskjutningsvektorn beräknad i iii; vi) överlagra TIRF- och IRM-bilderna i en flerkanalig .tiff fil.
Representative Results
Den optiska inställningen schemaläggs i figur 1. Både IRM-belysning och TIRF-excitationsljus riktas mot målets bakre bländare (100x, NA: 1,49) via en 10/90 (R / T) stråldelare (BS1). Den utsända signalen passerar genom samma stråldelare (BS1) och reflekteras till bilddelaren via en spegel (M1). Komponenterna i bilddelaren (inneslutna med streckade linjer i figur 1) separerar IRM- och TIRF-signalerna via en 90/10 (R/T) stråldelare (BS2) tillsammans med lämpliga spektralfilter. Slutligen projiceras de delade bilderna på kamerachipet för visualisering. Justeringen av bilddelaren är sådan att TIRF- och IRM-signalerna projiceras på separata halvor av chipet.
I ett välriktat mikroskop ska kamerabilden visa en halvvägs delad bild, som visas i figur 2. Ytbundna mikrotubuli ska vara väl synliga i IRM-kanal13 och fluorescerande kinesin ska vara synligt i TIRF-kanalen.
Mikropärlorna som används för att justera och registrera de två kanalerna visas som ljusa fläckar i TIRF-bilderna och mörka fläckar i IRM-bilderna. Även om pärlorna är synliga i rådata förbättrar bakgrunds subtraktion kontrasten avsevärt (figur 2). Bakgrundsbilden som används för subtraktionen är den temporala medianen för en video som spelats in med ett rörligt stadium. Som beskrivs i protokollet utfördes bildjustering genom att välja en samling pärlor nära det intressanta området och köra det angivna makrot (imageSplitterRegistration.ijm). Makrot anpassar punkterna till Gaussianerna och justerar bilderna genom att minimera det genomsnittliga avståndet mellan mittpunkterna för passningarna i varje kanal. Denna process representeras i figur 2, som visar en bra inriktning av de fluorescerande mikroberna (grön i TIRF-kanalen, svart i IRM-kanalen).
Slutligen demonstreras kapaciteten hos denna samtidiga avbildningsinställning genom att observera enstaka kinesinmolekyler som går mot de krympande ändarna av mikrotubuli. Figur 3 visar en kymograf av eGFP-märkta kinesinmolekyler (gröna) som går på en krympande mikrotubuli (grå). Dessutom presenteras en serie ögonblicksbilder från inspelningen från vilken kymografen genererades.
Figur 1: Schematisk representation av den optiska inställningen för samtidig IRM- och TIRF-avbildning av kinesinmotilitet. Epiillumination från en LED-ljuskälla passerar genom bländarmembranet och når 10/90 (R / T) stråldelaren (BS1). Stråldelaren reflekterar delvis det röda IRM-belysningsljuset och 488 nm TIRF-excitationsljuset upp till målet att belysa provet. Signalen från provet samlas in med samma mål och riktas till bilddelningsenheten där IRM- och TIRF-bilder separeras rumsligt av 90/10 (R / T) stråldelaren (BS2). Signalerna filtreras sedan spektralt innan de når kamerachipet. Förkortningar: IRM = interferensreflektionsmikroskopi; TIRF = total-intern-reflektion-fluorescens; LED = lysdiod; ITIRF = TIRF-belysning; IGFP = GFP fluorescens; Iinc = IRM-belysning; Iref = spritt ljus vid glas/vatten-gränssnittet; Iscat = spritt ljus från mikrotubuli; IIRM = IRM-signal (Interferens av Iref och Iscat); R/T = reflekterad/överförd; LP600: långpassfilter (600 nm); DM = dikroisk spegel; BS1 och BS2 = stråldelare 1 och 2; M1, M2, M3, M4 = speglar; BP535/50 = bandpass (535/50 nm); GFP = grönt fluorescerande protein; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-metylendifosfonat; BNP = guanosindifosfat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 2: Bakgrunds subtraktion och bildjustering. TIRF-bilderna (vänster halva) och IRM-bilderna (höger halva) visas samtidigt på två halvor av samma kamerachip (kamerabild). Temporal medianbakgrunds subtraktion ökar kontrasten mellan pärlorna (bakgrunds subtraherad bild), som verkar mörka i IRM och ljusa i TIRF-bilder. IRM- och TIRF-bilder justeras genom översättning (höger) baserat på lokalisering av valda pärlor (vita rektanglar). Skalstänger = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Kymograf och ögonblicksbilder av Kinesins rörelse under mikrotubulikrympning. Kymografen (vänster) visar eGFP-kinesin-1 (grön) som går mot plusänden av mikrotubuli (mörkgrå). Ögonblicksbilder från motsvarande tidsserie visas (höger). Vita pilar visar enstaka kinesin-1 molekyler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
ImageSplitterRegistration File: Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
Att studera regleringen av mikrotubulidynamiken med mikrotubuliassocierade proteiner (MAPs) kräver ofta samtidig avbildning av mikrotubuli och MAPs. Fluorescensmikroskopitekniker som TIRF används vanligtvis för detta ändamål. De är emellertid begränsade av nackdelarna med fluorescensavbildning, som inkluderar fotoblekning, fotoskada och behovet av fluoroformärkning. Etikettfria metoder, såsom IRM, är lämpliga för visualisering av mikrotubuli men kan inte avbilda enstaka fluoroforer. Detta protokoll kombinerar etikettfri IRM-avbildning och TIRF-mikroskopi för samtidig avbildning av dynamiska mikrotubuli och MAPs.
