Summary
Mevcut protokol, bir ışık aydınlatma sistemi ile iletim elektron mikroskobu (TEM) modifikasyonlarını, sıvı hücrelerin üretimini ve bakteri hücreleri ile bir fotosensitizör arasındaki ışık kaynaklı etkileşimlerin yerinde TEM gözlemlerini açıklamaktadır. Numune hazırlama yöntemleri, elektron ışını hasarı ve görüntüleme de tartışılmaktadır.
Abstract
Mevcut protokol, in situ ışık kaynaklı gözlemler için iletim elektron mikroskobu (TEM) kurulumunun modifikasyonlarını açıklamaktadır. Cihazı imal etmek için objektif lens kutup parçasının üzerindeki elektron sütununa yerleştirilmiş bir cam optik fiber ve ayarlanabilir bir ışık kaynağı olan bir lazer kullanıldı. Aydınlatıcı harici bir ölçüm sistemi kullanılarak kalibre edildikten sonra, aydınlatmanın yoğunluğunu gözlemlenen işlemin ihtiyaçlarına göre ayarlamaya izin verir. Bu aydınlatma sistemi, şu anda yoğun araştırmalara konu olan antimikrobiyal fotodinamik terapi fenomenlerini görüntülemek için kullanılmıştır. Numune, bir karbon, grafen veya silikon nitrür substratı üzerinde bir bakteri süspansiyonu tespit edilerek, fazla çözeltinin lekelenmesiyle, fotosensitizör çözeltisinin tespit edilmesiyle, fazla sıvının tekrar lekelenmesiyle ve daha sonra sıvı hücrenin ikinci bir substrat veya grafen filmi ile birleştirilmesiyle hazırlandı. Görüntüleme deneyinin kendisi, düşük büyütme ve minimum dozda elektron kullanımı ile gözlem için doğru yeri seçmeyi ve daha sonra gerekli minimum elektron miktarı ile belirli aralıklarla sonraki görüntüleri yakalamak için ışık kaynağının döngüsel aktivasyonunu içerir. Her maruziyetin elektron dozu ve kullanılan aydınlatmanın zamanı ve yoğunluğu, gözlemlenen fenomenlerin karmaşıklığı nedeniyle dikkatlice kaydedilmelidir, çünkü aynı zamanda süreç hem ışık hem de elektron güdümlüdür. Gerçek deney yapıldıktan sonra, aynı dozda elektronların kullanıldığı, ancak ek ışık etkisi olmadan ve daha yüksek ışık dozları için daha küçük dozlarda elektronların kullanıldığı ek kontrol gözlemleri yapılmalıdır. Bu, ışığın neden olduğu mikroyapısal etkileri, hem yaşam hem de malzeme bilimi alanlarında elektronların neden olduğu etkilerden ayırt etmeyi mümkün kılar.
Introduction
Yüksek çözünürlükte ışık kaynaklı fenomenler, nanomühendislik 1,2,3, kataliz 4,5 ve biyofotonik6 gibi birçok alanda ilginçtir. Bu tür deneylere izin veren bazı orijinal tasarımlar, örnek tutucuların 1,4,7,8,9 ve mikroskopa bağlı optik fiber 10,11'in modifikasyonları da dahil olmak üzere literatürde bulunabilir.
