Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af proteinomsætningshastigheder i senescerende og ikke-delende dyrkede celler med metabolisk mærkning og massespektrometri

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63835
Automatic Translation
1, 1, 2
1Laboratory of Genetics and Genomics, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health, 2Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health

Summary

Denne protokol beskriver arbejdsgangen for metabolisk mærkning af senescerende og ikke-delende celler med pulserende SILAC, ikke-målrettet massespektrometrianalyse og en strømlinet beregning af proteinhalvingstider.

Abstract

Stigende beviser har vist, at akkumuleringen af senescerende celler i centralnervesystemet bidrager til neurodegenerative lidelser som Alzheimers og Parkinsons sygdomme. Cellulær ældning er en tilstand af permanent cellecyklusarrest, der typisk opstår som reaktion på udsættelse for subdødelige belastninger. Ligesom andre ikke-delende celler forbliver senescerende celler imidlertid metabolisk aktive og udfører mange funktioner, der kræver unikke transkriptionelle og translationelle krav og udbredte ændringer i de intracellulære og udskillede proteomer. At forstå, hvordan proteinsyntese og henfaldshastigheder ændres under ældning, kan belyse de underliggende mekanismer for cellulær ældning og finde potentielle terapeutiske veje til sygdomme, der forværres af senescerende celler. Dette papir beskriver en metode til proteomskala evaluering af proteinhalvingstider i ikke-delende celler ved hjælp af pulserende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (pSILAC) i kombination med massespektrometri. pSILAC involverer metabolisk mærkning af celler med stabile tunge isotopholdige versioner af aminosyrer. Sammen med moderne massespektrometrimetoder muliggør pSILAC måling af proteinomsætning af hundreder eller tusinder af proteiner i komplekse blandinger. Efter metabolisk mærkning kan proteinernes omsætningsdynamik bestemmes ud fra den relative berigelse af tunge isotoper i peptider detekteret ved massespektrometri. I denne protokol beskrives en arbejdsgang til generering af senescerende fibroblastkulturer og tilsvarende arresterede quiescent fibroblaster samt et forenklet, enkeltpunkt pSILAC-mærkningstidsforløb, der maksimerer dækningen af forventede proteinomsætningshastigheder. Endvidere præsenteres en pipeline til analyse af pSILAC-massespektrometridata og brugervenlig beregning af proteinnedbrydningshastigheder ved hjælp af regneark. Anvendelsen af denne protokol kan udvides ud over senescerende celler til alle ikke-delende dyrkede celler, såsom neuroner.

Introduction

Senescens blev først identificeret som en tilstand af ubestemt vækstarrest udstillet af dyrkede primære celler efter at have nået replikativ udmattelse1. Det har siden vist sig, at ældning kan opstå som reaktion på adskillige cellulære fornærmelser, herunder genotoksiske, mitokondrielle og onkogene belastninger, blandt andre2. Mens ældning har flere fysiologisk vigtige roller, såsom tumorundertrykkelse og sårheling, er akkumuleringen af senescerende celler under aldring forbundet med en lang række skadelige virkninger på helbredet3, herunder flere neurodegenerative tilstande 4,5,6. Cellulær ældning forekommer i flere hjernecelletyper, herunder neuroner 7,8,9,10, astrocytter11, microglia 12 og oligodendrocytprækursorer13, og bidrager til neurodegeneration og kognitiv dysfunktion. Amyloid beta-oligomerer, et af kendetegnene ved Alzheimers sygdom14, har vist sig at fremskynde neuronal ældning 13,15,16. En øget forekomst af senescerende celler har også været forbundet med Parkinsons sygdom17, især som følge af miljømæssige stressfaktorer11,18. Det er vigtigt, at den selektive eliminering af senescerende celler i prækliniske modeller forlænger levetiden og afbøder en lang række aldersrelaterede sygdomme 3,5,12 og forbedrer kognitive underskud 8,11,12,13. Senescerende celler har således vist sig som lovende terapeutiske mål for behandling af mange aldersrelaterede tilstande.

Meget af den skadelige virkning af senescerende celler er forårsaget af den ældningsrelaterede sekretoriske fænotype (SASP), en kompleks blanding af bioaktive molekyler udskilt af senescerende celler, der kan forårsage lokal inflammation, angiogenese, ødelæggelse af den ekstracellulære matrix og udbredelse af ældning i omgivende væv 19,20,21 . SASP repræsenterer også et interessant biologisk fænomen af ældning, fordi det kræver en betydelig transkriptionel og translationel indsats under en tilstand af cellecyklusarrest. Faktisk har senescerende celler vist sig at udvise fald i ribosombiogenese 22,23,24, der skulle reducere proteinsyntesen. I stedet oversætter senescerende celler robust nogle proteiner, især SASP-faktorer, og påvirker metabolismen af omgivende væv25. Der er således stor interesse for at forstå, hvordan senescerende celler, der gennemgår en permanent cellecyklusstop, fortsætter med at opretholde proteinhomeostase, samtidig med at de robust udtrykker SASP-faktorer og andre udvalgte proteiner.

Denne metode beskriver, hvordan man bruger massespektrometri og pulserende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur (pSILAC) til globalt at måle halveringstiderne for proteiner i senescerende celler i en proteom-bred skala. I traditionel SILAC er dyrkede celler fuldstændigt metabolisk mærket med tunge og lette ikke-radioaktive isotoper af aminosyrer til nedstrøms analyse af proteinoverflod. Denne metode er tidligere blevet anvendt til at vurdere overflodsændringer omfattende og kvantitativt i SASP af dyrkede fibroblaster26. I pSILAC er celler ligeledes metabolisk mærket med en puls af tung isotop, der følger formærkning med let isotop og derefter høstes med et eller flere tidsintervaller. Inkorporeringshastighederne for tung isotop i forhold til allerede eksisterende lysisotop bruges derefter til at beregne relative proteinomsætningshastigheder. Generelt anvendes isotoper af arginin og lysin, fordi trypsin spalter ved disse rester; således vil alle peptider fra standard fordøjelse potentielt indeholde den tunge etiket. Par af peptider, der kun adskiller sig ved tilstedeværelsen eller fraværet af tung lysin eller arginin, er kemisk identiske og kan differentieres og kvantificeres ved hjælp af et massespektrometer. Efter massespektrometrianalyse kan peptider identificeres som nyligt syntetiserede eller allerede eksisterende baseret på tilstedeværelsen eller fraværet af isotopetiketten i de resulterende peptididentifikationer. Proteinomsætningshastigheder kan derefter bestemmes ved at tilpasse forholdet mellem tunge (13 C-15N) over lette (12 C-14N) peptider for et givet protein til kinetiske modeller for eksponentiel vækst eller henfald27,28. pSILAC er blevet anvendt i flere sammenligninger af proteinomsætningshastigheder 29,30,31,32 og er i øjeblikket den mest omfattende metode med høj gennemstrømning til måling af proteinhalvingstider.

Denne protokol beskriver forberedelsen af senescerende celler parallelt med tilsvarende væksthæmmede hvilende celler i kultur efterfulgt af metabolisk mærkning med pSILAC. Celler høstes derefter, homogeniseres til lysater og behandles til massespektrometri erhvervelse og analyse. De data, der opnås fra massespektrometri, bruges derefter til at bestemme proteinhalvingstider ved hjælp af en forenklet kvantitativ metode, der anvender et enkelt tidspunkt og halveringstidsberegninger udført i et regneark. Ved hjælp af denne tilgang kan estimater af proteinhalvingstider måles på en omfattende og kvantitativ måde, der er mere autentisk for uforstyrrede cellulære forhold end protokoller, der bruger blokkere af proteinsyntese eller omsætning.

