Summary
Den nuværende protokol beskriver undersøgelsen af neutrofil-biofilminteraktioner. Staphylococcus aureus biofilm etableres in vitro og inkuberes med perifere blodafledte humane neutrofiler. Det oxidative burstrespons fra neutrofiler kvantificeres, og neutrofillokaliseringen i biofilmen bestemmes ved mikroskopi.
Abstract
Neutrofiler er den første forsvarslinje, der anvendes af immunsystemet under mikrobiel infektion. In vivo rekrutteres neutrofiler til infektionsstedet, hvor de bruger processer som fagocytose, produktion af reaktivt ilt og nitrogenarter (henholdsvis ROS, RNS), NETosis (neutrofil ekstracellulær fælde) og degranulering for at dræbe mikrober og løse infektionen. Interaktioner mellem neutrofiler og planktoniske mikrober er blevet grundigt undersøgt. Der har været nye interesser i at studere infektioner forårsaget af biofilm i de senere år. Biofilm udviser egenskaber, herunder tolerance over for drab af neutrofiler, adskilt fra deres planktoniske dyrkede modstykker. Med den vellykkede etablering af både in vitro- og in vivo-biofilmmodeller kan interaktioner mellem disse mikrobielle samfund med forskellige immunceller nu undersøges. Her er teknikker, der bruger en kombination af traditionelle biofilmmodeller og veletablerede neutrofile aktivitetsassays, skræddersyet specifikt til at studere neutrofile og biofilminteraktioner. Bredfeltsfluorescensmikroskopi bruges til at overvåge lokaliseringen af neutrofiler i biofilm. Disse biofilm dyrkes under statiske forhold efterfulgt af tilsætning af neutrofiler afledt af humant perifert blod. Prøverne farves med passende farvestoffer inden visualisering under mikroskopet. Derudover kvantificeres produktionen af ROS, som er et af de mange neutrofile reaktioner mod patogener, i nærværelse af en biofilm. Tilføjelsen af immunceller til dette etablerede system vil udvide forståelsen af værtspatogeninteraktioner, samtidig med at brugen af standardiserede og optimerede betingelser sikres til at måle disse processer nøjagtigt.
Introduction
En biofilm er et fællesskab af overfladeassocierede mikrober eller ikke-vedhæftede aggregater indkapslet i et ekstracellulært polymerstof (EPS)1,2. Disse samfund beskytter de indkapslede mikroorganismer mod miljømæssige stressfaktorer, herunder tolerance over for antimikrobielle midler og immunsystemet3. Flere patogene mikrobielle arter danner biofilm, der har været forbundet med kroniske infektioner4. Udviklingen af biofilm er en indviklet proces, der involverer fastgørelse til overflader, EPS-produktion, celleproliferation, biofilmstrukturering og celleløsrivelse5. Når celler spredes for at danne en biofilm, forbliver de planktoniske eller translokerer til et nyt underlag og genoptager biofilmudvikling6.
Staphylococcus aureus, et opportunistisk patogen, følger en generel ordning for biofilmudvikling, herunder vedhæftning, spredning, modning og spredning7. Fastgørelsesprocessen i S. aureus biofilm dikteres af hydrofobe interaktioner, teichoesyrer og mikrobielle overfladekomponenter, der genkender klæbende matrixmolekyler (MSCRAMMs)8,9. Når spredningen af S. aureus begynder, produceres EPS, som primært består af polysaccharider, proteiner, ekstracellulært DNA og teichoesyrer,5. Efterhånden som EPS-komponenter produceres, produceres også forskellige exoenzymer og små molekyler, hvilket bidrager til biofilmens 3-dimensionelle struktur og hjælper med løsrivelse5. S. aureus udnytter denne stærkt koordinerede livsstil til at etablere forskellige kroniske infektioner, herunder infektioner på grund af indboing af medicinsk udstyr10.
Methicillinresistent S. aureus (MRSA) er en af de førende årsager til infektioner relateret til indwelling medicinsk udstyr, såsom centrale vene- og urinkatetre, proteser, pacemakere, mekaniske hjerteklapper og intrauterin udstyr11. Under sådanne infektioner er neutrofiler de første værtsimmunceller, der rekrutteres til infektionsstedet for at bekæmpe patogener via flere strategier12. Disse omfatter fagocytose, degranulering, reaktiv ilt og nitrogenarter (ROS / RNS) produktion eller frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NET'er) for at eliminere patogener13.
Generering af ROS ved fagocytose af mikrober er et af de vigtigste antimikrobielle reaktioner udstillet af neutrofiler14. Fagocytose forstærkes, hvis mikrober er belagt med opsoniner, især immunoglobuliner og komplementkomponenter, der findes i serum15. De opsoniserede mikrober genkendes derefter af celleoverfladereceptorer på neutrofiler og opsluges og danner et rum kaldet fagosomet15. Neutrofiler genererer og frigiver ROS i fagosomet via den membranassocierede NADPH-oxidase16. Dette multikomponentenzymkompleks genererer superoxidanioner ved at overføre elektroner til molekylært ilt16. Derudover genererer neutrofiler også RNS gennem ekspression af inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS)17. Disse høje superoxid- og nitrogenoxidradikaler i fagosomet har brede antimikrobielle aktiviteter. De kan interagere med metalcentre i enzymer og beskadige nukleinsyrer, proteiner og cellemembraner af patogenet 18,19,20,21. Talrige mikrober vedtager en biofilm-livsstil og anvender forskellige strategier for at undgå drab med ROS22,23. Således er standardiserede assays, der parrer biofilm med neutrofiler for at kvantificere ROS, gavnlige for ensartede resultater.
Mens assays, såsom kvantificering af neutrofil ROS-produktion, giver information om neutrofilers reaktioner på biofilm, kan evnen til at visualisere interaktionerne mellem neutrofiler i en biofilm også tjene som et kraftfuldt værktøj. Brugen af fluorescerende farvestoffer til mikroskopi kræver ofte optimering for at opnå billeder af høj kvalitet, der kan bruges til mikroskopibilledanalyse. Fleksibiliteten til at optimere nogle forhold er begrænset, da neutrofiler kan gennemgå celledød efter isolation. Desuden vaskes biofilm typisk for at fjerne planktonpopulationen fra den eksperimentelle opsætning før tilsætning af neutrofiler. Under vask kan der opstå variation mellem replikate biofilm på grund af tab af delvis biomasse, hvis biofilm klæbes løst til overfladen.
