Summary
Il presente protocollo descrive le modifiche al microscopio elettronico a trasmissione (TEM) con un sistema di illuminazione della luce, la fabbricazione di cellule liquide e osservazioni TEM in situ delle interazioni indotte dalla luce tra cellule batteriche e un fotosensibilizzatore. Vengono inoltre discussi i metodi di preparazione del campione, il danno al fascio di elettroni e l'imaging.
Abstract
L'attuale protocollo descrive le modifiche della configurazione del microscopio elettronico a trasmissione (TEM) per le osservazioni indotte dalla luce in situ . Una fibra ottica di vetro inserita nella colonna di elettroni sopra il polo dell'obiettivo e un laser, una sorgente luminosa regolabile, sono stati utilizzati per fabbricare il dispositivo. Dopo che l'illuminatore è stato calibrato utilizzando un sistema di misurazione esterno, consente di regolare l'intensità dell'illuminazione alle esigenze del processo osservato. Questo sistema di illuminazione è stato utilizzato per visualizzare fenomeni di terapia fotodinamica antimicrobica, attualmente oggetto di intense ricerche. Il campione è stato preparato individuando una sospensione di batteri su un substrato di carbonio, grafene o nitruro di silicio, tamponando la soluzione in eccesso, individuando la soluzione fotosensibilizzante, tamponando nuovamente il liquido in eccesso e quindi assemblando la cella liquida con un secondo substrato o film di grafene. Il processo dell'esperimento di imaging stesso include la scelta del posto giusto per l'osservazione con l'uso di un basso ingrandimento e una dose minima di elettroni, e quindi l'attivazione ciclica della sorgente luminosa per catturare immagini successive a intervalli specificati con la minima quantità di elettroni necessari. La dose elettronica di ciascuna esposizione e il tempo e l'intensità dell'illuminazione utilizzati devono essere accuratamente registrati a causa della complessità dei fenomeni osservati poiché, allo stesso tempo, il processo è guidato sia dalla luce che dall'elettrone. Dopo aver eseguito l'esperimento effettivo, devono essere fatte ulteriori osservazioni di controllo, in cui vengono utilizzate le stesse dosi di elettroni ma senza ulteriore influenza della luce e dosi più piccole di elettroni vengono utilizzate per dosi più elevate di luce. Ciò consente di distinguere gli effetti microstrutturali indotti dalla luce da quelli causati dagli elettroni sia nel campo della vita che nella scienza dei materiali.
Introduction
I fenomeni indotti dalla luce in alta risoluzione sono interessanti in molti campi come la nanoingegneria 1,2,3, la catalisi 4,5 e la biofotonica 6. Alcuni disegni originali che consentono tali esperimenti possono essere trovati in letteratura, comprese le modifiche dei supporti del campione 1,4,7,8,9 e la fibra ottica attaccata al microscopio 10,11.
La combinazione di illuminazione luminosa, ambiente liquido e microscopia elettronica a trasmissione (TEM) offre una grande opportunità per studi dettagliati e dinamici dei processi fotoindotti. Tuttavia, la condizione di alto vuoto all'interno del microscopio è piuttosto sfavorevole per molti liquidi, in particolare le soluzioni acquose. L'incapsulamento liquido, che lo protegge dall'ambiente, può essere ottenuto utilizzando alcune tecniche basate principalmente su substrati di grafene 12, nitruro di silicio13 o carbonio14. Oltre alla ricerca nella scienza dei materiali2, le cosiddette cellule liquide offrono la possibilità di condurre osservazioni microscopiche non convenzionali su campioni biologici vicini alle loro condizioni native15. Tali osservazioni sono estremamente impegnative, specialmente per i microrganismi viventi come le cellule batteriche. Il fascio di elettroni come radiazione ionizzante provoca danni irreversibili ai campioni idratati, quindi la dose di elettroni deve essere specificata16. Ciò è necessario per ridurre al minimo gli effetti sfavorevoli, controllare il danno ed evitare artefatti confusi. La dose massima ottimale di elettroni che consente l'osservazione delle cellule viventi è ancora un argomento discutibile16, ma la dose di 30 e−/nm2 sembra essere il valore soglia, almeno per i batteri17.