Protocol

1. Fremstilling af hvilende celler og celler, der er gjort senescerende ved udsættelse for ioniserende stråling (IR)

BEMÆRK: Cellulær ældning og quiescens kan induceres ved hjælp af flere metoder, som beskrevet detaljeret andetsteds 33,34,35. De stimuli, der bruges til at fremkalde ældning og stilhed, kan afhænge af celletypen af interesse og det biologiske spørgsmål, der undersøges. De celler, der anvendes i denne undersøgelse, er kommercielt tilgængelige.

  1. Optø humane diploide IMR-90 fibroblaster (~ 1 x 106 celler) fra en kryovial og plade dem i 20 ml DMEM suppleret med 10% føtal bovin serum (FBS) (tabel 1) på en 150 mm plade.
  2. Cellerne dyrkes ved fysiologiske iltforhold (3 %O2, 5 % CO2, 37 °C), og kulturerne udvides i 10 % FBS-holdige medier, indtil der er etableret tilstrækkelige replikater til stillestående og senescerende celler (mindst 3-5 replikater anbefales pr. tilstand).
    BEMÆRK: Dyrkning af celler ved fysiologisk (3%) ilt er ideel til primære humane fibroblastceller, men egnede dyrkningsbetingelser for andre celletyper kan variere og bør bestemmes fra sag til sag.
  3. Generer senescerende celler ved at udsætte prolifererende celler for 15 grå (Gy) ioniserende stråling (IR).
    BEMÆRK: Intensiteten af strålingseksponering kan variere afhængigt af celletype. Mens 15 Gy bruges her, er 10 Gy også en almindeligt anvendt strålingsdosis til fibroblaster; Andre celler, såsom monocytter, kan kræve en dosis så lav som 5 Gy. Dosis bestemmes generelt empirisk ved at veje levedygtighed mod ældningsinduktion.
    1. Udsæt cellerne ved 40% -60% sammenløb til IR i medier, der indeholder 10% FBS.
    2. Efter IR-eksponering skal du skifte til friske medier, der indeholder 10% FBS.
    3. Skift medie (20 ml, indeholdende 10% FBS) hver anden dag i 8 dage.
      BEMÆRK: Celler udsættes for IR ved lavere sammenløb, fordi IR-behandlede celler vil ekspandere i kultur, før de ophører med at vokse. I dette eksperiment blev celler ikke splittede celler under etableringen af ældning, og selvom de blev mere sammenflydende, viste de stadig senescerende cellemarkører ved høst. I fibroblaster udvikler den senescerende fænotype inden for 7-10 dage.
  4. Generer stillestående kontrolceller ved at ændre mediet på belagte prolifererende celler til medier, der indeholder 0,2% FBS (serum sult) (tabel 1).
    1. Fortsæt med at dyrke celler, der vil blive brugt til quiescenskontrol i medier, der indeholder 10% FBS indtil dag 4, efter at senescerende celler er udsat for IR, splittes, når det er nødvendigt.
    2. På dag 4 efter IR skal du ændre mediet af hvilende celler til 20 ml medier indeholdende 0,2% FBS (tabel 1) og fortsætte med at vokse i yderligere 6 dage og skifte medie hver anden dag.
      BEMÆRK: Selv i medier, der indeholder 0,2% FBS, vil fibroblaster fortsætte med at vokse noget og kan virke sammenflydende ved høstens afslutning. Som en tommelfingerregel skal du sigte mod at indsamle stillestående celler, når de har nået sammenløb svarende til de senescerende cellekulturer.

2. Mærkning af celler til pulserende SILAC og høst af lysater

  1. Skift medier på både senescerende og stillestående celler (12 plader) til SILAC Light (tabel 1) og dyrk i 2 dage.
    BEMÆRK: Denne mærkning hjælper med at reducere baggrundsstøj, da der er en lav naturlig overflod på 13C og 15N. Dette trin kan springes over under reagensbegrænsende forhold, men vil resultere i en lille overvurdering af ny proteinsyntese.
  2. Udskift medier med SILAC DMEM (tabel 1) til metabolisk mærkning.
    BEMÆRK: SILAC DMEM-medier er specielt formuleret til at indeholde rent lette eller tunge isotoper af arginin og lysin til metabolisk mærkning. De må ikke erstattes med DMEM-standardformuleringer i undertrin 2.2.1 eller 2.2.2.
    1. For tre senescerende og tre hvilende plader skal du udskifte medier med 30 ml SILAC Light (tabel 1) og vokse i 3 dage uden at skifte medie.
    2. For mindst tre senescerende og tre hvilende plader skal mediet udskiftes med 30 ml SILAC Heavy (tabel 1) og vokse i 3 dage uden at skifte medie.
      BEMÆRK: Der er en mulighed på dette tidspunkt for at høste, hvad der vil være de lysmærkede celler med det samme, snarere end at mærke dem i yderligere 3 dage. I et enkelt tidsrum foretrækkes det at mærke tunge og lette celler i samme periode som det gøres i denne protokol for at minimere batcheffekter.
  3. Fjern cellerne fra dyrkningsplader ved at tilsætte 5 ml forvarmet trypsinreagens til hver skål og inkubere i 5 minutter ved 37 ° C.
  4. Resuspend de løsrevne celler i 5 ml af det samme medie, der anvendes til dyrkning (enten SILAC Light eller SILAC Heavy) til et samlet volumen på 10 ml.
  5. Høst cellerne til ekstraktion af lysater og validering af ældningsmarkører.
    1. For hver suspension aliquot 0,6 x 106 celler i 2 ml medier indeholdende 0,2% FBS i en 6-brønds skål (to retter, en til SILAC Light dyrkede celler og en til SILAC Heavy dyrkede celler) og anbringes ved 37 ° C til inkubation natten over.
      BEMÆRK: Disse plader (undertrin 2.5.1) vil blive anvendt til påvisning af ældningsrelateret β-galactosidase (SA-βGal) aktivitet (trin 3.1).
    2. For hver suspension aliquoteres 1 x 106 celler i et mikrocentrifugerør og drejes ned i en bordpladecentrifuge med fuld hastighed i 1 min. Fjern supernatanten og resuspend pelleten i 1 ml phenol; på dette trin kan RNA renses fuldt ud som beskrevet i phenolleverandørens manual eller opbevares på lang sigt ved -80 °C.
      FORSIGTIG: Fenol er ætsende og bør udelukkende håndteres i en hætte med handsker og en laboratoriefrakke.
      BEMÆRK: Det ekstraherede RNA vil blive anvendt til påvisning af mRNA'er, der koder for SASP-faktorer ved hjælp af omvendt transkription (RT) efterfulgt af kvantitativ (q) PCR-analyse (RT-qPCR) i realtid (trin 3.2). Et andet pålideligt assay for ældningsinduktion er en test for 5-ethynyldihydroxyuridin (EdU) inkorporering, hvilket indikerer tilstedeværelsen af prolifererende celler. Fraværet af spredning kan bruges til at bekræfte stilhed og ældning.
    3. Overfør de resterende celler til is og spin ned ved 300 x g og 4 °C.
  6. Fjern supernatanten, og vask cellerne to gange i 1 ml kold PBS for at fjerne medier/trypsin og eksogen proteinforurening fra føtalt kvægserum fra dyrkningsmediet.
  7. Spin ned cellerne igen, fjern supernatanten, og fortsæt til lysis.
  8. Resuspend cellepillerne i 150 μL frisklavet 8 M urinstof 50 mM ammoniumbicarbonat lysis buffer (tabel 1), og bland ved pipettering op og ned.
  9. Sonikere lysaterne i en vand sonicator i 2,5 min med 30 s tænd / sluk ved medium effekt ved 4 ° C.
  10. Lysaterne overføres til en forvarmet varmeblok på 95 °C og denatureres i 4 minutter.
  11. Spin ned lysaterne; lysater kan nu opbevares ved -80 °C eller anvendes straks til kvantificering.
  12. Lav en 30 μL bestand af 1:10 fortyndinger for hvert lysat i Lysis Buffer.
  13. Proteinkoncentrationen måles med BCA-analysesættet ved hjælp af en standardkurve fremstillet i 1/10x lysisbuffer fortyndet iddH20. Lysater kan nu opbevares ved -80 °C på ubestemt tid.

