Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

قياس معدلات دوران البروتين في الخلايا المستزرعة الشائخة وغير المنقسمة مع وضع العلامات الأيضية وقياس الطيف الكتلي

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63835
Automatic Translation
1, 1, 2
1Laboratory of Genetics and Genomics, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health, 2Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health

Summary

يصف هذا البروتوكول سير العمل لوضع العلامات الأيضية للخلايا الشائخة وغير المنقسمة باستخدام SILAC النبضي ، وتحليل مطياف الكتلة غير المستهدف ، وحساب مبسط لعمر نصف البروتين .

Abstract

أظهرت الأدلة المتزايدة أن تراكم الخلايا الشائخة في الجهاز العصبي المركزي يساهم في الاضطرابات العصبية التنكسية مثل مرض الزهايمر وأمراض باركنسون. الشيخوخة الخلوية هي حالة من توقف دورة الخلية الدائمة التي تحدث عادة استجابة للتعرض لضغوط شبه مميتة. ومع ذلك ، مثل الخلايا الأخرى غير المنقسمة ، تظل الخلايا الشائخة نشطة استقلابيا وتؤدي العديد من الوظائف التي تتطلب متطلبات نسخ وانتقالية فريدة وتغييرات واسعة النطاق في البروتينات داخل الخلايا والمفرزة. إن فهم كيفية تغير تخليق البروتين ومعدلات الاضمحلال أثناء الشيخوخة يمكن أن يسلط الضوء على الآليات الأساسية للشيخوخة الخلوية وإيجاد طرق علاجية محتملة للأمراض التي تتفاقم بسبب الخلايا الشائخة. تصف هذه الورقة طريقة لتقييم نصف عمر البروتين على نطاق البروتين في الخلايا غير المنقسمة باستخدام وسم النظائر المستقرة النبضية بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (pSILAC) بالاشتراك مع قياس الطيف الكتلي. يتضمن pSILAC وضع العلامات الأيضية للخلايا ذات الإصدارات المستقرة المحتوية على النظائر الثقيلة من الأحماض الأمينية. إلى جانب أساليب قياس الطيف الكتلي الحديثة ، تمكن pSILAC من قياس دوران البروتين لمئات أو آلاف البروتينات في مخاليط معقدة. بعد وضع العلامات الأيضية ، يمكن تحديد ديناميكيات دوران البروتينات بناء على الإثراء النسبي للنظائر الثقيلة في الببتيدات المكتشفة بواسطة مطياف الكتلة. في هذا البروتوكول ، يتم وصف سير العمل لتوليد ثقافات الخلايا الليفية الشائخة والخلايا الليفية الهادئة التي تم اعتقالها بشكل مماثل ، بالإضافة إلى مسار زمني مبسط لوسم pSILAC بنقطة واحدة يزيد من تغطية معدلات دوران البروتين المتوقعة. وعلاوة على ذلك، يقدم خط أنابيب لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي pSILAC وحساب سهل الاستعمال لمعدلات تحلل البروتين باستخدام جداول البيانات. يمكن توسيع تطبيق هذا البروتوكول إلى ما وراء الخلايا الشائخة إلى أي خلايا مستزرعة غير منقسمة مثل الخلايا العصبية.

Introduction

تم تحديد الشيخوخة لأول مرة على أنها حالة من توقف النمو إلى أجل غير مسمى أظهرتها الخلايا الأولية المستزرعة بعد الوصول إلى الإرهاق التكراري1. وقد تبين منذ ذلك الحين أن الشيخوخة يمكن أن تنشأ استجابة للعديد من الإهانات الخلوية ، بما في ذلك الضغوط السامة والميتوكوندريا والأورام ، من بين أمور أخرى2. في حين أن الشيخوخة لها العديد من الأدوار المهمة من الناحية الفسيولوجية ، مثل قمع الورم والتئام الجروح ، فإن تراكم الخلايا الشائخة أثناء الشيخوخة يرتبط بمجموعة من الآثار الضارة على الصحة3 ، بما في ذلك العديد من الحالات العصبية التنكسية4،5،6. يحدث الشيخوخة الخلوية في أنواع متعددة من خلايا الدماغ ، بما في ذلك الخلايا العصبية7،8،9،10 ، والخلايا النجمية 11 ، والخلايا الدبقية الصغيرة 12 ، وسلائف الخلايا قليلة التغصن 13 ، وتساهم في التنكس العصبي والخلل المعرفي. وقد ثبت أن قلة الأميلويد بيتا ، وهي واحدة من السمات المميزة لمرض الزهايمر14 ، تسرع الشيخوخة العصبية13،15،16. كما ارتبط الانتشار المتزايد للخلايا الشائخة بمرض باركنسون17 ، وخاصة الناشئة عن الضغوطات البيئية11,18. الأهم من ذلك ، أن القضاء الانتقائي على الخلايا الشائخة في النماذج قبل السريرية يطيل العمر ويخفف من العديد من الأمراض المرتبطة بالعمر3،5،12 ويحسن العجز المعرفي8،11،12،13. وهكذا برزت الخلايا الشائخة كأهداف علاجية واعدة لعلاج العديد من الحالات المرتبطة بالعمر.

يحدث الكثير من التأثير الضار للخلايا الشائخة بسبب النمط الظاهري الإفرازي المرتبط بالشيخوخة (SASP) ، وهو خليط معقد من الجزيئات النشطة بيولوجيا التي تفرزها الخلايا الشائخة التي يمكن أن تسبب التهابا موضعيا ، وتولد الأوعية الدموية ، وتدمير المصفوفة خارج الخلية ، وانتشار الشيخوخة في الأنسجة المحيطة19،20،21 . يمثل SASP أيضا ظاهرة بيولوجية مثيرة للاهتمام للشيخوخة لأنه يتطلب جهدا كبيرا في النسخ والترجمة أثناء حالة توقف دورة الخلية. في الواقع ، ثبت أن الخلايا الشائخة تظهر انخفاضا في التكوين الحيوي للريبوسوم 22،23،24 التي يجب أن تقلل من تخليق البروتين. بدلا من ذلك ، تترجم الخلايا الشائخة بقوة بعض البروتينات ، وخاصة عوامل SASP ، وتؤثر على عملية التمثيل الغذائي للأنسجة المحيطة25. وبالتالي ، هناك اهتمام كبير بفهم كيف تستمر الخلايا الشائخة التي تخضع لتوقف دائم في دورة الخلية في الحفاظ على توازن البروتين بينما تعبر في الوقت نفسه بقوة عن عوامل SASP وغيرها من البروتينات المختارة.

تصف هذه الطريقة كيفية استخدام قياس الطيف الكتلي ووضع العلامات على النظائر المستقرة نبضيا بواسطة الأحماض الأمينية في زراعة الخلايا (pSILAC) لقياس نصف عمر البروتينات في الخلايا الشائخة على نطاق واسع من البروتيوم على نطاق واسع من البروتينات. في SILAC التقليدي ، يتم تصنيف الخلايا المستزرعة بالكامل بشكل استقلابي مع نظائر ثقيلة وخفيفة غير مشعة من الأحماض الأمينية للتحليل النهائي لوفرة البروتين. تم تطبيق هذه الطريقة سابقا لتقييم تغيرات الوفرة بشكل شامل وكمي في SASP للخلايا الليفية المستزرعة26. في pSILAC ، يتم تصنيف الخلايا بشكل مماثل على التمثيل الغذائي مع نبضة من النظائر الثقيلة التي تتبع وضع العلامات مسبقا مع النظير الخفيف ، ثم يتم حصادها على فترات زمنية واحدة أو أكثر. ثم تستخدم معدلات دمج النظائر الثقيلة في إشارة إلى النظائر الخفيفة الموجودة مسبقا لحساب معدلات دوران البروتين النسبية. بشكل عام ، يتم استخدام نظائر الأرجينين والليسين لأن التربسين يشق في تلك المخلفات. وبالتالي ، فإن جميع الببتيدات من الهضم القياسي من المحتمل أن تحتوي على التسمية الثقيلة. أزواج الببتيدات التي تختلف فقط عن طريق وجود أو عدم وجود ليسين ثقيل أو أرجينين متطابقة كيميائيا ويمكن تمييزها وتحديدها كميا بواسطة مطياف الكتلة. وبعد تحليل قياس الطيف الكتلي، يمكن تحديد الببتيدات على أنها مركبة حديثا أو موجودة مسبقا استنادا إلى وجود أو عدم وجود الملصق النظيري في عمليات تحديد الببتيد الناتجة. يمكن بعد ذلك تحديد معدلات دوران البروتين عن طريق تركيب نسبة الببتيدات الثقيلة (13 C-15 N) على الببتيدات الخفيفة (12 C-14N) لبروتين معين إلى النماذج الحركية للنمو الأسي أو الاضمحلال27,28. تم استخدام pSILAC في عدة مقارنات لمعدلات دوران البروتين29،30،31،32 وهي حاليا الطريقة الأكثر شمولا وعالية الإنتاجية لقياس عمر نصف البروتين .

