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Engineering

तरल-नरम पदार्थ इंटरैक्शन के अवलोकन के लिए सीटू ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी में प्रकाश-प्रेरित

Published: July 26, 2022 doi: 10.3791/63742
Automatic Translation
1, 2
1Electron Microscopy Laboratory, Faculty of Mechanical Engineering, Wroclaw University of Science and Technology, 2Advanced Materials Engineering and Modelling Group, Faculty of Chemistry, Wroclaw University of Science and Technology

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल एक प्रकाश रोशनी प्रणाली, तरल कोशिकाओं के निर्माण, और बैक्टीरिया कोशिकाओं और फोटोसेंसिटाइज़र के बीच प्रकाश-प्रेरित बातचीत के सीटू टीईएम अवलोकनों के साथ ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) संशोधनों का वर्णन करता है। नमूना तैयार करने के तरीकों, इलेक्ट्रॉन बीम क्षति और इमेजिंग पर भी चर्चा की जाती है।

Abstract

वर्तमान प्रोटोकॉल सीटू प्रकाश-प्रेरित टिप्पणियों के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (टीईएम) सेटअप के संशोधनों का वर्णन करता है। ऑब्जेक्टिव लेंस पोलपीस के ऊपर इलेक्ट्रॉन कॉलम में एक ग्लास ऑप्टिकल फाइबर डाला गया था, और डिवाइस को बनाने के लिए एक लेजर, एक समायोज्य प्रकाश स्रोत, का उपयोग किया गया था। एक बाहरी माप प्रणाली का उपयोग करके इलुमिनेटर को कैलिब्रेट करने के बाद, यह किसी को देखी गई प्रक्रिया की जरूरतों के लिए प्रकाश की तीव्रता को समायोजित करने की अनुमति देता है। इस प्रकाश प्रणाली का उपयोग रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी घटनाओं की छवि बनाने के लिए किया गया था, जो वर्तमान में गहन शोध का विषय हैं। नमूना कार्बन, ग्राफीन, या सिलिकॉन नाइट्राइड सब्सट्रेट पर बैक्टीरिया के निलंबन को देखकर तैयार किया गया था, अतिरिक्त समाधान को सोखना, फोटोसेंसिटाइज़र समाधान को स्पॉट करना, अतिरिक्त तरल को फिर से सोखना, और फिर तरल सेल को दूसरे सब्सट्रेट या ग्राफीन फिल्म के साथ इकट्ठा करना। इमेजिंग प्रयोग की प्रक्रिया में कम आवर्धन और इलेक्ट्रॉनों की न्यूनतम खुराक के उपयोग के साथ अवलोकन के लिए सही जगह चुनना शामिल है, और फिर आवश्यक इलेक्ट्रॉनों की न्यूनतम मात्रा के साथ निर्दिष्ट अंतराल पर बाद की छवियों को कैप्चर करने के लिए प्रकाश स्रोत का चक्रीय सक्रियण शामिल है। प्रत्येक एक्सपोज़र की इलेक्ट्रॉन खुराक और उपयोग किए गए प्रकाश व्यवस्था के समय और तीव्रता को अवलोकन की गई घटनाओं की जटिलता के कारण सावधानीपूर्वक दर्ज करने की आवश्यकता होती है, क्योंकि एक ही समय में, प्रक्रिया प्रकाश और इलेक्ट्रॉन-संचालित दोनों होती है। वास्तविक प्रयोग किए जाने के बाद, अतिरिक्त नियंत्रण अवलोकन किए जाने चाहिए, जिसमें इलेक्ट्रॉनों की समान खुराक का उपयोग किया जाता है लेकिन अतिरिक्त प्रकाश प्रभाव के बिना और प्रकाश की उच्च खुराक के लिए इलेक्ट्रॉनों की छोटी खुराक का उपयोग किया जाता है। इससे जीवन और सामग्री विज्ञान दोनों क्षेत्रों में इलेक्ट्रॉनों के कारण प्रकाश-प्रेरित सूक्ष्म-संरचनात्मक प्रभावों को अलग करना संभव हो जाता है।

Introduction

उच्च रिज़ॉल्यूशन में प्रकाश-प्रेरित घटनाएं कई क्षेत्रों में दिलचस्प हैं जैसे कि नैनोइंजीनियरिंग 1,2,3, उत्प्रेरण 4,5, और बायोफोटोनिक्स 6। कुछ मूल डिजाइन जो इस तरह के प्रयोगों की अनुमति देते हैं, साहित्य में पाए जा सकते हैं,जिसमें नमूना धारकों 1,4,7,8,9 और माइक्रोस्कोप10,11 से जुड़े ऑप्टिकल फाइबर के संशोधन शामिल हैं।