3. Validering af ældning ved ældningsrelateret β-Galactosidase (SA-βGal) aktivitet og RT-qPCR-analyse af ældningsrelaterede mRNA'er

BEMÆRK: Udgangsmaterialet til disse trin indsamles i trin 2.5

  1. Ud fra de 6-brønds plader, der blev oprettet i undertrin 2.5.1, analyseres celler for SA-βGal-aktivitet ved hjælp af Senescence β-Galactosidase Staining kit efter producentens protokol. Visualiser farvning under brightfield med farve aktiveret, som tidligere beskrevet36.
    BEMÆRK: SA-βGal kvantificeres ved at sammenligne procentdelen af positive celler (synlig blå farve) i senescerende versus stillestående kontrolbetingelser. Mindst 70% af cellerne skal være SA-βGal-positive for en vellykket bekræftelse af ældning. Quiescent kontrolceller bør være mindre end 10% positive for SA-βGal.
  2. Uddrag RNA'et fra phenolsuspension (undertrin 2.5.2) og analyser ved hjælp af RT-qPCR for øgede niveauer af mRNA'er, der koder for SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B), cellecyklusmarkører (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) og andre indikatorer for ældning (tab af LMNB1 og PCNA).
    BEMÆRK: RNA er ustabilt og bør derfor håndteres med RNase-frit udstyr, friske handsker og på is, medmindre andet er angivet i protokollen.
    1. Med udgangspunkt i phenolsuspension tilsættes 200 μL chloroform pr. 1 ml phenol og spinnes ned ved 12.000 x g i 15 minutter ved 4 °C.
    2. Fjern forsigtigt den vandige fase, og tilsæt 1:1 volumen isopropanol, 15 μg glykogen-co-bundfald, og inkuber derefter ved 4 °C i 10 minutter for at udfælde RNA.
    3. Efter inkubation pelleteres RNA'et ved centrifugering ved 12.000 x g i 20 minutter ved 4 °C efterfulgt af en vask i 75% EtOH svarende til 1 volumen anvendt phenol. Resuspend RNA'et i 50 μL nukleasefrit destilleret vand; RNA kan opbevares ved -80 °C på ubestemt tid.
    4. Til RNA-prøver tilsættes 38 μL nukleasefrit destilleret vand, 10 μL 10x DNAse-reaktionsbuffer og 2 μL DNase I efterfulgt af blanding.
      BEMÆRK: Det er bedste praksis at generere en fælles blanding af alle reagenserne i undertrin 3.2.3 ganget med antallet af prøver til behandling med henblik på ligelig fordeling på prøverne.
    5. Inkuber DNase I-behandlede RNA-prøver ved 37 °C i 30 min.
    6. DNase fjernes fra prøverne ved hjælp af 1 volumen phenol/chloroform/isoamylalkohol (25:24:1) blanding ved hvirvel og centrifugering ved maksimal hastighed i en bordpladecentrifuge i 5 minutter. RNA'et vil være indeholdt i den vandige fase.
    7. Gentag undertrin 3.2.2 og 3.2.3 for at udfælde RNA. Resuspend i 20 μL nukleasefrit destilleret vand; RNA kan opbevares ved -80 °C på ubestemt tid.
    8. Generer cDNA fra oprenset RNA ved at inkubere 0,5-1,0 μg oprenset RNA med 200 U omvendt transkriptase, 100 pMol tilfældige primere og 10 mM af en dNTP-blanding i 1x reaktionsbuffer forsynet med den omvendte transkriptase; inkubere i 10 minutter ved 25 °C, derefter i 30 minutter ved 50 °C med et sidste inaktiveringstrin ved 85 °C i 5 minutter.
    9. Analysér cDNA fra RT-trinnet (undertrin 3.2.3) fra stillestående kontrol- og senescerende celler ved hjælp af realtids, kvantitativ (q) PCR-analyse for at vurdere niveauet af mRNA-markører, der vides at være øget (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21, IL1B, IL6 og CXCL8 mRNA'er) eller nedsat (LMNB1 og PCNA mRNA'er) med ældning som beskrevet andetsteds. ACTB mRNA, der koder for husholdningsproteinet β-Actin, er ofte et godt mRNA til at normalisere forskelle i inputmaterialet. De anvendte primere findes i tabel 2.
      BEMÆRK: Relativ RT-qPCR-analyse er afhængig af antagelser om lige bindingseffektivitet mellem målprimerparrene og et referenceprimerpar. Disse antagelser bør testes for nye grundsæt som beskrevet andetsteds37. Derudover skal referencemarkører være konstante mellem de celletyper, der sammenlignes, og flere yderligere muligheder for senescerende celler er tidligere blevet identificeret38.

4. Trypsinfordøjelse i opløsning

BEMÆRK: Fra dette tidspunkt og fremefter er det afgørende at anvende massespektrometri-grade buffere, opløsningsmidler og kemikalier for at forhindre interferens fra urenheder under massespektrometrianalyse. Alle buffere bør bestå af ingredienser, der er egnede til analyse af tandemmassespektrometri med væskekromatografi, herunder vand og acetonitril. Se tabellen over materialer for en liste over egnede kemikalier og opløsningsmidler.

  1. Aliquot 50 μg af hver proteinprøve i nye rør og bringes til lige store mængder med Lysis Buffer.
  2. Til hver prøve tilsættes DTT til en endelig koncentration på 20 mM for at reducere disulfidbindinger.
  3. Inkuber prøverne ved 37 °C i 30 minutter med omrystning, og lad derefter prøverne køle af ved stuetemperatur (RT, ~10 min).
  4. Der tilsættes iodoacetamid til en endelig koncentration på 40 mM for irreversibelt at alkylere de sulfhydrylgrupper, der blev reduceret i det foregående trin. Inkuber prøverne ved RT i mørke i 30 minutter.
  5. Hver prøve fortyndes til under 1 M urinstof med en buffer bestående af 50 mM ammoniumbicarbonat. Kontroller, om pH er ca. 8 ved at pipettere en lille mængde prøve på pH-strimler.
  6. Der tilsættes 1 μg trypsin til hver prøve for 50 μg startprotein eller ved 1:50 trypsin:protein-forhold efter masse, hvis der fordøjes en anden proteinmængde. For eksempel vil 3 μg trypsin blive tilsat til fordøjelsen af 150 μg protein.
  7. Inkubere prøverne natten over ved 37 °C med omrystning for at fordøje proteiner til peptider.
  8. Tilsæt myresyre til 1 volumenprocent af hver prøve for at slukke proteinfordøjelsen.
    BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her. Prøverne fryses ved -80 °C, og fortsæt om nødvendigt til næste trin på et senere tidspunkt.

5. Prøveoprydning med fastfaseekstraktion (SPE)

BEMÆRK: Denne fastfaseekstraktionsprotokol kræver fastfaseekstraktionspatroner og en vakuummanifoldopsætning. Andre tilsvarende SPE-protokoller (solid phase extraction) kan udføres efter forskerens skøn inden massespektrometrianalyse.