Alcuni dei soggetti di interesse per tali studi microscopici sono i processi durante la terapia fotodinamica antimicrobica (APDT)18. In breve, la terapia procede come segue. Le cellule batteriche sono circondate dal liquido fotosensibile chiamato fotosensibilizzatore. Quando l'illuminazione della luce viene fornita a una lunghezza d'onda specifica, le specie citotossiche reattive dell'ossigeno (ROS) vengono generate dal trasferimento di energia o carica dalle molecole fotosensibilizzatrici eccitate all'ossigeno naturalmente presente nella soluzione. Gli agenti patogeni esposti ai ROS vengono rapidamente inattivati con un'efficienza molto elevata, senza effetti collaterali19. La risposta alla terapia varia per microbi distinti - ad esempio, l'impatto dello stesso fotosensibilizzatore può essere molto diverso per i batteri Gram-positivi e Gram-negativi20. In generale, è stato stabilito che il bersaglio principale dei ROS sono le strutture esterne delle cellule, dove il danno provoca disturbi funzionali della membrana cellulare e, di conseguenza, porta alla morte dei batteri21,22. Tuttavia, anche il danno agli acidi nucleici e alle proteine può essere considerato una causa di inattivazione18, quindi non è ancora noto quali strutture cellulari siano i principali bersagli durante questo processo19. Una comprensione più profonda dei processi dannosi potrebbe aiutare a migliorare questa terapia definitiva. Rispetto ai metodi di microscopia ottica utilizzati nella ricerca APDT23, le tecniche TEM offrono maggiori possibilità di osservare il meccanismo APDT con risoluzione e ingrandimento più elevati24. TEM è già stato utilizzato con successo per l'osservazione cellulare durante la terapia in corso, che ci ha permesso di studiare il danno batterico Gram-positivo e descrivere i cambiamenti che si verificano all'interno della parete cellulare in dettaglio 6,25.
L'attuale protocollo presenta una configurazione sperimentale adatta per l'imaging ad alta risoluzione dell'inattivazione batterica indotta dalla luce utilizzando TEM, che richiede un adeguato sistema di illuminazione della luce, l'incapsulamento delle cellule con un liquido e un rigoroso controllo della dose di elettroni. Il batterio utilizzato per l'osservazione era Staphylococcus aureus e una soluzione di blu di metilene è stata utilizzata come fotosensibilizzante. La speciale configurazione di illuminazione della luce comprende un laser a semiconduttore sintonizzabile collegato direttamente alla colonna del microscopio utilizzando la fibra luminosa. Questo design fornisce un'irradiazione uniforme in tutto il campione a causa del posizionamento quasi parallelo della fibra ottica all'asse del microscopio. La luce monocromatica di alta intensità generata dal laser può quindi essere utilizzata per studiare vari effetti fotochimici. La luce utilizzata nell'esperimento aveva una lunghezza d'onda pari a 660 nm perché, nella regione visibile, il blu di metilene ha picchi di assorbimento a 613 nm e 664 nm26. Il protocollo per l'incapsulamento liquido si basa su substrati di carbonio, il che rende la procedura rapida e senza complicazioni. Infine, viene presentato un metodo per l'osservazione TEM in situ a basse dosi di cellule in liquido. Vengono discusse le difficoltà relative alla preparazione del campione, agli effetti della dose di elettroni sul campione sensibile e alla ragionevole interpretazione delle immagini.
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Protocol
1. Modifica del microscopio elettronico a trasmissione
- Modificare il microscopio elettronico a trasmissione collegando la fibra ottica (vedere Tabella dei materiali) alla colonna del microscopio nella parte superiore della lente dell'obiettivo. Lasciare alcuni centimetri di spazio tra la lente dell'obiettivo e la lente del condensatore, oltre a una fessura libera per gli accessori.
NOTA: È possibile utilizzare anche un portacampioni dedicato4 o un supporto per osservazioni catodoluminescenti in configurazione inversa1 . - Controllare il sistema per verificare la presenza di perdite utilizzando pompe per vuoto grezze. Se il sistema non mostra una perdita di vuoto, testare il sistema sotto un vuoto elevato.
- Verificare che l'azionamento del sistema per vuoto non si discosti dall'avvio standard del microscopio ventilato. In caso di problemi con l'esecuzione, il montaggio o la messa in servizio del modulo, contattare il personale di assistenza autorizzato o il produttore del dispositivo.