प्रकाश रोशनी, एक तरल वातावरण, और ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) का संयोजन फोटो-प्रेरित प्रक्रियाओं के विस्तृत, गतिशील अध्ययन के लिए एक शानदार अवसर देता है। हालांकि, माइक्रोस्कोप के अंदर उच्च-वैक्यूम स्थिति कई तरल पदार्थों, विशेष रूप से पानी के समाधान के लिए प्रतिकूल है। तरल एनकैप्सुलेशन, जो इसे पर्यावरण से बचाता है, मुख्य रूप से ग्राफीन12, सिलिकॉन नाइट्राइड13, या कार्बन14 सब्सट्रेट्स पर आधारित कुछ तकनीकों का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है। सामग्री विज्ञान2 में अनुसंधान के अलावा, तथाकथित तरल कोशिकाएं अपनी मूल स्थितियों के पास जैविक नमूनों पर अपरंपरागत सूक्ष्म अवलोकन करने की संभावनाएं प्रदान करतीहैं। इस तरह के अवलोकन बेहद मांग कर रहे हैं, खासकर जीवित सूक्ष्मजीवों जैसे जीवाणु कोशिकाओं के लिए। आयनकारी विकिरण के रूप में इलेक्ट्रॉन बीम हाइड्रेटेड नमूनों को अपरिवर्तनीय क्षति का कारण बनता है, इसलिए इलेक्ट्रॉन खुराकको निर्दिष्ट किया जाना चाहिए। प्रतिकूल प्रभावों को कम करने, क्षति को नियंत्रित करने और भ्रामक कलाकृतियों से बचने के लिए यह आवश्यक है। इष्टतम अधिकतम इलेक्ट्रॉन खुराक जो जीवित कोशिकाओं के अवलोकन की अनुमति देती है, अभी भी एक संदिग्ध विषय16 है, लेकिन 30 ई-/एनएम 2 की खुराककम से कम बैक्टीरिया17 के लिए दहलीज मूल्य प्रतीत होती है।

इस तरह के सूक्ष्म अध्ययनों के लिए रुचि के कुछ विषय रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी (एपीडीटी) 18 के दौरान प्रक्रियाएं हैं। संक्षेप में, चिकित्सा निम्नानुसार आगे बढ़ती है। जीवाणु कोशिकाएं फोटोसेंसिटाइज़र नामक फोटोसेंसिटिव तरल से घिरी होती हैं। जब प्रकाश रोशनी एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य पर दी जाती है, तो साइटोटोक्सिक प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां (आरओएस) उत्तेजित फोटोसेंसिटाइज़र अणुओं से समाधान में स्वाभाविक रूप से मौजूद ऑक्सीजन में ऊर्जा या चार्ज ट्रांसफर से उत्पन्न होती हैं। आरओएस के संपर्क में आने वाले रोगजनकों को बहुत उच्च दक्षता के साथ जल्दी से निष्क्रिय कर दिया जाता है, जिसमें कोई दुष्प्रभाव नहींहोता है। चिकित्सा की प्रतिक्रिया अलग-अलग रोगाणुओं के लिए भिन्न होती है - उदाहरण के लिए, ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नकारात्मक बैक्टीरिया20 के लिए एक ही फोटोसेंसिटाइज़र का प्रभाव काफी भिन्न हो सकता है। सामान्य तौर पर, यह स्थापित किया गया है कि आरओएस का मुख्य लक्ष्य कोशिकाओं की बाहरी संरचनाएं हैं, जहां क्षति के परिणामस्वरूप कोशिका झिल्ली के कार्यात्मक विकार होते हैं और परिणामस्वरूप, बैक्टीरिया21,22 की मृत्यु हो जाती है। हालांकि, न्यूक्लिक एसिड और प्रोटीन को नुकसान को निष्क्रियता का कारण भी माना जा सकता है18, इसलिए यह अभी भी अज्ञात है कि इस प्रक्रियाके दौरान कौन सी कोशिका संरचनाएं मुख्य लक्ष्य हैं। हानिकारक प्रक्रियाओं की गहरी समझ इस निश्चित चिकित्सा को बेहतर बनाने में मदद कर सकती है। एपीडीटी अनुसंधान23 में उपयोग की जाने वाली प्रकाश माइक्रोस्कोपी विधियों की तुलना में, टीईएम तकनीक उच्च रिज़ॉल्यूशन और आवर्धन24 के साथ एपीडीटी तंत्र को देखने की अधिक संभावनाएं देती है। चल रही चिकित्सा के दौरान सेल अवलोकन के लिए टीईएम का पहले से ही सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है, जिसने हमें ग्राम-पॉजिटिव बैक्टीरिया क्षति का अध्ययन करने और सेल की दीवार के भीतर होने वालेपरिवर्तनों का विस्तार से वर्णन करने की अनुमति दी।

वर्तमान प्रोटोकॉल टीईएम का उपयोग करके प्रकाश-प्रेरित बैक्टीरिया निष्क्रियता की उच्च-रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग के लिए एक उपयुक्त प्रयोगात्मक सेटअप प्रस्तुत करता है, जिसके लिए उचित प्रकाश रोशनी प्रणाली, तरल के साथ कोशिकाओं के एनकैप्सुलेशन और सख्त इलेक्ट्रॉन खुराक नियंत्रण की आवश्यकता होती है। अवलोकन के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला बैक्टीरिया स्टेफिलोकोकस ऑरियस था, और एक मेथिलीन ब्लू समाधान का उपयोग फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में किया गया था। विशेष प्रकाश रोशनी सेटअप में प्रकाश फाइबर का उपयोग करके माइक्रोस्कोप कॉलम से सीधे जुड़ा एक असमर्थ अर्धचालक लेजर शामिल है। माइक्रोस्कोप अक्ष पर ऑप्टिकल फाइबर के लगभग समानांतर प्लेसमेंट के कारण यह डिजाइन पूरे नमूने में समान विकिरण प्रदान करता है। लेजर द्वारा उत्पन्न उच्च तीव्रता के मोनोक्रोमैटिक प्रकाश का उपयोग तब विभिन्न फोटोकैमिकल प्रभावों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। प्रयोग में प्रयुक्त प्रकाश की तरंग दैर्ध्य 660 एनएम के बराबर थी क्योंकि, दृश्य क्षेत्र में, मेथिलीन ब्लू में 613 एनएम और 664 एनएम26 पर अवशोषण शिखर हैं। तरल एनकैप्सुलेशन के लिए प्रोटोकॉल कार्बन सब्सट्रेट्स पर आधारित है, जो प्रक्रिया को त्वरित और सरल बनाता है। अंत में, तरल में कोशिकाओं के सीटू टीईएम अवलोकन में कम खुराक के लिए एक विधि प्रस्तुत की गई है। नमूना तैयार करने के बारे में कठिनाइयों, संवेदनशील नमूने पर इलेक्ट्रॉन खुराक प्रभाव, और उचित छवि व्याख्या पर चर्चा की जाती है।

