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Biochemistry

इमेजिंग गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और संबद्ध प्रोटीन के लिए एक साथ हस्तक्षेप प्रतिबिंब और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी

Published: May 3, 2022 doi: 10.3791/63730
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Molecular Biophysics & Biochemistry, Yale University, 2Department of Physics, Yale University

Summary

हम गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन के एक साथ इमेजिंग के लिए हस्तक्षेप-प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी और कुल-आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी को लागू करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

Abstract

साइटोस्केलेटल फिलामेंट्स और उनके संबंधित प्रोटीन के प्रत्यक्ष विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कई तकनीकों का उपयोग किया गया है। कुल-आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति (टीआईआरएफ) माइक्रोस्कोपी में एक उच्च सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात होता है, लेकिन यह फ्लोरोसेंट प्रोटीन के फोटोब्लीचिंग और फोटोडैमेज से ग्रस्त है। लेबल-मुक्त तकनीकें जैसे कि हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (आईआरएम) और इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी (आईएससीएटी) फोटोब्लीचिंग की समस्या को दरकिनार करती हैं, लेकिन आसानी से एकल अणुओं की कल्पना नहीं कर सकती हैं। यह पेपर सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन (एमएपी) और विट्रो में गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं की एक साथ इमेजिंग के लिए एक वाणिज्यिक टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के साथ आईआरएम के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। यह प्रोटोकॉल गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं के साथ बातचीत करने वाले एमएपी के उच्च गति के अवलोकन की अनुमति देता है। यह सूक्ष्मनलिका लेबलिंग की आवश्यकता और कई अतिरिक्त ऑप्टिकल घटकों की आवश्यकता, जैसे कि दूसरे उत्तेजना लेजर की आवश्यकता को समाप्त करके मौजूदा दो-रंग टीआईआरएफ सेटअप पर सुधार करता है। दोनों चैनलों को छवि पंजीकरण और फ्रेम सिंक्रनाइज़ेशन समस्याओं से बचने के लिए एक ही कैमरा चिप पर चित्रित किया जाता है। इस सेटअप को गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं पर चलने वाले एकल किनेसिन अणुओं की कल्पना करके प्रदर्शित किया जाता है।

Introduction

कुल-आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति (TIRF) माइक्रोस्कोपी आमतौर पर एकल फ्लोरोसेंट अणुओं के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए नियोजित होती है। एपिफ्लोरेसेंस इमेजिंग की तुलना में, टीआईआरएफ बेहतर पृष्ठभूमि दमन प्राप्त करता है, जिससे उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्थानीयकरण और एकल फ्लोरोफोरस की ट्रैकिंग की अनुमति मिलती है। इस कारण से, TIRF फ्लोरोसेंटली लेबल वाले सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन की कल्पना करने के लिए पसंदीदा विधि है और अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं 1,2 की छवि के लिए उपयोग किया जाता है।

एमएपी द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के विनियमन की जांच करने के लिए, अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी दोनों को एक साथ प्रतिबिंबित करना आवश्यक होता है। इस उद्देश्य के लिए अधिकांश मौजूदा तरीके महंगे हैं या तकनीकी कमियों से पीड़ित हैं। उदाहरण के लिए, एक साथ दो रंग के टीआईआरएफ को दो उत्तेजना लेजर और दो कैमरों की आवश्यकता होती है। उच्च लागत के अलावा, अलग-अलग कैमरों की आवश्यकता फ्रेम-सिंक्रनाइज़ेशन और छवि-पंजीकरण समस्याओं को जन्म देती है। इस आवश्यकता को दरकिनार किया जा सकता है यदि एक घूर्णन फ़िल्टर क्यूब का उपयोग लगातार फ्रेम3 में उत्तेजना लेजर के बीच शारीरिक रूप से स्विच करने के लिए किया जाता है। इस तरह के सेटअप में, एक एकल कैमरा चिप का उपयोग किया जा सकता है, और फ्रेम सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की छवियों के बीच वैकल्पिक होते हैं। हालांकि, यह तकनीक फ़िल्टर परिवर्तन की गति से सीमित है, जो आमतौर पर फ्रेम दर को 0.5 फ्रेम प्रति सेकंड3 (एफपीएस) से कम तक सीमित करती है। इस तरह की फ्रेम दर तेजी से गतिशील प्रक्रियाओं को हल करने के लिए अपर्याप्त है, जैसे कि 500 एनएम / सेकंड तक के वेग पर होने वाली सूक्ष्मनलिकाएं का संकोचन, 800 एनएम / एस के क्रम पर वेग पर एक किनेसिन का चलना, या 0.3 μm2 / s4 से अधिक प्रसार गुणांक के साथ होने वाले एमएपी का प्रसार। प्रत्येक चैनल में दो चलती लक्ष्यों के सापेक्ष पदों को ट्रैक करते समय यह विशेष रूप से समस्याग्रस्त है, जैसे कि एक चलती सूक्ष्मनलिकाएं टिप5 की स्थिति के सापेक्ष एक एमएपी की स्थिति।