NOTA: L'illuminatore correttamente realizzato e montato non oscurerà il fascio di elettroni. Se il fascio si sposta successivamente durante il funzionamento del microscopio, la fibra ottica non conduttiva non sarà sufficientemente coperta da uno schermo metallico e accumulerà una carica elettrica. In questo caso, far scorrere la fibra ottica in profondità nella giacca conduttrice.
- Verificare che l'azionamento del sistema per vuoto non si discosti dall'avvio standard del microscopio ventilato. In caso di problemi con l'esecuzione, il montaggio o la messa in servizio del modulo, contattare il personale di assistenza autorizzato o il produttore del dispositivo.
- Misurare l'intensità della luce utilizzando il sensore di potenza del fotodiodo (vedere Tabella dei materiali). Se lo spazio tra i poli della lente dell'obiettivo non consente la misurazione all'interno del microscopio, misurare la geometria del campione e dell'illuminatore e riprodurre queste condizioni in una configurazione di misurazione esterna.
- Se il microscopio non è dotato di un sistema di misurazione della dose di elettroni, eseguire la calibrazione misurando la corrente del fascio con una coppa di Faraday (vedi Tabella dei materiali) e calcolando numericamente la densità degli elettroni che colpiscono il campione27.
2. Incapsulamento di batteri con il fotosensibilizzatore
- Posizionare due griglie TEM non trattate ricoperte di carbonio amorfo tra due pinzette incrociate rivolte verso l'alto verso il lato rivestito di carbonio. Tenere le griglie il più vicino possibile al bordo.
NOTA: Per alcune combinazioni di substrato, soluzione e campione, può essere utile utilizzare lo scarico di bagliore su una o entrambe le maglie per rimuovere le impurità di fabbrica e ottenere una superficie idrofila massima28. Utilizzando l'esempio dei batteri S. aureus e della soluzione di blu di metilene, è stato determinato che i risultati migliori e più riproducibili sono stati ottenuti su nuovo carbonio non trattato su griglie di rame senza ulteriore scarico di bagliore o pulizia al plasma6. - Mettere 4 μL di soluzione batterica su una delle griglie. La densità ottica del campione deve essere compresa tra 5 e 10.
NOTA: I batteri utilizzati nello studio sono stati purificati dalla coltura e dispersi nel tampone PBS. Si raccomanda vivamente di controllare la concentrazione di batteri nel campione fresco ogni volta che lo si utilizza, ad esempio, utilizzando metodi di colorazione negativa, seguendo i protocolli stabiliti disponibili 29,30,31. - Attendere 60 secondi e asciugare accuratamente il liquido con carta da filtro. Cerca di distribuire il liquido su tutta la superficie della griglia durante questo processo.
- Mettere 4 μL di fotosensibilizzatore sulla stessa griglia.
NOTA: Il blu di metilene ad una concentrazione di 2 μg/ml è stato utilizzato come fotosensibilizzatore per il presente studio. - Dopo 5 secondi, asciugare il liquido. Lasciare uno strato molto sottile di liquido sul substrato.
- Posizionare rapidamente la griglia asciutta sopra quella coperta di liquido.
- Spostare delicatamente la griglia superiore sul bordo della seconda e spremere i substrati ai bordi usando una pinzetta.
NOTA: in questa fase può fuoriuscire del liquido dal campione, il che significa che non è stato scaricato abbastanza. Tuttavia, ciò non significa necessariamente che la formazione della cellula liquida non avrà successo. - Ripetere attentamente la compressione.
NOTA: È più facile eseguire questo passaggio ruotando le pinzette di 90° in modo che si trovino perpendicolarmente al tavolo e che le punte di entrambe le pinzette rimangano alla stessa altezza, non a seconda della posizione di apertura / chiusura. - Lasciare la cella liquida tra le pinzette per 1 minuto.
- Inserire il campione nel supporto TEM subito dopo aver terminato la preparazione.
NOTA: La tensione della piastra / anello di montaggio del supporto aiuterà i substrati ad aderire e mantenere il liquido all'interno.- Se possibile, pompare il supporto del campione in una stazione di pompaggio esterna per ridurre la contaminazione del microscopio mediante evaporazione del liquido.
3. Osservazioni TEM in situ di cellule batteriche nell'effetto della dose di elettroni liquidi
- Inserire il campione nel microscopio.