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Protocol

1. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप संशोधन

  1. ऑप्टिकल फाइबर ( सामग्री की तालिका देखें) को उद्देश्य लेंस के शीर्ष पर माइक्रोस्कोप कॉलम से जोड़कर ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप को संशोधित करें। उद्देश्य लेंस और कंडेनसर लेंस के बीच कुछ सेंटीमीटर की जगह की अनुमति दें, साथ ही सहायक उपकरण के लिए एक मुफ्त स्लॉट।
    नोट: रिवर्स कॉन्फ़िगरेशन1 में कैथोडोलुमिनसेंट अवलोकनों के लिए एक समर्पित नमूना धारक4 या एक धारक भी नियोजित किया जा सकता है।
  2. रफ वैक्यूम पंप का उपयोग करके लीक के लिए सिस्टम की जांच करें। यदि सिस्टम वैक्यूम रिसाव नहीं दिखाता है, तो उच्च वैक्यूम के तहत सिस्टम का परीक्षण करें।
    1. जांचें कि वैक्यूम सिस्टम का एक्ट्यूएशन मानक वेंट माइक्रोस्कोप स्टार्ट से विचलित नहीं होता है। मॉड्यूल के निष्पादन, असेंबली या कमीशनिंग के साथ समस्याओं के मामले में, अधिकृत सेवा कर्मियों या डिवाइस निर्माता से संपर्क करें।
      नोट: सही ढंग से बनाया गया और माउंटेड इलुमिनेटर इलेक्ट्रॉन बीम को अस्पष्ट नहीं करेगा। यदि माइक्रोस्कोप के संचालन के दौरान बीम क्रमिक रूप से बदलता है, तो नॉनकंडक्टिव ऑप्टिकल फाइबर धातु ढाल के साथ पर्याप्त रूप से कवर नहीं होगा और एक विद्युत आवेश जमा करेगा। इस मामले में, ऑप्टिकल फाइबर को संचालन जैकेट में गहराई से स्लाइड करें।
  3. फोटोडायोड पावर सेंसर का उपयोग करके प्रकाश की तीव्रता को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)। यदि उद्देश्य लेंस के ध्रुव टुकड़ों के बीच का स्थान माइक्रोस्कोप के अंदर माप की अनुमति नहीं देता है, तो नमूने और प्रकाशक की ज्यामिति को मापें और बाहरी माप सेटअप में इन स्थितियों को पुन: उत्पन्न करें।
  4. यदि माइक्रोस्कोप इलेक्ट्रॉन खुराक माप प्रणाली से लैस नहीं है, तो फैराडे कप के साथ बीम प्रवाह को मापकर अंशांकन करें ( सामग्री की तालिका देखें) और संख्यात्मक रूप से नमूना27 से टकराने वाले इलेक्ट्रॉनों के घनत्व की गणना करें।