  1. Forbered dig på SPE ved at placere fastfasede ekstraktionspatroner på en vakuummanifold ved hjælp af en ekstraktionspatron til hver prøve.
    BEMÆRK: Se producentens retningslinjer for den mængde sorbent, der skal anvendes i SPE-protokollen. For 50 μg peptidprøver anbefales det at anvende 10 mg sorbentpatroner.
  2. Konditioner hver SPE-patron ved at tilsætte 800 μL SPE Elution Buffer (tabel 1), og brug vakuumsugning til at trække opløsningsmidlet gennem patronen.
  3. Gentag trin 5.2.
  4. Ligevægt hver patron ved at tilføje 800 μL SPE Wash Buffer (tabel 1) og brug vakuumsugning til at trække bufferen gennem patronerne.
  5. Gentag trin 5.4 to ekstra gange i alt tre gange.
  6. Læg peptidprøverne i SPE-patroner, og brug vakuumsugning til at trække prøver gennem patronerne.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt er peptider bundet til sorbenten inde i patronerne.
  7. Vask hver patron med SPE Wash Buffer, og brug vakuumsugning til at trække bufferen gennem patronerne.
  8. Gentag trin 5.7 to ekstra gange for i alt tre vaske.
  9. Før elueringstrinnet skal du arrangere opsamlingsrør i vakuummanifolden under hver patron og omhyggeligt sikre justering mellem opsamlingsrørene og patronerne.
  10. For at eluere peptider tilsættes 800 μL SPE Elution Buffer til hver patron og elueres peptider i opsamlingsrør med vakuumsugning.
  11. Gentag trin 5.10 med 400 μL SPE Elution Buffer.
  12. Fjern peptidprøverne fra vakuummanifolden og tør helt i en vakuumkoncentrator (tørring tager ca. 3 timer).
    BEMÆRK: Eksperimentet kan sættes på pause her. Prøverne fryses ved -80 °C og fortsættes om nødvendigt på et senere tidspunkt.

6. Dataafhængig erhvervelse (DDA) massespektrometrianalyse

  1. Resuspend peptidprøverne i en koncentration på 400 ng/μL i en buffer sammensat af 0,2% myresyre i vand.
  2. For at hjælpe med genopløseliggørelse af peptider, hvirvel prøverne i 5 minutter. Derefter sonikere prøverne i 5 minutter i et vandbad sonicator.
  3. Pellet eventuelle uopløselige materialer ved centrifugering af prøver ved 15.000 x g i 15 minutter ved 4 °C. Overfør peptidsupernatanterne til MS-hætteglas.
  4. Der tilsættes indekserede retentionstidspeptidstandarder (iRT) til hver prøve i en koncentration på 1:30 iRT:prøve, udtrykt i volumen.
  5. Prøverne indsendes til proteomisk analyse ved hjælp af væskekromatografi tandemmassespektrometri (LC-MS/MS) analyse.
    1. Brug LC-MS/MS-indstillinger, der anbefales til ikke-målrettet analyse af massespektrometrifaciliteten. Eksempler på analyseindstillinger er vist i figur 3, der er konfigureret til analyse på et Orbitrap-massespektrometer koblet til et nanovæskekromatografisystem i nanoflow-tilstand. Et eksempel på en protokol følger.
    2. Læg 1 μg (5 μL) af hver prøve på en fældesøjle (1 cm lang x 100 μm diameter) og vask dem med ilægningsopløsningsmiddel (tabel 1) med en strømningshastighed på 10 μL/min i 5 minutter.
    3. Prøverne lægges på en analytisk kolonne (50 cm lang x 100 μm diameter) med en strømningshastighed på 400 nL/min.
    4. Peptiderne elueres over en 90 minutters lineær gradient med et organisk opløsningsmiddel (0,2 % myresyre og 99,8 % acetonitril) og uorganisk opløsningsmiddel (0,2 % myresyre i 99,8 % vand), der spænder fra 5 % til 35 % organisk opløsningsmiddel.
    5. Indsaml massespektrometridata i dataafhængig tilstand med en kontinuerlig cyklus af MS1-undersøgelsesscanninger (60.000 opløsning, 3e6 AGC-mål, 100 ms maksimal akkumuleringstid og 400-1.600 m /z masseområde) efterfulgt af 20 dataafhængige MS2-scanninger (15.000 opløsning, 1e5 AGC-mål, 25 ms maksimal injektionstid og 1,6 m / z breddeisoleringsvinduer) med HCD-fragmentering (normaliseret kollisionsenergi på 27%).
  6. Efter MS-erhvervelse af alle prøver importeres rå massespektrometrifiler til et massespektrometri proteomics-analysesoftwareværktøj til identifikation og kvantificering af peptidtopområder.
    BEMÆRK: Til identifikation af peptider og proteiner i dette eksperiment blev Mascot-databasesøgningsværktøjet brugt sammen med den gennemgåede UniProt humane proteomsekvensdatabase (Proteome ID: UP000005640). Følgende søgeparametre blev specificeret i Mascot:
    • Mængde: SILAC K+8 R+10 [MD] Enzym: Trypsin/p Fast modifikation: carbamidomethyl (C)
    • Variable modifikationer: acetyl (protein N-term), Gln->pyro-Glu (N-term Q), oxidation (M), etiket: 13C (6) 15N (2) (K), etiket: 13C (6) 15N (4) (R)
    • Peptidmassetolerance: 10 ppm
    • Fragment massetolerance: 0,08 Da
    • Max savnede kavalergange: 2
    • Alle de uspecificerede parametre var standardparametre
  7. Kvantificer peptidtopområderne for tunge og lette peptider i proteomkvantificeringssoftwareværktøjet. Til kvantificering af spidsbelastningsområder i dette eksperiment blev den gratis og open source Skyline-softwareplatform brugt39,40. Eksporter tunge og lette peptidtopområder til estimering af proteinhalvingstider.

7. Beregning af proteinhalvingstider

  1. Åbn SILAC Analysis Workbook (tabel 3) til det første ark med navnet 1) Rådata og indsæt UniProt ID'er, gennavne, tunge topområder og lette topområder i de angivne kolonner (SH = Senescent-Heavy, SL = Senescent-Light, CH = Control (quiescent)-Heavy, CL = Control (quiescent)-Light).
  2. Åbn ark 2-4 og sørg for, at UniProt ID- og Gen-kolonnerne matcher antallet af proteiner, der er identificeret fra analysen (disse eksperimenter identificerede 841 proteiner). Resten af kolonnerne fyldes automatisk med data, når de er blevet trukket for at dække de identificerede proteiner.
  3. Åbn det fjerde ark med navnet 4) Analyse , og fjern rækker, hvor kolonnerne G og H angiver, at prøven er uden for rækkevidde; hold rækker, der læses inden for rækkevidde. Vulkanplottet i det femte ark udfyldes automatisk.

Representative Results

Denne protokol beskriver en metode til globalt at sammenligne proteinhalvingstider mellem senescerende og ikke-delende, hvilende kontrolceller ved hjælp af pSILAC og minimale tidspunkter. Denne protokol beskriver generering af senescerende og stillestående celler i kultur, metabolisk mærkning af celler med stabile isotoper af arginin og lysin over 3 dage, kvantificering af de relative mængder af tunge og lette peptidisotoper ved massespektrometri og en ligetil og tilgængelig beregning af proteinhaleringstider ved hjælp af regnearksformler (figur 1). Denne metode er meget fleksibel og kan tilpasses mange celletyper og tilstande.

Som en del af genereringen af senescerende celler til denne protokol anvendes to metoder til ældningsvalidering: SA-βGal-positive celler visualiseret ved mikroskopi og øgede niveauer af senescerende markører kvantificeret ved hjælp af RT-qPCR-analyse. Målingen af senescerende markører bør give klare sondringer mellem hvilende og senescerende celler, for at sammenligninger af de to cellepopulationer kan betragtes som gyldige. For SA-βGal-aktivitet skal senescerende celler fremstå blå, mens stillestående kontrolceller ikke har nogen eller meget lidt farve (figur 2A). Dette assay kan kvantificeres ved at tælle de positive, blåfarvede celler som en procentdel af det samlede antal celler og derefter sammenligne den procentvise positivitetshastighed mellem stillestående kontrol og senescerende celler. Det er vigtigt, at denne protokol udføres på samme tid til sammenligning af begge celletilstande; SA-βGal-aktivitet er afhængig af farvningsopløsningens pH-værdi, så resultaterne kan variere betydeligt mellem assays og bør betragtes som et kvalitativt mål.