Işık aydınlatması, sıvı bir ortam ve transmisyon elektron mikroskobu (TEM) kombinasyonu, foto-indüklenen süreçlerin ayrıntılı, dinamik çalışmaları için harika bir fırsat sunar. Bununla birlikte, mikroskop içindeki yüksek vakum koşulu, birçok sıvı, özellikle de su çözeltileri için oldukça elverişsizdir. Onu çevreden koruyan sıvı kapsülleme, esas olarak grafen12, silikon nitrür 13 veya karbon14 substratlarına dayanan birkaç teknik kullanılarak elde edilebilir. Malzeme bilimi2'deki araştırmalara ek olarak, sözde sıvı hücreler, doğal koşullarına yakın biyolojik örnekler üzerinde alışılmadık mikroskobik gözlemler yapma olanakları sunar15. Bu tür gözlemler, özellikle bakteri hücreleri gibi canlı mikroorganizmalar için son derece zordur. İyonlaştırıcı radyasyon olarak elektron ışını, hidratlanmış numunelerde geri dönüşü olmayan hasara neden olur, bu nedenle elektron dozubelirtilmelidir 16. Bu, olumsuz etkileri en aza indirmek, hasarı kontrol etmek ve kafa karıştırıcı yapıtlardan kaçınmak için gereklidir. Canlı hücrelerin gözlemlenmesine izin veren optimal maksimum elektron dozu hala şüpheli bir konu16'dır, ancak 30 e-/ nm2 dozu, en azından bakteri17 için eşik değer gibi görünmektedir.
Bu tür mikroskobik çalışmalar için ilgi çekici konulardan bazıları, antimikrobiyal fotodinamik tedavi (APDT) sırasındaki süreçlerdir18. Kısacası terapi şu şekilde ilerler. Bakteri hücreleri, fotosensitizör adı verilen ışığa duyarlı sıvı ile çevrilidir. Işık aydınlatması belirli bir dalga boyunda verildiğinde, sitotoksik reaktif oksijen türleri (ROS), uyarılmış fotosensitizör moleküllerden çözeltide doğal olarak bulunan oksijene enerji veya yük transferinden üretilir. ROS'a maruz kalan patojenler, hiçbir yan etkisi olmadan, çok yüksek verimlilikle hızlı bir şekilde inaktive edilir19. Tedaviye verilen yanıt farklı mikroplar için değişir – örneğin, aynı fotosensitizörün etkisi Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler için oldukça farklı olabilir20. Genel olarak, ROS'un ana hedefinin, hasarın hücre zarının fonksiyonel bozukluklarına neden olduğu ve sonuç olarak bakterilerin ölümüne yol açtığı hücrelerin dış yapıları olduğu tespit edilmiştir21,22. Bununla birlikte, nükleik asitlere ve proteinlere verilen hasar, inaktivasyonun bir nedeni olarak da düşünülebilir18, bu nedenle bu işlem sırasında hangi hücre yapılarının ana hedefler olduğu hala bilinmemektedir19. Zarar verici süreçlerin daha derin bir şekilde anlaşılması, bu kesin tedavinin iyileştirilmesine yardımcı olabilir. APDT araştırması23'te kullanılan ışık mikroskobu yöntemleriyle karşılaştırıldığında, TEM teknikleri APDT mekanizmasına daha yüksek çözünürlük ve büyütme ile bakmak için daha fazla olanak sağlar24. TEM, devam eden tedavi sırasında hücre gözlemi için zaten başarıyla kullanılmıştır, bu da Gram-pozitif bakteri hasarını incelememize ve hücre duvarında meydana gelen değişiklikleri ayrıntılı olarak tanımlamamıza izin verdi 6,25.
Mevcut protokol, uygun bir ışık aydınlatma sistemi, hücrelerin bir sıvı ile kapsüllenmesi ve sıkı elektron dozu kontrolü gerektiren TEM kullanarak ışığa bağlı bakteri inaktivasyonunun yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi için uygun bir deneysel kurulum sunmaktadır. Gözlem için kullanılan bakteriler Staphylococcus aureus idi ve fotosensitizör olarak metilen mavisi bir çözelti kullanıldı. Özel ışık aydınlatma kurulumu, ışık fiberi kullanılarak doğrudan mikroskop kolonuna bağlanan ayarlanabilir bir yarı iletken lazerden oluşur. Bu tasarım, optik fiberin mikroskop eksenine neredeyse paralel yerleştirilmesi nedeniyle numune boyunca eşit ışınlama sağlar. Lazer tarafından üretilen yüksek yoğunluklu monokromatik ışık daha sonra çeşitli fotokimyasal etkileri incelemek için kullanılabilir. Deneyde kullanılan ışık 660 nm'ye eşit bir dalga boyuna sahipti, çünkü görünür bölgede metilen mavisi 613 nm ve 664 nm26'da absorpsiyon zirvelerine sahipti. Sıvı kapsülleme protokolü, prosedürü hızlı ve karmaşık hale getiren karbon substratlarına dayanmaktadır. Son olarak, sıvı içindeki hücrelerin düşük doz in situ TEM gözlemi için bir yöntem sunulmuştur. Numune hazırlama ile ilgili zorluklar, hassas numune üzerindeki elektron dozu etkileri ve makul görüntü yorumlama tartışılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İletim elektron mikroskobu modifikasyonu
- Optik fiberi (bkz. Malzeme Tablosu) objektif lensin üstündeki mikroskop sütununa bağlayarak iletim elektron mikroskobunu değiştirin. Objektif lens ile kondansatör lens arasında birkaç santimetre boşluk bırakın, ayrıca aksesuarlar için boş bir yuva bırakın.
NOT: Özel bir numune tutucu4 veya ters konfigürasyon1'deki katodoluminesan gözlemler için bir tutucu da kullanılabilir. - Kaba vakum pompaları kullanarak sistemde sızıntı olup olmadığını kontrol edin. Sistem vakum sızıntısı göstermiyorsa, sistemi yüksek vakum altında test edin.
- Vakum sisteminin çalıştırılmasının standart havalandırmalı mikroskop başlangıcından sapmadığını kontrol edin. Modülün çalıştırılması, montajı veya devreye alınması ile ilgili sorunlar olması durumunda, yetkili servis personeline veya cihaz üreticisine başvurun.
NOT: Doğru yapılmış ve monte edilmiş aydınlatıcı, elektron ışınını gizlemeyecektir. Işın mikroskobun çalışması sırasında art arda değişirse, iletken olmayan optik fiber metal bir kalkanla yeterince kaplanmayacak ve bir elektrik yükü biriktirecektir. Bu durumda, optik fiberi iletken ceketin derinliklerine kaydırın.
- Vakum sisteminin çalıştırılmasının standart havalandırmalı mikroskop başlangıcından sapmadığını kontrol edin. Modülün çalıştırılması, montajı veya devreye alınması ile ilgili sorunlar olması durumunda, yetkili servis personeline veya cihaz üreticisine başvurun.
- Fotodiyot güç sensörünü kullanarak ışık yoğunluğunu ölçün (bkz. Objektif lensin kutup parçaları arasındaki boşluk mikroskop içinde ölçüme izin vermiyorsa, numunenin ve aydınlatıcının geometrisini ölçün ve bu koşulları harici bir ölçüm kurulumunda yeniden üretin.
- Mikroskop bir elektron dozu ölçüm sistemi ile donatılmamışsa, ışın akımını bir Faraday kabı ile ölçerek (bakınız Malzeme Tablosu) ve numuneye çarpan elektronların yoğunluğunu sayısal olarak hesaplayarak kalibrasyonu gerçekleştirin27.
2. Bakterilerin fotosensitizör ile kapsüllenmesi
- Amorf karbonla kaplı iki işlenmemiş TEM ızgarasını, karbon kaplı tarafa bakan iki çapraz cımbız arasına yerleştirin. Izgaraları kenara mümkün olduğunca yakın tutun.
NOT: Belirli substrat, çözelti ve numune kombinasyonları için, fabrika safsızlıklarını gidermek ve maksimum hidrofilik yüzey elde etmek için bir veya her iki ağda kızdırma deşarjı kullanmak faydalı olabilir28. S. aureus bakterileri ve metilen mavisi çözeltisi örneği kullanılarak, ek kızdırma deşarjı veya plazma temizliği olmadan bakır ızgaralarda yeni, işlenmemiş karbon üzerinde en iyi ve en tekrarlanabilir sonuçların elde edildiği belirlenmiştir6. - Izgaralardan birine 4 μL bakteri çözeltisi koyun. Numunenin optik yoğunluğu 5-10 aralığında olmalıdır.
NOT: Çalışmada kullanılan bakteriler kültürden saflaştırıldı ve PBS tamponunda dağıldı. Taze numunedeki bakteri konsantrasyonunun, örneğin negatif boyama yöntemlerini kullanarak, mevcut29,30,31 yerleşik protokolleri izleyerek her seferinde kontrol edilmesi şiddetle tavsiye edilir. - 60 saniye bekleyin ve filtre kağıdı kullanarak sıvıyı dikkatlice lekeleyin. Bu işlem sırasında sıvıyı tüm ızgara yüzeyine yaymaya çalışın.
- Aynı ızgaraya 4 μL fotosensitizör koyun.
NOT: Bu çalışmada fotosensitizör olarak 2 μg/mL konsantrasyonda metilen mavisi kullanılmıştır. - 5 s'den sonra sıvıyı kurulayın. Substrat üzerinde çok ince bir sıvı tabakası bırakın.
- Kuru ızgarayı sıvı ile kaplı olanın üzerine hızlıca yerleştirin.
- Üst ızgarayı yavaşça ikincisinin kenarına hareket ettirin ve cımbız kullanarak kenarlardaki substratları sıkın.
NOT: Bu aşamada numuneden bir miktar sıvı akabilir, bu da yeterince boşaltılmadığı anlamına gelir. Bununla birlikte, bu mutlaka sıvı hücrenin oluşumunun başarısız olacağı anlamına gelmez. - Sıkmayı dikkatlice tekrarlayın.
NOT: Bu adımı, cımbızları masaya dik duracak şekilde 90° döndürerek gerçekleştirmek daha kolaydır ve her iki cımbızın ucu da açık/kapalı konuma bağlı olarak aynı yükseklikte kalır. - Sıvı hücreyi cımbız arasında 1 dakika bekletin.
- Hazırlığı bitirdikten hemen sonra numuneyi TEM tutucuya yerleştirin.
NOT: Tutucu montaj plakasının/halkasının gerginliği, alt tabakaların sıvıyı içeride tutmasına ve tutmasına yardımcı olacaktır.- Mümkünse, sıvıyı buharlaştırarak mikroskobun kirlenmesini azaltmak için numune tutucuyu harici bir pompa istasyonuna pompalayın.
3. Sıvı-elektron doz etkisinde bakteri hücrelerinin yerinde TEM gözlemleri
- Numuneyi mikroskopa yerleştirin.
- Uygun bir gözlem alanı bulmak için gözlemleri düşük büyütme modunda başlatın.
NOT: Daha koyu bölgelerin elektron ışını saçılması nedeniyle sıvı olma olasılığı daha yüksektir.- Gözlemler sırasında, elektron dozunu mümkün olduğunca düşük tutun. Pozlama süresini genişletin (150 kV'luk bir hızlanma voltajı ve 5.000x büyütme için 2 sn'ye kadar). Alttan montajlı kamera için 5.000x büyütme (yaklaşık görüş alanı 10 μm'dir), ~1 μm çapındaki bakterileri görüntülemek için yeterlidir.
NOT: Bazen, sıvıyı ayırt etmek kolay değildir, bu nedenle, gözlemlerin başında, elektron ışınını sıvı olması muhtemel yere odaklamak yararlıdır. Sıvı, odaklanmış bir elektron ışını üzerinde hareket etmeli ve kabarcıklar görünecektir. Bu doğrulamadan sonra, daha fazla gözlem için başka bir alan bulmak gerekir.
- Gözlemler sırasında, elektron dozunu mümkün olduğunca düşük tutun. Pozlama süresini genişletin (150 kV'luk bir hızlanma voltajı ve 5.000x büyütme için 2 sn'ye kadar). Alttan montajlı kamera için 5.000x büyütme (yaklaşık görüş alanı 10 μm'dir), ~1 μm çapındaki bakterileri görüntülemek için yeterlidir.
- Sıvıyla çevrili hücreleri, uzatılmış pozlama süresiyle uygun büyütmede bulun ve ilk görüntüyü hemen yakalayın. Elektron dozunu sabit tutun ve değişiklikleri gözlemlemek için her 30 saniyede bir görüntü toplayın.