2. फोटोसेंसिटाइज़र के साथ बैक्टीरिया का एनकैप्सुलेशन

  1. कार्बन-लेपित पक्ष के सामने दो क्रॉस किए गए चिमटी के बीच अनाकार कार्बन से ढके दो अनुपचारित टीईएम ग्रिड रखें। ग्रिड को जितना संभव हो सके किनारे के करीब रखें।
    नोट: कुछ सब्सट्रेट, समाधान और नमूना संयोजनों के लिए, कारखाने की अशुद्धियों को दूर करने और अधिकतम हाइड्रोफिलिक सतह28 प्राप्त करने के लिए एक या दोनों जाल पर चमक निर्वहन का उपयोग करना फायदेमंद हो सकता है। ऑरियस बैक्टीरिया और मेथिलीन ब्लू सॉल्यूशन के उदाहरण का उपयोग करते हुए, यह निर्धारित किया गया था कि अतिरिक्त चमक निर्वहन या प्लाज्मा सफाई के बिना कॉपर ग्रिड पर नए, गैर-उपचारित कार्बन पर सबसे अच्छा और सबसे अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्तकिए गए थे।
  2. ग्रिड में से एक पर बैक्टीरिया के घोल के 4 μL डालें। नमूने का ऑप्टिकल घनत्व 5-10 की सीमा में होना चाहिए।
    नोट: अध्ययन में उपयोग किए गए बैक्टीरिया को संस्कृति से शुद्ध किया गया था और पीबीएस बफर में फैलाया गया था। हर बार इसका उपयोग करके ताजा नमूने में बैक्टीरिया की एकाग्रता की जांच करने की अत्यधिक अनुशंसा की जाती है, उदाहरण के लिए, 29,30,31 उपलब्ध स्थापित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए नकारात्मक धुंधला तरीकों का उपयोग करना।
  3. 60 सेकंड तक प्रतीक्षा करें और फिल्टर पेपर का उपयोग करके तरल को सावधानीपूर्वक धब्बा दें। इस प्रक्रिया के दौरान पूरे ग्रिड सतह पर तरल फैलाने की कोशिश करें।
  4. एक ही ग्रिड पर 4 μL फोटोसेंसिटाइज़र डालें।
    नोट: वर्तमान अध्ययन के लिए फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में 2 μg / mL की एकाग्रता पर मेथिलीन ब्लू का उपयोग किया गया था।
  5. 5 सेकंड के बाद, तरल को बाहर निकाल दें। सब्सट्रेट पर तरल की एक बहुत पतली परत छोड़ दें।
  6. जल्दी से सूखे ग्रिड को तरल से ढके हुए के शीर्ष पर रखें।
  7. धीरे से ऊपरी ग्रिड को दूसरे के किनारे पर ले जाएं और चिमटी का उपयोग करके किनारों पर सब्सट्रेट निचोड़ें।
    नोट: इस स्तर पर नमूने से कुछ तरल बह सकता है, जिसका अर्थ है कि पर्याप्त नहीं निकाला गया था। हालांकि, इसका मतलब यह नहीं है कि तरल सेल का गठन असफल होगा।
  8. सावधानी से निचोड़ को दोहराएं।
    नोट: चिमटी को 90 ° तक घुमाकर इस चरण को करना आसान है ताकि वे तालिका के लंबवत हों और दोनों चिमटी की युक्तियां समान ऊंचाई पर रहें, न कि खुली / बंद स्थिति पर निर्भर करें।
  9. तरल सेल को 1 मिनट के लिए चिमटी के बीच छोड़ दें।
  10. तैयारी पूरी करने के तुरंत बाद नमूना टीईएम धारक में डालें।
    नोट: होल्डर माउंटिंग प्लेट / रिंग का तनाव सब्सट्रेट्स को तरल को अंदर रखने और रखने में मदद करेगा।
    1. यदि संभव हो, तो तरल वाष्पीकरण द्वारा माइक्रोस्कोप के संदूषण को कम करने के लिए नमूना धारक को बाहरी पंपिंग स्टेशन में पंप करें।

3. तरल-इलेक्ट्रॉन खुराक प्रभाव में जीवाणु कोशिकाओं के सीटू टीईएम अवलोकन

  1. माइक्रोस्कोप में नमूना डालें।
  2. एक उपयुक्त अवलोकन क्षेत्र खोजने के लिए कम आवर्धन मोड में अवलोकन शुरू करें।
    नोट: इलेक्ट्रॉन बीम प्रकीर्णन के कारण गहरे क्षेत्रों के तरल होने की सबसे अधिक संभावना है।
    1. अवलोकन के दौरान, इलेक्ट्रॉन खुराक को यथासंभव कम रखें। एक्सपोज़र समय का विस्तार करें (150 केवी के तेज वोल्टेज और 5,000x के आवर्धन के लिए 2 सेकंड तक)। बॉटम-माउंट कैमरे के लिए 5,000x का आवर्धन (दृश्य का अनुमानित क्षेत्र 10 μm है) ~ 1 μm के व्यास के साथ बैक्टीरिया की छवि बनाने के लिए पर्याप्त है।
      नोट: कभी-कभी, तरल को अलग करना आसान नहीं होता है, इसलिए, टिप्पणियों की शुरुआत में, इलेक्ट्रॉन बीम पर ध्यान केंद्रित करना सहायक होता है जहां यह तरल होने की संभावना है। तरल को एक केंद्रित इलेक्ट्रॉन बीम पर चलना चाहिए, और बुलबुले दिखाई देंगे। इस सत्यापन के बाद, आगे के अवलोकनों के लिए एक और क्षेत्र खोजना आवश्यक है।
  3. विस्तारित एक्सपोजर समय के साथ उचित आवर्धन पर तरल से घिरी कोशिकाओं का पता लगाएं और पहली छवि को तुरंत कैप्चर करें। इलेक्ट्रॉन खुराक को स्थिर रखें और परिवर्तनों का निरीक्षण करने के लिए हर 30 सेकंड में छवियों को इकट्ठा करें।
  4. छवियों की सावधानीपूर्वक जांच करें और कुल इलेक्ट्रॉन खुराक27 की गणना करें जो कोशिकाओं में पहले दृश्यमान परिवर्तनों से मेल खाती है।

4. बैक्टीरियल कोशिकाओं और फोटोसेंसिटाइज़र के बीच प्रकाश-प्रेरित प्रक्रियाओं के सीटू टीईएम अवलोकन