Generelt omfatter nuværende metoder på området til analyse af interaktioner mellem neutrofiler og biofilm hovedsageligt mikroskopi, flowcytometri og kolonidannende enheder (CFU) optælling24,25,26,27. Mikroskopi involverer brugen af farvestoffer, der enten direkte pletter neutrofiler og biofilm eller målretter forskellige neutrofile reaktioner mod mikrober såsom NET-dannelse, degranulering og celledød25,28. En delmængde af disse reaktioner, såsom neutrofil celledød og degranulering, kan også analyseres via flowcytometri, men kræver, at neutrofiler fortrinsvis ikke er forbundet med store aggregater af mikrober i en biofilm28,29. Flowcytometri kan også kvantificere nogle biofilmparametre, såsom cellelevedygtighed27. Disse processer kræver imidlertid forstyrrelse af biofilmbiomassen og ville ikke være nyttige til at visualisere andre vigtige interaktioner såsom den rumlige fordeling af neutrofiler og deres komponenter i en biofilm27,29,30.
Den nuværende protokol fokuserer på at tilpasse nogle af de traditionelt anvendte metoder til at studere neutrofil-biofilminteraktioner på biofilm, der er optimeret til at give minimal variation under håndtering. Denne protokol giver således standardiserede metoder til at dyrke og kvantificere biofilm, isolere primære humane neutrofiler fra perifert blod, kvantificere ROS-produktion og visualisere biofilm-neutrofile interaktioner via mikroskopi. Denne protokol kan tilpasses forskellige systemer til at forstå biofilm-neutrofile interaktioner, samtidig med at heterogeniteten blandt donorpuljer overvejes.
Protocol
Alle procedurer blev godkendt af Ohio State University Institutional Review Board (IRB) (2014H0154). Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra alle donorer til indsamling af perifert blod for at isolere primære humane neutrofiler. Staphylococcus aureus (USA300 LAC)31 blev brugt som modelorganisme til udførelse af forsøgene. Forsøgene blev udført med korrekt personligt beskyttelsesudstyr (PPE) på grund af potentiel eksponering for et blodbåren patogen.
1. Fremstilling af in vitro biofilm
- Opnå isolerede kolonier af S. aureus fra en kryopræserveret bestand 31 ved hjælp af en stribepladeteknik32,33 på en næringsrig agarplade, såsom Tryptic Soy Agar (se Materialetabel).
- Overtræk individuelle brønde på en 96-brøndsplade med 100 μL 0,001% (v/v) poly-L-lysin (PLL) fortyndet i steril H2O og inkuberes ved stuetemperatur i 30 min. Aseptisk opsuges PLL-opløsningen ved hjælp af en vakuumassisteret aspirationsfælde. Lad brøndene tørre natten over ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Alle aspirationstrin i protokollen udføres ved hjælp af en vakuumassisteret aspirationsfælde, medmindre andet er angivet. - Forbered en overnatningskultur ved at inokulere en koloni af S. aureus i minimal essentiel medie alfa (MEMα) suppleret med 2% glucose og inkuberes ved 37 ° C, omrystes ved 200 o / min i 16-18 timer.
- Fortynd natten over ved at overføre 50 μL til 5 ml frisk MEMα suppleret med 2% glucose og inkuberes ved 37 ° C, omrystes ved 200 o / min, indtil midten af logaritmisk fase, generelt mellem optisk densitet 600 (OD600 nm) på 0,5-0,8. Brug MEMα til at normalisere midtlogaritmisk kultur til en OD600nm på 0,1.
- Overfør 150 μL normaliseret kultur til hver brønd i den PLL-behandlede 96-brøndplade. Inkuberes statisk i 18-20 timer i et befugtet kammer ved 37 °C.
BEMÆRK: Biofilmene kan også dyrkes i andre formater såsom μ-kanals dias (se Materialetabel). - Aspirer supernatanten for at fjerne planktoncellerne. Vask forsigtigt resterende biomasse med 150 μL Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) for at fjerne de ikke-bundne celler. Tilsæt HBSS dråbevis for at undgå at forstyrre biofilmen.
BEMÆRK: Mens du opsuger supernatanten og HBSS under vask, skal du efterlade lige nok væske (supernatant eller HBSS) i brøndene, der indeholder biofilm, således at biofilmen stadig er nedsænket. Dette forhindrer forstyrrelse af biofilmstrukturen, når HBSS tilsættes dråbevis for at vaske biofilmen. - Gentag trin 1.6 mindst to gange mere for at fjerne alle planktoncellerne. På dette tidspunkt er biofilm klar til øjeblikkelige downstream-eksperimenter.
BEMÆRK: Hvis biofilmene ikke anvendes til neutrofile eksperimenter, kan HBSS erstattes med fosfatbufferet saltvand (PBS). HBSS foretrækkes frem for PBS, da HBSS indeholder komponenter, herunder glucose, der giver optimale betingelser for neutrofil aktivering34.
2. Kvantificering af biofilmbiomasse
- Der fremstilles en bestand af 0,1 % (w/v) krystalviolet (CV) opløsning (se materialetabel) ved opløsning i 20 % (v/v) ethanol og 80 % (v/v) H2O. Sørg for, at CV'et er fuldstændigt opløst i ethanol, inden H2O. Filtersteriliser opløsningen.
- Tilsæt 150 μL 0,1% CV-opløsning til den vaskede biofilm og inkuber i 20 minutter ved stuetemperatur. Brug mindst tre tomme brønde som kontrolelementer kun for medier.
- Sproppe 0,1% CV-opløsningen fra biofilmene og vask de farvede biofilm med 200 μL 1x PBS. Gentag denne proces i alt tre vaske for at fjerne overskydende CV fra brøndene.
- Der tilsættes 150 μL 33 % (v/v) iseddike fortyndet med H2O. Inkuberes ved stuetemperatur på en vippe ved 50 o/min. i 30 minutter, så CV'et, der er bundet til biomassen, opløses fuldstændigt.
FORSIGTIG: Udfør dette trin i en laminær strømningshætte med passende PPE, da iseddike er et ætsende kemikalie. - I mellemtiden skal du indstille mikropladelæseren (se Materialetabel) for at læse CV-pletværdierne. Efter behandling af iseddike læses pladen ved 595 nm bølgelængde.