IRM-installationen använder en LED-belysningskälla filtrerad till >600 nm, medan TIRF-installationen använder en 488 nm laser. Vi använde en billig plattstråledelare för att reflektera belysningsljuset på provet och överföra den insamlade signalen till detektorn (figur 1). En stråldelare med 10% reflektans och 90% överföring valdes för att minimera förlusten av enmolekylsignalen. 90% förlust i belysningsljusintensiteten kompenseras genom att öka effekten av belysningslasern och lysdioden.
Spektral separation av signalerna uppnåddes med hjälp av en 90/10 (R / T) stråldelare och två spektralfilter (långpass 600 nm för IRM och bandpass 535/50 nm för TIRF). De spektralt separerade IRM- och TIRF-signalerna projiceras på två halvor av ett enda kamerachip med hjälp av en bilddelare. Användningen av en 90/10 stråldelare offrar 90% av IRM-signalen, men detta kompenseras genom att öka intensiteten hos LED-belysningskällan. En dikroisk spegel kan också användas här för att separera IRM- och TIRF-signalerna mer effektivt. Fluorescerande mikrober som ingår i analyserna möjliggör exakt inriktning av TIRF- och IRM-bilderna och fungerar som en referens för att fokusera målet.
Det mest kritiska optiska elementet i detta protokoll är målet med hög numerisk bländare (NA). Detta är viktigt inte bara för att uppnå total intern reflektion utan också för att maximera samlingens effektivitet och bildkontrast. Kvaliteten på de erhållna bilderna beror också på glasytans renhet och förvärvet av en tydlig bakgrundsbild för att korrigera för icke-enhetlig belysning och ta bort statiska funktioner. För IRM-avbildning rekommenderar vi att du använder långvåglängdsbelysning (>600 nm) för att minimera fotoskadorna hos mikrotubuli och proteiner. Detta är särskilt viktigt om en vit LED-ljuskälla används, i vilket fall ett långpassfilter bör inkluderas för att ta bort UV-ljus.
Detta protokoll möjliggör etikettfri, höghastighetsavbildning av dynamiska mikrotubuli och samtidig högupplöst visualisering av fluorescerande MAPs17. Jämfört med filterkubväxlingstekniken, som växlar mellan att ta bilder av mikrotubuli och MAPs, kan denna inställning mycket högre bildhastigheter eftersom den inte beror på den fysiska rotationen av en filterkub. Jämfört med tvåfärgade TIRF-avbildningstekniker använder denna teknik en mindre krävande optisk inställning och kringgår behovet av fluoroformärkning av mikrotubuli. De primära begränsningarna för denna inställning beror på TIRF-avbildning av MAPs; bildhastigheten begränsas av exponeringstiden för en fluorofor, och fotoblekning av fluoroforer är fortfarande en möjlighet. Icke desto mindre förbättrar detta protokoll befintliga tekniker eftersom det endast använder TIRF när det är nödvändigt (dvs. för att visualisera MAPs men inte mikrotubuli) och uppnår högsta möjliga hastighet inom gränserna för TIRF. Ytterligare förbättringar är endast möjliga om både mikrotubuli och MAPs visualiseras via en interferometrisk teknik, men detta kräver märkning av MAPs med metallnanopartiklar, vilket har sina begränsningar och experimentella utmaningar.