  1. प्रयोग शुरू करने से पहले, वर्तमान मान को समायोजित करके लेजर प्रकाश तीव्रता सेट करें। फोटोसेंसिटाइज़र के अवशोषण स्पेक्ट्रम के अनुसार उपयुक्त तरंग दैर्ध्य चुनें। पिछले अंशांकन प्लॉट (चरण 1.4.) के अनुसार, सबसे कम प्रकाश तीव्रता के अनुरूप वर्तमान मान चुनें।
    नोट: इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली प्रकाश तरंग दैर्ध्य 660 एनएम थी।
  2. माइक्रोस्कोप में नमूना डालें और चरण 3.2 के बाद अवलोकन क्षेत्र खोजें। पिछले खंड में।
  3. नमूने की रोशनी शुरू करने से पहले सेल की पहली छवि को कैप्चर करें और इलेक्ट्रॉन विकिरण के प्रभाव से बचने के लिए इलेक्ट्रॉन बीम को बंद करने के लिए बीम ब्लैंकर का उपयोग करें।
  4. लेजर चालू करें। एक छोटे रोशनी समय (यहां 30 सेकंड) के साथ शुरू करें क्योंकि लेजर प्रकाश में अपेक्षाकृत उच्च तीव्रता होती है। उस समय के बाद, प्रकाश स्रोत को बंद कर दें।
  5. बीम ब्लैंकर को बंद करें और छवि को तुरंत कैप्चर करें। यदि संभव हो, तो छवि लेने के लिए आवश्यक समय के लिए केवल नमूने को उजागर करने के लिए एक स्वचालित एल्गोरिथ्म का उपयोग करें। इमेजिंग के लिए उपयोग की जाने वाली इलेक्ट्रॉन खुराक27 की गणना करने के लिए इलेक्ट्रॉन विकिरण समय को ध्यान से मापें।
  6. चरण 4.4 दोहराएँ। और चरण 4.5। अपेक्षित प्रकाश रोशनी समय प्राप्त करने के लिए।

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Representative Results

प्रयोगात्मक सेटअप को उच्च रिज़ॉल्यूशन वाले तरल में होने वाली प्रकाश-प्रेरित प्रक्रियाओं का निरीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया गया था। छवियों के प्रतिस्पर्धी विश्लेषण ने हमें फोटोकैमिकल प्रतिक्रिया से संबंधित परिवर्तनों से इलेक्ट्रॉन बीम के कारण होने वाले नुकसान को अलग करने की अनुमति दी। संवेदनशील नमूने पर इलेक्ट्रॉन बीम का प्रभाव (इस मामले में, तरल के साथ समझाया गया कोशिकाएं) विकिरणित क्षेत्र में दिखाई दे रहा था क्योंकि इलेक्ट्रॉन समान रूप से इसके माध्यम से प्रवेश करते थे। बेशक, प्रभाव इलेक्ट्रॉन खुराक पर निर्भर करता है, इसलिए नमूना आकृति विज्ञान में अधिक महत्वपूर्ण परिवर्तन अधिक केंद्रित बीम के लिए तेजी से देखे जा सकते हैं। इस गंभीर क्षति की तुलना में, फोटोडायनामिक निष्क्रियता के वास्तविक विनाशकारी प्रभाव कोशिकाओं के विशिष्ट भागों में केवल रोशन फोटोसेंसिटाइज़र से घिरे क्षेत्रों में हुए।

बैक्टीरिया इमेजिंग के उदाहरण में, और साहित्य के अनुसार, 30 ई-/एनएम2 की खुराक बैक्टीरिया17 के लिए घातक दहलीज मूल्य प्रतीत होती है, जो लेखकों के पिछले अध्ययनों 6,25 में अत्यधिक अधिक थी। हालांकि, 6000 e−/nm2 की इलेक्ट्रॉन खुराक तक पहुंचने से पहले सेल में दिखाई देने वाले परिवर्तनों पर ध्यान नहीं दिया गया था। परिणामों ने 1 मिनट के बाद फोटोसेंसिटाइज़र के प्रकाश विकिरण द्वारा उत्पन्न प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के कारण कोशिका की बाहरी परत का उल्लेखनीय क्षरण दिखाया (चित्रा 1)। आगे प्रकाश रोशनी ने परिवर्तनों को अधिक दृश्यमान बना दिया (चित्रा 1 डी, जी)।

कार्बन सब्सट्रेट्स के बीच कोशिकाओं का एनकैप्सुलेशन कम से कम 1 घंटे के लिए निरंतर अवलोकन करने के लिए पर्याप्त था। पर्याप्त तरल के साथ उचित अवलोकन धब्बे आसानी से कम आवर्धन पर पाए जा सकते हैं, क्योंकि ये क्षेत्र गहरे और धुंधले दिखाई देते हैं ( चित्रा 2 ए में फ्रेम द्वारा इंगित)। तरल से ढके बैक्टीरिया सूखे लोगों की तुलना में कम दिखाई देते हैं, लेकिन फिर भी अलग किया जा सकता है (चित्रा 2 बी)। इमेजिंग के दौरान तरल सीमा को देखना उपयोगी है, और इसकी गति का आसानी से पता लगाया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि चुना गया क्षेत्र अनुपयुक्त और अस्थिर हो सकता है (चित्रा 3)। अवलोकनों के दौरान एक और मुद्दा पानी का वाष्पीकरण और समाधान की वर्षा है, जो नमूने के यादृच्छिक क्षेत्रों में हो सकता है, जिसमें बैक्टीरिया के आसपास के क्षेत्र भी शामिल हैं (चित्रा 3 बी, सी)।