इन ऑप्टिकल बाधाओं के अलावा, दो-रंग टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी को एमएपी और सूक्ष्मनलिकाएं को विभिन्न फ्लोरोफोर के साथ लेबल करने की आवश्यकता होती है जिनके उत्सर्जन स्पेक्ट्रा पर्याप्त रूप से अलग होते हैं। ट्यूबुलिन की फ्लोरोसेंट लेबलिंग सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता6 को बदल सकती है, और फ्लोरोफोरस की फोटोब्लीचिंग इमेजिंग गति7 को सीमित करती है। इन मुद्दों के कारण, सूक्ष्मनलिकाएं की कल्पना करने के लिए लेबल-मुक्त इमेजिंग तकनीकों को विकसित किया गया है। इनमें इंटरफेरोमेट्रिक स्कैटरिंग माइक्रोस्कोपी (iSCAT) 8,9, घूर्णन-सुसंगत-प्रकीर्णन माइक्रोस्कोपी (ROCS)10, स्थानिक प्रकाश हस्तक्षेप माइक्रोस्कोपी (SLIM)11, और हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी (IRM)12,13 शामिल हैं। ये तकनीकें प्रतिदीप्ति इमेजिंग की कमियों के बिना सूक्ष्मनलिकाएं के तेजी से लेबल-मुक्त इमेजिंग की अनुमति देती हैं, लेकिन उनका उपयोग एकल एमएपी की कल्पना करने के लिए नहीं किया जा सकता है।

इन लेबल-मुक्त तकनीकों में से, आईआरएम अपनी कम लागत और इंस्ट्रूमेंटेशन पर अपनी मामूली मांगों के लिए खड़ा है। हमने हाल ही में एक वाणिज्यिक टीआईआरएफ माइक्रोस्कोप के साथ आईआरएम के संयोजन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया है, जिससे सूक्ष्मनलिकाएं और फ्लोरोसेंट एमएपी को बारी-बारी से फ्रेम3,13 में चित्रित किया जा सकता है। यह पेपर एक ही कैमरा चिप पर एक साथ TIRF और IRM छवियों को कैप्चर करने के लिए इस सेटअप को संशोधित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इसमें उत्तेजना पथ में एक सस्ती बीम विभाजक के अलावा एक साथ एक TIRF लेजर और एक आईआरएम एलईडी प्रकाश स्रोत के साथ नमूने को रोशन करने के लिए शामिल है। एक संशोधित वाणिज्यिक छवि विभाजक का उपयोग टीआईआरएफ और आईआरएम संकेतों को वर्णक्रमीय रूप से अलग करने और उन्हें एक ही कैमरा चिप के अलग-अलग हिस्सों पर प्रोजेक्ट करने के लिए किया जाता है। हम एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम को भी नियोजित करते हैं जो इमेजिंग के दौरान अभिकर्मकों के तेजी से आदान-प्रदान की अनुमति देता है। यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि इस सेटअप का उपयोग गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की छवि के लिए कैसे किया जा सकता है। उपकरण की क्षमता को सिकुड़ते हुए सूक्ष्मनलिकाएं पर चलने वाले किनेसिन -1 प्रोटीन के पहले विज़ुअलाइज़ेशन को प्रस्तुत करके प्रदर्शित किया जाता है, जिसे 10 एस -1 की फ्रेम दर पर कब्जा कर लिया जाता है।

Protocol

1. प्रवाह कक्षों की तैयारी

नोट: Microfluidic प्रवाह कक्षों polydimethylsiloxane (PDMS) माइक्रोचैनल का पालन करके एक साफ और कार्यात्मक कवर ग्लास के लिए निर्माण किया जाएगा। माइक्रोचैनल को एक मास्टर मोल्ड में डाला जाएगा।

  1. PDMS चैनलों की तैयारी
    1. विशिष्ट परख छवि के लिए उपयुक्त सतह रसायन विज्ञान के साथ साफ और / या functionalized कवर चश्मा तैयार करें।
      नोट: kinesin गतिशीलता assays के लिए, piranha-साफ silanized कवर चश्मे का उपयोग किया जाता है। ये तैयार किए गए हैं जैसा कि गेल एट में वर्णित है। al.1 वैकल्पिक रूप से, एक सरल प्रक्रिया isopropanol में कवर चश्मे sonicate करने के लिए 3x 20 मिनट चक्र के लिए मेथनॉल द्वारा पीछा किया जाता है।
    2. एक मास्टर मोल्ड तैयार करने के लिए, वांछित प्रवाह चैनल आकार के लिए एकल-पक्षीय स्थिर टेप की स्ट्रिप्स में कटौती करें। स्ट्रिप्स को 10 सेमी पेट्री डिश के नीचे की ओर रखें, उन्हें स्ट्रिप्स के बीच कम से कम 1 सेमी की दूरी के साथ साइड-टू-साइड व्यवस्थित करें।
      नोट: यदि सटीक चैनल आयामों की आवश्यकता होती है, तो मोल्ड को फोटोलिथोग्राफी14 का उपयोग करके सिलिकॉन वेफर्स पर गढ़ा जा सकता है।
    3. पीडीएमएस बहुलक तैयार करने के लिए, इलाज एजेंट और बेस इलास्टोमर को 1: 10 द्रव्यमान अनुपात में मिलाएं। 2 मिनट के लिए मिलाएं।
      नोट: यह मिश्रण अनुपात बहुलक की कठोरता ट्यून करने के लिए विविध किया जा सकता है। इलाज एजेंट के लिए आधार का एक उच्च अनुपात एक नरम बहुलक में परिणाम है।
    4. एक वैक्यूम कक्ष में मिश्रण degas जब तक सभी बुलबुले गायब हो जाते हैं.
    5. एक ~ 0.5 सेमी मोटी परत में मास्टर मोल्ड पर मिश्रण डालो, बुलबुले बनाने से बचने के लिए ध्यान रखना।
    6. मिश्रण को 40 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर पहले से गर्म ओवन में बेक करें।
      नोट:: PDMS ब्लॉक मोटी (>1 सेमी) है, तो एक लंबे समय तक इलाज समय की आवश्यकता हो सकती है। 5 मिनट की वृद्धि में हीटिंग जारी रखें जब तक कि यह पूरी तरह से ठीक न हो जाए।
    7. बहुलक के संरचित क्षेत्रों को काटें। एक PDMS पंचर का उपयोग कर चैनल के प्रत्येक छोर पर पंच छेद.
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में, छेद व्यास 0.75 मिमी करने के लिए सेट किया गया है और आवश्यक प्रवाह दरों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है। पीडीएमएस चैनलों को विस्तारित अवधि के लिए शुष्क वातावरण में संग्रहीत किया जा सकता है, लेकिन उपयोग से पहले साफ किया जाना चाहिए।
    8. PDMS ब्लॉक के संरचित पक्ष को साफ करें। बड़े कणों को हटाने के लिए स्थिर टेप का उपयोग करें। isopropanol और फिर मेथनॉल के साथ कुल्ला। इन कुल्ला 3x दोहराएँ, ultrapure पानी के साथ कुल्ला, और झटका-सतह सूखी.
    9. प्लाज्मा ऑक्सीजन या एयर प्लाज्मा का उपयोग करके पीडीएमएस को साफ करता है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, 18 W एयर प्लाज्मा का उपयोग किया जाता है।
    10. प्लाज्मा साफ पीडीएमएस को उचित रूप से साफ किए गए कवर ग्लास पर रखें और 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म प्लेट पर गर्मी डालें।
      नोट: Epoxy राल को PDMS ब्लॉक के किनारों पर लागू किया जा सकता है ताकि इसे कवर ग्लास का बेहतर ढंग से पालन किया जा सके।
    11. छेद में उचित आकार के कम घनत्व वाले पॉलीथीन (LDPE) टयूबिंग डालें। आउटलेट टयूबिंग को 0.5 mL सिरिंज से कनेक्ट करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, 0.023 के आंतरिक व्यास के साथ ट्यूबों में बाहरी व्यास धातु एडाप्टर में एक 0.025 के माध्यम से PDMS से जुड़े हुए हैं।
    12. समाधान में इनलेट ट्यूब को डुबोकर और सिरिंज के साथ आवश्यक मात्रा ड्राइंग द्वारा माइक्रोचैनल में प्रवाह समाधान।