RT-qPCR-analysen af senescerende markører vil vise høje niveauer af mRNA'erne, der koder for SASP-faktorer (IL6, CXCL8, IL1B) og cellecyklushæmmere (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21) i de fleste senescerende modeller. Selvom der forventes en vis variation baseret på celletype, dyrkningstilstand og senescerende induktor41,42, viser de fleste senescerende celler mere end fem gange højere niveauer af IL6, CXCL8 og CDKN1A / p21 mRA'er sammenlignet med hvilende kontrolceller; Omvendt bør niveauerne af LMNB1- og PCNA-mRNA'er, der koder for spredningsmarkører, være lave eller fraværende i senescerende celler sammenlignet med hvilende celler (figur 2B). Samlet set er en signifikant procentdel af SA-βGal-positivitet og den forventede ekspression af et panel af ældningsrelaterede mRNA-markører tilstrækkelige til at bekræfte induktionen af ældning i et eksperiment.

Behandling af proteinprøver til massespektrometrianalyse består af fordøjelse i opløsningen (2 dage) og fastfaseekstraktion (4-6 timer). For at udføre ikke-målrettet proteomisk analyse indsendes de resulterende peptider til LC-MS/MS-analyse ved hjælp af dataafhængig erhvervelse (DDA). På Orbitrap-instrumenter kan en DDA-metode specificeres i massespektrometriinstrumentets softwaremetodeeditor. De massespektrometerindstillinger, der anvendes i denne undersøgelse, er vist i figur 3A. Væskekromatografiindstillinger kan også angives i metodeeditoren. Til denne undersøgelse blev der anvendt en 90 minutters lineær gradient med stigende organisk fase (acetonitril) (figur 3B). Efter en vellykket erhvervelse skal den samlede ionstrøm (TIC) indeholde et intenst signal under den lineære gradientdel af metoden (figur 3C). Denne protokol beskriver en eksempelprotokol på et Orbitrap-instrument, men beregningen af proteinhalvingstider kan udføres på data opnået fra ethvert massespektrometer, der blev indsamlet i DDA-tilstand, som er tilgængelig på flere typer instrumenter (f.eks. Orbitraps og time-of-flight-instrumenter) og leverandører. Anskaffelsesindstillingerne vil være unikke for typen og konfigurationen af det anvendte instrument, og det anbefales at bruge de indstillinger, der foreslås af massespektrometrifaciliteten. Denne metode er også kompatibel med ikke-DDA-metoder (SRM, PRM, DIA), så længe kvantitative kromatografiske topområder for tunge og lette toppe kan udtrækkes fra rådatafilerne og indtastes i regnearksformlerne.

Rå massespektrometrifiler søges med et af de mange tilgængelige proteomiske databasesøgningsværktøjer til identifikation af peptider og proteiner. For eksempel brugte denne undersøgelse Mascot43-søgemaskinen. For at opnå kromatografiske topområder til kvantificering af tunge og lette peptider importeres databasesøgeresultater til en proteomisk software, der er i stand til kromatografiske topområder som Skyline39,40. Undersøgelse af de ekstraherede ionkromatogrammer af peptider (figur 4) vil afsløre den relative andel af tunge og lette peptidsignaler. En lavere andel af tungt peptidsignal i forhold til let peptidsignal i senescerende celler indikerer en langsommere proteinomsætningshastighed (figur 4A), og et højere tungt peptidsignal i forhold til lys indikerer en hurtigere proteinomsætningshastighed (figur 4B). De umærkede prøver skal vise ringe eller intet tungt peptidsignal. Ethvert tilsyneladende tungt peptidsignal i de umærkede prøver betragtes som baggrundsstøj og trækkes fra under de endelige beregninger. Kvantificering af kromatografiske spidsområder for lette og tunge peptider til alle behandlings- og mærkningsbetingelser skal eksporteres til efterfølgende beregning af proteinomsætningshastigheder og statistisk analyse.

Ved hjælp af enkelttidspunktsanalyse er kvantificeringen af proteinhalvingstider enkel at udføre og kan udføres bekvemt i regneark. I tabel 3 blev halveringstiderne for 695 proteiner identificeret ud fra massespektrometrianalysen beregnet. Ud fra tunge og lette isotopmængder på proteinniveau for hvert protein i prøverne (input til 1) Rådatabladet ) beregnes en procent tung isotop (nævnt Forholdet, R) derefter automatisk på arket med titlen 2) Forhold H | H + L. På dette trin normaliseres R fra tunge mærkede prøver ved at trække R fra umærkede prøver for at producere en endelig R for de quiescent og senescerende triplikater. Da umærkede prøver ikke bør have nogen eksogent tilsat tung isotop, bruges de til at eliminere baggrundssignalet. Fra R beregnes kdeg (omsætningshastighed) ved hjælp af følgende formel:

Equation 1

Halveringstiden (H, i dage) bestemmes for hvert protein i den hvilende kontrol og senescerende triplikater (ark med titlen 3) Half-Life (dage)) ved hjælp af følgende formel:

Equation 2

Disse halveringstider er derefter i gennemsnit blandt de hvilende og senescerende triplikater for at generere en hvilende og senescerende gennemsnitlig halveringstid for hvert protein samt en p-værdi. Beregnede halveringstider filtreres derefter for værdier, der er negative, hvilket opstår, når det tunge signal fra lysmærkede celler (baggrunden) er større end det tunge signal fra tungt mærkede celler. Denne filtrering resulterede i 707 proteiner fra 841 identificeret med gyldige halveringstider for de resultater, der præsenteres her.

Halveringstiden rapporteres derefter som et log2-forhold mellem senescerende over hvilende kontrolceller (log2FC) og afbildes i et vulkanplot (figur 5). For eksempel ved at se på 5) Analysearket kan koagulation II-trombinreceptorproteinet (F2R) ses at have en halveringstid i hvilende celler på 0,51 dage (kolonne B) og en halveringstid i senescerende celler på 1,07 dage (kolonne C), der gav en log2FC på ~ 1,06 (kolonne D) med en p-værdi på 0,001.