För att demonstrera kapaciteten hos denna teknik visualiserade vi samtidigt två snabba dynamiska processer via IRM och TIRF: krympningen av en mikrotubuli och gångningen av en fluorescerande kinesinmolekyl. Denna teknik har tidigare använts för att visualisera den snabba diffusionen av spastin på krympande mikrotubuli5. Utöver denna applikation på MAPs och mikrotubuli kan detta protokoll användas för att visualisera enstaka fluorescerande molekyler samtidigt med vilken makromolekylär struktur som helst som är tillräckligt massiv för att visualiseras via IRM, såsom ett cellmembran eller aktinfilament.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Thierry Emonets labb för att de delar renrumsutrustning. Vi tackar Yin-Wei Kuo för att ha förberett det renade eGFP-kinesinet som används i denna studie. Y.T. erkänner stödet från Alexander von Humboldt Foundation genom Feodor Lynen Research Fellowship. Detta arbete stöddes av NIH Grant R01 GM139337 (till J.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10/90 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSN10R | Plane beam splitter used in the excitation beam path |
| 90/10 (R/T) beam splitter | Thorlabs | BSX10R | Plane beam splitter used in the image splitter |
| Anti-biotin antibody | Sigma-Aldrich | B3640 | Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules |
| ATP | Sigma-Aldrich | FLAAS | Used for preparing the motility buffer |
| Band-pass filter | Newport | HPM535-50 | Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal |
| Biotinylated tubulin | Cytoskeleton, Inc. | T333P-A | Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | Casein is used to block nonspesific interactions |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Desiccator chamber | Southern Labware | 55207 | Desiccator is used for degasing the resin |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7016 | Used for preparing the oxygen scavenger solution |
| GMPCPP nucleotides | Jena Bioscience | NU-405L | Used for the polymerization of stabilized microtubules |
| Image splitter | Teledyne-Photometrics Imaging | OptoSplit II | An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope |
| ImajeJ2 | NIH | ImageJ2 is used for image analysis | |
| Kinesin | prepared in house (see references in text) | ||
| LDPE tubing | Thomas Scientific | 9565S22 | Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers |
| LED light source | Lumencor | Lumencor sola light engine | Used for IRM imaging |
| Long-pass filters | Thorlabs | FELH0600 | Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 63068 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Micoscope objective heater | okolab | H401-T-DUAL-BL | Used to keep sample temperature constant via heating the objective |
| Microscope | Nikon | Ti-Eclipse | An inverted microscope that is used in the experiments |
| Na-PIPES | Sigma-Aldrich | P2949 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective | Nikon | MRD01991 | The imaging objective has 1.49 numerical aperture |
| PDMS and curing agent | Electron Microscopy Sciences | Sylgard 184 (24236-10) | Used for contructing the flow channels |
| PDMS puncher | World Precision Instruments LLC | 504529 | Used to punch hole into the PDMS |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | DPC-32G | The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface |
| Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) | Sigma-aldrich | P2443 | Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 567530 | Used for preparing the BRB80 buffer |
| Stabilized microtubules | prepared in house (see references in text) | ||
| Table-top ultracentrifuge | Beckman Coulter | 340400 | Used to spin down microtubule seeds |
| TetraSpeck beads | ThermoFisher Scientific | T7279 | Used as a reference for aligning images |
| Zyla 4.2 camera | Andor | Zyla 4.2 | Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range |
References
- Gell, C., et al. Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).
- Axelrod, D. Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy. Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).
- Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).
- Hinrichs, M. H., et al. Tau protein diffuses along the microtubule lattice. The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).
- Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. Herding of proteins by the ends of shrinking polymers. arXiv:. , (2021).
- Guo, H., et al. Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules. Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).
- Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
- Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).
- Young, G., Kukura, P.
- Koch, M. D., Rohrbach, A. Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping. Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).
- Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy. ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).
- Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy. Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).
- Mahamdeh, M., Howard, J. Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520 (2019).
- Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A.
- Rogers, K. R., et al. KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry. The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).
- Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).
- Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy. arXiv. , (2022).