يفصل هذا البروتوكول إعداد الخلايا الشائخة بالتوازي مع الخلايا الهادئة المماثلة التي يتم إيقافها للنمو في المزرعة ، تليها العلامات الأيضية باستخدام pSILAC. ثم يتم حصاد الخلايا وتجانسها إلى ليزات ومعالجتها للحصول على مطياف الكتلة وتحليلها. ثم تستخدم البيانات التي تم الحصول عليها من قياس الطيف الكتلي لتحديد نصف عمر البروتين باستخدام طريقة كمية مبسطة تستخدم نقطة زمنية واحدة وحسابات نصف العمر التي يتم إجراؤها في جدول بيانات. باستخدام هذا النهج ، يمكن قياس تقديرات نصف عمر البروتين بطريقة شاملة وكمية أكثر أصالة للظروف الخلوية غير المضطربة من البروتوكولات التي تستخدم حاصرات تخليق البروتين أو دورانه.

Protocol

1. تحضير الخلايا الهادئة والخلايا التي تصبح شائخة بسبب التعرض للإشعاع المؤين (IR)

ملاحظة: يمكن إحداث الشيخوخة الخلوية والسكون باستخدام طرق متعددة ، كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر 33،34،35. قد تعتمد المحفزات المستخدمة للحث على الشيخوخة والسكون على نوع الخلية ذات الاهتمام والمسألة البيولوجية قيد البحث. الخلايا المستخدمة في هذه الدراسة متاحة تجاريا.

  1. إذابة الخلايا الليفية البشرية ثنائية الصبغيات IMR-90 (~ 1 × 106 خلايا) من المبرد وطبقها في 20 مل من DMEM مكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) (الجدول 1) على لوحة 150 مم.
  2. تنمو الخلايا في ظروف الأكسجين الفسيولوجية (3٪ O 2 ، 5٪ CO2 ، 37 درجة مئوية) وتوسيع الثقافات في 10٪ وسائط تحتوي على FBS حتى يتم إنشاء نسخ متماثلة كافية للخلايا الهادئة والشيخوخة (يوصى بتكرار 3-5 على الأقل لكل حالة).
    ملاحظة: تعد زراعة الخلايا بالأكسجين الفسيولوجي (3٪) مثالية لخلايا الخلايا الليفية البشرية الأولية ، ولكن قد تختلف ظروف الزراعة المناسبة لأنواع الخلايا الأخرى ويجب تحديدها على أساس كل حالة على حدة.
  3. توليد خلايا شائخة عن طريق تعريض الخلايا المنتشرة إلى 15 رماديا (Gy) من الإشعاع المؤين (IR).
    ملاحظة: قد تختلف شدة التعرض للإشعاع وفقا لنوع الخلية. في حين يتم استخدام 15 Gy هنا ، فإن 10 Gy هي أيضا جرعة إشعاعية شائعة الاستخدام للخلايا الليفية. قد تتطلب الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا الوحيدة ، جرعة منخفضة تصل إلى 5 Gy. يتم تحديد الجرعة بشكل عام تجريبيا عن طريق وزن الجدوى مقابل تحريض الشيخوخة.
    1. تعريض الخلايا عند التقاء 40٪ -60٪ للأشعة تحت الحمراء في الوسائط التي تحتوي على 10٪ FBS.
    2. بعد التعرض للأشعة تحت الحمراء، قم بالتغيير إلى وسائط جديدة تحتوي على 10٪ FBS.
    3. تغيير الوسائط (20 مل، تحتوي على 10٪ FBS) كل يومين لمدة 8 أيام.
      ملاحظة: تتعرض الخلايا للأشعة تحت الحمراء عند التقاء أقل لأن الخلايا المعالجة بالأشعة تحت الحمراء سوف تتوسع في الثقافة قبل أن تتوقف عن النمو. في هذه التجربة ، لم تكن الخلايا خلايا منقسمة أثناء إنشاء الشيخوخة ، وبينما أصبحت أكثر التقاء ، إلا أنها لا تزال تعرض علامات الخلايا الشائخة عند الحصاد. في الخلايا الليفية ، يتطور النمط الظاهري المسن في غضون 7-10 أيام.
  4. توليد خلايا تحكم هادئة عن طريق تغيير الوسائط الموجودة على الخلايا المنتشرة المطلية إلى وسائط تحتوي على 0.2٪ FBS (تجويع المصل) (الجدول 1).
    1. استمر في نمو الخلايا التي سيتم استخدامها للتحكم في السكون في الوسائط التي تحتوي على 10٪ FBS حتى اليوم 4 بعد تعرض الخلايا الشائخة للأشعة تحت الحمراء ، والانقسام عند الضرورة.
    2. في اليوم الرابع بعد الأشعة تحت الحمراء، قم بتغيير وسائط الخلايا الهادئة إلى 20 مل من الوسائط التي تحتوي على 0.2٪ FBS (الجدول 1) واستمر في النمو لمدة 6 أيام أخرى، مع تغيير الوسائط كل يومين.
      ملاحظة: حتى في الوسائط التي تحتوي على 0.2٪ FBS ، ستستمر الخلايا الليفية في النمو إلى حد ما وقد تبدو متقاربة بحلول نهاية الحصاد. كقاعدة عامة ، تهدف إلى جمع الخلايا الهادئة عندما تصل إلى التقاء مماثل لتلك الموجودة في مزارع الخلايا الشائخة.

2. وضع العلامات على الخلايا ل SILAC النبضي وحصاد الليزات

  1. تغيير الوسائط على كل من الخلايا الشائخة والهادئة (12 لوحة) إلى SILAC Light (الجدول 1) وتنمو لمدة يومين.
    ملاحظة: يساعد هذا التصنيف على تقليل ضوضاء الخلفية نظرا لوجود وفرة طبيعية منخفضة تبلغ 13درجة مئوية و 15درجة مئوية. يمكن تخطي هذه الخطوة في ظروف الحد من الكاشف ولكنها ستؤدي إلى مبالغة طفيفة في تقدير تخليق البروتين الجديد.
  2. استبدل الوسائط ب SILAC DMEM (الجدول 1) لوضع العلامات الأيضية.
    ملاحظة: تم تصميم وسائط سيلاك DMEM خصيصا لتحتوي على نظائر خفيفة أو ثقيلة بحتة من أرجينين وليسين لوضع العلامات الأيضية. ويجب عدم الاستعاضة عنها بتركيبات DMEM القياسية في الخطوتين الفرعيتين 2-2-1 أو 2-2-2.
    1. بالنسبة لثلاث لوحات قديمة وثلاث لوحات هادئة، استبدل الوسائط ب 30 مل من ضوء SILAC (الجدول 1) وتنمو لمدة 3 أيام دون تغيير الوسائط.
    2. بالنسبة لما لا يقل عن ثلاثة ألواح قديمة وثلاث لوحات هادئة ، استبدل الوسائط ب 30 مل من SILAC Heavy (الجدول 1) وتنمو لمدة 3 أيام دون تغيير الوسائط.
      ملاحظة: هناك خيار في هذه المرحلة لحصاد ما ستكون عليه الخلايا ذات العلامات الضوئية على الفور ، بدلا من تسميتها لمدة 3 أيام إضافية. بالنسبة لنقطة زمنية واحدة ، يفضل تسمية الخلايا الثقيلة والخفيفة لنفس الفترة كما هو الحال في هذا البروتوكول لتقليل تأثيرات الدفعات.
  3. افصل الخلايا عن ألواح الزراعة عن طريق إضافة 5 مل من كاشف التربسين المسخن مسبقا إلى كل طبق واحتضانه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  4. أعد تعليق الخلايا المنفصلة في 5 مل من نفس الوسائط المستخدمة في الزراعة (إما SILAC Light أو SILAC Heavy) إلى حجم إجمالي قدره 10 مل.
  5. حصاد الخلايا لاستخراج الليزات والتحقق من صحة علامات الشيخوخة.
    1. لكل تعليق، أليكوت 0.6 × 10 6 من الخلايا في 2 مل من الوسائط التي تحتوي على 0.2٪ FBS في طبق من6 آبار (طبقان، واحد للخلايا المستزرعة الخفيفة SILAC وواحد للخلايا المستزرعة الثقيلة SILAC) ووضعها في 37 درجة مئوية للحضانة بين عشية وضحاها.
      ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات (الخطوة الفرعية 2.5.1) للكشف عن نشاط β-galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-βGal) (الخطوة 3.1).
    2. لكل تعليق ، أليكوت 1 × 106 من الخلايا في أنبوب جهاز طرد مركزي دقيق وتدور لأسفل في جهاز طرد مركزي على الطاولة بأقصى سرعة لمدة دقيقة واحدة. إزالة supernatant وإعادة تعليق الكريات في 1 مل من الفينول ؛ في هذه الخطوة ، يمكن تنقية الحمض النووي الريبي بالكامل كما هو موضح في دليل مورد الفينول أو تخزينه على المدى الطويل عند -80 درجة مئوية.
      تحذير: الفينول قابل للتآكل ويجب التعامل معه حصريا في غطاء محرك السيارة مع قفازات ومعطف مختبري.
      ملاحظة: سيتم استخدام الحمض النووي الريبي المستخرج للكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال الذي يشفر عوامل SASP باستخدام النسخ العكسي (RT) متبوعا بتحليل PCR الكمي (Q) في الوقت الفعلي (RT-qPCR) (الخطوة 3.2). فحص آخر موثوق به لتحريض الشيخوخة هو اختبار لدمج 5-ethynyl dihydroxy uridine (EdU) ، مما يشير إلى وجود خلايا متكاثرة. ويمكن استخدام غياب الانتشار لتأكيد السكون والشيخوخة.
    3. انقل الخلايا المتبقية إلى الجليد وقم بالدوران لأسفل عند 300 × g و 4 °C.
  6. قم بإزالة supernatant واغسل الخلايا مرتين في 1 مل من PBS البارد لإزالة الوسائط / التربسين وتلوث البروتين الخارجي من مصل البقر الجنيني من وسط الثقافة.
  7. قم بتدوير الخلايا مرة أخرى ، وقم بإزالة supernatant ، وانتقل إلى التحلل.
  8. أعد تعليق كريات الخلايا في 150 ميكرولتر من اليوريا الطازجة 8 م 50 ملليمتر من محلول تحلل بيكربونات الأمونيوم (الجدول 1) ، واخلطها عن طريق السحب لأعلى ولأسفل.
  9. قم بسونيكات الليزات في سونيكتور مائي لمدة 2.5 دقيقة مع تشغيل / إيقاف تشغيل 30 ثانية عند طاقة متوسطة عند 4 درجات مئوية.
  10. انقل الليزات إلى كتلة حرارة 95 درجة مئوية مسخنة مسبقا وقم بتشويهها لمدة 4 دقائق.
  11. تدور أسفل lysates. يمكن الآن تخزين الليزات عند -80 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لتحديد الكمية.
  12. قم بعمل مخزون 30 ميكرولتر من التخفيفات 1:10 لكل محللة في Lysis Buffer.
  13. قم بقياس تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص BCA باستخدام منحنى قياسي تم إعداده في 1/10x Lysis Buffer المخفف في ddH2O. يمكن الآن تخزين Lysates عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.

3. التحقق من صحة الشيخوخة عن طريق نشاط β-Galactosidase المرتبط بالشيخوخة (SA-βGal) وتحليل RT-qPCR للحمض النووي الريبي المرسال المرتبط بالشيخوخة

ملاحظة: يتم تجميع المواد الأولية لهذه الخطوات خلال الخطوة 2.5

  1. بدءا من لوحات 6 آبار التي تم إعدادها في الخطوة الفرعية 2.5.1 ، قم بتحليل الخلايا لنشاط SA-βGal باستخدام مجموعة تلطيخ Senescence β-Galactosidase وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تصور التلطيخ تحت الحقل الساطع مع تمكين اللون ، كما هو موضح سابقا36.
    ملاحظة: يتم قياس SA-βGal كميا من خلال مقارنة النسبة المئوية للخلايا الموجبة (اللون الأزرق المرئي) في ظروف التحكم الشائخة مقابل ظروف التحكم الهادئة. يجب أن يكون ما لا يقل عن 70٪ من الخلايا إيجابية SA-βGal للتأكيد الناجح للشيخوخة. يجب أن تكون خلايا التحكم الهادئة أقل من 10٪ إيجابية ل SA-βGal.
  2. استخراج الحمض النووي الريبي من تعليق الفينول (الخطوة الفرعية 2.5.2) وتحليلها باستخدام RT-qPCR لزيادة مستويات الحمض النووي الريبي المرسال التي تشفر عوامل SASP (IL6 ، CXCL8 ، IL1B) ، وعلامات دورة الخلية (CDKN2A / p16 ، CDKN1A / p21) ، وغيرها من مؤشرات الشيخوخة (فقدان LMNB1 و PCNA).
    ملاحظة: الحمض النووي الريبي غير مستقر وبالتالي يجب التعامل معه بمعدات خالية من RNase وقفازات جديدة وعلى الجليد ما لم يذكر خلاف ذلك في البروتوكول.
    1. بدءا من تعليق الفينول ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 1 مل من الفينول وقم بالدوران لأسفل عند 12000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بإزالة الطور المائي بعناية وإضافة حجم 1: 1 من الأيزوبروبانول ، و 15 ميكروغرام من المرسب المشترك للجليكوجين ، ثم احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق لترسيب الحمض النووي الريبي.
    3. بعد الحضانة ، قم بتكوير الحمض النووي الريبي عن طريق الطرد المركزي عند 12000 × g لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية متبوعا بغسل في 75٪ EtOH يساوي 1 حجم من الفينول المستخدم. إعادة تعليق الحمض النووي الريبي في 50 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من النوكليز ؛ يمكن تخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
    4. إلى عينات الحمض النووي الريبي ، أضف 38 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من النوكليز ، و 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتفاعل الحمض النووي 10x ، و 2 ميكرولتر من DNase I متبوعا بالخلط.
      ملاحظة: إن توليد مزيج مشترك من جميع الكواشف في الخطوة الفرعية 3-2-3 مضروبا في عدد العينات للمعالجة من أجل التوزيع المتساوي على العينات هو أفضل الممارسات.
    5. احتضان عينات الحمض النووي الريبي المعالجة بالحمض النووي الريبي المعالجة بتقنية DNase عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    6. إزالة DNase من العينات باستخدام حجم واحد من خليط الفينول / الكلوروفورم / كحول الأيزو أميل (25:24:1) عن طريق الدوامة والدوران بسرعة قصوى في جهاز طرد مركزي على الطاولة لمدة 5 دقائق ؛ سيتم احتواء الحمض النووي الريبي في المرحلة المائية.
    7. كرر الخطوتين الفرعيتين 3.2.2 و3.2.3 لتعجيل الحمض النووي الريبي. إعادة التعليق في 20 ميكرولتر من الماء المقطر الخالي من النوكليز ؛ يمكن تخزين الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
    8. توليد cDNA من الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق احتضان 0.5-1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي النقي مع 200 U من النسخ العكسي ، و 100 pMol الاشعال العشوائي ، و 10 mM من مزيج dNTP في مخزن مؤقت تفاعل 1x مزود بالنسخ العكسي ؛ احتضن لمدة 10 دقائق عند 25 درجة مئوية ، ثم لمدة 30 دقيقة عند 50 درجة مئوية ، مع خطوة تعطيل نهائية عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    9. قم بتحليل cDNA من الخطوة RT (الخطوة الفرعية 3.2.3) من خلايا التحكم الهادئة والشيخوخة باستخدام تحليل PCR الكمي (q) في الوقت الفعلي لتقييم مستوى علامات mRNA المعروفة بزيادتها (CDKN2A / p16 و CDKN1A / p21 و IL1B و IL6 و CXCL8 mRNAs) أو انخفاضها (LMNB1 و PCNA mRNAs) مع الشيخوخة كما هو موضح في مكان آخر. ACTB mRNA ، ترميز بروتين التدبير المنزلي β-Actin ، غالبا ما يكون mRNA جيدا لتطبيع الاختلافات في مواد الإدخال. وترد المواد التمهيدية المستخدمة في الجدول 2.
      ملاحظة: يعتمد التحليل النسبي RT-qPCR على افتراضات كفاءة الربط المتساوية بين أزواج التمهيدي المستهدفة وزوج التمهيدي المرجعي. يجب اختبار هذه الافتراضات لمجموعات تمهيدية جديدة كما هو مفصل في مكان آخر37. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تكون العلامات المرجعية ثابتة بين أنواع الخلايا التي تتم مقارنتها ، وقد تم تحديد العديد من الخيارات الإضافية للخلايا الشائخة سابقا38.

4. في محلول التربسين الهضم

ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا، من الأهمية بمكان استخدام المخازن المؤقتة من فئة قياس الطيف الكتلي والمذيبات والمواد الكيميائية لمنع التداخل من الشوائب أثناء تحليل مطياف الكتلة. يجب أن تتكون جميع المخازن المؤقتة من مكونات مناسبة لتحليل مطياف الكتلة الترادفية للكروماتوغرافيا السائلة ، بما في ذلك الماء والأسيتونيتريل. ارجع إلى جدول المواد للحصول على قائمة بالمواد الكيميائية والمذيبات المناسبة.

  1. Aliquot 50 ميكروغرام من كل عينة بروتين في أنابيب جديدة وجلب إلى أحجام متساوية مع Lysis Buffer.
  2. لكل عينة، أضف DTT إلى تركيز نهائي قدره 20 مللي متر لتقليل روابط ثاني كبريتيد.
  3. احتضن العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز ، ثم اترك العينات تبرد في درجة حرارة الغرفة (RT ، ~ 10 دقائق).
  4. أضف يودوأسيتاميد إلى تركيز نهائي قدره 40 مللي متر إلى ألكيلات مجموعات السلفهيدرول التي تم تخفيضها في الخطوة السابقة. احتضان العينات في RT في الظلام لمدة 30 دقيقة.
  5. قم بتخفيف كل عينة إلى أقل من 1 مليون يوريا باستخدام مخزن مؤقت يتكون من بيكربونات الأمونيوم 50 ملليمتر. تحقق مما إذا كان الرقم الهيدروجيني حوالي 8 عن طريق سحب كمية صغيرة من العينة على شرائط الأس الهيدروجيني.
  6. أضف 1 ميكروغرام من التربسين إلى كل عينة للحصول على 50 ميكروغرام من بروتين البدء ، أو عند 1:50 التربسين: نسبة البروتين ، حسب الكتلة ، إذا كنت تهضم كمية بروتين مختلفة. على سبيل المثال ، سيتم إضافة 3 ميكروغرام من التربسين لهضم 150 ميكروغرام من البروتين.
  7. احتضان العينات بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز لهضم البروتينات إلى الببتيدات.
  8. أضف حمض الفورميك إلى 1٪ ، من حيث الحجم ، من كل عينة لإخماد هضم البروتين.
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية واستمر في الخطوة التالية في وقت لاحق إذا لزم الأمر.

5. تنظيف العينات باستخدام استخراج المرحلة الصلبة (SPE)

ملاحظة: يتطلب بروتوكول الاستخراج ذي الطور الصلب هذا خراطيش استخراج ذات طور صلب وإعداد مشعب فراغ. يمكن تنفيذ بروتوكولات استخراج الطور الصلب المكافئة الأخرى (SPE) وفقا لتقدير الباحث قبل تحليل مطياف الكتلة.

  1. استعد ل SPE عن طريق وضع خراطيش استخراج ذات طور صلب على مشعب فراغ ، باستخدام خرطوشة استخراج واحدة لكل عينة.
    ملاحظة: ارجع إلى إرشادات الشركة المصنعة لكمية المواد الماصة التي سيتم استخدامها في بروتوكول SPE. بالنسبة ل 50 ميكروغرام من عينات الببتيد ، يوصى باستخدام خراطيش ماصة 10 ملغ.
  2. قم بتكييف كل خرطوشة SPE بإضافة 800 ميكرولتر من SPE Elution Buffer (الجدول 1) واستخدم شفط الفراغ لسحب المذيب عبر الخرطوشة.
  3. كرر الخطوة 5.2.
  4. قم بموازنة كل خرطوشة بإضافة 800 ميكرولتر من SPE Wash Buffer (الجدول 1) واستخدم شفط الفراغ لسحب المخزن المؤقت عبر الخراطيش.
  5. كرر الخطوة 5.4 مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث مرات.
  6. قم بتحميل عينات الببتيد في خراطيش SPE واستخدم شفط الفراغ لسحب العينات من خلال الخراطيش.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، ترتبط الببتيدات بالمادة الماصة داخل الخراطيش.
  7. اغسل كل خرطوشة باستخدام SPE Wash Buffer واستخدم شفط الفراغ لسحب المخزن المؤقت عبر الخراطيش.
  8. كرر الخطوة 5.7 مرتين إضافيتين لما مجموعه ثلاث غسلات.
  9. قبل خطوة الاستخلاص، قم بترتيب أنابيب التجميع داخل مشعب التفريغ أسفل كل خرطوشة، مما يضمن بعناية المواءمة بين أنابيب التجميع والخراطيش.
  10. لتلوت الببتيدات ، أضف 800 ميكرولتر من SPE Elution Buffer إلى كل خرطوشة وقم بإخراج الببتيدات في أنابيب التجميع مع شفط الفراغ.
  11. كرر الخطوة 5.10 مع 400 ميكرولتر من SPE Elution Buffer.
  12. قم بإزالة عينات الببتيد من مشعب الفراغ وجففها تماما في مكثف فراغ (يستغرق التجفيف حوالي 3 ساعات).
    ملاحظة: يمكن إيقاف التجربة مؤقتا هنا. قم بتجميد العينات عند -80 درجة مئوية واستمر في وقت لاحق إذا لزم الأمر.

6. تحليل قياس الطيف الكتلي المعتمد على البيانات (DDA)

  1. أعد تعليق عينات الببتيد بتركيز 400 نانوغرام / ميكرولتر في مخزن مؤقت يتكون من 0.2٪ من حمض الفورميك في الماء.
  2. للمساعدة في إعادة إذابة الببتيدات ، دوامة العينات لمدة 5 دقائق. ثم ، سونيك العينات لمدة 5 دقائق في سونيكاتور حمام مائي.
  3. قم بتكوير أي مواد غير قابلة للذوبان عن طريق عينات الطرد المركزي عند 15000 × g لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. انقل الببتيد الفائق إلى قوارير MS.
  4. أضف معايير الببتيد المفهرسة لوقت الاحتفاظ (iRT) المفضلة لكل عينة بتركيز 1:30 iRT:sample، حسب الحجم.
  5. تقديم العينات للتحليل البروتيني باستخدام تحليل الطيف الكتلي الترادف الترادف للكروماتوغرافيا السائلة (LC-MS/MS).
    1. استخدم إعدادات LC-MS/MS الموصى بها للتحليل غير المستهدف بواسطة مرفق قياس الطيف الكتلي. ويرد مثال على إعدادات التحليل في الشكل 3، الذي تم تكوينه للتحليل على مطياف كتلة Orbitrap مقترنا بنظام كروماتوغرافيا سائلة نانوية في وضع التدفق النانوي. وفيما يلي مثال على البروتوكول.
    2. قم بتحميل 1 ميكروغرام (5 ميكرولتر) من كل عينة على عمود فخ (طوله 1 سم × قطره 100 ميكرومتر) واغسله بمذيب التحميل (الجدول 1) بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة لمدة 5 دقائق.
    3. قم بتحميل العينات على عمود تحليلي (طوله 50 سم × قطره 100 ميكرومتر) بمعدل تدفق 400 نانولتر/دقيقة.
    4. قم بالتخلص من الببتيدات على مدى 90 دقيقة من التدرج الخطي باستخدام مذيب عضوي (0.2٪ حمض الفورميك و 99.8٪ أسيتونيتريل) والمذيب غير العضوي (0.2٪ حمض الفورميك في 99.8٪ من الماء) ، يتراوح من 5٪ إلى 35٪ من المذيبات العضوية.
    5. احصل على بيانات قياس الطيف الكتلي في الوضع المعتمد على البيانات من خلال دورة مستمرة من عمليات مسح MS1 (دقة 60,000، وهدف AGC 3e6، ووقت تراكم أقصى يبلغ 100 مللي ثانية، ونطاق كتلة 400-1,600 m/z) متبوعا ب 20 عملية مسح MS2 تعتمد على البيانات (دقة 15,000، وهدف 1e5 AGC، ووقت حقن أقصى يبلغ 25 مللي ثانية، ونوافذ عزل بعرض 1.6 m/z) مع تجزئة HCD (طاقة تصادم طبيعية تبلغ 27٪).
  6. بعد الحصول على MS لجميع العينات ، قم باستيراد ملفات قياس الطيف الكتلي الخام إلى أداة برمجية لتحليل البروتينات لقياس الطيف الكتلي لتحديد مناطق ذروة الببتيد وتحديدها كميا.
    ملاحظة: لتحديد الببتيدات والبروتينات في هذه التجربة، تم استخدام أداة البحث في قاعدة بيانات التميمة مع قاعدة بيانات تسلسل البروتيوم البشري UniProt (معرف البروتين: UP000005640). تم تحديد معلمات البحث التالية في التميمة:
    • الكمية: SILAC K + 8 R + 10 [MD] إنزيم: التربسين / ف تعديل ثابت: كارباميدوميثيل (C)
    • التعديلات المتغيرة: أسيتيل (بروتين N-term) ، Gln->pyro-Glu (N-term Q) ، أكسدة (M) ، التسمية: 13C (6) 15N (2) (K) ، التسمية: 13C (6) 15N (4) (R)
    • تحمل كتلة الببتيد: 10 جزء في المليون
    • التسامح كتلة شظايا: 0.08 دا
    • ماكس الانقسامات المفقودة: 2
    • كانت جميع المعلمات غير المحددة افتراضية
  7. حدد كميا مناطق ذروة الببتيد للببتيدات الثقيلة والخفيفة في أداة برمجية تكميم البروتين. لتحديد مناطق الذروة في هذه التجربة ، تم استخدام منصة برمجيات Skyline المجانية والمفتوحة المصدر39,40. تصدير مناطق ذروة الببتيد الثقيلة والخفيفة لتقدير عمر نصف البروتين.

7. حساب نصف عمر البروتين

  1. افتح مصنف تحليل SILAC (الجدول 3) إلى الورقة الأولى المسماة 1) البيانات الخام والصقها في معرفات UniProt وأسماء الجينات ومناطق الذروة الثقيلة ومناطق الذروة الخفيفة في الأعمدة المشار إليها (SH = Senescent-Heavy و SL = Senescent-Light وCH = Control (quiescent) -heavy و CL = Control (quiescent) -Light).
  2. افتح الأوراق 2-4 وتأكد من أن عمودي UniProt ID و Gene يطابقان عدد البروتينات المحددة من التحليل (حددت هذه التجارب 841 بروتينا). سيتم ملء بقية الأعمدة تلقائيا بالبيانات بعد سحبها لتغطية البروتينات المحددة.
  3. افتح الورقة الرابعة المسماة 4) التحليل وإزالة الصفوف حيث يشير العمودان G و H إلى أن العينة خارج النطاق ؛ احتفظ بالصفوف التي تقرأ ضمن النطاق. سوف تملأ مؤامرة البركان في الورقة الخامسة تلقائيا.

Representative Results

يصف هذا البروتوكول طريقة لمقارنة نصف عمر البروتين عالميا بين خلايا التحكم الشائخة وغير المنقسمة باستخدام pSILAC والحد الأدنى من النقاط الزمنية. يفصل هذا البروتوكول توليد الخلايا الشائخة والهادئة في المزرعة ، ووضع العلامات الأيضية للخلايا ذات النظائر المستقرة للأرجينين والليسين على مدار 3 أيام ، وتحديد الوفرة النسبية لنظائر الببتيد الثقيلة والخفيفة عن طريق قياس الطيف الكتلي ، وحساب مباشر ويمكن الوصول إليه لنصف عمر البروتين باستخدام صيغ جداول البيانات (الشكل 1). هذه الطريقة مرنة للغاية ويمكن تكييفها مع العديد من أنواع الخلايا وظروفها.

كجزء من توليد الخلايا الشائخة لهذا البروتوكول ، يتم استخدام طريقتين للتحقق من صحة الشيخوخة: الخلايا الإيجابية SA-βGal التي تم تصورها بواسطة الفحص المجهري وزيادة مستويات علامات الشيخوخة التي تم تحديدها كميا باستخدام تحليل RT-qPCR. يجب أن يسفر قياس علامات الشيخوخة عن تمييز واضح بين الخلايا الهادئة والشيخوخة من أجل اعتبار المقارنات بين مجموعتي الخلايا صالحة. بالنسبة لنشاط SA-βGal ، يجب أن تظهر الخلايا الشائخة باللون الأزرق بينما لا تحتوي خلايا التحكم الهادئة على لون أو لون قليل جدا (الشكل 2A). يمكن تحديد هذا الفحص كميا عن طريق حساب الخلايا الإيجابية الملطخة باللون الأزرق كنسبة مئوية من إجمالي عدد الخلايا ، ثم مقارنة النسبة المئوية لمعدل الإيجابية بين الخلايا الهادئة والخلايا الشائخة. من المهم أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول في نفس الوقت لمقارنة كلتا الحالتين الخلويتين ؛ يعتمد نشاط SA-βGal على الرقم الهيدروجيني لمحلول التلطيخ ، لذلك يمكن أن تختلف النتائج اختلافا كبيرا بين الفحوصات ويجب اعتبارها مقياسا نوعيا.

سيظهر تحليل RT-qPCR لعلامات الشيخوخة مستويات عالية من mRNAs التي تشفر عوامل SASP (IL6 و CXCL8 و IL1B) ومثبطات دورة الخلية (CDKN2A / p16 و CDKN1A / p21) في معظم النماذج الشائخة. على الرغم من توقع بعض التباين بناء على نوع الخلية وحالة المزرعة ومحفز الشيخوخة 41,42 ، إلا أن معظم الخلايا الشائخة تعرض مستويات أعلى من خمسة أضعاف من IL6 و CXCL8 و CDKN1A / p21 mRNAs مقارنة بخلايا التحكم الهادئة ؛ وعلى العكس من ذلك، ينبغي أن تكون مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال LMNB1 والحمض النووي الريبوزي المرسال PCNA، التي تشفر علامات الانتشار، منخفضة أو غائبة في الخلايا الشائخة مقارنة بالخلايا الهادئة (الشكل 2B). إذا أخذنا معا ، فإن نسبة كبيرة من إيجابية SA-βGal والتعبير المتوقع عن لوحة من علامات mRNA المرتبطة بالشيخوخة كافية لتأكيد تحريض الشيخوخة في التجربة.

تتكون معالجة عينات البروتين لتحليل الطيف الكتلي من الهضم داخل المحلول (2 أيام) واستخراج الطور الصلب (4-6 ساعات). لإجراء تحليل بروتيني غير مستهدف ، يتم تقديم الببتيدات الناتجة لتحليل LC-MS / MS باستخدام الاكتساب المعتمد على البيانات (DDA). على أجهزة Orbitrap ، يمكن تحديد طريقة DDA في محرر طريقة برنامج أداة قياس الطيف الكتلي. وتظهر إعدادات مطياف الكتلة المستخدمة في هذه الدراسة في الشكل 3A. يمكن أيضا تحديد إعدادات الكروماتوغرافيا السائلة داخل محرر الطريقة. في هذه الدراسة ، تم استخدام تدرج خطي لمدة 90 دقيقة مع زيادة الطور العضوي (الأسيتونيتريل) (الشكل 3B). بعد الاستحواذ الناجح ، يجب أن يحتوي إجمالي تيار الأيونات (TIC) على إشارة مكثفة أثناء جزء التدرج الخطي من الطريقة (الشكل 3C). يصف هذا البروتوكول مثالا على بروتوكول على جهاز Orbitrap ، ولكن يمكن إجراء حساب نصف عمر البروتين على البيانات التي تم الحصول عليها من أي مطياف كتلي تم جمعه في وضع DDA ، وهو متاح على عدة أنواع من الأدوات (مثل Orbitraps وأدوات وقت الطيران) والبائعين. وستكون إعدادات الاقتناء فريدة من نوعها بالنسبة لنوع وتكوين الأداة المستخدمة، ويوصى باستخدام الإعدادات التي يقترحها مرفق قياس الطيف الكتلي. تتوافق هذه الطريقة أيضا مع الطرق غير DDA (SRM ، PRM ، DIA) ، طالما يمكن استخراج مناطق الذروة الكروماتوغرافية الكمية للقمم الثقيلة والخفيفة من ملفات البيانات الخام وإدخالها في صيغ جداول البيانات.

يتم البحث في ملفات قياس الطيف الكتلي الخام باستخدام واحدة من العديد من أدوات البحث المتاحة في قاعدة بيانات البروتينات لتحديد الببتيدات والبروتينات. على سبيل المثال ، استخدمت هذه الدراسة محرك البحث Mascot43. للحصول على مناطق الذروة الكروماتوغرافية لتحديد كمية الببتيدات الثقيلة والخفيفة ، يتم استيراد نتائج البحث في قاعدة البيانات إلى برنامج بروتيني قادر على مناطق الذروة الكروماتوغرافية مثل Skyline39,40. وسيكشف فحص كروماتوغرام الأيونات المستخرجة من الببتيدات (الشكل 4) عن النسبة النسبية لإشارات الببتيد الثقيلة والخفيفة. تشير نسبة أقل من إشارة الببتيد الثقيل بالنسبة لإشارة الببتيد الخفيفة في الخلايا الشائخة إلى معدل دوران أبطأ للبروتين (الشكل 4A) ، وتشير إشارة الببتيد الثقيلة الأعلى بالنسبة للضوء إلى معدل دوران أسرع للبروتين (الشكل 4B). يجب أن تظهر العينات غير المصنفة إشارة ببتيد ثقيلة قليلة أو معدومة. تعتبر أي إشارة ببتيد ثقيلة واضحة في العينات غير المصنفة ضوضاء خلفية وسيتم طرحها أثناء الحسابات النهائية. يجب تصدير التحديد الكمي لمناطق الذروة الكروماتوغرافية للببتيدات الخفيفة والثقيلة لجميع ظروف المعالجة ووضع العلامات من أجل الحساب اللاحق لمعدلات دوران البروتين والتحليل الإحصائي.

باستخدام تحليل نقطة زمنية واحدة ، فإن التحديد الكمي لعمر النصف للبروتين سهل التنفيذ ويمكن القيام به بسهولة في جداول البيانات. في الجدول 3 ، تم حساب عمر النصف ل 695 بروتينا تم تحديدها من تحليل مطياف الكتلة. بدءا من وفرة النظائر الثقيلة والخفيفة على مستوى البروتين لكل بروتين في العينات (مدخلات ورقة البيانات الخام 1) ، يتم حساب نظير ثقيل في المائة (يسمى النسبة ، R) تلقائيا على الورقة المعنونة 2) النسبة H | ح + ل. في هذه الخطوة، يتم تطبيع R من العينات الثقيلة الموسومة عن طريق طرح R من العينات غير المصنفة لإنتاج R نهائي للثلاثيات الهادئة والشائخة. وبما أن العينات غير المصنفة لا ينبغي أن تحتوي على أي نظير ثقيل مضاف خارجيا، فإنها تستخدم للقضاء على إشارة الخلفية. من R ، يتم حساب kdeg (معدل دوران) باستخدام الصيغة التالية:

Equation 1

يتم تحديد عمر النصف (H ، بالأيام) لكل بروتين في التحكم الهادئ وثلاثة أضعاف الشيخوخة (ورقة بعنوان 3) عمر النصف (أيام)) باستخدام الصيغة التالية:

Equation 2

ثم يتم حساب متوسط عمر النصف هذا بين الثلاثية الهادئة والشائخة لتوليد متوسط عمر نصف هادئ وشيخوخ لكل بروتين بالإضافة إلى قيمة p. ثم تتم تصفية نصف العمر المحسوب للقيم السالبة ، والتي تحدث عندما تكون الإشارة الثقيلة من الخلايا ذات العلامات الضوئية (الخلفية) أكبر من الإشارة الثقيلة من الخلايا ذات العلامات الثقيلة. نتج عن هذه التصفية 707 بروتينات من 841 تم تحديدها مع نصف عمر صالح للنتائج المعروضة هنا.

ثم يتم الإبلاغ عن عمر النصف كنسبة سجل2 من الشيخوخة على خلايا التحكم الهادئة (log2FC) ويتم رسمها في مخطط بركان (الشكل 5). على سبيل المثال ، من خلال النظر إلى ورقة التحليل 5) ، يمكن رؤية بروتين مستقبلات الثرومبين II للتخثر (F2R) على أنه نصف عمر في الخلايا الهادئة يبلغ 0.51 يوم (العمود B) ونصف عمر في الخلايا الشائخة يبلغ 1.07 يوم (العمود C) الذي ينتج عنه سجل2FC من ~ 1.06 (العمود D) بقيمة p تبلغ 0.001.

Figure 1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير عمل pSILAC لخلايا التحكم الشائخة والهادئة . تم استخدام الخلايا الليفية البشرية IMR-90 لإعداد مزارع الخلايا الهادئة (منخفضة المصل) أو الشيخوخة (IR) لمقارنة نصف عمر البروتين. ثم تم تصنيف الخلايا باستخدام SILAC Light أو SILAC Heavy Media مع أرجينين نظيري وليسين لمدة 3 أيام. تم استخراج الليزات من الخلايا وهضمها وتحليبها وتحليلها باستخدام مطياف الكتلة. تتوافق قمم نظائر الببتيد الثقيلة والخفيفة مع الببتيدات المركبة حديثا والموجودة مسبقا ، على التوالي. تم حساب نصف العمر باستخدام معادلة الاضمحلال الأسي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: التحقق من صحة الأنماط الظاهرية الشائخة باستخدام تحليلات SA-βGal و RT-qPCR . (أ) يتم إعادة طلاء الخلايا الشائخة والهادئة في وقت الحصاد في صفيحة من 6 آبار وتلطيخها ل SA-βGal باستخدام مجموعة تلطيخ SA-βGal. اللون الأزرق في جسم الخلية إيجابي للشيخوخة. يتم التقاط الصور في حقل ساطع مع اللون عند التكبير 10x ، وعلامة الحجم باللون الأحمر. (ب) تحليل RT-qPCR مقارنة الخلايا الشائخة (الحمراء) وخلايا ركوب الدراجات (الرمادية) من تجربة غير ذات صلة. الزيادات في مستويات CDKN1A / p21 و CXCL8 و IL6 mRNAs هي مؤشر على الشيخوخة ، وكذلك الانخفاض في مستويات LMNB1 mRNA. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: الطرق التمثيلية لمسح الاكتساب المعتمد على البيانات (DDA) وتدرج الكروماتوغرافيا السائلة لمزارع pSILAC على مطياف الكتلة المداري Q-Exactive HF. (أ) إعدادات الأدوات الموصى بها في برنامج الأداة للتحليل المعتمد على البيانات لمحللات الخلايا الكاملة من تجربة pSILAC. (ب) مثال على إعدادات طريقة تدرج تدفق الكروماتوغرافيا السائلة. يتم التخلص من الببتيدات على تدرج خطي مدته 90 دقيقة يتراوح من 5٪ إلى 35٪ عازل B (0.2٪ حمض الفورميك و 99.8٪ acetonitrile) ، يليه غسل لمدة 10 دقائق مع 80٪ عازل B ، و 25 دقيقة من التوازن مع 5٪ مخزن مؤقت B. (C) كروماتوغرام أيون إجمالي تمثيلي (TIC) لاكتساب مطياف الكتلة لببتيدات الخلايا الليفية IMR-90 التي تم الحصول عليها مع الإعدادات المحددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: كروماتوغرام أيون مستخرج تمثيليا للببتيدات مع دوران متغير أثناء الشيخوخة . (أ) مناطق الذروة الكروماتوغرافية للببتيد FQMTQEVVCDECPNVK ++ من البروتين DnaJ الفصيلة المتجانسة B عضو 11 (DNAJB11) في الخلايا الشائخة وغير الشائخة. بعد 3 أيام من SILAC ، تدمج الخلايا الشائخة نظائر أقل ثقلا في هذا الببتيد مقارنة بالخلايا الهادئة (غير الشائخة) ، كما هو موضح في انخفاض في منطقة الذروة من الببتيد الثقيل المحتوي على النظائر (الأزرق) بالنسبة للببتيد الخفيف (الأحمر) ، مما يشير إلى أن هذا الببتيد قد قلل من دوران الخلايا الشائخة. (ب) مناطق الذروة الكروماتوغرافية للببتيد VQAQVIQETIVPK++ من الوحدة الفرعية 1 لعامل ربط البروتين 3a (SF3A1) في الخلايا الشائخة وغير الشائخة. بعد 3 أيام من SILAC ، تدمج الخلايا الشائخة نسبة أعلى من النظائر الثقيلة في هذا الببتيد مقارنة بالخلايا الهادئة (غير الشائخة) ، كما هو موضح في انخفاض منطقة الذروة للببتيد الثقيل المحتوي على النظائر (الأزرق) بالنسبة للببتيد الخفيف (الأحمر) ، مما يشير إلى أن هذا الببتيد قد زاد من دوران الخلايا الشائخة. ولا تظهر الظروف غير المصنفة (اليوم 0) أي دمج للنظائر الثقيلة لكل من الببتيدات، كما هو متوقع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5: مقارنة بين نصف عمر البروتين في الخلايا الشائخة والهادئة التي يتم تحديدها من خلال وضع العلامات pSILAC. (أ) مخطط بركان يعرض نسبة السجل2 للشيخوخة / التحكم (هادئ) لكل من البروتينات المحددة البالغ عددها 695 بروتينا ؛ في هذه التجربة ، لم تحتوي وسائط وضع العلامات الخفيفة والثقيلة على أي جلوكوز ولا على أحمر فينول. (ب) جداول تبين أفضل 10 بروتينات ذات عمر نصف سنوي أكبر أو أقل في الخلايا الهادئة مقابل الخلايا الشائخة (اليسار واليمين، على التوالي). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: الوسائط والمخازن المؤقتة المستخدمة في هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 2: الاشعال RT-qPCR المستخدمة في هذا البروتوكول. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

الجدول 3: مصنف تحليل SILAC لحساب عمر النصف للبروتين ، وتغيرات الطيات ، واختبارات t. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

Discussion

pSILAC هي تقنية قوية تمكن من القياس الكمي العالمي لمعدلات دوران البروتين عبر ظروف خلوية متعددة. تفصل هذه الورقة استخدام pSILAC لمقارنة نصف عمر البروتين العالمي بين الخلايا الشائخة والهادئة ، بما في ذلك تعليمات لإعداد الخلايا الشائخة والهادئة ، ووضع العلامات على SILAC وحصادها ، وفي النهاية التحليل باستخدام الطيف الكتلي DDA. بالإضافة إلى ذلك ، يتم وصف اختبار من خطوتين للتحقق من صحة النمط الظاهري للشيخوخة باستخدام تحليل SA-βGal و RT-qPCR لمجموعة من mRNAs التي تشفر البروتينات المرتبطة بالشيخوخة. بالإضافة إلى التحقق من صحة الشيخوخة باستخدام النهجين الموصوفين ، يمكن إجراء فحص ثالث للشيخوخة بعد تحليل الطيف الكتلي من خلال البحث عن التغيرات في علامات الشيخوخة المعروفة بين الخلايا الشائخة والهدوء على المستوى البروتيني. تشمل البروتينات المرتبطة بالشيخوخة التي من المتوقع أن تكون مرتفعة p16 و p21 و BCL2 ، من بين أمور أخرى ، موصوفة في مكان آخر44,45. في البروتوكول الموصوف أعلاه ، تم استخدام الإشعاع المؤين لتحريض الشيخوخة وتجويع المصل للخلايا الهادئة. لتحريض الشيخوخة ، هناك خيارات متعددة متاحة وهناك عدم تجانس كبير فيما بينها 41،42،46. حاليا ، لا توجد طريقة للشيخوخة تعتبر "الأكثر فسيولوجية" ، لذلك يعتمد اختيار محفز الشيخوخة إلى حد كبير على سياق التجربة. ومع ذلك ، يوصى بإجراء تجارب بهدف تحديد ظاهرة عامة حول الشيخوخة لاستخدام اثنين على الأقل من محفزات الشيخوخة المختلفة. إن مناقشة مجموعة نماذج الشيخوخة خارج نطاق هذه الورقة ، ولكن بعض الطرق الشائعة للحث على الشيخوخة تشمل إثارة تلف الحمض النووي (الأشعة تحت الحمراء ، دوكسوروبيسين ، استنفاد النسخ التكراري) ، والتعبير عن البروتينات السرطانية (HRAS ، BRAF) ، وتعطيل وظيفة الميتوكوندريا2.

بالإضافة إلى اختيار محفز الشيخوخة ، فإن اختيار خلايا التحكم هو اعتبار مهم بنفس القدر. الخلايا الشائخة ، بحكم تعريفها ، تحت توقف النمو إلى أجل غير مسمى ، لذلك غالبا ما يتم اختيار مقارنة مع الخلايا الأخرى الموقوفة عن النمو. بالنسبة ل pSILAC ، تكون الخلايا الموقوفة عن دورة الخلية مفضلة بشكل عام لأنها لا تتكاثر وبالتالي يسهل استخدامها في حسابات نصف عمر البروتين47. ومع ذلك ، نظرا لأن الخلايا المستزرعة غالبا ما تحتفظ ببعض الخلايا المنقسمة ، فمن المهم أن الطرق المستخدمة للحث على إيقاف دورة الخلية تنتج استجابة متجانسة قدر الإمكان لتقليل الخطأ من الخلايا التي لا تزال تتكاثر. لحساب معدلات تحلل البروتين لخلايا ركوب الدراجات باستخدام pSILAC يتطلب حسابات إضافية للتعويض عن المعدل الذي يتم فيه تخفيف البروتين إلى خلايا ابنة27. ومع ذلك ، فإن توقف النمو الهادئ نفسه لا يخلو من المضاعفات. هناك طريقتان عامتان لاعتقال دورة الخلية: الحرمان من المصل وتثبيط الاتصال48. لا يمكن جعل جميع الخلايا هادئة من خلال تثبيط الاتصال ، على الرغم من أن بعض الخلايا الليفية قد ثبت أنها تظهر الهدوء بعد عدة أيام من زراعة49. استخدمت هذه الطريقة الحرمان من المصل لأنه يستخدم بشكل أكثر شيوعا لمقارنات الخلايا الشائخة ، على الرغم من أنه يتطلب أن تكون الخلية الشائخة محرومة من المصل بشكل مماثل لإجراء مقارنات دقيقة. ينشط المصل مجمع mTOR ، وبالتالي فإن الحرمان من المصل له العديد من التأثيرات النهائية على الخلية بالإضافة إلى إيقاف دورة الخلية50. والجدير بالذكر أن الخلايا الشائخة أظهرت انخفاضا في SASP عند الحرمان من المصل أو تثبيط mTOR51,52.

نقطة أخرى مهمة يجب مراعاتها في pSILAC هي عدد النقاط الزمنية للاختبار. جمع هذا البروتوكول الخلايا في نقطة زمنية واحدة (3 أيام من وضع العلامات الخفيفة أو الثقيلة) ، مما يبسط التحليل الناتج بشكل كبير. يجب أن يعتمد اختيار النقطة الزمنية على الهدف من التجربة. بالنسبة للتحليل العالمي ، من المتوقع أن تلتقط 3 أيام غالبية البروتينات ، على الرغم من أنه لا يمكن قياس نصف العمر للبروتينات قصيرة العمر التي تتحول بالكامل في غضون 3 أيام (يتم فقدان جميع الإشارات الضوئية) في هذه المرحلة الزمنية. على العكس من ذلك ، من الصعب أيضا تحديد كمية البروتينات طويلة العمر ذات الدوران القليل جدا في 3 أيام وغالبا ما تظهر على أنها ذات عمر نصف كبير للغاية (في ترتيب أسابيع) والتي عادة ما تكون مجرد نتيجة لتراكم إشارات ثقيلة قليلة جدا. نظرا للعلاقة غير الخطية في نسبة إشارات الببتيد الثقيلة والخفيفة مقابل النسبة المئوية للبروتين الذي تم تصنيعه حديثا في نقاط زمنية أقصر وأطول ، يمكن تحسين كمية نصف العمر عن طريق إضافة نقاط زمنية إضافية لوضع العلامات. بالنسبة للمقارنات النسبية بين حالتين خليتين ، كما هو الحال في هذا البروتوكول ، قد يكون عمر النصف التقريبي كافيا ، ولكن يمكن استخدام نقاط زمنية إضافية لتحسين الدقة الكمية.

يصف هذا البروتوكول كيفية إجراء تحليل غير مستهدف يستند إلى DDA لدوران البروتين. ومع ذلك ، يمكن تطبيق حسابات دوران البروتين بشكل عام على أي مخطط اقتناء قادر على اشتقاق الوفرة النسبية لأزواج الببتيد الثقيلة والخفيفة. على سبيل المثال ، يمكن أيضا تطبيق الأساليب المستندة إلى MS2 مثل الاستحواذ المستقل عن البيانات (DIA / SWATH) لحساب معدلات دوران بنجاح53. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام أجهزة وخطوط أنابيب البرامج بخلاف تلك الموضحة في هذا البروتوكول لإجراء تحليل DDA وتحديد البروتين وتحديد كمية البروتين. عند استخدام منصات برامج قياس كمية البروتين مثل Skyline لاستخراج مناطق ذروة الببتيد ، ينصح بفحص كروماتوغرام الأيونات المستخرجة يدويا في مساحة عمل المستند ، وتحديد القمم التي تم دمجها بشكل خاطئ والقمم غير الكمية ، وتنظيم المستند وفقا لذلك. تتوفر مجموعة واسعة من البرامج التعليمية عبر الإنترنت ل Skyline (skyline.ms).

يمثل pSILAC واحدة من أكثر الطرق مثالية للقياس الكمي العالمي لنصف عمر البروتين في الخلايا المستزرعة بسبب الإرسال المتعدد المتفوق (تغطية البروتين) والإنتاجية. في حين أن pSILAC لا يوفر معدلات مباشرة للتوليف أو التدهور ، نظرا لأن التغيير في الإشارة الخفيفة والثقيلة يرجع إلى التقاء العوامل ، فإن pSILAC مفيد للغاية للمقارنات بين الظروف وأنواع الخلايا المختلفة. غالبا ما تقع الطرق منخفضة الإنتاجية في نوعين: 1) علاج الخلايا بالسيكلوهيكسيميد لمنع تخليق البروتين وحصاده على فترات زمنية بعد الإضافة إلى مراقبة الاضمحلال ، أو 2) علاج الخلايا بمثبط لاضمحلال البروتين والحصاد على فترات زمنية بعد الإضافة لمراقبة تراكم البروتين ، وبالتالي استنتاج معدلات تحلل البروتين. الحد من كلتا الطريقتين هو أن مثل هذه العلاجات ستسبب حتما تغييرات كبيرة في علم وظائف الأعضاء الخلوية. وعلى النقيض من ذلك، لا يتطلب pSILAC تدخلا كبيرا وليس له نظريا أي آثار يمكن اكتشافها على علم وظائف الأعضاء الخلوية لأن الأحماض الأمينية النظيرية تختلف بمقدار نيوترون واحد فقط عن نظيراتها غير النظيرية. وبالتالي ، فإن الطريقة الموصوفة هنا ل pSILAC تمثل بروتوكولا بسيطا للقياس العالمي لنصف عمر البروتين الأكثر فسيولوجية في الخلايا غير المنقسمة.

التغيرات في دوران البروتين لها علاقة وثيقة بالشيخوخة والأمراض المرتبطة بالعمر والتنكس العصبي وطول العمر54,55. يصف هذا البروتوكول طريقة لاستجواب هذه العلاقات باستخدام وسم النظائر المستقرة للأحماض الأمينية في زراعة الخلايا لقياس معدلات دوران البروتين في خلايا الشيخوخة. ومع ذلك ، توجد العديد من الطرق المماثلة لإجراء دراسات في سياق الشيخوخة والتنكس العصبي في الجسم الحي في الكائنات الحية بأكملها مثل الفئران. في الواقع ، أكدت هذه الدراسات على أهمية قياس معدلات دوران البروتين في سياق الأمراض المرتبطة بالعمر56،57،58،59.

في هذه الدراسة ، برزت البروتينات الريبوسومية والبروتينات الموجودة في الشبكة الإندوبلازمية كفئتين من البروتينات مع انخفاض وزيادة عمر النصف في الخلايا الشائخة ، على التوالي. في حين أن هناك حاجة إلى مزيد من التحليل لمستويات الحالة الثابتة للحصول على استنتاجات نهائية ، فإن هذه النتائج تشير أيضا إلى أن الخلايا الشائخة قد تنظم الترجمة بشكل فريد من خلال انخفاض عمر النصف للبروتينات الريبوسومية. ومن الآن فصاعدا، فإن تطبيق نهج وضع العلامات المستقرة على النظائر لدراسة العلاقة بين الشيخوخة الخلوية والتنكس العصبي في الجسم الحي في نماذج الفئران سيكون امتدادا واعدا لنهج وسم النظائر الموصوفة في هذا البروتوكول.

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي إفصاحات.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) وبرنامج البحوث الداخلية (IRP) ، المعهد الوطني للشيخوخة (NIA). تم دعم ملاحظة من قبل منح زخم طول العمر ، وبرنامج علماء مكتب المكملات الغذائية (ODS). تم إنشاء الشكل 1 مع BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (LC-MS grade) Grainger AH015
Ammonium Bicarbonate Millipore-Sigma 9830
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher 15240062
BCA Assay Kit ThermoFisher 23227
Dithiothreotol (DTT) Sigma D9779
DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher 12430112
dNTP Mix ThermoFisher R0191
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated ThermoFisher 10082147
Formic Acid Sigma 27001
Gammacel 40 Exactor Best Theratronics Cesium Irradiator for cells
GlycoBlue ThermoFisher AM2238
Iodoacetamide (IAA) Sigma I1149 Light sensitive
IMR-90 primary lung fibroblasts ATCC CCL-186
iRT Kit (indexed retention time) Biognosys Ki-3002-2 Indexed Retention Time Peptide Standards
Isopropanol ThermoFisher 423835000
Mascot Matrix Science Mascot Daemon 2.8 Proteomic database searching software
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) ThermoFisher EP0742
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher 11140050
Nano LC System ThermoFisher ULTIM3000RSLCNANO
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges Waters 186000383
Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher Q Exactive HF Orbitrap
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 327110025
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM ThermoFisher A33972
QuantStudio 6 Real-Time PCR System ThermoFisher
Random Hexamer Primer ThermoFisher SO142
Senescence β-Galactosidase Staining Kit Cell Signaling 9860
Skyline University of Washington Skyline-Daily v21.2.1.424 Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms
Sonicator waterbath Branson CPX-952-516R
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018 Referred to as phenol in text; hazardous
TRYPle Express ThermoFisher 12605010
Trypsin (sequencing grade) Promega V5113
TURBO Dnase (2U/ uL) ThermoFisher AM2238
Urea ThermoFisher 29700
Water (LC-MS grade) Grainger AH365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L. The cell biology of aging. Journal of Investigative Dermatology. 73 (1), 8-14 (1979).
  2. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a path forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  3. Borghesan, M., Hoogaars, W. M. H., Varela-Eirin, M., Talma, N., Demaria, M. A senescence-centric view of aging: Implications for longevity and disease. Trends in Cell Biology. 30 (10), 777-791 (2020).
  4. Martinez-Cue, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 16 (2020).
  5. Wissler Gerdes, E. O., et al. Cellular senescence in aging and age-related diseases: Implications for neurodegenerative diseases. International Review of Neurobiology. 155, 203-234 (2020).
  6. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  7. Musi, N., et al. Tau protein aggregation is associated with cellular senescence in the brain. Aging Cell. 17 (6), 12840 (2018).
  8. Ogrodnik, M., et al. Obesity-induced cellular senescence drives anxiety and impairs neurogenesis. Cell Metabolism. 29 (5), 1061-1077 (2019).
  9. Chow, H. M., et al. Age-related hyperinsulinemia leads to insulin resistance in neurons and cell-cycle-induced senescence. Nature Neuroscience. 22 (11), 1806-1819 (2019).
  10. Dehkordi, S. K., et al. Profiling senescent cells in human brains reveals neurons with CDKN2D/p19 and tau neuropathology. Nature Aging. 1, 1107-1116 (2021).
  11. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence is induced by the environmental neurotoxin paraquat and contributes to neuropathology linked to Parkinson's disease. Cell Reports. 22 (4), 930-940 (2018).
  12. Bussian, T. J., et al. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature. 562 (7728), 578-582 (2018).
  13. Zhang, P., et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience. 22 (5), 719-728 (2019).
  14. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  15. Wei, Z., et al. Amyloid beta protein aggravates neuronal senescence and cognitive deficits in 5xfad mouse model of Alzheimer's disease. Chinese Medical Journal (England). 129 (15), 1835-1844 (2016).
  16. He, N., et al. Amyloid-beta(1-42) oligomer accelerates senescence in adult hippocampal neural stem/progenitor cells via formylpeptide receptor 2. Cell Death & Disease. 4 (11), 924 (2013).
  17. van Dijk, K. D., et al. Changes in endolysosomal enzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson's disease. Movement Disorders: Offical Journal of Movement Disorder Society. 28 (6), 747-754 (2013).
  18. Chinta, S. J., et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson's disease. Journal of Internal Medicine. 273 (5), 429-436 (2013).
  19. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  20. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Patholology. 5, 99-118 (2010).
  21. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nature Cell Biology. 15 (8), 978-990 (2013).
  22. Payea, M. J., Anerillas, C., Tharakan, R., Gorospe, M. Translational control during cellular senescence. Molecular and Cellular Biology. 41 (2), 00512 (2021).
  23. Nishimura, K., et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation. Cell Reports. 10 (8), 1310-1323 (2015).
  24. Lessard, F., et al. Senescence-associated ribosome biogenesis defects contributes to cell cycle arrest through the Rb pathway. Nature Cell Biology. 20 (7), 789-799 (2018).
  25. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  26. Wiley, C. D., et al. SILAC Analysis reveals increased secretion of hemostasis-related factors by senescent cells. Cell Reports. 28 (13), 3329-3337 (2019).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Doherty, M. K., Hammond, D. E., Clague, M. J., Gaskell, S. J., Beynon, R. J. Turnover of the human proteome: determination of protein intracellular stability by dynamic SILAC. Journal of Proteome Research. 8 (1), 104-112 (2009).
  29. Riba, A., et al. Protein synthesis rates and ribosome occupancies reveal determinants of translation elongation rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (30), 15023-15032 (2019).
  30. Mathieson, T., et al. Systematic analysis of protein turnover in primary cells. Nature Communications. 9 (1), 689 (2018).
  31. Liu, T. Y., et al. Time-resolved proteomics extends ribosome profiling-based measurements of protein synthesis dynamics. Cell Systems. 4 (6), 636-644 (2017).
  32. Welle, K. A., et al. Time-resolved analysis of proteome dynamics by tandem mass tags and stable isotope labeling in cell culture (TMT-SILAC) hyperplexing. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (12), 3551-3563 (2016).
  33. Neri, F., Basisty, N., Desprez, P. Y., Campisi, J., Schilling, B. Quantitative proteomic analysis of the senescence-associated secretory phenotype by data-independent acquisition. Current Protocols. 1 (2), 32 (2021).
  34. Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and validation of cellular senescence in primary human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57782 (2018).
  35. Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and quantify cellular senescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55533 (2017).
  36. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Hernandez-Segura, A., Rubingh, R., Demaria, M. Identification of stable senescence-associated reference genes. Aging Cell. 18 (2), 12911 (2019).
  39. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  40. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  41. Casella, G., et al. Transcriptome signature of cellular senescence. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7294-7305 (2019).
  42. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biology. 18 (1), 3000599 (2020).
  43. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  44. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  45. Kohli, J., et al. Algorithmic assessment of cellular senescence in experimental and clinical specimens. Nature Protocols. 16 (5), 2471-2498 (2021).
  46. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Current Biology: CB. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  47. Swovick, K., et al. Interspecies differences in proteome turnover kinetics are correlated with life spans and energetic demands. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100041 (2021).
  48. Marescal, O., Cheeseman, I. M. Cellular mechanisms and regulation of quiescence. Developmental Cell. 55 (3), 259-271 (2020).
  49. Lacorazza, H. D. Cellular Quiescence. , Springer, Humana Press. New York. (2018).
  50. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  51. Herranz, N., et al. mTOR regulates MAPKAPK2 translation to control the senescence-associated secretory phenotype. Nature Cell Biology. 17 (9), 1205-1217 (2015).
  52. Laberge, R. M., et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nature Cell Biology. 17 (8), 1049-1061 (2015).
  53. Pino, L. K., Baeza, J., Lauman, R., Schilling, B., Garcia, B. A. Improved SILAC quantification with data-independent acquisition to investigate Bortezomib-induced protein degradation. Journal of Proteome Research. 20 (4), 1918-1927 (2021).
  54. Basisty, N., Meyer, J. G., Schilling, B. Protein turnover in aging and longevity. Proteomics. 18 (5-6), 1700108 (2018).
  55. Basisty, N., Holtz, A., Schilling, B. Accumulation of "Old Proteins" and the critical need for MS-based protein turnover measurements in aging and longevity. Proteomics. 20 (5-6), 1800403 (2020).
  56. Basisty, N., et al. Mitochondrial-targeted catalase is good for the old mouse proteome, but not for the young: 'reverse' antagonistic pleiotropy. Aging Cell. 15 (4), 634-645 (2016).
  57. Dai, D. F., et al. Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell. 13 (3), 529-539 (2014).
  58. Karunadharma, P. P., et al. Subacute calorie restriction and rapamycin discordantly alter mouse liver proteome homeostasis and reverse aging effects. Aging Cell. 14 (4), 547-557 (2015).
  59. Basisty, N. B., et al. Stable isotope labeling reveals novel insights into ubiquitin-mediated protein aggregation with age, calorie restriction, and rapamycin treatment. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (5), 561-570 (2018).

Tags

الكيمياء الحيوية ، العدد 182 ، الشيخوخة الخلوية ، قياس الطيف الكتلي ، SILAC ، دوران البروتين ، البروتيوستاسيس ، الشيخوخة ، التنكس العصبي ، زراعة الخلايا ، التدهور ، التوليف ، وضع العلامات المستقرة على النظائر ، وضع العلامات الأيضية
قياس معدلات دوران البروتين في الخلايا المستزرعة الشائخة وغير المنقسمة مع وضع العلامات الأيضية وقياس الطيف الكتلي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N.… More

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N. Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63835, doi:10.3791/63835 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter