Summary
يصف هذا البروتوكول تعديلات المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) مع نظام إضاءة الضوء ، وتصنيع الخلايا السائلة ، وملاحظات TEM في الموقع للتفاعلات الناجمة عن الضوء بين الخلايا البكتيرية والمحسس الضوئي. كما تتم مناقشة طرق تحضير العينات وتلف شعاع الإلكترون والتصوير.
Abstract
يصف البروتوكول الحالي تعديلات إعداد المجهر الإلكتروني الناقل (TEM) للملاحظات التي يسببها الضوء في الموقع . تم إدخال ألياف بصرية زجاجية في عمود الإلكترون فوق قطب العدسة الموضوعي ، وتم استخدام الليزر ، وهو مصدر ضوء قابل للتعديل ، لتصنيع الجهاز. بعد معايرة المصباح باستخدام نظام قياس خارجي ، فإنه يسمح للمرء بضبط شدة الإضاءة وفقا لاحتياجات العملية المرصودة. تم استخدام نظام الإضاءة هذا لتصوير ظواهر العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات ، والتي تخضع حاليا لبحث مكثف. تم تحضير العينة عن طريق اكتشاف تعليق البكتيريا على ركيزة الكربون أو الجرافين أو نيتريد السيليكون ، ونشاف المحلول الزائد ، واكتشاف محلول التحسس الضوئي ، ونشاف السائل الزائد مرة أخرى ، ثم تجميع الخلية السائلة مع ركيزة ثانية أو فيلم جرافين. تتضمن عملية تجربة التصوير نفسها اختيار المكان المناسب للمراقبة باستخدام تكبير منخفض وجرعة دنيا من الإلكترونات ، ثم التنشيط الدوري لمصدر الضوء لالتقاط صور لاحقة على فترات زمنية محددة بأقل قدر ممكن من الإلكترونات اللازمة. يجب تسجيل جرعة الإلكترون لكل تعرض ووقت وشدة الإضاءة المستخدمة بعناية بسبب تعقيد الظواهر المرصودة ، حيث أن العملية ، في الوقت نفسه ، مدفوعة بالضوء والإلكترون. بعد إجراء التجربة الفعلية ، يجب إجراء ملاحظات تحكم إضافية ، حيث يتم استخدام نفس جرعات الإلكترونات ولكن دون تأثير ضوئي إضافي ويتم استخدام جرعات أصغر من الإلكترونات لجرعات أعلى من الضوء. وهذا يجعل من الممكن التمييز بين التأثيرات الهيكلية المجهرية الناجمة عن الضوء وتلك التي تسببها الإلكترونات في كل من مجالات الحياة وعلوم المواد.
Introduction
الظواهر التي يسببها الضوء بدقة عالية مثيرة للاهتمام في العديد من المجالات مثل الهندسة النانوية1،2،3 ، والتحفيز4،5 ، والضوئيات الحيوية6. يمكن العثور على بعض التصاميم الأصلية التي تسمح بمثل هذه التجارب في الأدبيات ، بما في ذلك تعديلات أصحاب العينات1،4،7،8،9 والألياف البصرية المرفقة بالمجهر10،11.
إن الجمع بين الإضاءة الضوئية والبيئة السائلة والمجهر الإلكتروني الناقل (TEM) يعطي فرصة كبيرة للدراسات التفصيلية والديناميكية للعمليات المستحثة بالصور. ومع ذلك ، فإن حالة الفراغ العالي داخل المجهر غير مواتية إلى حد ما للعديد من السوائل ، وخاصة المحاليل المائية. يمكن تحقيق التغليف السائل ، الذي يحميه من البيئة ، باستخدام بعض التقنيات التي تعتمد بشكل أساسي على ركائز الجرافين 12 أو نيتريد السيليكون13 أو الكربون14. بالإضافة إلى الأبحاث في علوم المواد2 ، توفر ما يسمى بالخلايا السائلة إمكانيات لإجراء ملاحظات مجهرية غير تقليدية على العينات البيولوجية بالقرب من ظروفها الأصلية15. هذه الملاحظات صعبة للغاية ، خاصة بالنسبة للكائنات الحية الدقيقة مثل الخلايا البكتيرية. تسبب حزمة الإلكترون كإشعاع مؤين أضرارا لا رجعة فيها للعينات المائية ، لذلك يجب تحديد جرعة الإلكترون16. هذا ضروري لتقليل الآثار غير المواتية ، والتحكم في الضرر ، وتجنب القطع الأثرية المربكة. لا تزال الجرعة القصوى المثلى للإلكترون التي تسمح بمراقبة الخلايا الحية موضوعا مشكوكا فيه16 ، ولكن يبدو أن جرعة 30 e− / nm2 هي قيمة العتبة ، على الأقل بالنسبة للبكتيريا17.
بعض الموضوعات ذات الاهتمام لمثل هذه الدراسات المجهرية هي عمليات أثناء العلاج الضوئي الديناميكي المضاد للميكروبات (APDT)18. باختصار ، يستمر العلاج على النحو التالي. الخلايا البكتيرية محاطة بسائل حساس للضوء يسمى المحسس الضوئي. عندما يتم إعطاء إضاءة ضوئية بطول موجي محدد ، يتم توليد أنواع الأكسجين التفاعلي السام للخلايا (ROS) من الطاقة أو نقل الشحنة من جزيئات المحسس الضوئي المثارة إلى الأكسجين الموجود بشكل طبيعي في المحلول. يتم تعطيل مسببات الأمراض المعرضة ل ROS بسرعة بكفاءة عالية جدا ، دون أي آثار جانبية19. تختلف الاستجابة للعلاج بالنسبة للميكروبات المتميزة - على سبيل المثال ، قد يكون تأثير نفس المحسس الضوئي مختلفا تماما بالنسبة للبكتيريا إيجابية الجرام وسالبة الجرام20. بشكل عام ، ثبت أن الهدف الرئيسي ل ROS هو الهياكل الخارجية للخلايا ، حيث يؤدي الضرر إلى اضطرابات وظيفية في غشاء الخلية ، وبالتالي يؤدي إلى وفاة البكتيريا21,22. ومع ذلك ، فإن تلف الأحماض النووية والبروتيناتيمكن اعتباره أيضا سببا للتعطيل18 ، لذلك لا يزال من غير المعروف أي هياكل الخلايا هي الأهداف الرئيسية خلال هذه العملية19. يمكن أن يساعد الفهم الأعمق للعمليات الضارة في تحسين هذا العلاج النهائي. بالمقارنة مع طرق الفحص المجهري الضوئي المستخدمة في أبحاث APDT23 ، توفر تقنيات TEM المزيد من الإمكانيات للنظر إلى آلية APDT بدقة أعلى وتكبير24. تم بالفعل استخدام TEM بنجاح لمراقبة الخلايا أثناء العلاج المستمر ، مما سمح لنا بدراسة تلف البكتيريا إيجابية الجرام ووصف التغييرات التي تحدث داخل جدار الخلية بالتفصيل 6,25.
يقدم البروتوكول الحالي إعدادا تجريبيا مناسبا للتصوير عالي الدقة لتعطيل البكتيريا المستحثة بالضوء باستخدام TEM ، والذي يتطلب نظاما مناسبا لإضاءة الضوء ، وتغليف الخلايا بسائل ، والتحكم الصارم في جرعة الإلكترون. كانت البكتيريا المستخدمة في الملاحظة هي المكورات العنقودية الذهبية ، وتم استخدام محلول أزرق الميثيلين كمحسس للضوء. يتكون إعداد الإضاءة الضوئية الخاص من ليزر أشباه موصلات قابل للضبط متصل مباشرة بعمود المجهر باستخدام الألياف الضوئية. يوفر هذا التصميم تشعيعا موحدا في جميع أنحاء العينة بسبب الوضع المتوازي تقريبا للألياف البصرية على محور المجهر. يمكن بعد ذلك استخدام الضوء أحادي اللون ذي الكثافة العالية الناتج عن الليزر لدراسة التأثيرات الكيميائية الضوئية المختلفة. كان للضوء المستخدم في التجربة طول موجي يساوي 660 نانومتر لأنه في المنطقة المرئية ، يكون للميثيلين الأزرق قمم امتصاص عند 613 نانومتر و 664 نانومتر26. يعتمد بروتوكول تغليف السائل على ركائز الكربون ، مما يجعل الإجراء سريعا وغير معقد. أخيرا ، يتم تقديم طريقة لجرعة منخفضة في الموقع TEM مراقبة الخلايا في السائل. وتناقش الصعوبات المتعلقة بإعداد العينة، وتأثيرات جرعة الإلكترون على العينة الحساسة، وتفسير الصورة المعقول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. تعديل المجهر الإلكتروني الناقل
- قم بتعديل المجهر الإلكتروني الناقل عن طريق توصيل الألياف البصرية (انظر جدول المواد) بعمود المجهر في الجزء العلوي من العدسة الموضوعية. اترك بضعة سنتيمترات من المساحة بين العدسة الموضوعية والعدسة المكثفة، بالإضافة إلى فتحة مجانية للملحقات.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام حامل عينة مخصص4 أو حامل لملاحظات الكاثودولومينيسنت في التكوين العكسي1 . - تحقق من النظام بحثا عن التسريبات باستخدام مضخات تفريغ خشنة. إذا لم يظهر النظام تسربا للفراغ ، فاختبر النظام تحت فراغ عال.
- تحقق من أن تشغيل نظام التفريغ لا ينحرف عن بدء تشغيل المجهر القياسي المهواة. في حالة وجود مشاكل في تنفيذ الوحدة النمطية أو تجميعها أو تشغيلها ، اتصل بموظفي الخدمة المعتمدين أو الشركة المصنعة للجهاز.
ملاحظة: لن يحجب المصباح المصنوع والمثبت بشكل صحيح شعاع الإلكترون. إذا تحول الشعاع على التوالي أثناء تشغيل المجهر ، فلن يتم تغطية الألياف البصرية غير الموصلة بشكل كاف بدرع معدني وستتراكم شحنة كهربائية. في هذه الحالة ، حرك الألياف البصرية بعمق في سترة التوصيل.
- تحقق من أن تشغيل نظام التفريغ لا ينحرف عن بدء تشغيل المجهر القياسي المهواة. في حالة وجود مشاكل في تنفيذ الوحدة النمطية أو تجميعها أو تشغيلها ، اتصل بموظفي الخدمة المعتمدين أو الشركة المصنعة للجهاز.
- قم بقياس شدة الضوء باستخدام مستشعر طاقة الصمام الثنائي الضوئي (انظر جدول المواد). إذا كانت المسافة بين قطع القطب من العدسة الموضوعية لا تسمح بالقياس داخل المجهر ، فقم بقياس هندسة العينة والإضاءة وإعادة إنتاج هذه الظروف في إعداد قياس خارجي.
- إذا لم يكن المجهر مجهزا بنظام قياس جرعة الإلكترون ، فقم بإجراء المعايرة عن طريق قياس تيار الحزمة باستخدام كوب فاراداي (انظر جدول المواد) وحساب كثافة الإلكترونات التي تصطدم بالعينةرقميا 27.
2. تغليف البكتيريا مع المحسس الضوئي
- ضع شبكتي TEM غير المعالجتين المغطاة بالكربون غير المتبلور بين ملاقط متقاطعة تواجه الجانب المطلي بالكربون إلى الأعلى. أمسك الشبكات بالقرب من الحافة قدر الإمكان.
ملاحظة: بالنسبة لبعض مجموعات الركيزة والمحلول والعينات، قد يكون من المفيد استخدام تفريغ التوهج على أحد الشبكات أو كليهما لإزالة شوائب المصنع والحصول على أقصى سطح محب للماء28. باستخدام مثال بكتيريا S. aureus ومحلول الميثيلين الأزرق ، تم تحديد أنه تم الحصول على أفضل النتائج وأكثرها قابلية للتكرار على الكربون الجديد غير المعالج على الشبكات النحاسية دون تفريغ توهج إضافي أو تنظيف البلازما6. - ضع 4 ميكرولتر من محلول البكتيريا على إحدى الشبكات. يجب أن تكون الكثافة البصرية للعينة في حدود 5-10.
ملاحظة: تم تنقية البكتيريا المستخدمة في الدراسة من الثقافة وتشتت في مخزن PBS المؤقت. يوصى بشدة بالتحقق من تركيز البكتيريا في العينة الطازجة في كل مرة تستخدمها ، على سبيل المثال ، باستخدام طرق التلطيخ السلبية ، باتباع البروتوكولات المعمول بها المتاحة29،30،31. - انتظر لمدة 60 ثانية وقم بمسح السائل بعناية باستخدام ورق الترشيح. حاول نشر السائل في جميع أنحاء سطح الشبكة بأكمله أثناء هذه العملية.
- ضع 4 ميكرولتر من المحسس الضوئي على نفس الشبكة.
ملاحظة: تم استخدام الميثيلين الأزرق بتركيز 2 ميكروغرام / مل كمحسس للضوء لهذه الدراسة. - بعد 5 ثوان ، قم بمسح السائل. اترك طبقة رقيقة جدا من السائل على الركيزة.
- ضع الشبكة الجافة بسرعة فوق الشبكة المغطاة بالسائل.
- حرك الشبكة العلوية برفق إلى حافة الشبكة الثانية واضغط على الركائز عند الحواف باستخدام ملاقط.
ملاحظة: قد يتدفق بعض السائل خارج العينة في هذه المرحلة، مما يعني أنه لم يتم تصريف ما يكفي منه. ومع ذلك ، هذا لا يعني بالضرورة أن تكوين الخلية السائلة لن ينجح. - كرر الضغط بعناية.
ملاحظة: من الأسهل تنفيذ هذه الخطوة عن طريق تدوير الملقط بمقدار 90 درجة بحيث تقع عموديا على الطاولة وتبقى أطراف الملقط على نفس الارتفاع ، ولا تعتمد على موضع الفتح / الإغلاق. - اترك الخلية السائلة بين الملقط لمدة 1 دقيقة.
- أدخل العينة في حامل TEM مباشرة بعد الانتهاء من التحضير.
ملاحظة: سيساعد توتر لوحة / حلقة تركيب الحامل الركائز على الالتصاق بالسائل والحفاظ عليه في الداخل.- إذا كان ذلك ممكنا ، قم بضخ حامل العينة في محطة ضخ خارجية لتقليل تلوث المجهر عن طريق تبخير السائل.
3. في الموقع ملاحظات TEM للخلايا البكتيرية في تأثير جرعة الإلكترون السائل
- أدخل العينة في المجهر.
- ابدأ عمليات الرصد في وضع التكبير المنخفض للعثور على منطقة مراقبة مناسبة.
ملاحظة: من المرجح أن تكون المناطق الداكنة سائلة بسبب تشتت شعاع الإلكترون.- أثناء الملاحظات ، حافظ على جرعة الإلكترون منخفضة قدر الإمكان. قم بتوسيع وقت التعرض (حتى 2 ثانية لجهد متسارع يبلغ 150 كيلو فولت وتكبير 5000 ضعف). إن تكبير 5000x للكاميرا المثبتة في الأسفل (مجال الرؤية التقريبي هو 10 ميكرومتر) يكفي لتصوير البكتيريا التي يبلغ قطرها ~ 1 ميكرومتر.
ملاحظة: في بعض الأحيان ، ليس من السهل التمييز بين السائل ، لذلك ، في بداية الملاحظات ، من المفيد تركيز حزمة الإلكترون حيث من المحتمل أن يكون سائلا. يجب أن يتحرك السائل على حزمة إلكترون مركزة ، وستظهر الفقاعات. بعد هذا التحقق ، من الضروري العثور على منطقة أخرى لمزيد من الملاحظات.
- أثناء الملاحظات ، حافظ على جرعة الإلكترون منخفضة قدر الإمكان. قم بتوسيع وقت التعرض (حتى 2 ثانية لجهد متسارع يبلغ 150 كيلو فولت وتكبير 5000 ضعف). إن تكبير 5000x للكاميرا المثبتة في الأسفل (مجال الرؤية التقريبي هو 10 ميكرومتر) يكفي لتصوير البكتيريا التي يبلغ قطرها ~ 1 ميكرومتر.
- ابحث عن الخلايا المحاطة بالسائل عند التكبير المناسب مع وقت التعرض الممتد والتقط الصورة الأولى على الفور. حافظ على جرعة الإلكترون ثابتة وجمع الصور كل 30 ثانية لمراقبة التغييرات.
- افحص الصور بعناية واحسب إجمالي جرعة الإلكترون27 التي تتوافق مع التغيرات المرئية الأولى في الخلايا.
4. ملاحظات TEM في الموقع للعمليات التي يسببها الضوء بين الخلايا البكتيرية والمحسس الضوئي
- قبل البدء في التجربة، اضبط شدة ضوء الليزر عن طريق ضبط القيمة الحالية. اختر الطول الموجي المناسب وفقا لطيف امتصاص المحسس الضوئي. وفقا لمخطط المعايرة السابق (الخطوة 1.4)، اختر القيمة الحالية المقابلة لأقل كثافة ضوء.
ملاحظة: كان الطول الموجي للضوء المستخدم في هذه الدراسة 660 نانومتر. - أدخل العينة في المجهر وابحث عن منطقة المراقبة باتباع الخطوة 3.2. في القسم السابق.
- التقط الصورة الأولى للخلية قبل بدء إضاءة العينة واستخدم فراغ الشعاع لإيقاف تشغيل شعاع الإلكترون لتجنب تأثيرات تشعيع الإلكترون.
- قم بتشغيل الليزر. ابدأ بوقت إضاءة قصير (هنا 30 ثانية) لأن ضوء الليزر له كثافة عالية نسبيا. بعد ذلك الوقت ، قم بإيقاف تشغيل مصدر الضوء.
- قم بإيقاف تشغيل فراغ الشعاع والتقاط الصورة على الفور. إذا كان ذلك ممكنا، استخدم خوارزمية تلقائية لعرض العينة فقط للوقت اللازم لالتقاط الصورة. قم بقياس وقت تشعيع الإلكترون بعناية لحساب جرعة الإلكترون27 المستخدمة في التصوير.
- كرر الخطوة 4.4. والخطوة 4.5. للحصول على وقت الإضاءة المتوقع للضوء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم تصميم الإعداد التجريبي لمراقبة العمليات التي يسببها الضوء والتي تحدث في سائل عالي الدقة. سمح لنا التحليل التنافسي للصور بالتمييز بين الضرر الناجم عن شعاع الإلكترون والتغيرات المتعلقة بالتفاعل الكيميائي الضوئي. كان تأثير شعاع الإلكترون على العينة الحساسة (في هذه الحالة ، الخلايا المغلفة بالسائل) مرئيا في جميع أنحاء المنطقة المشععة حيث اخترقت الإلكترونات من خلالها بشكل موحد. بالطبع ، يعتمد التأثير على جرعة الإلكترون ، لذلك يمكن ملاحظة تغييرات أكثر أهمية في مورفولوجيا العينة بشكل أسرع للحصول على شعاع أكثر تركيزا. بالمقارنة مع هذا الضرر الشديد ، حدثت الآثار المدمرة الفعلية للتعطيل الضوئي الديناميكي في أجزاء محددة من الخلايا فقط في المناطق المحاطة بالمحسس الضوئي المضاء.
في مثال تصوير البكتيريا ، ووفقا للأدبيات ، يبدو أن جرعة 30 e− / nm2 هي قيمة العتبة القاتلة للبكتيريا17 ، والتي تم تجاوزها بشكل كبير في الدراسات السابقة للمؤلفين 6,25. ومع ذلك ، لم تلاحظ التغيرات المرئية في الخلية قبل الوصول إلى جرعة الإلكترون البالغة 6000 e− / nm2. أظهرت النتائج تدهورا ملحوظا في الطبقة الخارجية للخلية بسبب أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن التشعيع الضوئي للمحسس الضوئي بعد دقيقة واحدة (الشكل 1). جعلت الإضاءة الضوئية الإضافية التغييرات أكثر وضوحا (الشكل 1D ، G).
كان تغليف الخلايا بين ركائز الكربون كافيا لإجراء ملاحظات مستمرة لمدة 1 ساعة على الأقل. يمكن العثور بسهولة على بقع المراقبة المناسبة التي تحتوي على ما يكفي من السائل عند التكبير المنخفض ، حيث تبدو هذه المناطق أغمق وغير واضحة (كما هو موضح في الإطارات في الشكل 2A). البكتيريا المغطاة بالسائل أقل وضوحا من البكتيريا الجافة ولكن لا يزال من الممكن تمييزها (الشكل 2B). من المفيد النظر إلى الحدود السائلة أثناء التصوير ، ويمكن اكتشاف حركتها بسهولة ، مما يعني أن المنطقة المختارة قد تكون غير مناسبة وغير مستقرة (الشكل 3). وهناك مسألة أخرى أثناء عمليات الرصد وهي تبخر الماء وهطول الأمطار من المحلول، والتي يمكن أن تحدث في مناطق عشوائية من العينة، بما في ذلك المناطق المحيطة بالبكتيريا (الشكل 3B، C).
الشكل 1: النتائج المثالية للمعالجة الضوئية الديناميكية للبكتيريا. (أ) مخطط الخلية السائلة التي تحتوي على الخلايا البكتيرية والأزرق الميثيلين. (ب) الخلية قبل إضاءة الضوء. (ج) الخلية بعد الإضاءة لمدة 1 دقيقة. (د) الخلية بعد الإضاءة لمدة 10 دقائق (E-G) المناطق المكبرة من (B-D). كانت جرعة الإلكترون تساوي 1600 e−/nm 2 و 2500 e−/nm 2 و 6000 e−/nm 2 على التوالي. وهذا الرقم مستنسخ من Żak et al.25. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: صور TEM ل S. aureus مغلفة باللون الأزرق الميثيلين بين فيلمين من أفلام الكربون . (A) صورة التكبير المنخفض تعرض كلتا المنطقتين بكمية عالية من السائل (المشار إليها بالإطارات الصفراء) والبقع الجافة. يعطي الفحص السريع للعينة عند هذا التكبير معلومات حول ما إذا كان التغليف ناجحا أم لا. (ب) الحدود السائلة مرئية بوضوح في المنطقة المكبرة ، ويمكن تمييز البكتيريا المغطاة بالمحسس الضوئي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: صور TEM للتأثيرات غير المواتية التي قد تحدث أثناء التصوير . (أ) في البداية ، كانت الخلية محاطة بشكل موحد بالسائل ، الذي غطى معظم منطقة المراقبة. (ب) استنادا إلى تشعيع شعاع الإلكترون الثابت ، يمكن ملاحظة حركة السائل وتبخره وبدء هطول الأمطار من المحلول. (ج) يؤدي استمرار العمليات إلى حركة لا رجعة فيها ، ورغوة ، وتفكك محسس للضوء ، مما يجعل من المستحيل إجراء المزيد من الملاحظات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الآثار غير المواتية التي تؤدي إلى استنتاجات خاطئة . (أ) السائل المتبلور. (ب) استقر التلوث على الخلية. (ج) الرغوة التي يسببها شعاع الإلكترون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتطلب تركيب وتشغيل المصباح معرفة أساسية بالخدمة ويمكن أن يتلف المجهر. أبسط طريقة لإدخال الضوء إلى المجهر هي توصيل الألياف البصرية من أعلى العدسة الموضوعية ، حيث يوجد عادة مجال لملفات انحراف TEM وأجهزة الكشف الإضافية. يمكن أيضا توقع المزيد من المساحة الحرة من أجهزة الدخول العلوية القديمة ، حيث يضم نفس الموقع قفل فراغ العينة وآلية تثبيت العينة. تم وصف هذا التكوين على نطاق واسع في تقرير سابق25 ، والذي يحتوي على تصميم إضاءة مثالي. إذا كان الجزء الداخلي من المجهر لا يسمح بتركيب الألياف البصرية فوق العدسة الموضوعية ، فقد يتم تثبيت المصباح داخل قطب العدسة الموضوعية من الجانب32. وتفترض حلول أخرى استخدام حامل عينة مخصص4 أو الاستخدام العكسي للحامل لعمليات الرصد الكاثودولومينيسنت1.
بشكل عام ، يعد إعداد العينات السائلة ل TEM معقدا ويتطلب خبرة ومهارات يدوية. الخطوة الحاسمة في إعداد الخلايا السائلة هي الخطوة 2.6. من البروتوكول. من المهم وضع الشبكة الثانية بسرعة لتجنب تبخر السائل. الطريقة المعروضة هنا بسيطة ولا تتطلب مواد غير شائعة. ومع ذلك ، قد لا تناسب جميع السوائل. في بعض الحالات ، من المفيد تنظيف الركيزة بالبلازما لزيادة محبة الماء. بالنسبة للعينات السائلة ، وخاصة محاليل المياه ، التي لا تحتوي على أي جزيئات و / أو خلايا يمكن أن تكون بمثابة فاصل بين أغشية الكربون ، قد يكون التغليف غير ناجح لأن كل السائل قد يتدفق من بين الأسطح المستوية. قد يكون استخدام خلية سائلة من الجرافين محضرة باستخدام ركيزة هولي ، والتي تخلق "جيوبا" صغيرة للسائل ، أكثر ملاءمة33.
يمكن أن تزعج ملاحظات TEM التي يتم إجراؤها في السائل بعض العوامل المتعلقة بإعداد العينة والآثار غير المواتية التي تسببها حزمة الإلكترون. الأول يشمل انفصال الركائز وحركة السائل ، وغالبا ما يتبعه كسر فيلم الكربون ، والذي يحدث لكميات كبيرة من السوائل في المنطقة و / أو عند تشعيع الإلكترون. يمكن تجنب ذلك عن طريق تقليل حجم السائل في الخطوة 2.5. من البروتوكول.
يؤدي التشعيع بإلكترونات عالية الطاقة إلى نقل الطاقة ، مما يؤدي إلى التسخين أو التحلل اللاسلكي. بعد التفاعل مع الإشعاع ، يتحلل الماء إلى جذور (H· و OH·) ، H2 ، والإلكترونات المذابة. تشارك هذه الأنواع في المزيد من التفاعلات ، وبالتالي توليد منتجات مختلفة والتسبب في تلف العينة34. لذلك ، من المهم جدا الحفاظ على جرعة الإلكترون منخفضة أثناء الملاحظات (الخطوة 3.2.) ، خاصة بالنسبة للعينات الحساسة مثل الخلايا. الآثار الأخرى التي تسببها حزمة الإلكترون هي هطول الأمطار من المحلول (الشكل 4A) ورغوة السائل (الشكل 4C). يساعد خفض جرعة الإلكترون على تجنب هذين التأثيرين السلبيين ، ولكن في بعض الأحيان لا يمكن القضاء عليهما. قد يكون هناك أيضا بعض التلوث الحساس للإشعاع في المحلول ، والذي يستقر على الخلية (الشكل 4B) ويتغير على تأثير شعاع الإلكترون. هذا غير موات لأن الشوائب قد تؤخذ كجزء من الخلية ، والتي تتضرر عند تشعيع الضوء ، مما يؤدي إلى استنتاجات خاطئة. أفضل طريقة للحصول على صور موثوقة هي العثور على منطقة غير ملوثة والحفاظ على جرعة الإلكترون منخفضة قدر الإمكان.
تتطلب دراسات TEM الموثوقة في الموقع للتفاعلات الضوئية مقارنة جيدة بين العمليات التي يسببها الضوء وتلك التي يسببها شعاع الإلكترون. باستثناء خفض جرعة الإلكترون الموصوفة في الخطوة 3.2.، من المفيد إيقاف تشغيل مصدر الإلكترون لوقت إضاءة الضوء بحيث يمكن ملاحظة النتائج غير المضطربة، كما هو مؤكد في الخطوة 4.3. من البروتوكول.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لمراقبة التفاعلات التي يسببها الضوء (خاصة في السائل) ، على سبيل المثال ، الضوء على العناقيد النانوية المعدنية2 ، وعمليات التحفيز الناجم عن الضوء1 ، وتأثير الضوء على العينات البيولوجية (على سبيل المثال ، الخلايا التي تحتوي على محسس للضوء ، البلاستيدات الخضراء).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
تم دعم البحث من خلال منحة Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100 ، المركز الوطني للعلوم ، بولندا).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