2. ऑप्टिकल सेटअप

  1. माइक्रोस्कोप का संशोधन (चित्र 1)
    1. IRM इमेजिंग13 को सक्षम करने के लिए एक TIRF माइक्रोस्कोप को संशोधित करें। माइक्रोस्कोप के फिल्टर व्हील में उपयोग किए जाने वाले 50/50 (परावर्तकता (आर)/ ट्रांसमिशन (टी)) बीम स्प्लिटर को 10/90 (आर / टी) बीम स्प्लिटर के साथ बदलें।
    2. कैमरे और माइक्रोस्कोप के बीच एक छवि विभाजक सम्मिलित करें।
    3. छवि विभाजक के फ़िल्टर घन में, एक 10/90 (R/T) बीम विभाजक डालें. परावर्तित बीम के सामने एक 600 एनएम लंबे पास फिल्टर और संचरित बीम के सामने एक उपयुक्त प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फ़िल्टर रखें।
      नोट: विभिन्न आर / टी अनुपात के साथ बीम विभाजक का उपयोग एकत्र किए गए IRM और TIRF उत्सर्जन प्रकाश के अंशों को ट्यून करने के लिए किया जा सकता है।
    4. कैमरा चिप पर TIRF और IRM संकेतों को स्थानिक रूप से अलग करने के लिए निर्माता के विनिर्देशों के अनुसार छवि विभाजक को संरेखित करें।
      नोट: संकेतों के स्थानिक पृथक्करण की आवश्यकता होती है क्योंकि विशिष्ट फ्लोरोफोरस का टीआईआरएफ सिग्नल एक सूक्ष्मनलिका के आईआरएम सिग्नल की तुलना में बहुत कमजोर होता है और यदि दो संकेतों को ओवरले किया जाता है तो पता लगाने योग्य नहीं होगा।

3. इमेजिंग गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एकल Kinesin अणुओं

  1. सतह functionalization और passivation
    1. प्रवाह BRB80 बफर (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, NaOH के साथ pH 7.8 करने के लिए titrated) प्रतिक्रिया कक्ष में।
    2. प्रवाह एंटीबायोटिन समाधान BRB80 में 0.025 मिलीग्राम / एमएल करने के लिए पतला और 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    3. BRB80 के साथ चैनल धोएं।
    4. F-127 समाधान में प्रवाह (1% Pluronic F-127 (w / v) BRB80 में रातोंरात भंग) और सतह passivation के लिए कम से कम 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: यदि आसान साफ कवर चश्मे silanized कवर चश्मे के बजाय उपयोग किया जाता है, तो कमरे के तापमान पर >20 मिनट के लिए BRB80 में 2 मिलीग्राम / एमएल कैसिइन का उपयोग करके passivate।
    5. BRB80 के साथ चैनल धोएं।
  2. इमेजिंग के लिए तैयारी
    1. यदि तापमान नियंत्रण की आवश्यकता है, तो एक उद्देश्य हीटर का उपयोग करें और इसे सही तापमान पर सेट करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में, सभी प्रयोगों को 28 डिग्री सेल्सियस पर किया जाता है।
    2. माइक्रोस्कोप चरण पर नमूना रखें और आईआरएम इमेजिंग के लिए एपिइलुमिनेशन प्रकाश स्रोत (>600 एनएम) को चालू करें।
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में, एक सफेद एलईडी प्रकाश स्रोत एक 600 nm लंबे पास फ़िल्टर के साथ उपयोग किया जाता है।
    3. नमूना सतह पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें। PDMS-समाधान इंटरफ़ेस के पास सही फोकल प्लेन की तलाश करें।
      नोट: IRM में, चैनल का जलीय इंटीरियर PDMS बहुलक की तुलना में बहुत उज्ज्वल दिखाई देना चाहिए।
    4. चैनल के केंद्र के पास दृश्य का कोई फ़ील्ड चुनें.
    5. BRB80 में 0.1 μm फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स का एक समाधान तैयार करें (घनत्व: 109 मोती / एमएल, इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले मोतियों के लिए 200 गुना कमजोर पड़ने के अनुरूप)।
    6. माइक्रोबीड समाधान के कम से कम एक चैनल वॉल्यूम में प्रवाह।
    7. आईआरएम के माध्यम से प्रतिक्रिया की निगरानी करें। माइक्रोबीड्स के लिए धीरे-धीरे सतह पर "भूमि" की प्रतीक्षा करें। जब माइक्रोबीड्स का वांछित घनत्व प्राप्त हो जाता है, तो BRB80 के साथ अतिरिक्त को धो लें।
  3. बढ़ते biotinylated guanylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate (GMPCPP)-स्थिर सूक्ष्मनलिकाएं बीज
    1. एक 0.6 mL सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में, BRB80 में 1 mM GMPCPP, 1 mM MgCl 2, और2 μM बायोटिनिलेटेड ट्यूबुलिन (5-10% लेबलिंग स्टोइकोमेट्री) वाले एक समाधान के 50 μL तैयार करें।
      नोट: सही लेबलिंग stoichiometry सही अनुपात में unlabled गोजातीय ट्यूबुलिन के साथ उच्च घनत्व biotinylated ट्यूबुलिन के संयोजन से प्राप्त किया जा सकता है।
    2. 5 मिनट के लिए बर्फ पर समाधान को इनक्यूबेट करें, फिर 12.5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: बीज की लंबाई polymerization समय ट्यूनिंग द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है.
    3. कमरे के तापमान BRB80 के 100 μL जोड़कर पोलीमराइजेशन बंद करो।
    4. कमरे के तापमान (126,000 x g, 5 मिनट) पर एक ultracentrifuge में समाधान नीचे स्पिन। unpolymerized ट्यूबुलिन को हटाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करके supernatant छोड़ें।
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में, एक हवा संचालित ultracentrifuge उपयोग किया जाता है।
    5. गोली के लिए कमरे के तापमान BRB80 के 200 μL जोड़ें। धीरे से लेकिन अच्छी तरह से pipetting द्वारा गोली resuspend. सूक्ष्मनलिकाएं के कर्तन को कम करने के लिए एक कट टिप के साथ एक 200 μL पिपेट का उपयोग करें।
  4. बढ़ती गतिशील guanosine diphosphate (सकल घरेलू उत्पाद) - ट्यूबुलिन "एक्सटेंशन"
    नोट: बीज प्रवाह चैनल की एंटीबायोटिन सतह पर immobilized किया जाएगा। गतिशील जीटीपी / जीडीपी "एक्सटेंशन" को स्थिर बीजों के सिरों से उगाया जाएगा।
    1. BRB80 में बीज 20x पतला. प्रतिक्रिया कक्ष में पतला बीज प्रवाह.
    2. आईआरएम के माध्यम से प्रतिक्रिया की निगरानी करें। बीजों को धीरे-धीरे सतह पर "भूमि" करने और इसे बांधने के लिए प्रतीक्षा करें। जब बीज का वांछित घनत्व प्राप्त हो जाता है, तो BRB80 के साथ अतिरिक्त को धो लें।
    3. एक सूक्ष्मनलिकाएं विस्तार मिश्रण तैयार करें: BRB80 बफर में 12 μM बिना लेबल वाले ट्यूबुलिन, 1 mM GTP, 5 mM dithiothreitol (DTT)।
    4. विस्तार मिश्रण के कम से कम एक चैनल मात्रा में प्रवाह। सुनिश्चित करें कि प्रतिक्रिया का तापमान 28 डिग्री सेल्सियस है।
    5. समय के साथ बीज से बढ़ने के लिए सूक्ष्मनलिकाएं एक्सटेंशन की प्रतीक्षा करें।
      नोट: स्थिर-राज्य लंबाई आमतौर पर 20 मिनट से भी कम समय में प्राप्त की जाती है।
    6. इमेजिंग के लिए गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं का उपयोग करें। जोड़ें और सूक्ष्मनलिकाएं पर फ्लोरोसेंट एमएपी की कल्पना करें, जैसा कि किनेसिन -1 के लिए चरण 3.5 में वर्णित है।
      नोट: क्योंकि सूक्ष्मनलिकाएं सतह-बाउंड हैं, वे आसानी से TIRF द्वारा दिखाई देती हैं।
  5. Kinesin गतिशीलता परख
    नोट:: यह चरण गतिशील हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को विज़ुअलाइज़ करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है - सिकुड़ते सूक्ष्मनलिकाएं पर kinesin-1 लेबल। एक छोटा चूहा kinesin-1 ईजीएफपी (rKin430-eGFP) के लिए फ्यूज्ड निर्माण व्यक्त और शुद्ध किया गया था, जैसा कि पहले15,16 वर्णित है।
    1. गतिशीलता बफर तैयार करें: BRB80 में 1 mM एटीपी और 0.2 mg/
    2. 10 nM के लिए गतिशीलता बफर में kinesin-eGFP पतला.
    3. ऑक्सीडेटिव फोटोब्लीचिंग (80 एमएम ग्लूकोज, 80 मिलीग्राम / एमएल ग्लूकोज ऑक्सीडेज, 32 मिलीग्राम / एमएल कैटालेज, 0.2 मिलीग्राम / एमएल कैसिइन, 20 एमएम डीटीटी) का मुकाबला करने के लिए 2x ऑक्सीजन स्कैवेंजर समाधान तैयार करें।
    4. ऑक्सीजन स्कैवेंजर के 10 भागों, BRB80 के 9 भागों, और 0.5 nM की अंतिम kinesin एकाग्रता के लिए 10 nM kinesin-eGFP के 1 भाग को संयोजित करें।
      नोट:: कुल वॉल्यूम चैनल वॉल्यूम से कम से कम 1.5-गुना बड़ा होना चाहिए।
    5. माइक्रोस्कोप सॉफ़्टवेयर पर इमेजिंग सेटिंग्स सेट करें.
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में, वीडियो 100 ms एक्सपोज़र समय के साथ 10 fps पर रिकॉर्ड किए जाते हैं। लेजर तीव्रता ~ 0.05 किलोवाट / सेमी2 है।
    6. इमेजिंग शुरू करें और कक्ष में kinesin समाधान प्रवाह.
    7. माप पूरा होने के बाद, एक छोटा (~ 5 एस) वीडियो रिकॉर्ड करें जिसमें चरण को धीरे-धीरे एक परिपत्र या पार्श्व गति में अनुवादित किया जाता है। पृष्ठभूमि छवि के रूप में इस वीडियो के माध्य प्रक्षेपण का उपयोग करें और इसे कच्चे माप से घटाएं।