Figure 1
Figur 1: Diagram over pSILAC-arbejdsgangen for senescerende og stillestående kontrolceller. Humane IMR-90 fibroblaster blev anvendt til at forberede quiescent (low-serum) eller senescerende (IR) cellekulturer til sammenligning af proteinhalvingstider. Celler blev derefter mærket med SILAC Light eller SILAC Heavy medier med isotopisk arginin og lysin i 3 dage. Lysater blev ekstraheret fra celler, fordøjet, afsaltet og analyseret ved hjælp af massespektrometri. Tunge og lette peptidisotoptoppe svarer til henholdsvis nysyntetiserete og allerede eksisterende peptider. Halveringstider blev beregnet ved hjælp af en ligning for eksponentielt henfald. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Validering af senescerende fænotyper ved hjælp af SA-βGal- og RT-qPCR-analyser. (A) Senescerende og stillestående celler ombelægges på høsttidspunktet til en 6-brønds plade og farves til SA-βGal ved hjælp af SA-βGal-farvningssættet. Blå farve i cellekroppen er positiv for ældning. Billeder er taget i brightfield med farve ved 10x forstørrelse, størrelsesmarkør i rødt. (B) RT-qPCR-analyse, der sammenligner senescerende celler (røde) og cykelceller (grå) fra et ikke-relateret eksperiment. Stigninger i niveauerne af CDKN1A / p21, CXCL8 og IL6 mRNA'er er tegn på ældning, ligesom faldet i LMNB1 mRNA-niveauer. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Repræsentative metoder til dataafhængige erhvervelsesscanninger (DDA) og væskekromatografigradient af pSILAC-kulturer på Q-Exactive HF orbitrap-massespektrometeret. (A) Anbefalede instrumentindstillinger i instrumentsoftwaren til dataafhængig analyse af helcellelysater fra et pSILAC-eksperiment. B) Eksempel på indstillinger for væskekromatografiflowgradientmetode. Peptider elueres over en 90 minutters lineær gradient fra 5% til 35% buffer B (0,2% myresyre og 99,8% acetonitril) efterfulgt af en 10 minutters vask med 80% buffer B og 25 minutters ligevægt med 5% buffer B. (C) Et repræsentativt totalt ionkromatogram (TIC) af en massespektrometri erhvervelse af IMR-90 fibroblastpeptider erhvervet med de specificerede indstillinger. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Repræsentative ekstraherede ionkromatogrammer af peptider med ændret omsætning under ældning. (A) Kromatografiske topområder af peptidet FQMTQEVVCDECPNVK ++ fra proteinet DnaJ homolog underfamilie B medlem 11 (DNAJB11) i senescerende og ikke-senescerende celler. Efter 3 dages SILAC inkorporerer senescerende celler mindre tung isotop i dette peptid sammenlignet med stillestående (ikke-senescerende) celler, som indikeret ved en reduktion i topområdet af tungt isotopholdigt peptid (blåt) i forhold til det lette peptid (rødt), hvilket indikerer, at dette peptid har reduceret omsætningen i senescerende celler. B) Kromatografiske topområder af peptidet VQAQVIQETIVPK++ fra proteinet Splejsningsfaktor 3a-underenhed 1 (SF3A1) i senescerende og ikke-senescerende celler. Efter 3 dages SILAC inkorporerer senescerende celler en højere andel af tung isotop i dette peptid sammenlignet med stillestående (ikke-senescerende) celler, som indikeret ved en reduktion i topområdet af tungt isotopholdigt peptid (blåt) i forhold til det lette peptid (rødt), hvilket indikerer, at dette peptid har øget omsætningen i senescerende celler. De umærkede (dag 0) betingelser viser ingen inkorporering af tung isotop for begge peptider, som forventet. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning af proteinhalvingstider i senescerende og stillestående celler bestemt ud fra pSILAC-mærkning. (A) Vulkanplot, der viser log2-forholdet mellem senescerende / kontrol (quiescent) for hvert af de 695 identificerede proteiner; i dette eksperiment indeholdt lette og tunge mærkningsmedier ingen glukose og ingen phenolrød. (B) Tabeller, der viser de 10 bedste proteiner med de mest øgede eller nedsatte halveringstider i hvilende celler versus senescerende celler (henholdsvis venstre og højre). Klik her for at se en større version af denne figur.

Tabel 1: Medier og buffere, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 2: RT-qPCR-primere, der anvendes i denne protokol. Klik her for at downloade denne tabel.

Tabel 3: SILAC-analysearbejdsbog til beregning af proteinhalvingstider, foldændringer og t-test. Klik her for at downloade denne tabel.

Discussion

pSILAC er en kraftfuld teknik, der muliggør global kvantificering af proteinomsætningshastigheder på tværs af flere cellulære forhold. Dette papir beskriver brugen af pSILAC til at sammenligne globale proteinhaleringstider mellem senescerende og stillestående celler, herunder instruktioner til fremstilling af senescerende og stillestående celler, SILAC-mærkning og høst og i sidste ende analyse ved hjælp af DDA-massespektrometri. Derudover beskrives en totrinstest til validering af ældningsfænotypen ved hjælp af SA-βGal- og RT-qPCR-analyse af et panel af mRNA'er, der koder for ældningsrelaterede proteiner. Ud over validering af ældning med de to beskrevne tilgange kan en tredje validering af ældning udføres efter massespektrometrianalyse ved at lede efter ændringer i kendte ældningsmarkører mellem senescerende og hvilende celler på proteomisk niveau. Senescens-associerede proteiner, der forventes at være forhøjede, omfatter blandt andet p16, p21 og BCL2, beskrevet andetsteds44,45. I den ovenfor beskrevne protokol blev ioniserende stråling anvendt til induktion af ældning og serumsult for stillestående celler. Til induktion af ældning er der flere muligheder til rådighed, og der er betydelig heterogenitet blandt dem 41,42,46. I øjeblikket er der ingen senescerende metode, der betragtes som den "mest fysiologiske", så valget af senescerende inducer er i vid udstrækning baseret på eksperimentets kontekst. Eksperimenter med det formål at angive et generelt fænomen om ældning anbefales dog at anvende mindst to forskellige senescerende inducere. At diskutere rækkevidden af ældningsparadigmer ligger uden for dette papirs anvendelsesområde, men nogle almindelige metoder til at inducere ældning omfatter udløsning af DNA-skade (IR, doxorubicin, replikativ udmattelse), ekspression af onkogene proteiner (HRAS, BRAF) og forstyrrelse af mitokondrierfunktion2.

Ud over valget af senescerende inducer er valget af kontrolceller en lige så vigtig overvejelse. Senescerende celler er per definition under ubestemt vækstarremme, så en sammenligning med andre vækstanholdte celler vælges ofte. For pSILAC er cellecyklusanholdte celler generelt at foretrække, fordi de ikke replikerer og dermed er lettere at bruge til proteinhaleringstidsberegninger47. Men da dyrkede celler ofte vil beholde nogle delende celler, er det vigtigt, at de metoder, der bruges til at inducere cellecyklusstop, producerer så homogent et svar som muligt for at minimere fejl fra celler, der stadig formerer sig. For at beregne proteinnedbrydningshastigheder for cykelceller ved hjælp af pSILAC kræves yderligere beregninger for at kompensere for den hastighed, hvormed protein fortyndes i datterceller27. Imidlertid er quiescent vækst arrest i sig selv ikke uden komplikationer. Der er to generelle metoder til cellecyklusarrest: serummangel og kontakthæmning48. Ikke alle celler kan gøres stillestående gennem kontakthæmning, selvom nogle fibroblaster har vist sig at demonstrere quiescens efter flere dages dyrkning49. Denne metode brugte serummangel, fordi den er mere almindeligt anvendt til sammenligninger af senescerende celler, selvom det kræver, at den senescerende celle på samme måde serumberøves for nøjagtige sammenligninger. Serum aktiverer mTOR-komplekset, og serumberøvelse har således flere nedstrømsvirkninger på cellen ud over cellecyklusstop50. Især har senescerende celler vist sig at vise en reduceret SASP ved serummangel eller mTOR-hæmning51,52.

Et andet vigtigt punkt at overveje i pSILAC er, hvor mange tidspunkter der skal testes. Denne protokol indsamlede celler på et enkelt tidspunkt (3 dages let eller tung mærkning), hvilket i væsentlig grad forenkler den resulterende analyse. Valget af tidspunkt bør baseres på eksperimentets mål. Til global analyse forventes 3 dage at fange et flertal af proteiner, selvom halveringstider for kortlivede proteiner, der fuldstændigt omsættes inden for 3 dage (alt lyssignal går tabt), ikke kan måles på dette tidspunkt. Omvendt er langlivede proteiner med meget lille omsætning på 3 dage også vanskelige at kvantificere og fremstår ofte som havende ekstremt store halveringstider (i rækkefølgen af uger), der typisk kun er en konsekvens af meget lidt tung signalakkumulering. På grund af det ikke-lineære forhold i forholdet mellem tunge og lette peptidsignaler versus procentdelen af nysyntetiseret protein på kortere og længere tidspunkter kunne kvantiteten af halveringstider forbedres ved at tilføje yderligere mærkningstider. For relative sammenligninger mellem to celletilstande, som i denne protokol, kan en omtrentlig halveringstid være tilstrækkelig, men yderligere tidspunkter kan bruges til at forbedre kvantitativ nøjagtighed.

Denne protokol beskriver, hvordan man udfører en ikke-målrettet DDA-baseret analyse af proteinomsætning. Proteinomsætningsberegningerne kan dog generelt anvendes på ethvert erhvervelsesskema, der er i stand til at udlede den relative overflod af tunge og lette peptidpar. For eksempel kan MS2-baserede metoder såsom datauafhængig erhvervelse (DIA/SWATH) også anvendes til beregning af omsætningshastigheder med succes53. Derudover kan andre instrumenterings- og softwarerørledninger end dem, der er beskrevet i denne protokol, bruges til at udføre DDA-analyse, proteinidentifikation og proteinkvantificering. Når du bruger proteinkvantificeringssoftwareplatforme som Skyline til at udtrække peptidspidsområder, anbefales det manuelt at inspicere ekstraherede ionkromatogrammer i dokumentarbejdsområdet, identificere toppe, der fejlagtigt var integrerede og ikke-kvantitative toppe, og kuratere dokumentet i overensstemmelse hermed. En omfattende samling af tutorials er tilgængelig online for Skyline (skyline.ms).

pSILAC repræsenterer en af de mest ideelle metoder til global kvantificering af proteinhalvingstider i dyrkede celler på grund af overlegen multiplexing (proteomdækning) og gennemstrømning. Mens pSILAC ikke giver direkte syntese- eller nedbrydningshastigheder, da ændringen i let og tungt signal skyldes et sammenløb af faktorer, er pSILAC yderst nyttigt til sammenligninger mellem tilstande og forskellige celletyper. Metoder med lav gennemstrømning falder ofte i to typer: 1) behandling af celler med cyclohexamid for at blokere proteinsyntese og høst med tidsintervaller efter tilsætning for at overvåge henfald, eller 2) behandling af celler med en hæmmer af proteinhenfald og høst med tidsintervaller efter tilsætning for at overvåge akkumuleringen af protein og dermed udlede proteinhenfaldshastigheder. Begrænsningen af begge metoder er, at sådanne behandlinger uundgåeligt vil medføre væsentlige ændringer i cellulær fysiologi. I modsætning hertil kræver pSILAC ingen væsentlig indgriben og har teoretisk ingen påviselige virkninger på cellulær fysiologi, da isotopiske aminosyrer kun adskiller sig med en enkelt neutron fra deres ikke-isotopiske modstykker. Den her beskrevne metode for pSILAC repræsenterer således en simpel protokol til global måling af de mest fysiologiske proteinhaleringstider i ikke-delende celler.

Ændringer i proteinomsætning har et tæt forhold til aldring, aldersrelaterede sygdomme, neurodegeneration og lang levetid54,55. Denne protokol beskriver en metode til at forhøre disse forhold ved at anvende stabil isotopmærkning af aminosyrer i cellekultur til måling af proteinomsætningshastigheder i ældningsceller. Imidlertid findes der adskillige analoge metoder til at udføre undersøgelser i forbindelse med aldring og neurodegeneration in vivo i hele organismer som mus. Faktisk har disse undersøgelser understreget vigtigheden af at måle proteinomsætningshastigheder i forbindelse med aldersrelaterede sygdomme 56,57,58,59.

I denne undersøgelse skilte ribosomale proteiner og proteiner, der befinder sig i det endoplasmatiske retikulum, sig ud som to kategorier af proteiner med henholdsvis nedsat og øget halveringstid i senescerende celler. Mens yderligere analyse af steady-state niveauer er nødvendig for endelige konklusioner, tyder disse resultater yderligere på, at senescerende celler unikt kan regulere translation gennem nedsat halveringstid for ribosomale proteiner. Fremadrettet vil anvendelse af stabile isotopmærkningsmetoder til at studere forholdet mellem cellulær ældning og neurodegeneration in vivo i musemodeller være en lovende udvidelse af isotopmærkningsmetoden beskrevet i denne protokol.

Disclosures

Forfatterne har ingen afsløringer.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) og Intramural Research Program (IRP), National Institute on Aging (NIA). NB blev støttet af Longevity Impetus Grants og Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program. Figur 1 blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (LC-MS grade) Grainger AH015
Ammonium Bicarbonate Millipore-Sigma 9830
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher 15240062
BCA Assay Kit ThermoFisher 23227
Dithiothreotol (DTT) Sigma D9779
DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher 12430112
dNTP Mix ThermoFisher R0191
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated ThermoFisher 10082147
Formic Acid Sigma 27001
Gammacel 40 Exactor Best Theratronics Cesium Irradiator for cells
GlycoBlue ThermoFisher AM2238
Iodoacetamide (IAA) Sigma I1149 Light sensitive
IMR-90 primary lung fibroblasts ATCC CCL-186
iRT Kit (indexed retention time) Biognosys Ki-3002-2 Indexed Retention Time Peptide Standards
Isopropanol ThermoFisher 423835000
Mascot Matrix Science Mascot Daemon 2.8 Proteomic database searching software
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) ThermoFisher EP0742
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher 11140050
Nano LC System ThermoFisher ULTIM3000RSLCNANO
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges Waters 186000383
Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher Q Exactive HF Orbitrap
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 327110025
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM ThermoFisher A33972
QuantStudio 6 Real-Time PCR System ThermoFisher
Random Hexamer Primer ThermoFisher SO142
Senescence β-Galactosidase Staining Kit Cell Signaling 9860
Skyline University of Washington Skyline-Daily v21.2.1.424 Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms
Sonicator waterbath Branson CPX-952-516R
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018 Referred to as phenol in text; hazardous
TRYPle Express ThermoFisher 12605010
Trypsin (sequencing grade) Promega V5113
TURBO Dnase (2U/ uL) ThermoFisher AM2238
Urea ThermoFisher 29700
Water (LC-MS grade) Grainger AH365