BEMÆRK: Bølgelængden, der bruges til at måle OD af CV, kan variere fra 500-600 nm35.
3. Neutrofil isolering
BEMÆRK: Neutrofiler blev isoleret efter en tidligere offentliggjort metode med mindre ændringer36. Denne isolationsprotokol kombinerer densitetsgradientcentrifugering først, efterfulgt af 3% dextran sedimentering. Dette afsnit dækker kun den overordnede neutrofile isolationsprotokol med fokus på de ændringer, der er foretaget i den offentliggjorte protokol. Desuden er protokollen skitseret nedenfor en af de mange metoder, der kan isolere neutrofiler og kan erstattes efter behov. Andre metoder til isolering af neutrofiler omfatter anvendelse af celleseparationsmedier eller magnetisk antistofcelleseparation37.
- Tegn blod fra en voksen donor via venipunktur i henhold til protokollen, der er beskrevet i den institutionelle IRB. Før blodprøvetagningen skal du sikre dig, at sprøjten har tilstrækkelig konserveringsfri heparin, således at den endelige koncentration af heparin er 20 U / ml.
- Fortynd det hepariniserede blod med 3/4 volumen af endotoksinfri 0,9% NaCl (se materialetabel) i H2O ved stuetemperatur.
- For hver 20 ml fortyndet blodprøve aliquot 14 ml af et kommercielt tilgængeligt densitetsgradientmedium (se Materialetabel) i et frisk 50 ml konisk rør. Læg forsigtigt den fortyndede blodprøve oven på densitetsgradientmediet.
- Centrifuge den lagdelte blodprøve ved 400 x g i 40 minutter ved stuetemperatur. Sørg for, at centrifugen har en langsom pause for at undgå at forstyrre laget, når centrifugeringen er afsluttet.
BEMÆRK: Blodprøven vil have fem lag indeholdende en blanding af saltvand og plasma, et mononukleært cellelag, densitetsgradientmedium, neutrofiler og erythrocytter. - Ved hjælp af en serologisk pipette opsuges alle lagene over neutrofilerne og erythrocytpellet, efterfulgt af en blid resuspension af pelleten i kold endotoksinfri 0,9% NaCl iH2O. For hver pellet, der genereres fra en 20 ml blodprøve, skal pelleten resuspenderes tilbage til 20 ml volumen i alt. Tilføj 1: 1 volumen på 3% dextran (se Materialetabel). Inkuber røret lodret i 18-20 minutter på is.
BEMÆRK: Sørg for, at 3% dextran er lavet med endotoksinfri 0,9% NaCl i H2O. - Fjern 20 ml af det øverste lag, der indeholder neutrofiler og nogle erytrocytter, på et nyt 50 ml konisk rør og centrifuger det ved 355 x g i 10 minutter ved 4 °C. Hæld supernatanten af, der efterlader en rød pille.
- Pelleten gensuspenderes forsigtigt i 10 ml kold, sterilH2O, i 30 s for at lyse de resterende erytrocytter. Tilsæt straks 10 ml koldt endotoksinfrit 0,9% saltvand til blandingen for at genoprette toniciteten. Opløsningen centrifugeres ved 233 x g i 3 minutter ved 4 °C.
- Supernatanten hældes af, og pelleten indeholdende 95%-97% neutrofiler genudsættes i 1 ml kold HBSS pr. 20 ml blodprøve.
- Overfør 10 μL af de resuspenderede neutrofiler i 90 μL af 0,4% trypanblå eksklusionsfarvestof og tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer (se Materialetabel).
BEMÆRK: Ikke-levedygtige celler farves blå, da trypanblå udelukkelsesfarvestof er uigennemtrængeligt i levedygtige celler. Denne protokol giver >99% cellelevedygtighed37,38. - Der tilsættes yderligere HBSS, således at den endelige koncentration af neutrofiler er 4 x 106 celler/ml.
BEMÆRK: For tilfælde med <99% cellelevedygtighed kan den endelige koncentration på 4 x 106 celler / ml stadig opnås; det samlede volumen af opløsning indeholdende 4 x 106 celler/ml opnået vil dog falde. Den endelige koncentration af neutrofiler kan justeres i henhold til brugerens eksperimentelle behov. Neutrofilerne blev resuspenderet ved en endelig koncentration på 4 x 106 celler/ml for alle de nedenfor beskrevne forsøg. For at tage højde for donor-til-donor-variabilitet anbefales det kraftigt, at alle eksperimenter involveret med neutrofiler udføres med mindst tre forskellige donorer.
4. Måling af ROS produceret af neutrofiler
- Der tilsættes 100 μL 20 % normalt humant serum (fortyndet i HBSS) dråbevis til den vaskede biofilm (trin 1,6), og der inkuberes ved 37 °C under statisk tilstand i 30 minutter for at opsonisere biofilmen.
- Sproppe 20% serumopløsningen og vask biofilmene dråbevis med 150 μL HBSS én gang. Aspirer HBSS og efterlader brønde med opsoniserede biofilm.
BEMÆRK: Til fortolkning af eksperimentet anbefales mindst fire grupper: (A) Neutrofiler + Biofilm, (B) Neutrofiler + PMA (positiv kontrol, se Materialetabel), (C) Kun neutrofiler og (D) Kun biofilm. - Der tilsættes luminol (se materialetabel) til neutrofilerne, der resuspenderes i HBSS i en koncentration på 4 x 106 celler/ml, således at den endelige luminolkoncentration er 50 μM. Denne løsning er klar til brug for grupper (A) og (C). Tilsæt 4 x 105 neutrofiler blandet med luminol til brøndene med opsoniserede biofilm.
- I et separat rør fremstilles 50 μM luminolopløsning i HBSS uden neutrofiler og tilsættes det til brønden indeholdende biofilm (gruppe D).
- Aliquot 350 μL neutrofiler blandet med luminol og tilsæt phorbol 12-myrisat 13-acetat (PMA) i en slutkoncentration på 500 ng/ml til blandingen. For gruppe (B) tilsættes 4 x 105 neutrofiler fra denne blanding i brønde uden biofilm. Dette tjener som en positiv kontrol.
BEMÆRK: Koncentrationen af PMA indikeret i dette trin er relativt høj for at sikre robust burstrespons, da PMA-stimulerede neutrofiler er en positiv kontrol. PMA kan bruges i en lavere koncentration til at aktivere neutrofiler, afhængigt af eksperimentet. - Pladen centrifugeres ved 270 x g i 30 s ved 4 °C.