4. छवि प्रसंस्करण और विश्लेषण

नोट: छवि प्रसंस्करण NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/) का उपयोग कर किया गया था। TIRF और IRM चैनलों के विभाजन और संरेखण को स्वचालित करने के लिए एक मैक्रो विकसित किया गया था। इस मैक्रो को GaussFit_OnSpot प्लगइन को स्थापित करने की आवश्यकता होती है (ImageJ प्लगइन्स रिपॉजिटरी पर उपलब्ध)।

  1. पृष्ठभूमि रिकॉर्डिंग से, छवि | पर क्लिक करके ImageJ में एक माध्यिका प्रक्षेपण बनाएँ स्टैक्स | Z-परियोजना.
  2. प्रक्रिया | पर क्लिक करके कच्चे छवि डेटा से माध्यिका पृष्ठभूमि प्रक्षेपण घटाएं छवि कैलकुलेटर.
    नोट:: "32-बिट (फ्लोट) परिणाम" विकल्प की जाँच करने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. छवि पंजीकरण के लिए, ब्याज के सूक्ष्मनलिकाएं के पास माइक्रोबीड्स का एक संग्रह चुनें और उन्हें टीआईआरएफ और आईआरएम छवियों को संरेखित करने के लिए उपयोग करें।
  4. इस संग्रह में प्रत्येक मनका के लिए, TIRF चैनल में अनुमानित स्थान और उसके बाद IRM चैनल में संगत स्थान को चिह्नित करने के लिए multipoint चयन उपकरण का उपयोग करें।
    नोट: उदाहरण के लिए, यदि दो मोती (1 और 2) हैं, तो मल्टीपॉइंट चयन में निम्न क्रम में चार अंक होंगे: (1) TIRF में मनका 1, (2) आईआरएम में मनका 1, (3) TIRF में मनका 2, (4) आईआरएम में मनका 2।
  5. प्रदान की गई ImageJ मैक्रो (ImageSplitterRegistration.ijm) चलाएँ।
    नोट:: यह निम्न चरणों को स्वचालित करता है: i) एक गाऊसी के लिए फिटिंग द्वारा प्रत्येक मनका के केंद्र स्थान का अनुमान लगाना; ii) प्रत्येक मनका के लिए, आईआरएम चैनल में केंद्र से TIRF चैनल में केंद्र को अलग करने वाले विस्थापन वेक्टर की गणना; iii) सभी मोतियों में इस विस्थापन वेक्टर का औसत; iv) TIRF और IRM चैनलों को अलग-अलग छवियों में विभाजित करना; v) III में परिकलित औसत विस्थापन वेक्टर द्वारा TIRF छवि का अनुवाद करना; vi) एक multichannel .tiff फ़ाइल में TIRF और IRM छवियों overlaying.

Representative Results

ऑप्टिकल सेटअप को चित्र 1 में स्कीमेट किया गया है। दोनों आईआरएम रोशनी और टीआईआरएफ उत्तेजना प्रकाश को 10/90 (आर / टी) बीम स्प्लिटर (बीएस 1) के माध्यम से उद्देश्य (100x, एनए: 1.49) के पीछे एपर्चर के लिए निर्देशित किया जाता है। उत्सर्जित संकेत एक ही बीम विभाजक (बीएस 1) से गुजरता है और एक दर्पण (एम 1) के माध्यम से छवि विभाजक को परिलक्षित होता है। छवि विभाजक के घटक ( चित्रा 1 में धराशायी रेखाओं के साथ संलग्न) आईआरएम और टीआईआरएफ संकेतों को उचित वर्णक्रमीय फिल्टर के साथ 90/10 (आर / टी) बीम स्प्लिटर (बीएस 2) के माध्यम से अलग करते हैं। अंत में, विभाजन छवियों को विज़ुअलाइज़ेशन के लिए कैमरा चिप पर पेश किया जाता है। छवि विभाजक का संरेखण ऐसा है कि टीआईआरएफ और आईआरएम संकेतों को चिप के अलग-अलग हिस्सों पर प्रक्षेपित किया जाता है।

एक अच्छी तरह से संरेखित माइक्रोस्कोप में, कैमरा छवि को आधे रास्ते की विभाजित छवि प्रदर्शित करनी चाहिए, जैसा कि चित्र 2 में प्रस्तुत किया गया है। सतह-बाउंड सूक्ष्मनलिकाएं आईआरएम चैनल13 में आसानी से दिखाई देनी चाहिए, और फ्लोरोसेंट किनेसिन को टीआईआरएफ चैनल में दिखाई देना चाहिए।