- Görüntüleri dikkatlice inceleyin ve hücrelerdeki ilk görünür değişikliklere karşılık gelen toplam elektron dozu27'yi hesaplayın.
4. Bakteriyel hücreler ve fotosensitizör arasındaki ışığa bağlı süreçlerin yerinde TEM gözlemleri
- Deneye başlamadan önce, mevcut değeri ayarlayarak lazer ışık yoğunluğunu ayarlayın. Fotosensitizörün absorpsiyon spektrumuna göre uygun dalga boyunu seçin. Önceki kalibrasyon grafiğine göre (adım 1.4.), en düşük ışık yoğunluğuna karşılık gelen mevcut değeri seçin.
NOT: Bu çalışmada kullanılan ışık dalga boyu 660 nm idi. - Numuneyi mikroskopa yerleştirin ve adım 3.2'yi izleyerek gözlem alanını bulun. önceki bölümde.
- Numunenin aydınlatılmasına başlamadan önce hücrenin ilk görüntüsünü yakalayın ve elektron ışınlamasının etkilerinden kaçınmak için elektron ışınını kapatmak için ışın karartıcısını kullanın.
- Lazeri açın. Lazer ışığı nispeten yüksek yoğunluğa sahip olduğu için kısa bir aydınlatma süresiyle (burada 30 s) başlayın. Bu süreden sonra, ışık kaynağını kapatın.
- Işın karartıcıyı kapatın ve görüntüyü hemen yakalayın. Mümkünse, örneği yalnızca görüntüyü çekmek için gereken süre boyunca ortaya çıkarmak için otomatik bir algoritma kullanın. Görüntüleme için kullanılan elektron dozu27'yi hesaplamak için elektron ışınlama süresini dikkatlice ölçün.
- 4.4 adımını yineleyin. ve adım 4.5. beklenen ışık aydınlatma süresini elde etmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney düzeneği, yüksek çözünürlüklü bir sıvıda meydana gelen ışık kaynaklı süreçleri gözlemlemek için tasarlanmıştır. Görüntülerin rekabetçi analizi, elektron ışınının neden olduğu hasarı fotokimyasal reaksiyonla ilgili değişikliklerden ayırt etmemizi sağladı. Elektron ışınının hassas numune üzerindeki etkisi (bu durumda, sıvı ile kapsüllenmiş hücreler), elektronlar düzgün bir şekilde nüfuz ettikçe ışınlanmış alanın her yerinde görülebiliyordu. Tabii ki, etki elektron dozuna bağlıdır, bu nedenle numune morfolojisindeki daha önemli değişiklikler daha odaklanmış bir ışın için daha hızlı gözlemlenebilir. Bu ciddi hasarla karşılaştırıldığında, fotodinamik inaktivasyonun gerçek yıkıcı etkileri, hücrelerin belirli kısımlarında, yalnızca aydınlatılmış fotosensitizör ile çevrili alanlarda meydana geldi.
Bakteri görüntüleme örneğinde ve literatüre göre, 30 e-/nm2 dozu, yazarların önceki çalışmalarında 6,25'i oldukça aşan bakteri17 için ölümcül eşik değeri gibi görünmektedir. Bununla birlikte, hücredeki gözle görülür değişiklikler, 6000 e-/ nm2'lik elektron dozuna ulaşmadan önce fark edilmedi. Sonuçlar, 1 dakika sonra fotosensitizörün ışık ışınlamasıyla üretilen reaktif oksijen türlerinin neden olduğu hücrenin dış tabakasında kayda değer bir bozulma olduğunu göstermiştir (Şekil 1). Daha fazla ışık aydınlatması değişiklikleri daha görünür hale getirdi (Şekil 1D, G).
Hücrelerin karbon substratları arasındaki kapsüllenmesi, en az 1 saat boyunca sürekli gözlemler yapmak için yeterliydi. Yeterli sıvıya sahip uygun gözlem noktaları, düşük büyütmede kolayca bulunabilir, çünkü bu alanlar daha koyu ve bulanık görünür ( Şekil 2A'daki çerçevelerle gösterilir). Sıvı kaplı bakteriler kuru olanlardan daha az görünürdür, ancak yine de ayırt edilebilir (Şekil 2B). Görüntüleme sırasında sıvı sınırına bakmak yararlıdır ve hareketi kolayca tespit edilebilir, bu da seçilen alanın uygun ve dengesiz olabileceği anlamına gelir (Şekil 3). Gözlemler sırasındaki bir diğer konu, bakterileri çevreleyen alanlar da dahil olmak üzere numunenin rastgele alanlarında meydana gelebilecek olan suyun buharlaşması ve çözeltinin çökelmesidir (Şekil 3B, C).
Şekil 1: Bakterilerin fotodinamik tedavisinin örnek sonuçları. (A) Bakteri hücreleri ve metilen mavisi içeren sıvı hücrenin şeması. (B) Işık aydınlatmasından önceki hücre. (C) 1 dakika boyunca aydınlatmadan sonra hücre. (D) 10 dakika boyunca aydınlatmadan sonra hücre (E-G) (B-D) 'den büyütülmüş alanlar. Elektron dozu sırasıyla 1600 e-/nm 2, 2500 e-/nm 2 ve 6000 e-/nm 2'ye eşitti. Şekil Żak et al.25'ten çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: S. aureus'un iki karbon filmi arasında metilen mavisi ile kapsüllenmiş TEM görüntüleri . (A) Düşük büyütmeli görüntü, her iki alanda da yüksek miktarda sıvı (sarı çerçevelerle gösterilir) ve kuru lekeler sunar. Bu büyütmede numunenin hızlı bir şekilde incelenmesi, kapsüllemenin başarılı olup olmadığı hakkında bilgi verir. (B) Sıvı sınırı, büyütülmüş alanda açıkça görülebilir ve fotosensitizör ile kaplanan bakteriler ayırt edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Görüntüleme sırasında ortaya çıkabilecek olumsuz etkilerin TEM görüntüleri . (A) Başlangıçta, hücre, gözlem alanının çoğunu kaplayan sıvı ile eşit bir şekilde çevrelenmişti. (B) Sabit elektron ışını ışınlamasına dayanarak, sıvının hareketi ve buharlaşması ve çökelmenin çözeltiden başlaması fark edilebilir. (C) İşlemlerin devam etmesi, fotosensitizörün geri dönüşümsüz hareketine, köpüklenmesine ve parçalanmasına yol açarak, daha fazla gözlemi imkansız kılar. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yanlış sonuçlara yol açan olumsuz etkiler . (A) Kristalize sıvı. (B) Kirlenme hücreye yerleşti. (C) Elektron ışınının neden olduğu köpüklenme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Aydınlatıcının kurulumu ve devreye alınması temel servis bilgisi gerektirir ve mikroskopa zarar verebilir. Işığı mikroskopa tanıtmanın en basit yolu, optik fiberi, genellikle TEM sapma bobinleri ve ek dedektörler için yer bulunan objektif lensin üstünden bağlamaktır. Aynı konumun numune vakum kilidini ve numune kurulum mekanizmasını barındırdığı eski üstten girişli cihazlardan daha fazla boş alan da beklenebilir. Bu yapılandırma, örnek bir aydınlatıcı tasarımı içeren önceki bir rapor25'te yaygın olarak açıklanmıştır. Mikroskobun iç kısmı, optik fiberin objektif lensin üzerine yerleştirilmesine izin vermiyorsa, aydınlatıcı objektif lens direğinin içine32 numaralı taraftan monte edilebilir. Diğer çözümler, özel bir numune tutucu4 veya katodoluminesan gözlemler için tutucunun ters kullanımını varsayar1.