- Sørg for, at pladelæseren er indstillet til 37 °C sammen med indstillingen for luminescens og kinetisk læsning i 60 minutter med 3 minutters intervaller. Placer pladen i pladelæseren for at måle ROS-produktionen med neutrofiler i 60 minutter.
BEMÆRK: Til dette assay blev biofilm dyrket i hvide plader, der blev brugt til luminescensassays. PMA er en kendt agonist for det oxidative burstrespons39. Når du udfører undersøgelser, der involverer PMA, skal du sikre dig, at PMA tilsættes på det sidste trin, mens opløsningen indeholdende neutrofiler er kold, da PMA straks initierer burstresponsen.
5. Billeddannelse biofilm-neutrofile interaktioner
- Konfigurer en biofilm ved hjælp af trin 1.2-1.6. For at lette biofilmbilleddannelse skal du anvende en fluorescerende stamme af S. aureus, såsom USA300, der udtrykker grønt fluorescerende protein (GFP)40,41, for at øge letheden ved mikroskopibilleddannelse.
BEMÆRK: Et 6 μ-kanals dias (se Materialetabel) blev brugt i stedet for en 96-brøndplade til at demonstrere in vitro biofilmmodellen (trin 1). - Der inkuberes 4 x 106 celler/ml neutrofiler med 100 μM blåt CMAC-farvestof (7-amino-4-chlorcoumarin) (BCD, se materialetabel) i 30 minutter i en vippe ved 37 °C og 5 % CO2. Sørg for, at prøverne inkuberes i mørke, og begræns eksponeringen for lys i de resterende trin.
- For at vaske overskydende BCD centrifugeres neutrofiler ved 270 x g i 5 minutter og opsuges supernatanten. Resuspend neutrofilerne i frisk HBSS. På dette tidspunkt tilsættes ethidiumhomodimer-1 (se Materialetabel) til de BCD-farvede neutrofiler i en endelig koncentration på 4 μM for at overvåge neutrofil og bakteriel død.
- Tilsæt 150 μL neutrofiler til S. aureus biofilmen, der er dyrket i μ-dias, således at forholdet mellem neutrofil og bakterier er 1:30 (neutrofil: bakterier). Inkuber μ-diasene i et befugtet kammer i 30 min. Antallet af bakterieceller er baseret på celletællingerne opnået ved plettering af en 18 timers biofilm.
- Forestil dig neutrofil-biofilminteraktionen ved hjælp af fluorescerende kanaler svarende til excitations- og emissionsbølgelængderne af de fluorescerende farvestoffer / proteiner.
BEMÆRK: For denne undersøgelse er BCD 353/466 nm, ethidium homodimer-1 er 528/617 nm, og GFP er 395/509 nm. Begræns prøvens eksponering for laseren eller lyset for at forhindre fotoblegning af prøverne. - Analyser billederne ved hjælp af mikroskopi billedanalysesoftware eller programmer som FIJI / ImageJ, COMSTAT2, BiofilmQ og BAIT, blandt mange flere42,43,44,45.
BEMÆRK: Når du arbejder med pletter, er det vigtigt at overveje specificiteten af de farvestoffer, der er i brug. Nogle pletter virker på prokaryote og eukaryote celler, mens andre kun virker på en. Hvis neutrofiler og biofilm farves separat ved hjælp af farvestoffer, der kan plette begge celletyper, skal du sørge for at vaske eventuelt resterende farvestof af, før du kombinerer neutrofiler og biofilm for at forhindre krydsfarvning.
Representative Results
De medier, der bruges til at dyrke bakterielle biofilm, påvirker neutrofilernes overlevelse. Forskellige medier blev testet for at reducere effekten af medier alene på levedygtigheden af neutrofiler til undersøgelse af neutrofil-biofilminteraktioner (figur 1). Bakterievækstmedier såsom tryptisk sojabouillon minimerer levedygtigheden af neutrofiler, således at ~ 60% af neutrofiler er i live efter en 30 minutters inkubationsperiode ved 37 ° C med 5% CO2. Pattedyrcellekulturmedier, såsom MEMα, påvirker ikke levedygtigheden af neutrofiler og understøtter væksten af S. aureus biofilm. Faktisk fremmer minimale medier robust vækst af biofilm i andre bakterier46,47.
For at vurdere effekten af medier på biofilmvækst og variabilitet i kvantificering af biofilmbiomasse efter vask af biomassen for at eliminere planktonceller blev en 18 h S. aureus biofilm dyrket i en 96-brøndsplade med brønde behandlet eller ubehandlet med poly-L-lysin. En næringsrig (Tryptic Soy Broth (TSB)) og minimal (MEMα) medier blev brugt som den er eller suppleret med 2% glucose. Biofilmbiomassen farvet med CV afslørede, at S. aureus biofilm dyrket i MEMα suppleret med 2% glukose producerede den mest robuste biofilm blandt alle testede medier (figur 2A). Desuden viste biofilm dyrket i PLL forbehandlede brønde indeholdende MEMα + 2% glucose mindre variabilitet end biofilm i PLL-ubehandlede brønde indeholdende MEMα + 2% glucose. Disse biofilm viste mindre variation i kvantificering via CV-assay35 og CFU/ml, når de blev belagt efter præcis håndtering af biofilm til kvantificering af biomasse. Disse biofilm indeholdt i gennemsnit 1 x 108 CFU/ml, som det fremgår af plettering af biofilmene på 3 separate dage (figur 2B). Dette tal er nyttigt til bestemmelse af antallet af neutrofiler, der skal føjes til biofilmene for neutrofile funktionalitetsassays.
For at måle ROS-produktion af neutrofiler som reaktion på biofilm blev S. aureus biofilm dyrket statisk i 18-20 timer i en 96-brøndplade. Biofilm blev derefter opsoniseret, og neutrofiler blev tilføjet. ROS-produktionen blev derefter målt i 60 minutter (figur 3A). Arealet under kurven beregnes ud fra den kinetiske kurve for at kvantificere den samlede ROS-produktion af neutrofiler. Neutrofiler behandlet med en agonist, såsom PMA, der anvendes som kontrol, viser en øget ROS-produktion. I mangel af biofilm viste neutrofiler behandlet med PMA robust ROS-produktion. I nærværelse af S. aureus biofilm faldt den samlede ROS-produktion af neutrofiler behandlet med PMA. I mangel af PMA er neutrofiler udelukkende afhængige af deres interaktion med biofilmen, hvilket yderligere reducerer mængden af produceret ROS (figur 3B).
For at visualisere neutrofil-biofilminteraktionerne ved hjælp af fluorescensmikroskopi blev der anvendt en GFP-ekspressiv stamme af S. aureus, Blue CMAC-farvestof og ethidiumhomodimer-1, der pletter cytoplasmaet af levende celler og DNA fra døde celler. S. aureus biofilm blev dyrket i 18 timer i et 6 μ-kanals dias. Blå CMAC-farvestofmærkede neutrofiler blev tilsat sammen med ethidiumhomodimer-1 til de vaskede biofilm og inkuberet i 30 minutter ved 37 °C med 5% CO2 før billeddannelse. Bredfelt fluorescerende mikroskopi afslørede, at mange neutrofiler var lokaliseret til overfladen af S. aureus biofilm, mens nogle få er inden for biofilmen (figur 4A). Samspillet mellem S. aureus-celler inden for neutrofiler var også tydeligt (figur 4C). De fleste af S. aureus-cellerne, der interagerer med neutrofiler (cyan), var døde (magenta), mens nogle få forblev i live (gule) som bestemt af levende død farvning (figur 4C). Til sammenligning blev GFP-ekspressive S. aureus-biofilm farvet med ethidium homodimer-1, som afslørede en brøkdel af den døde S. aureus-population inden for biofilmen (figur 4B). Ikke-levedygtige neutrofiler, der var positive for ethidiumhomodimer-1, blev kvantificeret ved hjælp af analysesoftware (se Materialetabel) efter inkubation med S. aureus biofilm. Ca. 48% af neutrofilerne var allerede døde inden for 30 minutter efter inkubation med S. aureus biofilm. Under optimering af mikroskopiprotokollen blev effekten af vask af biofilm og neutrofiler efter 30 minutters inkubation for at fjerne ikke-klæbede neutrofiler også vurderet, hvilket afslørede omkring 33% af døde neutrofiler, der stadig er knyttet til biofilmen (figur 4D).
Figur 1: LIVE-DEAD assay sammenligner neutrofil overlevelse mellem bakterielle og pattedyrs vækstmedier. Neutrofiler blev isoleret og inkuberet i HBSS, MEMα, TSB eller 0,1% SDS i 30 min. LIVE-DEAD farvning blev udført ved anvendelse af Calcein AM (levende) og ethidium homodimer-1 (død). Procent af levende neutrofiler blev bestemt, hvor HBSS-inkuberede neutrofiler blev behandlet som 100% levende neutrofiler. Resultaterne repræsenterer i gennemsnit to uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer med neutrofiler opnået fra to forskellige donorer. Data præsenteres som middel ± SD (*p < 0,05, ****p < 0,0001. Envejs ANOVA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Kvantificering af biofilmbiomasse under forskellige forhold og bakteriel levedygtighedstælling af biofilm dyrket under optimerede forhold. (A) S. aureus blev podet i en 96-brønds plade enten belagt eller ubelagt med poly-L-lysin (PLL). Biofilm blev dyrket i TSB, MEMα eller et af medierne suppleret med 2% glucose under statiske forhold i 18 timer. Krystalviolet (CV) farvning blev udført for at plette biofilmbiomasse. Den eluerede CV-plet blev fortyndet kl. 1:10 og læst i en mikropladelæser. Resultaterne repræsenterer i gennemsnit tre uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer. Data præsenteres som middel ± SD. SD for hver gruppe er vist nederst for at demonstrere forskellige biofilms vækstbetingelser variabilitet. (B) Bakterielle CFU-tal blev opnået fra biofilm dyrket i et optimeret medium (MEMα + 2% glucose). De 18 timers statiske biofilm blev udsat for det samme antal vaske efterfulgt af en 10 minutters sonikering for at løsne biofilmbiomassen og passerede gennem en 22G-nål for at forstyrre aggregaterne inden plettering. Resultaterne repræsenterer tre replikater udført i tre eksemplarer. Data præsenteres som middel ± SD (ns = ikke signifikant. Envejs ANOVA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kvantificering af ROS-produktion af neutrofiler via kemiluminescensassay. (A) Neutrofiler (PMN) blev inkuberet med HBSS-vaskede S. aureus-biofilm (BF) enten i nærvær (lukket grå trekant) eller fravær (åben grå omvendt trekant) af PMA for at måle ROS-produktion ved neutrofiler. Luminol blev brugt til at detektere ROS hvert 3. minut i 60 minutter i en mikropladelæser. Mens neutrofiler behandlet med PMA i mangel af en biofilm (lukket sort cirkel) tjente som en positiv kontrol, tjente kun neutrofile (åben sort cirkel) og kun biofilm (åben grå trekant) grupper som negative kontroller. Data repræsenterer et gennemsnit af to uafhængige eksperimenter udført i tre eksemplarer med neutrofiler opnået fra to forskellige donorer. Data præsenteres som gennemsnit ± SD. (B) Arealet under kurven fra (A) blev beregnet for at kvantificere den samlede ROS genereret af neutrofilerne. Dataene er repræsenteret som middel ± SD. (***p < 0,0001. Envejs ANOVA). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Visualisering af interaktionen mellem S. aureus biofilm og neutrofiler ved hjælp af bredfeltsfluorescensmikroskopi. Blå CMAC-farvestofmærkede neutrofiler (cyan) blev suppleret med ethidium homodimer-1 (magenta; død) inden inkubation med en 18 h S. aureus biofilm (gul). Biofilm-neutrofile interaktioner blev afbildet ved hjælp af bredfelt fluorescerende mikroskopi og billeder behandlet ved hjælp af en billedanalysesoftware. Eksperimenter blev udført med tre forskellige donorer. Repræsentative billeder præsenteres som (A) 3D-visning af S. aureus biofilm med levende (cyan) og død (magenta; nogle få angivet med hvide pile) neutrofiler, (B) 3D-visning af en S. aureus-biofilm i fravær af neutrofiler med enten levende S. aureus, der udtrykker GFP (gul) eller død S. aureus farvet med ethidium homodimer-1 (magenta), (C) et ortogonalt billede af S. aureus og neutrofil interaktion som afbildet af xy-, yz- og xz-planerne og (D) kvantificering af neutrofil levedygtighed i nærværelse af S. aureus biofilm efter 30 minutter enten straks (uvasket) eller efter tre runder vask med HBSS for at fjerne ikke-klæbede neutrofiler (vasket). Neutrofil celledød præsenteres som middel ± SD (Student's t-test). Skalalinjen angiver 50 μm i (A) og (B) og 10 μm i (C). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Der har været adskillige bestræbelser på at vokse robuste og reproducerbare S. aureus biofilm til downstream eksperimenter in vitro48,49,50. En standardiseret protokol er skitseret, der udnytter PLL's kationiske karakter samt supplerer medierne med glukose til vækst af robuste in vitro S. aureus biofilm. Tilsætningen af PLL giver mulighed for bedre fastgørelse af den negativt ladede bakteriecelle til de positivt ladede PLL-belagte overflader. Det er vigtigt at bemærke, at PLL ved en koncentration på 10 μg/ml har antimikrobiel aktivitet mod Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og S. aureus, når den inkuberes i 24 timer51. Den samme koncentration bruges til at belægge overflader; overskydende PLL aspireres dog, hvilket gør koncentrationen af PLL lavere end 10 μg/ml ved såning til biofilmvækst.
Det er vigtigt at bemærke, at PLL kun har fungeret i specifikke vækstmedier som MEMα med 2% glucose, hvor det blev observeret, at S. aureus producerede robuste biofilm med minimal variabilitet (figur 2A). PLL-koncentration, der skal bruges sammen med andre medietyper, ville kræve yderligere optimering, såsom at bruge en øget koncentration af PLL til at belægge brøndene. Derudover er disse forhold blevet optimeret til en monospecies S. aureus biofilm. Mens kroniske sårbiofilm ofte er polymikrobielle, er standardisering af assays til undersøgelse af monospecies biofilm og dens interaktioner med neutrofiler og andre immunceller nøglen til at forstå deres bidrag til patogenese52. Disse standardiserede protokoller kan optimeres yderligere for at opretholde og studere polymikrobielle biofilm og deres interaktioner med neutrofiler.
Det blev også observeret, at rige bakteriekulturmedier, såsom TSB, førte til tab af neutrofil levedygtighed (figur 1). Derfor blev vækstbetingelserne for S. aureus biofilm i MEMα, der anvendes til pattedyrcellekulturer, optimeret. For undersøgelser, der involverer neutrofiler, understøtter dette medie neutrofil levedygtighed og fremmer S. aureus vækst. Mens det blev observeret, at medier påvirker levedygtigheden af neutrofiler, er det også vigtigt at overveje, at neutrofiler isoleret fra perifert humant blod gennemgår apoptose ex vivo med ca. 70% apoptotiske neutrofiler ved 20 h53. Dette kræver korrekt håndtering, såsom opbevaring af neutrofilerne på is, når man forbereder sig til forsøg, ved hjælp af endotoksinfrie reagenser og forhindrer aktivering af neutrofiler ved at undgå hvirvel af prøver med neutrofiler.
Vurderingen af oxidativ burst i neutrofiler udføres rutinemæssigt for at bestemme den dræbende virkning af neutrofiler på patogenet14,54,55. Disse undersøgelser udføres ofte med planktoniske bakterier, hvor neutrofiler tilsættes, og det oxidative burstrespons kvantificeres ved hjælp af luminolforstærket kemiluminescens, der detekterer superoxidanioner produceret af neutrofiler. Den nuværende protokol ændres ved at erstatte planktoniske bakterier med statisk dyrket 18 h S. aureus biofilm. Som sådan kan neutrofiler føjes direkte til biofilmen for at vurdere deres aktivering. På den anden side producerer bakterier i biofilm enzymer, såsom katalase og superoxiddismutase for at afgifte ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilm producerer højere katalase end dets planktoniske modstykke under stress57. Den samlede kemiluminescens af PMA-stimulerede neutrofiler i en S. aureus biofilm er signifikant lavere end de PMA-stimulerede neutrofiler, hvor biofilm er fraværende (figur 2). Dette kan skyldes aktiviteten af disse afgiftende enzymer. Desuden producerer S. aureus biofilm flere poredannende toksiner kaldet leukocidiner, der dræber neutrofiler58. Det reducerede burstrespons skyldes sandsynligvis også neutrofilernes nedsatte levedygtighed i nærværelse af S. aureus biofilm. Mens denne undersøgelse bruger luminol, der detekterer den samlede ROS produceret både inde i og uden for cellerne, skal andre reagenser, såsom CM-H2DCFDA (5-(og-6)-chlormethyl-2'7'-dichlorodihydrofluoresceindiacetat) eller isoluminol, overvejes, hvis målet med arbejdet er at studere intracellulær eller ekstracellulær ROS-produktion14,53,54 specifikt.
Evnen til at visualisere neutrofil-biofilminteraktioner via mikroskopi kan være informativ om neutrofilers og biofilms opførsel i nærværelse af hinanden. Excitations- og emissionsspektrene for fluorescerende farvestoffer og proteiner repræsenterer et øjebliksbillede af interaktionen mellem en 18 timers S. aureus biofilm og neutrofiler efter en 30 minutters inkubation. For effektivt at fange signaler fra farvede celler er det vigtigt at begrænse prøvernes eksponering for lyskilder, mens prøverne opsættes til mikroskopi. Under billeddannelse blev hurtig fotoblegning af prøverne undgået ved at sænke lyskildens intensitet, når alle parametre som Z-stack-højde og eksponeringstid for forskellige kanaler blev justeret.
Denne enkle praksis tillod korrekt mikroskopibilleddannelse, hvor det blev observeret, at få neutrofiler er lokaliseret i biofilmen (figur 4A). Dette kan skyldes mellemrum i biofilmen, da 18 h S. aureus biofilm dyrket i MEMα med 2% glucose ikke dækker overfladen ensartet (figur 4B). Andre undersøgelsers brug af rich media har imidlertid vist en ensartet græsplæne af S. aureus biofilmvækst og leukocytter, der trænger gennem biofilmen30,58. Desuden observeres det også, at der var neutrofil celledød efter 30 minutters inkubation med S. aureus biofilm på grund af S. aureus biofilmproducerede leukocidiner, der lyser neutrofiler58 (figur 4A, D). Tilsætning af et vasketrin for at fjerne ikke-klæbede neutrofiler efter inkubation af dem med biofilm i 30 minutter fjernede ~ 15% af døde neutrofiler fra systemet sammenlignet med den uvaskede gruppe, hvor mikroskopi blev udført umiddelbart efter 30 minutters inkubation (figur 4D). Neutrofiler, der interagerer med S. aureus, blev også observeret (figur 4C). Yderligere eksperimenter er nødvendige for at vurdere, om S. aureus er opslugt af neutrofiler eller bundet til celleoverfladen af neutrofiler54. Imaging neutrofiler og biofilm er det første skridt til at evaluere flere neutrofile funktionaliteter nedstrøms, såsom fagocytose og NETosis54,59. Neutrofilers virkning på biofilm kan også vurderes ved at kvantificere biofilmbiomassen, strukturelle ændringer af biofilmen og biofilmens levedygtighed blandt mange andre ved hjælp af billedanalyseværktøjer, der er anført i trin 5.6. Endelig findes der donor-til-donor-variation i neutrofiler; Det anbefales derfor, at mindst tre forskellige donorer anvendes til undersøgelser, der involverer neutrofiler.
Samlet set blev standardiserede in vitro-assays kombineret for at vurdere interaktioner mellem neutrofiler og biofilm. Selvom disse assays bruger S. aureus, kan de beskrevne protokoller let tilpasses til at studere andre patogener. Mens der er forskellige in vivo-modeller til at studere værtspatogeninteraktioner, kan de være dyre og arbejdskrævende, især hvis forholdene ikke er optimeret. Arbejde med standardiserede in vitro-assays gør det muligt at optimere eksperimentelle forhold og bekræfte observationer, inden man flytter til et in vivo-system. Endelig er forskellige dyreinfektionsmodeller blevet brugt til at studere biofilm-neutrofile interaktioner in vivo. Det er dog vigtigt at overveje immunologiske forskelle mellem mennesker og dyr modeller60,61,62,63. Dette nødvendiggør brug af neutrofiler afledt af mennesker til at studere disse komplekse værtspatogeninteraktioner.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) til DJW og en American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) til ESG. Vi takker Dr. Paul Stoodley for at give os USA 300 LAC GFP-stamme. Desuden anerkender vi ressourcer fra Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) og OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi takker også Amelia Staats, Peter Burback og Lisa Coleman fra Stoodley-laboratoriet for at udføre blodprøver.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
| 150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
| 200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
| 3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
| 60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
| Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
| Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
| Band-aids | Used for blood draw | ||
| BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
| Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
| CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
| Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
| Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
| Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
| Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
| D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
| Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
| Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
| Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
| Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
| Hemacytometer | Bright Line | ||
| Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
| IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
| Luminol | Sigma | A8511-5G | |
| Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
| Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
| Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
| NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
| Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
| Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
| Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
| Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
| SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
| Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
| Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Turnicate | Used for blood draw | ||
| UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
| μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |
References
- Donlan, R. M. Biofilms: microbial life on surfaces. Emerging Infectious Diseases. 8 (9), 881-890 (2002).
- Alhede, M., et al. Phenotypes of non-attached Pseudomonas aeruginosa aggregates resemble surface attached biofilm. PLoS One. 6 (11), 27943 (2011).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews: Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Donlan, R. M., Costerton, J. W. Biofilms: survival mechanisms of clinically relevant microorganisms. Clinical Microbiology Reviews. 15 (2), 167-193 (2002).
- Schilcher, K., Horswill, A. R. Staphylococcal biofilm development: structure, regulation, and treatment strategies. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 84 (3), 0002 (2020).
- Kaplan, J. B. Biofilm dispersal: mechanisms, clinical implications, and potential therapeutic uses. Journal of Dental Research. 89 (3), 205-218 (2010).
- Otto, M.
- Moormeier, D. E., Bayles, K. W. Staphylococcus aureus biofilm: a complex developmental organism. Molecular Microbiology. 104 (3), 365-376 (2017).
- Gross, M., Cramton, S. E., Gotz, F., Peschel, A. Key role of teichoic acid net charge in Staphylococcus aureus colonization of artificial surfaces. Infection and Immunity. 69 (5), 3423-3426 (2001).
- Zheng, Y., He, L., Asiamah, T. K., Otto, M. Colonization of medical devices by staphylococci. Environmental Microbiology. 20 (9), 3141-3153 (2018).
- Donlan, R. M.
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Amulic, B., Cazalet, C., Hayes, G. L., Metzler, K. D., Zychlinsky, A. Neutrophil function: from mechanisms to disease. Annual Review of Immunology. 30, 459-489 (2012).
- Chen, Y., Junger, W. G.
- van Kessel, K. P., Bestebroer, J., van Strijp, J. A.
- Nguyen, G. T., Green, E. R., Mecsas, J. Neutrophils to the ROScue: Mechanisms of NADPH oxidase activation and bacterial resistance. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 373 (2017).
- Saini, R., Singh, S. Inducible nitric oxide synthase: An asset to neutrophils. Journal of Leukocyte Biology. 105 (1), 49-61 (2019).
- Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium. Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).
- Segal, A. W. The function of the NADPH oxidase of phagocytes and its relationship to other NOXs in plants, invertebrates, and mammals. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (4), 604-618 (2008).
- Fang, F. C. Antimicrobial reactive oxygen and nitrogen species: concepts and controversies. Nature Reviews Microbiology. 2 (10), 820-832 (2004).
- Bogdan, C. Nitric oxide and the immune response. Nature Immunology. 2 (10), 907-916 (2001).
- Chua, S. L., et al. Reactive oxygen species drive evolution of pro-biofilm variants in pathogens by modulating cyclic-di-GMP levels. Open Biology. 6 (11), 160162 (2016).
- El Haj, C., Lichtenberg, M., Nielsen, K. L., Bjarnsholt, T., Jensen, P. O. Catalase protects biofilm of Staphylococcus aureus against daptomycin activity. Antibiotics. 10 (5), 511 (2021).
- Ghimire, N., et al. Direct microscopic observation of human neutrophil-Staphylococcus aureus interaction in vitro suggests a potential mechanism for initiation of biofilm infection on an implanted medical device. Infection and Immunity. 87 (12), 00745 (2019).
- Bhattacharya, M., et al. Leukocidins and the nuclease nuc prevent neutrophil-mediated killing of Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 88 (10), 00372 (2020).
- Bogachev, M. I., et al. Fast and simple tool for the quantification of biofilm-embedded cells sub-populations from fluorescent microscopic images. PLoS One. 13 (5), 0193267 (2018).
- Kerstens, M., et al. A flow cytometric approach to quantify biofilms. Folia Microbiologica. 60 (4), 335-342 (2015).
- Meyle, E., et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation. The International Journal of Artificial Organs. 33 (9), 608-620 (2010).
- Oveisi, M., et al. Novel assay to characterize neutrophil responses to oral biofilms. Infection and Immunity. 87 (2), 00790 (2019).
- Leid, J. G., Shirtliff, M. E., Costerton, J. W., Stoodley, P. Human leukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms. Infection and Immunity. 70 (11), 6339-6345 (2002).
- Fey, P. D., et al. A genetic resource for rapid and comprehensive phenotype screening of nonessential Staphylococcus aureus genes. mBio. 4 (1), 00537 (2013).
- Cody, W. L., et al. Skim milk enhances the preservation of thawed -80 degrees C bacterial stocks. Journal of Microbiological Methods. 75 (1), 135-138 (2008).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, 3064 (2012).
- Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L., Fernandes, E. Optimization of experimental settings for the analysis of human neutrophils oxidative burst in vitro. Talanta. 78 (4-5), 1476-1483 (2009).
- Merritt, J. H., Kadouri, D. E., O'Toole, G. A. Growing and analyzing static biofilms. Current Protocols in Microbiology. , Chapter 1 Unit 1B 1 (2005).
- Nauseef, W. M. Isolation of human neutrophils from venous blood. Methods in Molecular Biology. 412, 15-20 (2007).
- Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clinical and Vaccine Immunology. 19 (7), 1065-1074 (2012).
- Quach, A., Ferrante, A. The application of dextran sedimentation as an initial step in neutrophil purification promotes their stimulation, due to the presence of monocytes. Journal of Immunology Research. 2017, 1254792 (2017).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., McPhail, L. C. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. Journal of Leukocyte Biology. 67 (3), 396-404 (2000).
- Staats, A., et al. Rapid aggregation of Staphylococcus aureus in synovial fluid is influenced by synovial fluid concentration, viscosity, and fluid dynamics, with evidence of polymer bridging. mBio. , 0023622 (2022).
- Chiu, I. M., et al. Bacteria activate sensory neurons that modulate pain and inflammation. Nature. 501 (7465), 52-57 (2013).
- Hartig, S. M. Basic image analysis and manipulation in ImageJ. Current Protocols in Molecular Biology. 102 (1), 14-15 (2013).
- Heydorn, A., et al. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146 (10), 2395-2407 (2000).
- Hartmann, R., et al. Quantitative image analysis of microbial communities with BiofilmQ. Nature Microbiology. 6 (2), 151-156 (2021).
- Luo, T. L., et al. Introducing BAIT (Biofilm Architecture Inference Tool): a software program to evaluate the architecture of oral multi-species biofilms. Microbiology. 165 (5), 527-537 (2019).
- Naves, P., et al. Measurement of biofilm formation by clinical isolates of Escherichia coli is method-dependent. Journal of Applied Microbiology. 105 (2), 585-590 (2008).
- Eze, E. C., El Zowalaty, M. E. Combined effects of low incubation temperature, minimal growth medium, and low hydrodynamics optimize Acinetobacter baumannii biofilm formation. Infection and Drug Resistance. 12, 3523-3536 (2019).
- Harris, L. G., Tosatti, S., Wieland, M., Textor, M., Richards, R. G. Staphylococcus aureus adhesion to titanium oxide surfaces coated with non-functionalized and peptide-functionalized poly(L-lysine)-grafted-poly(ethylene glycol) copolymers. Biomaterials. 25 (18), 4135-4148 (2004).
- Miao, J., et al. Biofilm formation of Staphylococcus aureus under food heat processing conditions: first report on cml production within biofilm. Scientific Reports. 9 (1), 1312 (2019).
- Lade, H., et al. Biofilm formation by Staphylococcus aureus clinical isolates is differentially affected by glucose and sodium chloride supplemented culture media. Journal of Clinical Medicine. 8 (11), 1853 (2019).
- Guzel Kaya, G., et al. Antibacterial activity of linezolid against gram-negative bacteria: utilization of epsilon-Poly-l-Lysine capped silica xerogel as an activating carrier. Pharmaceutics. 12 (11), 1126 (2020).
- Clinton, A., Carter, T. Chronic wound biofilms: pathogenesis and potential therapies. Laboratory Medicine. 46 (4), 277-284 (2015).
- Scheel-Toellner, D., et al. Reactive oxygen species limit neutrophil life span by activating death receptor signaling. Blood. 104 (8), 2557-2564 (2004).
- Pestrak, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa rugose small-colony variants evade host clearance, are hyper-inflammatory, and persist in multiple host environments. PLoS Pathogens. 14 (2), 1006842 (2018).
- Guerra, F. E., et al. Staphylococcus aureus SaeR/S-regulated factors reduce human neutrophil reactive oxygen species production. Journal of Leukocyte Biology. 100 (5), 1005-1010 (2016).
- Suo, Y., Huang, Y., Liu, Y., Shi, C., Shi, X. The expression of superoxide dismutase (SOD) and a putative ABC transporter permease is inversely correlated during biofilm formation in Listeria monocytogenes 4b G. PLoS One. 7 (10), 48467 (2012).
- Olwal, C. O., Ang'ienda, P. O., Ochiel, D. O. Alternative sigma factor B (sigma(B)) and catalase enzyme contribute to Staphylococcus epidermidis biofilm's tolerance against physico-chemical disinfection. Scientific Reports. 9 (1), 5355 (2019).
- Bhattacharya, M., et al. Staphylococcus aureus biofilms release leukocidins to elicit extracellular trap formation and evade neutrophil-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (28), 7416-7421 (2018).
- Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
- Dworsky, E. M., et al. Novel in vivo mouse model of implant related spine infection. Journal of Orthopaedic Research. 35 (1), 193-199 (2017).
- Pletzer, D., Mansour, S. C., Wuerth, K., Rahanjam, N., Hancock, R. E. New mouse model for chronic infections by gram-negative bacteria enabling the study of anti-infective efficacy and host-microbe interactions. mBio. 8 (1), 00140 (2017).
- Davis, M. M. A prescription for human immunology. Immunity. 29 (6), 835-838 (2008).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).