दो चैनलों को संरेखित करने और पंजीकृत करने के लिए उपयोग किए जाने वाले माइक्रोबीड्स आईआरएम छवियों में टीआईआरएफ छवियों और अंधेरे धब्बों में उज्ज्वल धब्बे के रूप में दिखाई देते हैं। यद्यपि मोती कच्चे डेटा में दिखाई देते हैं, पृष्ठभूमि घटाव इसके विपरीत में काफी सुधार करता है (चित्रा 2)। घटाव के लिए उपयोग की जाने वाली पृष्ठभूमि छवि एक चलती चरण के साथ रिकॉर्ड किए गए वीडियो का अस्थायी माध्यिका है। जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है, छवि संरेखण ब्याज के क्षेत्र के पास मोतियों के संग्रह का चयन करके और प्रदान किए गए मैक्रो (imageSplitterRegistration.ijm) को निष्पादित करके किया गया था। मैक्रो गॉसियन के लिए अंक फिट बैठता है और प्रत्येक चैनल में फिट बैठता है के केंद्र बिंदुओं के बीच औसत दूरी को कम करके छवियों को संरेखित करता है। इस प्रक्रिया को चित्रा 2 में दर्शाया गया है, जो फ्लोरोसेंट माइक्रोबीड्स का एक अच्छा संरेखण दिखाता है (टीआईआरएफ चैनल में हरा, आईआरएम चैनल में काला)।

अंत में, इस एक साथ इमेजिंग सेटअप की क्षमताओं को सूक्ष्मनलिकाएं के सिकुड़ते सिरों की ओर चलने वाले एकल किनेसिन अणुओं को देखकर प्रदर्शित किया जाता है। चित्रा 3 eGFP-लेबल वाले किनेसिन अणुओं (हरे) का एक kymograph दिखाता है जो एक सिकुड़ते हुए सूक्ष्मनलिकाएं (ग्रे) पर चलता है। इसके अलावा प्रस्तुत रिकॉर्डिंग से स्नैपशॉट की एक श्रृंखला है जिसमें से kymograph उत्पन्न किया गया था।

Figure 1
चित्रा 1: एक साथ आईआरएम और किनेसिन गतिशीलता के टीआईआरएफ इमेजिंग के लिए ऑप्टिकल सेटअप का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। एक एलईडी प्रकाश स्रोत से एपिइलुमिनेशन एपर्चर डायाफ्राम से गुजरता है और 10/90 (आर / टी) बीम स्प्लिटर (बीएस 1) तक पहुंचता है। बीम विभाजक आंशिक रूप से लाल आईआरएम रोशनी प्रकाश और 488 एनएम TIRF उत्तेजना प्रकाश को दर्शाता है जो नमूने को रोशन करने के उद्देश्य तक है। नमूने से संकेत एक ही उद्देश्य द्वारा एकत्र किया जाता है और छवि विभाजन असेंबली को निर्देशित किया जाता है जहां आईआरएम और टीआईआरएफ छवियों को 90/10 (आर / टी) बीम स्प्लिटर (बीएस 2) द्वारा स्थानिक रूप से अलग किया जाता है। संकेतों को कैमरा चिप तक पहुंचने से पहले वर्णक्रमीय रूप से फ़िल्टर किया जाता है। संक्षेप: IRM = हस्तक्षेप प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी; TIRF = कुल आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति; एलईडी = प्रकाश उत्सर्जक डायोड; मैंTIRF = TIRF रोशनी; मैंGFP = GFP प्रतिदीप्ति; मैंइंक = आईआरएम रोशनी; मैंरेफरी = कांच / पानी इंटरफ़ेस पर बिखरे हुए प्रकाश; मैंस्कैट = सूक्ष्मनलिकाएं से बिखरे हुए प्रकाश; मैंIRM = IRM संकेत (मैंरेफरी और मैंस्कैट के हस्तक्षेप); R/T = परावर्तित/संचरित; LP600: लंबे समय से पास फिल्टर (600 एनएम); डीएम = dichroic दर्पण; BS1 और BS2 = बीम विभाजक 1 और 2; M1, M2, M3, M4 = दर्पण; BP535/50 = बैंड पास (535/50 nm); GFP = हरा फ्लोरोसेंट प्रोटीन; GMPCPP = guanylylyl 5'-α,β-methylenediphosphonate; GDP = guanosine diphosphate कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: पृष्ठभूमि घटाव और छवि संरेखण. TIRF (बाएं आधे) और IRM (दाएं आधे) छवियां एक ही कैमरा चिप (कैमरा छवि) के दो हिस्सों पर एक साथ दिखाई देती हैं। टेम्पोरल माध्यिका पृष्ठभूमि घटाव मोतियों (पृष्ठभूमि-घटाया गया छवि) के विपरीत को बढ़ाता है, जो आईआरएम में अंधेरे और टीआईआरएफ छवियों में उज्ज्वल दिखाई देते हैं। IRM और TIRF छवियों को चयनित मोतियों (सफेद आयतों) के स्थानीयकरण के आधार पर अनुवाद (दाएं) द्वारा संरेखित किया जाता है। स्केल सलाखों = 10 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: सूक्ष्मनलिकाएं संकुचन के दौरान किमोग्राफ और किनेसिन के आंदोलन के स्नैपशॉट। Kymograph (बाएं) eGFP-kinesin-1 (हरे) सूक्ष्मनलिकाएं (गहरे भूरे रंग) के प्लस अंत की ओर चल रहा है। संगत समय श्रृंखला से स्नैपशॉट दिखाए जाते हैं (दाएँ). सफेद तीर एकल किनेसिन -1 अणुओं को दिखाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ImageSplitter पंजीकरण फ़ाइल: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

Discussion

सूक्ष्मनलिकाएं-संबद्ध प्रोटीन (एमएपी) द्वारा सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता के विनियमन का अध्ययन करने के लिए अक्सर सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की एक साथ इमेजिंग की आवश्यकता होती है। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक जैसे कि टीआईआरएफ आमतौर पर इस उद्देश्य के लिए नियोजित होते हैं। हालांकि, वे प्रतिदीप्ति इमेजिंग की कमियों से सीमित हैं, जिसमें फोटोब्लीचिंग, फोटोडैमेज और फ्लोरोफोर लेबलिंग की आवश्यकता शामिल है। लेबल-मुक्त तरीके, जैसे कि आईआरएम, सूक्ष्मनलिकाएं देखने के लिए उपयुक्त हैं, लेकिन एकल फ्लोरोफोरस को इमेजिंग करने में सक्षम नहीं हैं। यह प्रोटोकॉल गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की एक साथ इमेजिंग के लिए लेबल-मुक्त आईआरएम इमेजिंग और टीआईआरएफ माइक्रोस्कोपी को जोड़ता है।

आईआरएम सेटअप >600 एनएम पर फ़िल्टर किए गए एक एलईडी रोशनी स्रोत को नियोजित करता है, जबकि टीआईआरएफ सेटअप 488 एनएम लेजर का उपयोग करता है। हमने नमूने पर रोशनी प्रकाश को प्रतिबिंबित करने और एकत्र किए गए सिग्नल को डिटेक्टर (चित्रा 1) तक पहुंचाने के लिए एक सस्ती प्लेट बीम स्प्लिटर का उपयोग किया। एकल-अणु संकेत के नुकसान को कम करने के लिए 10% परावर्तकता और 90% संचरण के साथ एक बीम विभाजक चुना गया था। रोशनी प्रकाश तीव्रता में 90% नुकसान रोशनी लेजर और एलईडी की शक्ति में वृद्धि के लिए क्षतिपूर्ति की है।

संकेतों का वर्णक्रमीय पृथक्करण 90/10 (आर / टी) बीम स्प्लिटर और दो वर्णक्रमीय फिल्टर (आईआरएम के लिए 600 एनएम और टीआईआरएफ के लिए बैंड-पास 535/50 एनएम) का उपयोग करके प्राप्त किया गया था। वर्णक्रमीय रूप से अलग किए गए आईआरएम और टीआईआरएफ संकेतों को एक छवि विभाजक असेंबली का उपयोग करके एक एकल कैमरा चिप के दो हिस्सों पर प्रक्षेपित किया जाता है। 90/10 बीम विभाजक का उपयोग आईआरएम सिग्नल का 90% बलिदान करता है, लेकिन यह एलईडी रोशनी स्रोत की तीव्रता को बढ़ाकर मुआवजा दिया जाता है। आईआरएम और टीआईआरएफ संकेतों को अधिक कुशलता से अलग करने के लिए यहां एक डाइक्रोइक दर्पण का भी उपयोग किया जा सकता है। assays में शामिल फ्लोरोसेंट microbeads TIRF और IRM छवियों के सटीक संरेखण को सक्षम करते हैं और उद्देश्य पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक संदर्भ के रूप में सेवा करते हैं।

इस प्रोटोकॉल में सबसे महत्वपूर्ण ऑप्टिकल तत्व उच्च संख्यात्मक एपर्चर (एनए) उद्देश्य है। यह न केवल कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, बल्कि संग्रह दक्षता और छवि विपरीत को अधिकतम करने के लिए भी आवश्यक है। प्राप्त छवियों की गुणवत्ता भी कांच की सतह की स्वच्छता और nonuniform रोशनी के लिए सही करने के लिए एक स्पष्ट पृष्ठभूमि छवि के अधिग्रहण और स्थिर सुविधाओं को हटाने पर निर्भर करता है। आईआरएम इमेजिंग के लिए, हम सूक्ष्मनलिकाएं और प्रोटीन के फोटोडैमेज को कम करने के लिए लंबी तरंग दैर्ध्य रोशनी (>600 एनएम) का उपयोग करने की सलाह देते हैं। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है यदि एक सफेद एलईडी प्रकाश स्रोत का उपयोग किया जाता है, तो इस मामले में किसी भी यूवी प्रकाश को हटाने के लिए एक लॉन्ग-पास फ़िल्टर को शामिल किया जाना चाहिए।

यह प्रोटोकॉल लेबल-मुक्त, गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं की उच्च गति इमेजिंग और फ्लोरोसेंट एमएपी17 के एक साथ उच्च-रिज़ॉल्यूशन विज़ुअलाइज़ेशन की अनुमति देता है। फिल्टर क्यूब स्विचिंग तकनीक की तुलना में, जो सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी की छवियों को कैप्चर करने के बीच वैकल्पिक है, यह सेटअप बहुत अधिक फ्रेम दरों में सक्षम है क्योंकि यह फ़िल्टर क्यूब के भौतिक रोटेशन पर निर्भर नहीं करता है। दो-रंग टीआईआरएफ इमेजिंग तकनीकों की तुलना में, यह तकनीक कम मांग वाले ऑप्टिकल सेटअप को नियोजित करती है और सूक्ष्मनलिकाएं के फ्लोरोफोर लेबलिंग की आवश्यकता को दरकिनार करती है। इस सेटअप की प्राथमिक सीमाएं एमएपी के टीआईआरएफ इमेजिंग के कारण हैं; फ्रेम दर एक fluorophore के जोखिम समय से सीमित है, और fluorophores के photobleaching एक संभावना बनी हुई है. फिर भी, यह प्रोटोकॉल मौजूदा तकनीकों पर सुधार करता है क्योंकि यह केवल आवश्यक होने पर टीआईआरएफ का उपयोग करता है (यानी, एमएपी की कल्पना करने के लिए लेकिन सूक्ष्मनलिकाएं नहीं) और टीआईआरएफ की सीमाओं के भीतर उच्चतम संभव गति प्राप्त करता है। आगे के सुधार केवल तभी संभव हैं जब सूक्ष्मनलिकाएं और एमएपी दोनों को एक इंटरफेरोमेट्रिक तकनीक के माध्यम से कल्पना की जाती है, लेकिन इसके लिए धातु नैनोकणों के साथ एमएपी को लेबल करने की आवश्यकता होती है, जिसकी अपनी सीमाएं और प्रयोगात्मक चुनौतियां हैं।

इस तकनीक की क्षमताओं को प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक साथ आईआरएम और टीआईआरएफ के माध्यम से दो तेज गतिकीय प्रक्रियाओं की कल्पना की: एक सूक्ष्मनलिकाएं का संकोचन और एक फ्लोरोसेंट किनेसिन अणु का चलना। इस तकनीक को पहले सिकुड़ने वाले सूक्ष्मनलिकाएं 5 पर स्पास्टिन के तेजी से प्रसार की कल्पना करने के लिए नियोजित किया गयाहै। एमएपी और सूक्ष्मनलिकाएं के लिए इस आवेदन से परे, इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी मैक्रोमोलेक्यूलर संरचना के साथ-साथ एकल फ्लोरोसेंट अणुओं को कल्पना करने के लिए किया जा सकता है, जो आईआरएम के माध्यम से कल्पना करने के लिए पर्याप्त है, जैसे कि सेल झिल्ली या एक्टिन फिलामेंट।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम Cleanroom उपकरणों को साझा करने के लिए Thierry Emonet की प्रयोगशाला को धन्यवाद देते हैं। हम इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध ईजीएफपी-किनेसिन को तैयार करने के लिए यिन-वेई कुओ को धन्यवाद देते हैं। Y.T. Feodor Lynen अनुसंधान फैलोशिप के माध्यम से अलेक्जेंडर वॉन हम्बोल्ट फाउंडेशन के समर्थन को स्वीकार करता है। यह काम NIH अनुदान R01 GM139337 (J.H. के लिए) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10/90 (R/T) beam splitter Thorlabs BSN10R Plane beam splitter used in the excitation beam path
90/10 (R/T) beam splitter Thorlabs BSX10R Plane beam splitter used in the image splitter
Anti-biotin antibody Sigma-Aldrich B3640 Used to functionalize surface for bonding biotinylated microtubules
ATP Sigma-Aldrich FLAAS Used for preparing the motility buffer
Band-pass filter Newport HPM535-50 Hard-coated band-pas filter is used in image splitter to image GFP signal
Biotinylated tubulin Cytoskeleton, Inc. T333P-A Used to bind microtubule seeds to the surface of the flow channel
Casein Sigma-Aldrich C8654 Casein is used to block nonspesific interactions
Catalase Sigma-Aldrich C9322 Used for preparing the oxygen scavenger solution
Desiccator chamber Southern Labware 55207 Desiccator is used for degasing the resin
DTT Sigma-Aldrich D0632 Used for preparing the oxygen scavenger solution
EGTA Sigma-Aldrich E4378 Used for preparing the BRB80 buffer
Glucose Sigma-Aldrich G7528 Used for preparing the oxygen scavenger solution
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7016 Used for preparing the oxygen scavenger solution
GMPCPP nucleotides Jena Bioscience NU-405L Used for the polymerization of stabilized microtubules
Image splitter Teledyne-Photometrics Imaging OptoSplit II An image splitter is used to split the images spatially. When buying, make sure about the compatibility with the microscope
ImajeJ2 NIH ImageJ2 is used for image analysis
Kinesin prepared in house (see references in text)
LDPE tubing Thomas Scientific 9565S22 Non-toxic, lower density polyethylene micro bore tubing is used for fluid transfers
LED light source Lumencor Lumencor sola light engine Used for IRM imaging
Long-pass filters Thorlabs FELH0600 Hard-coated long pass filters. One is used as an excitation filter, other is used in image splitter to image IRM signal
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068 Used for preparing the BRB80 buffer
Micoscope objective heater okolab H401-T-DUAL-BL Used to keep sample temperature constant via heating the objective
Microscope Nikon Ti-Eclipse An inverted microscope that is used in the experiments
Na-PIPES Sigma-Aldrich P2949 Used for preparing the BRB80 buffer
Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Oil objective Nikon MRD01991 The imaging objective has 1.49 numerical aperture
PDMS and curing agent Electron Microscopy Sciences Sylgard 184 (24236-10) Used for contructing the flow channels
PDMS puncher World Precision Instruments LLC 504529 Used to punch hole into the PDMS
Plasma cleaner Harrick Plasma DPC-32G The air plasma is used to remove organic contamination from the PDMS surface
Poloxamer 407 (commercial name Pluronic F-127) Sigma-aldrich P2443 Used for channel surface passivation to minimize nonspecific binding
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 567530 Used for preparing the BRB80 buffer
Stabilized microtubules prepared in house (see references in text)
Table-top ultracentrifuge Beckman Coulter 340400 Used to spin down microtubule seeds
TetraSpeck beads ThermoFisher Scientific T7279 Used as a reference for aligning images
Zyla 4.2 camera Andor Zyla 4.2 Scientific CMOS camera with spesifications: 2048 x 2048 pixels (6.5 μm pixel size) with quantum efficiency of 72% and 16 bit dynamic range

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References

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जैव रसायन अंक 183 लेबल मुक्त इमेजिंग हस्तक्षेप-प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी कुल आंतरिक-प्रतिबिंब-प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी एकल-अणु इमेजिंग सूक्ष्मनलिकाएं गतिशीलता किनेसिन
इमेजिंग गतिशील सूक्ष्मनलिकाएं और संबद्ध प्रोटीन के लिए एक साथ हस्तक्षेप प्रतिबिंब और कुल आंतरिक प्रतिबिंब प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी
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Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins. J. Vis. Exp. (183), e63730, doi:10.3791/63730 (2022).

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