Figure 1
चित्र 1: बैक्टीरिया के फोटोडायनामिक उपचार के अनुकरणीय परिणाम। (ए) बैक्टीरिया कोशिकाओं और मेथिलीन नीले रंग वाले तरल सेल की योजना। (बी) प्रकाश रोशनी से पहले की कोशिका। (C) 1 मिनट के लिए रोशनी के बाद की कोशिका। (D) 10 मिनट के लिए रोशनी के बाद की कोशिका। (E-G) (B-D) से आवर्धित क्षेत्र। इलेक्ट्रॉन खुराक क्रमशः 1600 e−/nm2, 2500 e−/nm2, और 6000 e−/nm2 के बराबर थी। यह आंकड़ा जैक एट अल.25 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्र 2: दो कार्बन फिल्मों के बीच मेथिलीन नीले रंग के साथ एस. ऑरियस की टीईएम छवियां। (ए) कम आवर्धन छवि दोनों क्षेत्रों को उच्च मात्रा में तरल (पीले फ्रेम द्वारा इंगित) और सूखे धब्बों के साथ प्रस्तुत करती है। इस आवर्धन पर नमूने की एक त्वरित जांच इस बात की जानकारी देती है कि एनकैप्सुलेशन सफल था या नहीं। (B) आवर्धित क्षेत्र में तरल सीमा स्पष्ट रूप से दिखाई देती है, और फोटोसेंसिटाइज़र से ढके बैक्टीरिया को अलग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: इमेजिंग के दौरान होने वाले प्रतिकूल प्रभावों की टीईएम छवियां। (ए) शुरुआत में, सेल समान रूप से तरल से घिरा हुआ था, जो अधिकांश अवलोकन क्षेत्र को कवर करता था। (बी) निरंतर इलेक्ट्रॉन बीम विकिरण के आधार पर, तरल की गति और वाष्पीकरण और समाधान से वर्षा की शुरुआत देखी जा सकती है। (सी) प्रक्रियाओं की निरंतरता से फोटोसेंसिटाइज़र की अपरिवर्तनीय गति, फोमिंग और विघटन होता है, जिससे आगे के अवलोकन असंभव हो जाते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्र 4: प्रतिकूल प्रभाव गलत निष्कर्ष की ओर ले जाते हैं। (A) क्रिस्टलीकृत तरल। (बी) संदूषण सेल पर बस गया। (सी) इलेक्ट्रॉन बीम के कारण फोमिंग। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रकाशक की स्थापना और कमीशनिंग के लिए बुनियादी सेवा ज्ञान की आवश्यकता होती है और माइक्रोस्कोप को नुकसान पहुंचा सकता है। प्रकाश को माइक्रोस्कोप में पेश करने का सबसे सरल तरीका उद्देश्य लेंस के शीर्ष से ऑप्टिकल फाइबर को जोड़ना है, जहां आमतौर पर टीईएम विक्षेपण कॉइल और अतिरिक्त डिटेक्टरों के लिए जगह होती है। पुराने टॉप-एंट्री उपकरणों से अधिक खाली स्थान की भी उम्मीद की जा सकती है, जहां एक ही स्थान पर नमूना वैक्यूम लॉक और नमूना स्थापना तंत्र होता है। इस कॉन्फ़िगरेशन को पिछली रिपोर्ट25 में व्यापक रूप से वर्णित किया गया है, जिसमें एक अनुकरणीय प्रकाशक डिजाइन शामिल है। यदि माइक्रोस्कोप का इंटीरियर उद्देश्य लेंस के ऊपर ऑप्टिकल फाइबर की स्थापना की अनुमति नहीं देता है, तो इलुमिनेटर को साइड32 से ऑब्जेक्टिव लेंस पोलपीस के अंदर स्थापित किया जा सकता है। अन्य समाधान एक समर्पित नमूना धारक4 या कैथोडोलुमिनसेंटअवलोकनों के लिए धारक के रिवर्स उपयोग का उपयोग करते हैं।

सामान्य तौर पर, टीईएम के लिए तरल नमूने की तैयारी जटिल है और अनुभव और मैनुअल कौशल की आवश्यकता होती है। तरल सेल तैयार करने में महत्वपूर्ण कदम चरण 2.6 है। प्रोटोकॉल का पालन करें। तरल के वाष्पीकरण से बचने के लिए दूसरे ग्रिड को जल्दी से रखना महत्वपूर्ण है। यहां प्रस्तुत विधि सरल है और असामान्य सामग्री की आवश्यकता नहीं है; हालांकि, यह सभी तरल पदार्थों के अनुरूप नहीं हो सकता है। कुछ मामलों में, इसकी हाइड्रोफिलिसिटी बढ़ाने के लिए प्लाज्मा के साथ सब्सट्रेट को साफ करना फायदेमंद होता है। तरल नमूनों के लिए, विशेष रूप से पानी के समाधान, जिनमें कोई कण और / या कोशिकाएं नहीं होती हैं जो कार्बन फिल्मों के बीच एक स्पेसर के रूप में काम कर सकती हैं, एनकैप्सुलेशन असफल हो सकता है क्योंकि सभी तरल सपाट सतहों के बीच से बह सकते हैं। एक छेदी सब्सट्रेट का उपयोग करके तैयार ग्राफीन तरल सेल का उपयोग करना, जो तरल के लिए छोटे "जेब" बनाता है, अधिक उपयुक्त हो सकताहै।

तरल में किए गए टीईएम अवलोकन नमूना तैयार करने से संबंधित कुछ कारकों और इलेक्ट्रॉन बीम के कारण प्रतिकूल प्रभावों से परेशान हो सकते हैं। पहले में सब्सट्रेट्स की टुकड़ी और तरल की गति शामिल है, जिसके बाद अक्सर कार्बन फिल्म का टूटना होता है, जो क्षेत्र में उच्च तरल मात्रा और / या इलेक्ट्रॉन विकिरण पर होता है। चरण 2.5 में तरल मात्रा को कम करके इससे बचा जा सकता है। प्रोटोकॉल का पालन करें।

अत्यधिक ऊर्जावान इलेक्ट्रॉनों के साथ विकिरण ऊर्जा हस्तांतरण की ओर जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हीटिंग या रेडियोलिसिस होता है। विकिरण के साथ बातचीत के बाद, पानी कणों (एच · और ओएच ·), एच2, और सॉल्वेटेड इलेक्ट्रॉनों में विघटित हो जाता है। ये प्रजातियां आगे की प्रतिक्रियाओं में भाग लेती हैं, इस प्रकार विभिन्न उत्पादों को उत्पन्न करती हैं और नमूना34 को नुकसान पहुंचाती हैं। इसलिए, अवलोकनों (चरण 3.2.) के दौरान इलेक्ट्रॉन खुराक को कम रखना बहुत महत्वपूर्ण है, खासकर कोशिकाओं जैसे संवेदनशील नमूनों के लिए। इलेक्ट्रॉन बीम के कारण होने वाले अन्य प्रभाव समाधान (चित्रा 4 ए) से वर्षा और तरल का फोमिंग (चित्रा 4 सी) हैं। इलेक्ट्रॉन की खुराक को कम करने से इन दो नकारात्मक प्रभावों से बचने में मदद मिलती है, लेकिन कभी-कभी उन्हें खत्म करना संभव नहीं होता है। समाधान में कुछ विकिरण-संवेदनशील संदूषण भी हो सकता है, जो सेल (चित्रा 4 बी) पर बसता है और इलेक्ट्रॉन बीम प्रभाव पर बदलता है। यह प्रतिकूल है क्योंकि अशुद्धता को सेल के हिस्से के रूप में लिया जा सकता है, जो प्रकाश विकिरण पर क्षतिग्रस्त हो जाता है, जिससे गलत निष्कर्ष निकलते हैं। विश्वसनीय छवियों को प्राप्त करने का सबसे अच्छा तरीका एक अदूषित क्षेत्र ढूंढना और इलेक्ट्रॉन खुराक को यथासंभव कम रखना है।

फोटोरिएक्शंस के विश्वसनीय सीटू टीईएम अध्ययनों के लिए इलेक्ट्रॉन बीम के कारण प्रकाश द्वारा प्रेरित प्रक्रियाओं के बीच एक अच्छी तुलना की आवश्यकता होती है। चरण 3.2 में वर्णित इलेक्ट्रॉन खुराक को कम करने के अलावा, प्रकाश रोशनी के समय के लिए इलेक्ट्रॉन स्रोत को बंद करना सहायक होता है ताकि अबाधित परिणाम देखे जा सकें, जैसा कि चरण 4.3 में जोर दिया गया है। प्रोटोकॉल का पालन करें।

वर्तमान प्रोटोकॉल का उपयोग प्रकाश-प्रेरित प्रतिक्रियाओं (विशेष रूप से तरल में) का निरीक्षण करने के लिए किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, धातु नैनोक्लस्टर्स 2 पर प्रकाश, प्रकाश-प्रेरित उत्प्रेरणप्रक्रियाएं 1, और जैविक नमूनों पर प्रकाश का प्रभाव (उदाहरण के लिए, फोटोसेंसिटाइज़र, क्लोरोप्लास्ट वाली कोशिकाएं)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

अनुसंधान को मिनियातुरा अनुदान (2019/03/X/NZ3/02100, राष्ट्रीय विज्ञान केंद्र, पोलैंड) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Carbon film on 200 mesh copper grid Agar Scientific AGS160 The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation
Crossover Tweezers Dumont N5 The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation
Photodiode Power Sensor ThorLabs S130C The sensor used for light intensity measurement
Polyimide-Coated Multimode Fiber Thorlabs FG400UEP Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388
Transmission Electron Microscope Hitachi H-800 Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification
Tuneable Diode Laser CNI MRL-III-660D The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum

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References

  1. Vadai, M., Angell, D. K., Hayee, F., Sytwu, K., Dionne, J. A. In-situ observation of plasmon-controlled photocatalytic dehydrogenation of individual palladium nanoparticles. Nature Communications. 9 (1), 1-8 (2018).
  2. Weng, B., et al. Visualizing light-induced dynamic structural transformations of Au clusters-based photocatalyst via in situ TEM. Nano Research. 12 (1), 1-5 (2021).
  3. Cao, K., et al. In situ TEM investigation on ultrafast reversible lithiation and delithiation cycling of Sn@C yolk-shell nanoparticles as anodes for lithium ion batteries. Nano Energy. 40, 187-194 (2017).
  4. Cavalca, F., et al. In situ transmission electron microscopy of light-induced photocatalytic reactions. Nanotechnology. 23 (7), 075705 (2012).
  5. Tung, C. -W., et al. Light-induced activation of adaptive junction for efficient solar-driven oxygen evolution: In situ unraveling the interfacial metal-silicon junction. Advanced Energy Materials. 9 (31), 1901308 (2019).
  6. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Matczyszyn, K. Light-induced in situ transmission electron microscopy: Novel approach for antimicrobial photodynamic therapy imaging. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 35, 102463 (2021).
  7. Shindo, D., et al. Development of a multifunctional TEM specimen holder equipped with a piezodriving probe and a laser irradiation port. Journal of Electron Microscopy. 58 (4), 245-249 (2009).
  8. Zhang, C., et al. Photosensing performance of branched CdS/ZnO heterostructures as revealed by in situ TEM and photodetector tests. Nanoscale. 6 (14), 8084-8090 (2014).
  9. Zhang, C., et al. Statistically analyzed photoresponse of elastically bent CdS nanowires probed by light-compatible in situ high-resolution TEM. Nano Letters. 16 (10), 6008-6013 (2016).
  10. Yoshida, K., Yamasaki, J., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy observation of photodecomposition process of poly-hydrocarbons on catalytic TiO2 films. Applied Physics Letters. 84 (14), 2542-2544 (2004).
  11. Yoshida, K., Nozaki, T., Hirayama, T., Tanaka, N. In situ high-resolution transmission electron microscopy of photocatalytic reactions by excited electrons in ionic liquid. Journal of Electron Microscopy. 56 (5), 177-180 (2007).
  12. Textor, M., De Jonge, N. Strategies for preparing graphene liquid cells for transmission electron microscopy. Nano Letters. 18 (6), 3313-3321 (2018).
  13. Ring, E. A., De Jonge, N. Microfluidic system for transmission electron microscopy. Microscopy and Microanalysis. 16 (5), 622-629 (2010).
  14. Inayoshi, Y., Minoda, H. A carbon sandwich environmental cell for wet specimens. Journal of Electron Microscopy. 62 (6), 623-628 (2013).
  15. Koo, K., Dae, K. S., Hahn, Y. K., Yuk, J. M. Live cell electron microscopy using graphene veils. Nano Letters. 20 (6), 4708-4713 (2020).
  16. De Jonge, N., Peckys, D. B. Live cell electron microscopy is probably impossible. ACS Nano. 10 (10), 9061-9063 (2016).
  17. Kennedy, E., Nelson, E. M., Damiano, J., Timp, G. Gene expression in electron-beam-irradiated bacteria in reply to "live cell electron microscopy is probably impossible.". ACS Nano. 11 (1), 3-7 (2017).
  18. Alves, E., et al. An insight on bacterial cellular targets of photodynamic inactivation. Future Medicinal Chemistry. 6 (2), 141-164 (2014).
  19. Cieplik, F., et al. Antimicrobial photodynamic therapy-What we know and what we don't. Critical Reviews in Microbiology. 44 (5), 571-589 (2018).
  20. Huang, L., et al. Type I and Type II mechanisms of antimicrobial photodynamic therapy: An in vitro study on gram-negative and gram-positive bacteria. Lasers in Surgery and Medicine. 44 (6), 490-499 (2012).
  21. Caminos, D. A., Spesia, M. B., Pons, P., Durantini, E. N. Mechanisms of Escherichia coli photodynamic inactivation by an amphiphilic tricationic porphyrin and 5,10,15,20-tetra(4-N,N,N-trimethylammoniumphenyl) porphyrin. Photochemical and Photobiological Sciences. 7 (9), 1071-1078 (2008).
  22. Chu, J. C. H., Chin, M. L., Wong, C. T. T., Hui, M., Lo, P. C., Ng, D. K. P. One-pot synthesis of a cyclic antimicrobial peptide-conjugated phthalocyanine for synergistic chemo-photodynamic killing of multidrug-resistant bacteria. Advanced Therapeutics. 4 (3), 1-10 (2021).
  23. Rogers, S., Honma, K., Mang, T. S. Confocal fluorescence imaging to evaluate the effect of antimicrobial photodynamic therapy depth on P. gingivalis and T. denticola biofilms. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 23, 18-24 (2018).
  24. Maldonado-Carmona, N., et al. Porphyrin-loaded lignin nanoparticles against bacteria: A photodynamic antimicrobial chemotherapy application. Frontiers in Microbiology. 11, 606185 (2020).
  25. Żak, A. M., Kaczmarczyk, O., Piksa, M., Grzęda, J., Matczyszyn, K. Fiber-optic sample illuminator design for the observation of light induced phenomena with transmission electron microscopy in situ: Antimicrobial photodynamic therapy. Ultramicroscopy. 230, 113388 (2021).
  26. Dinh, V. P., et al. Insight into the adsorption mechanisms of methylene blue and chromium(III) from aqueous solution onto pomelo fruit peel. RSC Advances. 9 (44), 25847-25860 (2019).
  27. Żak, A. Guide to controlling the electron dose to improve low-dose imaging of sensitive samples. Micron. 145, 103058 (2021).
  28. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallographica Section D. 74 (6), 560-571 (2018).
  29. Scarff, C. A., Fuller, M. J. G., Thompson, R. F., Iadaza, M. G. Variations on negative stain electron microscopy methods: Tools for tackling challenging systems. Journal of Visualized Experiments. (132), (2018).
  30. Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: From grid preparation to image acquisition. Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).
  31. Rames, M., Yu, Y., Ren, G. Optimized negative staining: A high-throughput protocol for examining small and asymmetric protein structure by electron microscopy. Journal of Visualized Experiments. (90), e51087 (2014).
  32. Miller, B. K., Crozier, P. A. System for in situ UV-visible illumination of environmental transmission electron microscopy samples. Microscopy and Microanalysis. 19 (2), 461-469 (2013).
  33. Yuk, J. M., et al. High-resolution EM of colloidal nanocrystal growth using graphene liquid cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
  34. Schneider, N. M., et al. Electron-Water interactions and implications for liquid cell electron microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).

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इंजीनियरिंग अंक 185
तरल-नरम पदार्थ इंटरैक्शन के अवलोकन के लिए सीटू ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी <em>में</em> प्रकाश-प्रेरित
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