Genel olarak, TEM için sıvı numunelerin hazırlanması karmaşıktır ve deneyim ve el becerileri gerektirir. Sıvı hücre hazırlamada kritik adım adım 2.6'dır. protokolünün. Sıvının buharlaşmasını önlemek için ikinci ızgarayı hızlı bir şekilde yerleştirmek önemlidir. Burada sunulan yöntem basittir ve nadir malzemeler gerektirmez; ancak, tüm sıvılara uymayabilir. Bazı durumlarda, hidrofilikliğini arttırmak için substratı plazma ile temizlemek faydalıdır. Sıvı numuneler, özellikle karbon filmler arasında ara parça görevi görebilecek herhangi bir parçacık ve / veya hücre içermeyen su çözeltileri için, tüm sıvı düz yüzeyler arasından akabileceğinden, kapsülleme başarısız olabilir. Sıvı için küçük "cepler" oluşturan delikli bir substrat kullanılarak hazırlanan bir grafen sıvı hücresi kullanmak daha uygun olabilir33.
Sıvı halde yapılan TEM gözlemleri, numune hazırlama ile ilgili birkaç faktör ve elektron ışınının neden olduğu olumsuz etkiler nedeniyle bozulabilir. Birincisi, substratların ayrılmasını ve sıvının hareketini, genellikle bölgedeki yüksek sıvı hacimleri için ve / veya elektron ışınlaması üzerine meydana gelen karbon filmin kırılmasını içerir. Bu, adım 2.5'teki sıvı hacmini en aza indirerek önlenebilir. protokolünün.
Yüksek enerjili elektronlarla ışınlama, enerji transferine yol açarak ısıtma veya radyoliz ile sonuçlanır. Radyasyonla etkileşimden sonra, su radikallere (H · ve OH ·),H2 ve çözünmüş elektronlara ayrışır. Bu türler daha fazla reaksiyona katılır, böylece farklı ürünler üretir ve numuneye zarar verir34. Bu nedenle, gözlemler sırasında elektron dozunu düşük tutmak çok önemlidir (adım 3.2.), özellikle hücreler gibi hassas örnekler için. Elektron ışınının neden olduğu diğer etkiler, çözeltiden çökelme (Şekil 4A) ve sıvının köpüklenmesidir (Şekil 4C). Elektron dozunun düşürülmesi bu iki olumsuz etkiden kaçınmaya yardımcı olur, ancak bazen bunları ortadan kaldırmak mümkün değildir. Çözeltide, hücreye yerleşen (Şekil 4B) ve elektron ışını etkisi üzerine değişen radyasyona duyarlı bir kontaminasyon da olabilir. Bu, safsızlık, hafif ışınlama üzerine hasar gören ve yanlış sonuçlara yol açan hücrenin bir parçası olarak alınabileceğinden elverişsizdir. Güvenilir görüntüler elde etmenin en iyi yolu, kirlenmemiş bir alan bulmak ve elektron dozunu mümkün olduğunca düşük tutmaktır.
Fotoreaksiyonların güvenilir in situ TEM çalışmaları, ışığın neden olduğu süreçler ile elektron ışınının neden olduğu süreçler arasında iyi bir karşılaştırma yapılmasını gerektirir. Adım 3.2.'de açıklanan elektron dozunun düşürülmesi dışında, adım 4.3'te vurgulandığı gibi, bozulmamış sonuçların gözlemlenebilmesi için elektron kaynağını ışık aydınlatma süresi için kapatmak yararlıdır. protokolünün.
Mevcut protokol, ışığa bağlı reaksiyonları (özellikle sıvıda), örneğin, metal nanokümeler2 üzerindeki ışığı, ışığa bağlı kataliz süreçleri1'i ve ışığın biyolojik örnekler üzerindeki etkisini (örneğin, fotosensitizörlü hücreler, kloroplastlar) gözlemlemek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Araştırma Miniatura hibesi (2019/03/X/NZ3/02100, Ulusal Bilim Merkezi, Polonya) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
References
- Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
- Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
- Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
- Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
- Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
- Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
- Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
- Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
- Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
- Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
- Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
- Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
- Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
- Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
- De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
- Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
- Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
- Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
- Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
- Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
- Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
- Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
- Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
- Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
- Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
- Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
- Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
- Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
- Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
- Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
- Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
- Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