- Avviare le osservazioni in modalità a basso ingrandimento per trovare un'area di osservazione adatta.
NOTA: le aree più scure hanno maggiori probabilità di essere liquide a causa della diffusione del fascio di elettroni.- Durante le osservazioni, mantenere la dose di elettroni il più bassa possibile. Espandere il tempo di esposizione (fino a 2 s per una tensione accelerata di 150 kV e un ingrandimento di 5.000x). L'ingrandimento di 5.000x per la fotocamera montata in basso (il campo visivo approssimativo è di 10 μm) è sufficiente per visualizzare batteri con un diametro di ~ 1 μm.
NOTA: A volte, non è facile distinguere il liquido, quindi, all'inizio delle osservazioni, è utile focalizzare il fascio di elettroni dove è probabile che sia liquido. Il liquido dovrebbe muoversi su un fascio di elettroni focalizzato e appariranno le bolle. Dopo questa verifica, è necessario trovare un'altra area per ulteriori osservazioni.
- Durante le osservazioni, mantenere la dose di elettroni il più bassa possibile. Espandere il tempo di esposizione (fino a 2 s per una tensione accelerata di 150 kV e un ingrandimento di 5.000x). L'ingrandimento di 5.000x per la fotocamera montata in basso (il campo visivo approssimativo è di 10 μm) è sufficiente per visualizzare batteri con un diametro di ~ 1 μm.
- Trova le celle circondate da liquido all'ingrandimento appropriato con un tempo di esposizione prolungato e cattura immediatamente la prima immagine. Mantenere costante la dose di elettroni e raccogliere immagini ogni 30 s per osservare i cambiamenti.
- Esaminare attentamente le immagini e calcolare la dose totale di elettroni27 che corrisponde ai primi cambiamenti visibili nelle cellule.
4. Osservazioni TEM in situ di processi indotti dalla luce tra cellule batteriche e fotosensibilizzatore
- Prima di iniziare l'esperimento, impostare l'intensità della luce laser regolando il valore corrente. Scegliere la lunghezza d'onda appropriata in base allo spettro di assorbimento del fotosensibilizzatore. In base al grafico di calibrazione precedente (passaggio 1.4.), scegliere il valore corrente corrispondente all'intensità luminosa più bassa.
NOTA: La lunghezza d'onda della luce utilizzata in questo studio era di 660 nm. - Inserire il campione nel microscopio e trovare l'area di osservazione seguendo il punto 3.2. nella sezione precedente.
- Acquisire la prima immagine della cella prima di iniziare l'illuminazione del campione e utilizzare il beam blanker per spegnere il fascio di elettroni per evitare gli effetti dell'irradiazione elettronica.
- Accendi il laser. Inizia con un breve tempo di illuminazione (qui 30 s) poiché la luce laser ha un'intensità relativamente elevata. Dopo quel tempo, spegnere la fonte di luce.
- Spegnere il beam blanker e acquisire immediatamente l'immagine. Se possibile, utilizzare un algoritmo automatico per esporre il campione solo per il tempo necessario per l'acquisizione dell'immagine. Misurare attentamente il tempo di irradiazione elettronica per calcolare la dose di elettroni27 utilizzata per l'imaging.
- Ripetere il passaggio 4.4. e il passaggio 4.5. per ottenere il tempo di illuminazione della luce previsto.
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Representative Results
La configurazione sperimentale è stata progettata per osservare i processi indotti dalla luce che si verificano in un liquido ad alta risoluzione. L'analisi competitiva delle immagini ha permesso di distinguere i danni causati dal fascio di elettroni dai cambiamenti legati alla reazione fotochimica. L'effetto del fascio di elettroni sul campione sensibile (in questo caso, le cellule incapsulate con liquido) era visibile in tutta l'area irradiata mentre gli elettroni penetravano uniformemente attraverso di essa. Naturalmente, l'effetto dipende dalla dose di elettroni, quindi cambiamenti più significativi nella morfologia del campione possono essere osservati più velocemente per un fascio più focalizzato. Rispetto a questo grave danno, gli effettivi effetti distruttivi dell'inattivazione fotodinamica si sono verificati in parti specifiche delle cellule solo nelle aree circondate dal fotosensibilizzatore illuminato.
Nell'esempio dell'imaging dei batteri, e secondo la letteratura, la dose di 30 e−/nm2 sembra essere il valore soglia letale per i batteri17, che è stato ampiamente superato negli studi precedenti degli autori 6,25. Tuttavia, i cambiamenti visibili nella cellula non sono stati notati prima di raggiungere la dose di elettroni di 6000 e−/nm2. I risultati hanno mostrato una notevole degradazione dello strato esterno della cellula causata dalle specie reattive dell'ossigeno generate dall'irradiazione luminosa del fotosensibilizzatore dopo 1 minuto (Figura 1). Un'ulteriore illuminazione della luce ha reso i cambiamenti più visibili (Figura 1D,G).
L'incapsulamento delle cellule tra i substrati di carbonio è stato sufficiente per eseguire osservazioni costanti per almeno 1 ora. Punti di osservazione appropriati con abbastanza liquido possono essere facilmente trovati a basso ingrandimento, poiché queste aree appaiono più scure e sfocate (indicate dai fotogrammi in Figura 2A). I batteri ricoperti di liquido sono meno visibili di quelli secchi, ma possono ancora essere distinti (Figura 2B). È utile osservare il confine del liquido durante l'imaging e il suo movimento può essere facilmente rilevato, il che implica che l'area scelta potrebbe essere inadatta e instabile (Figura 3). Un altro problema durante le osservazioni è l'evaporazione dell'acqua e la precipitazione della soluzione, che può verificarsi in aree casuali del campione, comprese le aree circostanti i batteri (Figura 3B, C).
Figura 1: Risultati esemplari del trattamento fotodinamico dei batteri. (A) Lo schema della cellula liquida contenente cellule batteriche e blu di metilene. (B) La cella prima dell'illuminazione della luce. (C) La cella dopo l'illuminazione per 1 min. (D) La cella dopo l'illuminazione per 10 min. (E-G) Le aree ingrandite da (B-D). La dose di elettroni era pari a 1600 e−/nm 2, 2500 e−/nm 2 e 6000 e−/nm 2, rispettivamente. La figura è riprodotta da Żak et al.25. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Immagini TEM di S. aureus incapsulate con blu di metilene tra due pellicole di carbonio . (A) L'immagine a basso ingrandimento presenta sia le aree con un'elevata quantità di liquido (indicata dai fotogrammi gialli) che macchie secche. Un rapido esame del campione a questo ingrandimento fornisce informazioni sul successo o meno dell'incapsulamento. (B) Il bordo del liquido è chiaramente visibile nell'area ingrandita e si possono distinguere i batteri coperti dal fotosensibilizzatore. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Immagini TEM degli effetti sfavorevoli che possono verificarsi durante l'imaging . (A) All'inizio, la cellula era uniformemente circondata dal liquido, che copriva la maggior parte dell'area di osservazione. (B) Sulla base dell'irradiazione costante del fascio di elettroni, si può notare il movimento e l'evaporazione del liquido e l'inizio della precipitazione dalla soluzione. (C) La continuazione dei processi porta a movimenti irreversibili, formazione di schiuma e disintegrazione del fotosensibilizzatore, rendendo impossibili ulteriori osservazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Gli effetti sfavorevoli che portano a conclusioni errate . (A) Il liquido cristallizzato. (B) La contaminazione si è depositata sulla cellula. (C) Schiuma causata dal fascio di elettroni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
L'installazione e la messa in servizio dell'illuminatore richiedono conoscenze di base e possono danneggiare il microscopio. Il modo più semplice per introdurre la luce al microscopio è collegare la fibra ottica dalla parte superiore della lente dell'obiettivo, dove di solito c'è spazio per le bobine di deflessione TEM e rilevatori aggiuntivi. Ci si può aspettare più spazio libero anche dai vecchi dispositivi top-entry, dove la stessa posizione ospita il blocco a vuoto del campione e il meccanismo di installazione del campione. Questa configurazione è ampiamente descritta in un precedente rapporto25, che contiene un design esemplare dell'illuminatore. Se l'interno del microscopio non consente l'installazione della fibra ottica sopra la lente dell'obiettivo, l'illuminatore può essere installato all'interno del polo della lente dell'obiettivo dal lato32. Altre soluzioni presuppongono l'utilizzo di un portacampioni dedicato4 o l'uso inverso del supporto per osservazioni catodoluminescenti1.
In generale, la preparazione di campioni liquidi per TEM è complicata e richiede esperienza e manualità. La fase critica nella preparazione delle cellule liquide è la fase 2.6. del protocollo. È importante posizionare rapidamente la seconda griglia per evitare l'evaporazione del liquido. Il metodo qui presentato è semplice e non richiede materiali non comuni; Tuttavia, potrebbe non essere adatto a tutti i liquidi. In alcuni casi, è utile pulire il substrato con plasma per aumentarne l'idrofilia. Per i campioni liquidi, in particolare le soluzioni acquose, che non contengono particelle e/o celle che potrebbero fungere da distanziatore tra i film di carbonio, l'incapsulamento potrebbe non avere successo poiché tutto il liquido potrebbe fuoriuscire tra le superfici piane. L'uso di una cella liquida di grafene preparata utilizzando un substrato holey, che crea piccole "tasche" per liquido, potrebbe essere più adatto33.
Le osservazioni TEM eseguite in liquido possono essere disturbate da alcuni fattori legati alla preparazione del campione e dagli effetti sfavorevoli causati dal fascio di elettroni. Il primo comprende il distacco dei substrati e il movimento del liquido, spesso seguito dalla rottura del film di carbonio, che avviene per elevati volumi di liquido nell'area e/o per irraggiamento di elettroni. Questo può essere evitato riducendo al minimo il volume del liquido nel passaggio 2.5. del protocollo.
L'irradiazione con elettroni altamente energetici porta al trasferimento di energia, con conseguente riscaldamento o radiolisi. Dopo l'interazione con la radiazione, l'acqua si decompone in radicali (H· e OH·), H2 ed elettroni solvatati. Queste specie partecipano a ulteriori reazioni, generando così prodotti diversi e causando danni al campione34. Pertanto, è molto importante mantenere bassa la dose di elettroni durante le osservazioni (fase 3.2.), specialmente per campioni sensibili come le cellule. Altri effetti causati dal fascio di elettroni sono la precipitazione dalla soluzione (Figura 4A) e la formazione di schiuma del liquido (Figura 4C). Abbassare la dose di elettroni aiuta ad evitare questi due effetti negativi, ma a volte non è possibile eliminarli. Ci può anche essere una certa contaminazione sensibile alle radiazioni nella soluzione, che si deposita sulla cellula (Figura 4B) e cambia sull'influenza del fascio di elettroni. Questo è sfavorevole in quanto l'impurità potrebbe essere presa come parte della cellula, che viene danneggiata dall'irradiazione luminosa, portando a conclusioni errate. Il modo migliore per ottenere immagini affidabili è trovare un'area incontaminata e mantenere la dose di elettroni il più bassa possibile.
Studi TEM affidabili in situ di fotoreazioni richiedono un buon confronto tra i processi indotti dalla luce con quelli causati dal fascio di elettroni. Fatta eccezione per la riduzione della dose di elettroni descritta al punto 3.2., è utile spegnere la sorgente di elettroni per il tempo di illuminazione della luce in modo da poter osservare i risultati indisturbati, come sottolineato al punto 4.3. del protocollo.
Il presente protocollo può essere utilizzato per osservare reazioni indotte dalla luce (specialmente in liquido), ad esempio, luce su nanocluster metallici2, processi di catalisi indotti dalla luce1 e l'influenza della luce su campioni biologici (ad esempio, cellule con fotosensibilizzatore, cloroplasti).
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
La ricerca è stata sostenuta dalla sovvenzione Miniatura (2019/03/X/NZ3/02100, National Science Center, Polonia).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Carbon film on 200 mesh copper grid | Agar Scientific | AGS160 | The standard TEM grids for observations and liquid cell preparation |
| Crossover Tweezers | Dumont | N5 | The tweezers are neecesarry for liquid cell preparation |
| Photodiode Power Sensor | ThorLabs | S130C | The sensor used for light intensity measurement |
| Polyimide-Coated Multimode Fiber | Thorlabs | FG400UEP | Must be built into the microscope using the on-site built adapter, according to the 10.1016/j.ultramic.2021.113388 |
| Transmission Electron Microscope | Hitachi | H-800 | Can be replaced with any side-entry microscope, available for modification |
| Tuneable Diode Laser | CNI | MRL-III-660D | The light wavelength must be chosen basing on photosensitizer's absorption spectrum |
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