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hayflick, L. The cell biology of aging. Journal of Investigative Dermatology. 73 (1), 8-14 (1979).
  2. Gorgoulis, V., et al. Cellular senescence: Defining a path forward. Cell. 179 (4), 813-827 (2019).
  3. Borghesan, M., Hoogaars, W. M. H., Varela-Eirin, M., Talma, N., Demaria, M. A senescence-centric view of aging: Implications for longevity and disease. Trends in Cell Biology. 30 (10), 777-791 (2020).
  4. Martinez-Cue, C., Rueda, N. Cellular senescence in neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 16 (2020).
  5. Wissler Gerdes, E. O., et al. Cellular senescence in aging and age-related diseases: Implications for neurodegenerative diseases. International Review of Neurobiology. 155, 203-234 (2020).
  6. Baker, D. J., Petersen, R. C. Cellular senescence in brain aging and neurodegenerative diseases: evidence and perspectives. Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1208-1216 (2018).
  7. Musi, N., et al. Tau protein aggregation is associated with cellular senescence in the brain. Aging Cell. 17 (6), 12840 (2018).
  8. Ogrodnik, M., et al. Obesity-induced cellular senescence drives anxiety and impairs neurogenesis. Cell Metabolism. 29 (5), 1061-1077 (2019).
  9. Chow, H. M., et al. Age-related hyperinsulinemia leads to insulin resistance in neurons and cell-cycle-induced senescence. Nature Neuroscience. 22 (11), 1806-1819 (2019).
  10. Dehkordi, S. K., et al. Profiling senescent cells in human brains reveals neurons with CDKN2D/p19 and tau neuropathology. Nature Aging. 1, 1107-1116 (2021).
  11. Chinta, S. J., et al. Cellular senescence is induced by the environmental neurotoxin paraquat and contributes to neuropathology linked to Parkinson's disease. Cell Reports. 22 (4), 930-940 (2018).
  12. Bussian, T. J., et al. Clearance of senescent glial cells prevents tau-dependent pathology and cognitive decline. Nature. 562 (7728), 578-582 (2018).
  13. Zhang, P., et al. Senolytic therapy alleviates Abeta-associated oligodendrocyte progenitor cell senescence and cognitive deficits in an Alzheimer's disease model. Nature Neuroscience. 22 (5), 719-728 (2019).
  14. Selkoe, D. J., Hardy, J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease at 25 years. EMBO Molecular Medicine. 8 (6), 595-608 (2016).
  15. Wei, Z., et al. Amyloid beta protein aggravates neuronal senescence and cognitive deficits in 5xfad mouse model of Alzheimer's disease. Chinese Medical Journal (England). 129 (15), 1835-1844 (2016).
  16. He, N., et al. Amyloid-beta(1-42) oligomer accelerates senescence in adult hippocampal neural stem/progenitor cells via formylpeptide receptor 2. Cell Death & Disease. 4 (11), 924 (2013).
  17. van Dijk, K. D., et al. Changes in endolysosomal enzyme activities in cerebrospinal fluid of patients with Parkinson's disease. Movement Disorders: Offical Journal of Movement Disorder Society. 28 (6), 747-754 (2013).
  18. Chinta, S. J., et al. Environmental stress, ageing and glial cell senescence: a novel mechanistic link to Parkinson's disease. Journal of Internal Medicine. 273 (5), 429-436 (2013).
  19. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  20. Coppe, J. P., Desprez, P. Y., Krtolica, A., Campisi, J. The senescence-associated secretory phenotype: the dark side of tumor suppression. Annual Review of Patholology. 5, 99-118 (2010).
  21. Acosta, J. C., et al. A complex secretory program orchestrated by the inflammasome controls paracrine senescence. Nature Cell Biology. 15 (8), 978-990 (2013).
  22. Payea, M. J., Anerillas, C., Tharakan, R., Gorospe, M. Translational control during cellular senescence. Molecular and Cellular Biology. 41 (2), 00512 (2021).
  23. Nishimura, K., et al. Perturbation of ribosome biogenesis drives cells into senescence through 5S RNP-mediated p53 activation. Cell Reports. 10 (8), 1310-1323 (2015).
  24. Lessard, F., et al. Senescence-associated ribosome biogenesis defects contributes to cell cycle arrest through the Rb pathway. Nature Cell Biology. 20 (7), 789-799 (2018).
  25. Xu, M., et al. Senolytics improve physical function and increase lifespan in old age. Nature Medicine. 24 (8), 1246-1256 (2018).
  26. Wiley, C. D., et al. SILAC Analysis reveals increased secretion of hemostasis-related factors by senescent cells. Cell Reports. 28 (13), 3329-3337 (2019).
  27. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  28. Doherty, M. K., Hammond, D. E., Clague, M. J., Gaskell, S. J., Beynon, R. J. Turnover of the human proteome: determination of protein intracellular stability by dynamic SILAC. Journal of Proteome Research. 8 (1), 104-112 (2009).
  29. Riba, A., et al. Protein synthesis rates and ribosome occupancies reveal determinants of translation elongation rates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (30), 15023-15032 (2019).
  30. Mathieson, T., et al. Systematic analysis of protein turnover in primary cells. Nature Communications. 9 (1), 689 (2018).
  31. Liu, T. Y., et al. Time-resolved proteomics extends ribosome profiling-based measurements of protein synthesis dynamics. Cell Systems. 4 (6), 636-644 (2017).
  32. Welle, K. A., et al. Time-resolved analysis of proteome dynamics by tandem mass tags and stable isotope labeling in cell culture (TMT-SILAC) hyperplexing. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 15 (12), 3551-3563 (2016).
  33. Neri, F., Basisty, N., Desprez, P. Y., Campisi, J., Schilling, B. Quantitative proteomic analysis of the senescence-associated secretory phenotype by data-independent acquisition. Current Protocols. 1 (2), 32 (2021).
  34. Hernandez-Segura, A., Brandenburg, S., Demaria, M. Induction and validation of cellular senescence in primary human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (136), e57782 (2018).
  35. Noren Hooten, N., Evans, M. K. Techniques to Induce and quantify cellular senescence. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (123), e55533 (2017).
  36. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-βgal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nature Protocols. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  37. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  38. Hernandez-Segura, A., Rubingh, R., Demaria, M. Identification of stable senescence-associated reference genes. Aging Cell. 18 (2), 12911 (2019).
  39. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  40. Pino, L. K., et al. The Skyline ecosystem: Informatics for quantitative mass spectrometry proteomics. Mass Spectrometry Reviews. 39 (3), 229-244 (2020).
  41. Casella, G., et al. Transcriptome signature of cellular senescence. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7294-7305 (2019).
  42. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biology. 18 (1), 3000599 (2020).
  43. Perkins, D. N., Pappin, D. J., Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Probability-based protein identification by searching sequence databases using mass spectrometry data. Electrophoresis. 20 (18), 3551-3567 (1999).
  44. Hernandez-Segura, A., Nehme, J., Demaria, M. Hallmarks of cellular senescence. Trends in Cell Biology. 28 (6), 436-453 (2018).
  45. Kohli, J., et al. Algorithmic assessment of cellular senescence in experimental and clinical specimens. Nature Protocols. 16 (5), 2471-2498 (2021).
  46. Hernandez-Segura, A., et al. Unmasking transcriptional heterogeneity in senescent cells. Current Biology: CB. 27 (17), 2652-2660 (2017).
  47. Swovick, K., et al. Interspecies differences in proteome turnover kinetics are correlated with life spans and energetic demands. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100041 (2021).
  48. Marescal, O., Cheeseman, I. M. Cellular mechanisms and regulation of quiescence. Developmental Cell. 55 (3), 259-271 (2020).
  49. Lacorazza, H. D. Cellular Quiescence. , Springer, Humana Press. New York. (2018).
  50. Saxton, R. A., Sabatini, D. M. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 168 (6), 960-976 (2017).
  51. Herranz, N., et al. mTOR regulates MAPKAPK2 translation to control the senescence-associated secretory phenotype. Nature Cell Biology. 17 (9), 1205-1217 (2015).
  52. Laberge, R. M., et al. MTOR regulates the pro-tumorigenic senescence-associated secretory phenotype by promoting IL1A translation. Nature Cell Biology. 17 (8), 1049-1061 (2015).
  53. Pino, L. K., Baeza, J., Lauman, R., Schilling, B., Garcia, B. A. Improved SILAC quantification with data-independent acquisition to investigate Bortezomib-induced protein degradation. Journal of Proteome Research. 20 (4), 1918-1927 (2021).
  54. Basisty, N., Meyer, J. G., Schilling, B. Protein turnover in aging and longevity. Proteomics. 18 (5-6), 1700108 (2018).
  55. Basisty, N., Holtz, A., Schilling, B. Accumulation of "Old Proteins" and the critical need for MS-based protein turnover measurements in aging and longevity. Proteomics. 20 (5-6), 1800403 (2020).
  56. Basisty, N., et al. Mitochondrial-targeted catalase is good for the old mouse proteome, but not for the young: 'reverse' antagonistic pleiotropy. Aging Cell. 15 (4), 634-645 (2016).
  57. Dai, D. F., et al. Altered proteome turnover and remodeling by short-term caloric restriction or rapamycin rejuvenate the aging heart. Aging Cell. 13 (3), 529-539 (2014).
  58. Karunadharma, P. P., et al. Subacute calorie restriction and rapamycin discordantly alter mouse liver proteome homeostasis and reverse aging effects. Aging Cell. 14 (4), 547-557 (2015).
  59. Basisty, N. B., et al. Stable isotope labeling reveals novel insights into ubiquitin-mediated protein aggregation with age, calorie restriction, and rapamycin treatment. The Journals of Gerontology. Series A, Biological Sciences and Medical Sciences. 73 (5), 561-570 (2018).

Tags

Biokemi Udgave 182 cellulær ældning massespektrometri SILAC proteinomsætning proteostase aldring neurodegeneration cellekultur nedbrydning syntese stabil isotopmærkning metabolisk mærkning
Måling af proteinomsætningshastigheder i senescerende og ikke-delende dyrkede celler med metabolisk mærkning og massespektrometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N.… More

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N. Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63835, doi:10.3791/63835 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter