Summary
Dieses Protokoll beschreibt den Workflow für die metabolische Markierung von seneszenten und nicht teilenden Zellen mit gepulstem SILAC, ungezielter Massenspektrometrie-Analyse und einer optimierten Berechnung der Proteinhalbwertszeiten.
Abstract
Immer mehr Beweise haben gezeigt, dass die Ansammlung von seneszenten Zellen im zentralen Nervensystem zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Alzheimer und Parkinson beiträgt. Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des permanenten Zellzyklusstillstands, der typischerweise als Reaktion auf die Exposition gegenüber subletalen Belastungen auftritt. Wie andere sich nicht teilende Zellen bleiben seneszente Zellen jedoch metabolisch aktiv und erfüllen viele Funktionen, die einzigartige transkriptionelle und translationale Anforderungen und weit verbreitete Veränderungen der intrazellulären und sezernierten Proteome erfordern. Zu verstehen, wie sich Proteinsynthese und Zerfallsraten während der Seneszenz ändern, kann die zugrunde liegenden Mechanismen der zellulären Seneszenz beleuchten und potenzielle therapeutische Wege für Krankheiten finden, die durch seneszente Zellen verschlimmert werden. Dieser Beitrag beschreibt eine Methode zur Proteom-skaligen Bewertung von Proteinhalbwertszeiten in nicht teilenden Zellen unter Verwendung der gepulsten stabilen Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in Zellkultur (pSILAC) in Kombination mit der Massenspektrometrie. pSILAC beinhaltet die metabolische Markierung von Zellen mit stabilen schweren isotopenhaltigen Versionen von Aminosäuren. In Verbindung mit modernen massenspektrometrie-Ansätzen ermöglicht pSILAC die Messung des Proteinumsatzes von Hunderten oder Tausenden von Proteinen in komplexen Gemischen. Nach der metabolischen Markierung kann die Umsatzdynamik von Proteinen basierend auf der relativen Anreicherung schwerer Isotope in Peptiden, die durch Massenspektrometrie nachgewiesen werden, bestimmt werden. In diesem Protokoll wird ein Workflow für die Erzeugung von seneszenten Fibroblastenkulturen und ähnlich gestoppten ruhenden Fibroblasten sowie ein vereinfachter pSILAC-Markierungszeitverlauf mit einem einzigen Zeitpunkt beschrieben, der die Abdeckung der erwarteten Proteinumsatzraten maximiert. Darüber hinaus wird eine Pipeline für die Analyse von pSILAC-Massenspektrometriedaten und die benutzerfreundliche Berechnung von Proteinabbauraten mithilfe von Tabellenkalkulationen vorgestellt. Die Anwendung dieses Protokolls kann über seneszente Zellen hinaus auf alle nicht teilenden kultivierten Zellen wie Neuronen ausgedehnt werden.
Introduction
Seneszenz wurde zuerst als ein Zustand des unbestimmten Wachstumsstillstands identifiziert, der von kultivierten Primärzellen nach Erreichen der replizierten Erschöpfung gezeigtwurde 1. Seitdem hat sich gezeigt, dass Seneszenz als Reaktion auf zahlreiche zelluläre Beleidigungen entstehen kann, darunter genotoxische, mitochondriale und onkogene Belastungen, unter anderem2. Während die Seneszenz mehrere physiologisch wichtige Rollen spielt, wie z.B. Tumorsuppression und Wundheilung, ist die Ansammlung von seneszenten Zellen während des Alterns mit einer Vielzahl schädlicher Auswirkungen auf die Gesundheitverbunden 3, einschließlich mehrerer neurodegenerativer Erkrankungen 4,5,6. Zelluläre Seneszenz tritt in mehreren Gehirnzelltypen auf, einschließlich Neuronen 7,8,9,10, Astrozyten 11, Mikroglia 12 und Oligodendrozytenvorläufer 13, und trägt zu Neurodegeneration und kognitiver Dysfunktion bei. Amyloid-Beta-Oligomere, eines der Kennzeichen der Alzheimer-Krankheit 14, beschleunigen nachweislich die neuronale Seneszenz13,15,16. Eine erhöhte Prävalenz von seneszenten Zellen wurde auch mit der Parkinson-Krankheit 17 in Verbindung gebracht, insbesondere aufgrund von Umweltstressoren11,18. Wichtig ist, dass die selektive Eliminierung seneszenter Zellen in präklinischen Modellen die Lebensdauer verlängert und eine Vielzahl von altersbedingten Krankheitenmildert 3,5,12 und kognitive Defiziteverbessert 8,11,12,13. Seneszente Zellen haben sich damit zu vielversprechenden therapeutischen Angriffspunkten für die Behandlung vieler altersbedingter Erkrankungen entwickelt.
Ein Großteil der schädlichen Wirkung seneszenter Zellen wird durch den seneszenzassoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) verursacht, eine komplexe Mischung aus bioaktiven Molekülen, die von seneszenten Zellen abgesondert werden und lokale Entzündungen, Angiogenese, Zerstörung der extrazellulären Matrix und Ausbreitung der Seneszenz im umgebenden Gewebe verursachen können19,20,21 . Das SASP stellt auch ein interessantes biologisches Phänomen der Seneszenz dar, da es während eines Zellzyklusstillstands einen erheblichen transkriptionellen und translationalen Aufwand erfordert. Tatsächlich wurde gezeigt, dass seneszente Zellen eine Abnahme der Ribosom-Biogenese22,23,24 aufweisen, die die Proteinsynthese reduzieren sollte. Stattdessen übersetzen seneszente Zellen einige Proteine, insbesondere SASP-Faktoren, robust und beeinflussen den Stoffwechsel des umgebenden Gewebes25. Daher besteht ein erhebliches Interesse daran, zu verstehen, wie seneszente Zellen, die sich einem permanenten Zellzyklusstillstand unterziehen, weiterhin die Proteinhomöostase aufrechterhalten und gleichzeitig SASP-Faktoren und andere ausgewählte Proteine robust exprimieren.
Diese Methode beschreibt, wie Massenspektrometrie und pulsstabile Isotopenmarkierung durch Aminosäuren in Zellkultur (pSILAC) eingesetzt werden können, um die Halbwertszeiten von Proteinen in seneszenten Zellen auf einer proteomweiten Skala global zu messen. In traditionellem SILAC werden kultivierte Zellen vollständig metabolisch mit schweren und leichten nicht-radioaktiven Isotopen von Aminosäuren markiert, um die Proteinhäufigkeit nachzubilden. Diese Methode wurde bereits angewendet, um Abundanzänderungen im SASP von kultivierten Fibroblasten umfassend und quantitativ zu bewerten26. In pSILAC werden Zellen in ähnlicher Weise metabolisch mit einem Puls aus schwerem Isotop markiert, der der Vormarkierung mit leichtem Isotop folgt, und dann in einem oder mehreren Zeitintervallen geerntet. Die Einbauraten schwerer Isotope in Bezug auf bereits existierende leichte Isotope werden dann verwendet, um die relativen Proteinumsatzraten zu berechnen. Im Allgemeinen werden Isotope von Arginin und Lysin verwendet, weil Trypsin an diesen Rückständen spaltet; Daher enthalten alle Peptide aus der Standardverdauung möglicherweise das Heavy-Label. Paare von Peptiden, die sich nur durch das Vorhandensein oder Fehlen von schwerem Lysin oder Arginin unterscheiden, sind chemisch identisch und können durch ein Massenspektrometer differenziert und quantifiziert werden. Nach der massenspektrometrieren Analyse können Peptide als neu synthetisiert oder bereits vorhanden identifiziert werden, basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen der Isotopenmarkierung in den resultierenden Peptididentifikationen. Proteinumsatzraten können dann bestimmt werden, indem das Verhältnis von schweren (13 C-15 N) über leichten (12 C-14N) Peptiden für ein gegebenes Protein an kinetische Modelle für exponentielles Wachstum oder Zerfallangepasst wird 27,28. pSILAC wurde in mehreren Vergleichen von Proteinumsatzraten 29,30,31,32 eingesetzt und ist derzeit die umfassendste und durchsatzfähigste Methode zur Messung von Proteinhalbwertszeiten.
Dieses Protokoll beschreibt die Präparation seneszenter Zellen parallel zu ähnlich wachstumshemmenden Ruhezellen in Kultur, gefolgt von der metabolischen Markierung mit pSILAC. Die Zellen werden dann geerntet, zu Lysaten homogenisiert und für die massenspektrometrische Erfassung und Analyse verarbeitet. Die aus der Massenspektrometrie gewonnenen Daten werden dann verwendet, um Proteinhalbwertszeiten mit einer vereinfachten quantitativen Methode zu bestimmen, die einen einzigen Zeitpunkt und Halbwertszeiten in einer Tabelle verwendet. Mit diesem Ansatz können Schätzungen der Proteinhalbwertszeiten auf eine umfassende und quantitative Weise gemessen werden, die für ungestörte zelluläre Bedingungen authentischer ist als Protokolle, die Blocker der Proteinsynthese oder des Proteinumsatzes verwenden.
Protocol
1. Herstellung von Ruhezellen und Zellen, die durch die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung (IR) seneszent geworden sind
HINWEIS: Zelluläre Seneszenz und Ruhephase können mit mehreren Methoden induziert werden, wie an anderer Stelleausführlich beschrieben 33,34,35. Die Reize, die zur Induktion von Seneszenz und Ruhezustand verwendet werden, können vom interessierenden Zelltyp und der untersuchten biologischen Frage abhängen. Die in dieser Studie verwendeten Zellen sind im Handel erhältlich.
- Tauen Sie humane diploide IMR-90-Fibroblasten (~ 1 x 106 Zellen) aus einem Kryo auf und plattieren Sie sie in 20 ml DMEM, ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) (Tabelle 1) auf einer 150-mm-Platte.
- Züchten Sie die Zellen unter physiologischen Sauerstoffbedingungen (3%O2 , 5% CO 2, 37 °C) und erweitern Sie die Kulturen in 10% FBS-haltigen Medien, bis ausreichende Replikate für quiszente und seneszente Zellen etabliert sind (mindestens 3-5 Replikate werden pro Bedingung empfohlen).
HINWEIS: Die Kultivierung von Zellen bei physiologischem (3%) Sauerstoff ist ideal für primäre menschliche Fibroblastenzellen, aber geeignete Kulturbedingungen für andere Zelltypen können variieren und sollten von Fall zu Fall bestimmt werden. - Erzeugen Sie seneszente Zellen, indem Sie proliferierende Zellen 15 Gray (Gy) ionisierender Strahlung (IR) aussetzen.
HINWEIS: Die Intensität der Strahlenexposition kann je nach Zelltyp variieren. Während 15 Gy hier verwendet wird, ist 10 Gy auch eine häufig verwendete Strahlendosis für Fibroblasten; andere Zellen, wie Monozyten, können eine Dosis von nur 5 Gy benötigen. Die Dosis wird im Allgemeinen empirisch durch Abwägung der Lebensfähigkeit gegen die Seneszenzinduktion bestimmt.- Setzen Sie die Zellen bei 40%-60% Konfluenz gegenüber IR in Medien aus, die 10% FBS enthalten.
- Wechseln Sie nach der IR-Belichtung zu frischen Medien mit 10% FBS.
- Wechseln Sie das Medium (20 ml, davon 10% FBS) alle 2 Tage für 8 Tage.
HINWEIS: Zellen werden IR bei geringerem Konfluenz ausgesetzt, da sich IR-behandelte Zellen in Kultur ausdehnen, bevor sie aufhören zu wachsen. In diesem Experiment waren Zellen während der Etablierung der Seneszenz keine gespaltenen Zellen, und während sie konfluenter wurden, zeigten sie bei der Ernte immer noch seneszente Zellmarker. In Fibroblasten entwickelt sich der seneszente Phänotyp innerhalb von 7-10 Tagen.
- Erzeugen Sie ruhende Kontrollzellen, indem Sie die Medien auf plattierten proliferierenden Zellen in Medien mit 0,2% FBS (Serumhunger) umwandeln (Tabelle 1).
- Setzen Sie das Züchten von Zellen, die für die Ruhekontrolle in Medien mit 10% FBS verwendet werden, bis zum Tag 4 fort, nachdem seneszente Zellen IR ausgesetzt wurden, und spalten Sie sich bei Bedarf.
- Wechseln Sie am Tag 4 nach der IR die Medien der Ruhezellen auf 20 ml Medien mit 0,2% FBS (Tabelle 1) und wachsen Sie weitere 6 Tage weiter, wobei Sie alle 2 Tage das Medium wechseln.
HINWEIS: Selbst in Medien, die 0,2% FBS enthalten, wachsen die Fibroblasten weiter etwas und können am Ende der Ernte zusammenfließend erscheinen. Als Faustregel gilt, dass ruhende Zellen gesammelt werden sollen, wenn sie einen ähnlichen Zusammenfluss wie die seneszenten Zellkulturen erreicht haben.
2. Markierung von Zellen für gepulstes SILAC und Ernte von Lysaten
- Wechseln Sie die Medien auf seneszenten und ruhenden Zellen (12 Platten) zu SILAC Light (Tabelle 1) und wachsen Sie für 2 Tage.
HINWEIS: Diese Kennzeichnung hilft, Hintergrundgeräusche zu reduzieren, da es eine geringe natürliche Häufigkeit von 13C und 15N gibt. Dieser Schritt kann unter reagenzlimitierenden Bedingungen übersprungen werden, führt jedoch zu einer leichten Überschätzung der neuen Proteinsynthese. - Ersetzen Sie die Medien durch SILAC DMEM (Tabelle 1) zur metabolischen Markierung.
HINWEIS: SILAC DMEM-Medien sind speziell formuliert, um rein leichte oder schwere Isotope von Arginin und Lysin zur metabolischen Markierung zu enthalten. Sie dürfen in den Teilschritten 2.2.1 oder 2.2.2 nicht durch Standard-DMEM-Formulierungen ersetzt werden.- Ersetzen Sie bei drei seneszenten und drei Ruheplatten die Medien durch 30 ml SILAC Light (Tabelle 1) und wachsen Sie 3 Tage lang, ohne das Medium zu wechseln.
- Ersetzen Sie bei mindestens drei seneszenten und drei ruhenden Platten die Medien durch 30 ml SILAC Heavy (Tabelle 1) und wachsen Sie 3 Tage lang, ohne das Medium zu wechseln.
HINWEIS: An dieser Stelle gibt es eine Option, um die markierten Zellen sofort zu ernten, anstatt sie für weitere 3 Tage zu kennzeichnen. Für einen einzigen Zeitpunkt ist es vorzuziehen, schwere und leicht markierte Zellen für den gleichen Zeitraum wie in diesem Protokoll zu kennzeichnen, um Batch-Effekte zu minimieren.
- Lösen Sie die Zellen von den Kulturplatten, indem Sie 5 ml vorgewärmtes Trypsin-Reagenz zu jeder Schale geben und für 5 min bei 37 ° C inkubieren.
- Resuspendieren Sie die abgelösten Zellen in 5 ml des gleichen Mediums, das für die Kultur verwendet wird (entweder SILAC Light oder SILAC Heavy), auf ein Gesamtvolumen von 10 ml.
- Ernten Sie die Zellen für die Extraktion von Lysaten und die Validierung von Seneszenzmarkern.
- Für jede Suspension aliquot 0,6 x 10 6 Zellen in 2 ml Medien mit 0,2% FBS in einer 6-Well-Schale (zwei Schalen, eine für SILAC Light kultivierte Zellen und eine für SILAC Heavy kultivierte Zellen) und bei 37 °C für die Inkubation über Nacht aufstellen.
HINWEIS: Diese Platten (Teilschritt 2.5.1) werden zum Nachweis der seneszenzassoziierten β-Galactosidase-Aktivität (SA-βGal) verwendet (Schritt 3.1). - Für jede Suspension 1 x 106 der Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und in einer Tischzentrifuge mit voller Geschwindigkeit für 1 min nach unten drehen. Entfernen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 1 ml Phenol; In diesem Schritt kann RNA wie im Handbuch des Phenollieferanten beschrieben vollständig gereinigt oder langfristig bei -80 °C gelagert werden.
ACHTUNG: Phenol ist ätzend und sollte ausschließlich in einer Kapuze mit Handschuhen und einem Laborkittel gehandhabt werden.
HINWEIS: Die extrahierte RNA wird für den Nachweis von mRNAs verwendet, die für SASP-Faktoren kodieren, mittels Reverse Transkription (RT), gefolgt von einer quantitativen (q) PCR-Analyse (RT-qPCR) in Echtzeit (Schritt 3.2). Ein weiterer zuverlässiger Assay für die Seneszenzinduktion ist ein Test für die 5-Ethynyldihydroxy-Uridin (EdU) -Einarbeit, der auf das Vorhandensein von proliferierenden Zellen hinweist. Das Fehlen von Proliferation kann verwendet werden, um Ruhe und Seneszenz zu bestätigen. - Die verbleibenden Zellen auf Eis überführen und bei 300 x g und 4 °C nach unten drehen.
- Für jede Suspension aliquot 0,6 x 10 6 Zellen in 2 ml Medien mit 0,2% FBS in einer 6-Well-Schale (zwei Schalen, eine für SILAC Light kultivierte Zellen und eine für SILAC Heavy kultivierte Zellen) und bei 37 °C für die Inkubation über Nacht aufstellen.
- Entfernen Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen zweimal in 1 ml kaltem PBS, um Medien / Trypsin und exogene Proteinkontamination aus fetalem Rinderserum aus dem Kulturmedium zu entfernen.
- Drehen Sie die Zellen wieder herunter, entfernen Sie den Überstand und fahren Sie mit der Lyse fort.
- Resuspendiert die Zellpellets in 150 μL frisch zubereitetem 8 M Harnstoff 50 mM Ammoniumbicarbonat-Lysepuffer (Tabelle 1) und mischen Sie sie durch Pipettieren nach oben und unten.
- Beschallen Sie die Lysate in einem Wasserbeschallungsgerät für 2,5 min mit 30 s Ein-/Ausschalten bei mittlerer Leistung bei 4 °C.
- Die Lysate in einen vorgewärmten 95 °C Heizblock geben und für 4 min denaturieren.
- Spin down die Lysates; Lysate können nun bei -80 °C gelagert oder sofort zur Quantifizierung verwendet werden.
- Machen Sie einen 30 μL Vorrat von 1:10 Verdünnungen für jedes Lysat in Lysis Buffer.
- Messen Sie die Proteinkonzentration mit dem BCA Assay Kit unter Verwendung einer Standardkurve, die in einem 1/10-fachen Lysepuffer hergestellt wurde, der in ddH2O verdünnt ist.
3. Validierung der Seneszenz durch Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase (SA-βGal)-Aktivität und RT-qPCR-Analyse von seneszenzassoziierten mRNAs
HINWEIS: Das Ausgangsmaterial für diese Schritte wird in Schritt 2.5 gesammelt.
- Ausgehend von den 6-Well-Platten, die in Teilschritt 2.5.1 eingerichtet wurden, werden die Zellen mit dem Senescence β-Galactosidase-Färbekit gemäß dem Protokoll des Herstellers auf SA-βGal-Aktivität analysiert. Visualisieren Sie die Färbung unter Hellfeld mit aktivierter Farbe, wie zuvor beschrieben36.
HINWEIS: SA-βGal wird quantifiziert, indem der Prozentsatz positiver Zellen (sichtbare blaue Farbe) unter seneszenten und Ruhekontrollbedingungen verglichen wird. Mindestens 70% der Zellen sollten SA-βGal-positiv sein, um eine erfolgreiche Bestätigung der Seneszenz zu ermöglichen. Ruheregelzellen sollten weniger als 10% positiv für SA-βGal sein. - Die RNA wird aus der Phenolsuspension extrahiert (Unterschritt 2.5.2) und mittels RT-qPCR auf erhöhte Konzentrationen von mRNAs analysiert, die für SASP-Faktoren (IL6, CXCL8, IL1B), Zellzyklusmarker (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) und andere Indikatoren der Seneszenz (Verlust von LMNB1 und PCNA) kodieren.
HINWEIS: RNA ist instabil und sollte daher mit RNase-freier Ausrüstung, frischen Handschuhen und auf Eis gehandhabt werden, sofern im Protokoll nichts anderes angegeben ist.- Ausgehend von der Phenolsuspension 200 μL Chloroform pro 1 ml Phenol hinzufügen und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C nach unten drehen.
- Entfernen Sie vorsichtig die wässrige Phase und fügen Sie 1: 1 Volumen Isopropanol, 15 μg Glykogen Co-Fällungsmittel hinzu und inkubieren Sie dann bei 4 ° C für 10 Minuten, um RNA auszufällen.
- Nach der Inkubation pelletieren Sie die RNA durch Zentrifugation bei 12.000 x g für 20 min bei 4 °C, gefolgt von einer Wäsche in 75% EtOH, was 1 Volumen des verwendeten Phenols entspricht. Resuspendiert die RNA in 50 μL nukleasefreiem destilliertem Wasser; RNA kann unbegrenzt bei -80 °C gelagert werden.
- Zu RNA-Proben fügen Sie 38 μL nukleasefreies destilliertes Wasser, 10 μL 10x DNAse-Reaktionspuffer und 2 μL DNase I hinzu, gefolgt von einer Mischung.
HINWEIS: Die Generierung einer gemeinsamen Mischung aller Reagenzien in Teilschritt 3.2.3 multipliziert mit der Anzahl der Proben für die Behandlung bei gleicher Verteilung mit Proben ist die bewährte Methode. - Inkubieren Sie DNase I-behandelte RNA-Proben bei 37 °C für 30 min.
- Entfernen Sie DNase aus den Proben mit 1 Volumen einer Mischung aus Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25:24:1), indem Sie in einer Tischzentrifuge 5 min lang mit maximaler Geschwindigkeit wirbeln und drehen. die RNA wird in der wässrigen Phase enthalten sein.
- Wiederholen Sie die Teilschritte 3.2.2 und 3.2.3, um RNA auszufällen. Resuspendiert in 20 μL nukleasefreiem destilliertem Wasser; RNA kann unbegrenzt bei -80 °C gelagert werden.
- Erzeugen Sie cDNA aus gereinigter RNA durch Inkubation von 0,5-1,0 μg gereinigter RNA mit 200 U umgekehrter Transkriptase, 100 pMol-Zufallsprimern und 10 mM einer dNTP-Mischung in 1x Reaktionspuffer, der mit der reversen Transkriptase geliefert wird; 10 min bei 25 °C inkubieren, dann 30 min bei 50 °C, mit einem abschließenden Inaktivierungsschritt bei 85 °C für 5 min.
- Analyse der cDNA aus dem RT-Schritt (Unterschritt 3.2.3) aus ruhenden Kontroll- und seneszenten Zellen mittels quantitativer (q) Echtzeit-PCR-Analyse, um den Gehalt an mRNA-Markern zu bewerten, von denen bekannt ist, dass sie erhöht sind (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21, IL1B, IL6 und CXCL8 mRNAs) oder erniedrigt (LMNB1- und PCNA-mRNAs) mit Seneszenz, wie an anderer Stelle beschrieben. ACTB mRNA, die für das Housekeeping-Protein β-Actin kodiert, ist oft eine gute mRNA, um Unterschiede im Eingangsmaterial zu normalisieren. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgeführt.
HINWEIS: Die relative RT-qPCR-Analyse hängt von Annahmen der gleichen Bindungseffizienz zwischen den Zielprimerpaaren und einem Referenzprimerpaar ab. Diese Annahmen sollten für neue Primer-Sets getestet werden, wie an anderer Stelle37 beschrieben. Darüber hinaus sollten Referenzmarker zwischen den zu vergleichenden Zelltypen konstant sein, und mehrere zusätzliche Optionen für seneszente Zellen wurden zuvor identifiziert38.
4. Trypsin-Aufschluss in Lösung
HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt ist es wichtig, massenspektrometrische Puffer, Lösungsmittel und Chemikalien zu verwenden, um Störungen durch Verunreinigungen während der Massenspektrometrie-Analyse zu verhindern. Alle Puffer sollten aus Inhaltsstoffen bestehen, die für die Analyse der Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie geeignet sind, einschließlich Wasser und Acetonitril. Eine Liste geeigneter Chemikalien und Lösungsmittel finden Sie in der Materialtabelle .
- Aliquot 50 μg jeder Proteinprobe in neue Röhrchen und mit Lysis Buffer auf gleiche Volumina bringen.
- Zu jeder Probe DTT zu einer Endkonzentration von 20 mM hinzufügen, um Disulfidbindungen zu reduzieren.
- Inkubieren Sie die Proben bei 37 °C für 30 min mit Schütteln und lassen Sie die Proben dann bei Raumtemperatur (RT, ~ 10 min) abkühlen.
- Fügen Sie Iodacetamid zu einer Endkonzentration von 40 mM hinzu, um die Sulfhydrylgruppen, die im vorherigen Schritt reduziert wurden, irreversibel zu alkylatieren. Inkubieren Sie die Proben bei RT im Dunkeln für 30 min.
- Verdünnen Sie jede Probe auf unter 1 M Harnstoff mit einem Puffer aus 50 mM Ammoniumbicarbonat. Überprüfen Sie, ob der pH-Wert ungefähr 8 beträgt, indem Sie eine kleine Menge Probe auf pH-Streifen pipettieren.
- Fügen Sie 1 μg Trypsin zu jeder Probe für 50 μg Startprotein oder bei einem Verhältnis von 1:50 Trypsin: Protein nach Masse hinzu, wenn eine andere Proteinmenge verdaut wird. Zum Beispiel würden 3 μg Trypsin für die Verdauung von 150 μg Protein hinzugefügt werden.
- Inkubieren Sie die Proben über Nacht bei 37 °C mit Schütteln, um Proteine zu Peptiden zu verdauen.
- Fügen Sie Ameisensäure zu 1% pro Volumen jeder Probe hinzu, um den Proteinaufschluss zu stoppen.
HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Die Proben bei -80 °C einfrieren und ggf. zu einem späteren Zeitpunkt mit dem nächsten Schritt fortfahren.
5. Probenreinigung mit Festphasenextraktion (SPE)
HINWEIS: Dieses Festphasen-Extraktionsprotokoll erfordert Festphasen-Extraktionspatronen und einen Vakuum-Verteileraufbau. Andere äquivalente SPE-Protokolle (Equivalent Solid-Phase Extraction) können nach Ermessen des Forschers vor der Massenspektrometrie-Analyse durchgeführt werden.
- Bereiten Sie sich auf SPE vor, indem Sie Festphasen-Extraktionspatronen auf einen Vakuumverteiler legen und dabei eine Extraktionspatrone für jede Probe verwenden.
HINWEIS: Beachten Sie die Richtlinien des Herstellers für die Menge an Sorptionsmittel, die im SPE-Protokoll verwendet werden soll. Für 50 μg Peptidproben wird empfohlen, 10 mg Sorptionspatronen zu verwenden. - Konditionieren Sie jede SPE-Kartusche durch Zugabe von 800 μL SPE Elution Buffer (Tabelle 1) und ziehen Sie das Lösungsmittel mit Vakuumsaugung durch die Kartusche.
- Wiederholen Sie Schritt 5.2.
- Quilibrieren Sie jede Kartusche durch Zugabe von 800 μL SPE Wash Buffer (Tabelle 1) und verwenden Sie Vakuumabsaugung, um den Puffer durch die Kartuschen zu ziehen.
- Wiederholen Sie Schritt 5.4 zwei weitere Male, insgesamt jedoch dreimal.
- Laden Sie die Peptidproben in SPE-Kartuschen und verwenden Sie Vakuumabsaugung, um Proben durch die Kartuschen zu ziehen.
HINWEIS: An diesem Punkt sind Peptide an das Sorptionsmittel in den Kartuschen gebunden. - Waschen Sie jede Kartusche mit SPE Wash Buffer und ziehen Sie den Puffer mit Vakuumsaugung durch die Kartuschen.
- Wiederholen Sie Schritt 5.7 zwei weitere Male für insgesamt drei Wäschen.
- Ordnen Sie vor dem Elutionsschritt die Auffangröhrchen innerhalb des Vakuumverteilers unter jeder Kartusche an und achten Sie sorgfältig auf die Ausrichtung zwischen den Auffangrohren und den Kartuschen.
- Um Peptide zu eluieren, fügen Sie 800 μL SPE Elution Buffer zu jeder Kartusche hinzu und eluierte Peptide in Sammelröhrchen mit Vakuumabsaugung.
- Wiederholen Sie Schritt 5.10 mit 400 μL SPE Elution Buffer.
- Entfernen Sie die Peptidproben aus dem Vakuumverteiler und trocknen Sie vollständig in einem Vakuumkonzentrator (die Trocknung dauert ca. 3 Stunden).
HINWEIS: Das Experiment kann hier pausiert werden. Proben bei -80 °C einfrieren und bei Bedarf zu einem späteren Zeitpunkt fortsetzen.
6. Massenspektrometrie-Analyse der datenabhängigen Erfassung (DDA)
- Resuspendieren Sie die Peptidproben in einer Konzentration von 400 ng / μL in einem Puffer, der aus 0,2% Ameisensäure in Wasser besteht.
- Um die Wiederauflösung von Peptiden zu unterstützen, wirbeln Sie die Proben für 5 Minuten ein. Dann beschallen Sie die Proben für 5 Minuten in einem Wasserbad-Ultraschallgerät.
- Pelletieren Sie alle unlöslichen Materialien durch Zentrifugieren von Proben bei 15.000 x g für 15 min bei 4 °C. Übertragen Sie die Peptidüberstände in MS-Fläschchen.
- Fügen Sie jeder Probe bei einer Konzentration von 1:30 iRT:sample nach Volumen indizierte Retentionszeit-Peptidstandards (iRT) hinzu.
- Reichen Sie die Proben zur proteomischen Analyse mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS)-Analyse ein.
- Verwenden Sie die LC-MS/MS-Einstellungen, die für die ungezielte Analyse durch die Massenspektrometrie-Einrichtung empfohlen werden. Beispieleinstellungen für die Analyse sind in Abbildung 3 dargestellt, die für die Analyse auf einem Orbitrap-Massenspektrometer konfiguriert ist, das mit einem Nanoflüssigkeitschromatographiesystem im Nano-Flow-Modus gekoppelt ist. Es folgt ein Beispielprotokoll.
- Laden Sie 1 μg (5 μL) jeder Probe auf eine Fallensäule (1 cm lang x 100 μm Durchmesser) und waschen Sie sie mit Ladelösungsmittel (Tabelle 1) bei einer Durchflussrate von 10 μl / min für 5 min.
- Laden Sie die Proben auf eine analytische Säule (50 cm lang x 100 μm Durchmesser) mit einer Durchflussrate von 400 nL/min.
- Eluieren Sie die Peptide über einen linearen Gradienten von 90 min mit einem organischen Lösungsmittel (0,2 % Ameisensäure und 99,8% Acetonitril) und anorganischem Lösungsmittel (0,2% Ameisensäure in 99,8% Wasser), das von 5% bis 35% organischem Lösungsmittel reicht.
- Erfassen Sie Massenspektrometriedaten im datenabhängigen Modus mit einem kontinuierlichen Zyklus von MS1-Vermessungsscans (60.000 Auflösung, 3e6 AGC-Ziel, 100 ms maximale Akkumulationszeit und 400-1.600 m/z Massenbereich), gefolgt von 20 datenabhängigen MS2-Scans (15.000 Auflösung, 1e5 AGC-Ziel, 25 ms maximale Einspritzzeit und 1,6 m/z Breite Isolationsfenster) mit HCD-Fragmentierung (normalisierte Kollisionsenergie von 27%).
- Nach der MS-Erfassung aller Proben importieren Sie rohe Massenspektrometriedateien in ein Massenspektrometrie-Proteomik-Analyse-Softwaretool zur Identifizierung und Quantifizierung von Peptid-Peak-Bereichen.
HINWEIS: Für die Identifizierung von Peptiden und Proteinen in diesem Experiment wurde das Suchwerkzeug der Maskottchendatenbank mit der überprüften UniProt-Datenbank für menschliche Proteomsequenzen (Proteom-ID: UP000005640) verwendet. Die folgenden Suchparameter wurden in Mascot angegeben:- Quantifizierung: SILAC K+8 R+10 [MD] Enzym: Trypsin/p Feste Modifikation: Carbamidomethyl (C)
- Variable Modifikationen: Acetyl (Protein N-term), Gln->pyro-Glu (N-term Q), Oxidation (M), Label:13C(6)15N(2) (K), Label:13C(6)15N(4) (R)
- Peptid-Massentoleranz: 10 ppm
- Toleranz der Fragmentmasse: 0,08 Da
- Max verpasste Spaltungen: 2
- Alle nicht spezifizierten Parameter waren Standard
- Quantifizieren Sie die Peptid-Peak-Bereiche für schwere und leichte Peptide im Proteom-Quantifizierungs-Software-Tool. Für die Quantifizierung von Peak-Areas in diesem Experiment wurde die freie und quelloffene Skyline-Softwareplattform 39,40 verwendet. Exportieren Sie schwere und leichte Peptid-Peak-Bereiche zur Abschätzung der Proteinhalbwertszeiten.
7. Berechnung der Proteinhalbwertszeiten
- Öffnen Sie die SILAC-Analyse-Arbeitsmappe (Tabelle 3) zum ersten Blatt mit dem Namen 1) Rohdaten und fügen Sie UniProt-IDs, Gennamen, Heavy-Peak-Bereiche und leichte Peak-Bereiche in die angegebenen Spalten ein (SH = Senescent-Heavy, SL = Senescent-Light, CH = Control (quiescent)-Heavy, CL = Control (quiescent)-Light).
- Öffnen Sie die Blätter 2-4 und stellen Sie sicher, dass die UniProt-ID- und Gensäulen mit der Anzahl der aus der Analyse identifizierten Proteine übereinstimmen (diese Experimente identifizierten 841 Proteine). Der Rest der Spalten füllt sich automatisch mit Daten, nachdem sie gezogen wurden, um die identifizierten Proteine abzudecken.
- Öffnen Sie das vierte Blatt mit dem Namen 4) Analyse und entfernen Sie Zeilen, in denen die Spalten G und H anzeigen, dass die Stichprobe außerhalb des Bereichs liegt. Behalten Sie Zeilen, die gelesen werden, innerhalb des Bereichs bei. Das Vulkandiagramm im fünften Blatt wird automatisch gefüllt.
Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zum globalen Vergleich von Proteinhalbwertszeiten zwischen seneszenten und nicht teilenden, ruhenden Kontrollzellen unter Verwendung von pSILAC und minimalen Zeitpunkten. Dieses Protokoll beschreibt die Erzeugung von seneszenten und ruhenden Zellen in Kultur, die metabolische Markierung von Zellen mit stabilen Isotopen von Arginin und Lysin über 3 Tage, die Quantifizierung der relativen Häufigkeiten schwerer und leichter Peptidisotope durch Massenspektrometrie und eine einfache und zugängliche Berechnung der Proteinhalbwertszeiten mithilfe von Tabellenkalkulationsformeln (Abbildung 1). Diese Methode ist hochflexibel und kann an zahlreiche Zelltypen und -bedingungen angepasst werden.
Im Rahmen der Generierung seneszenter Zellen für dieses Protokoll werden zwei Methoden der Seneszenzvalidierung verwendet: SA-βGal-positive Zellen, die durch Mikroskopie visualisiert wurden, und erhöhte Mengen an seneszenten Markern, die mittels RT-qPCR-Analyse quantifiziert wurden. Die Messung von seneszenten Markern sollte klare Unterscheidungen zwischen ruhenden und seneszenten Zellen ergeben, damit Vergleiche der beiden Zellpopulationen als gültig angesehen werden können. Für die SA-βGal-Aktivität sollten seneszente Zellen blau erscheinen, während ruhende Kontrollzellen keine oder nur eine sehr geringe Farbe haben (Abbildung 2A). Dieser Assay kann quantifiziert werden, indem die positiven, blau gefärbten Zellen als Prozentsatz der Gesamtzahl der Zellen gezählt und dann die prozentuale Positivitätsrate zwischen Ruhekontroll- und seneszenten Zellen verglichen wird. Es ist wichtig, dass dieses Protokoll gleichzeitig für den Vergleich beider Zellzustände durchgeführt wird; Die SA-βGal-Aktivität hängt vom pH-Wert der Färbelösung ab, so dass die Ergebnisse zwischen den Assays erheblich variieren können und als qualitatives Maß betrachtet werden sollten.
Die RT-qPCR-Analyse seneszenter Marker zeigt in den meisten seneszenten Modellen hohe Konzentrationen der mRNAs, die für SASP-Faktoren (IL6, CXCL8, IL1B) und Zellzyklusinhibitoren (CDKN2A/p16, CDKN1A/p21) kodieren. Obwohl eine gewisse Variation basierend auf Zelltyp, Kulturzustand und seneszentem Induktor 41,42 erwartet wird, zeigen die meisten seneszenten Zellen mehr als fünfmal höhere Konzentrationen von IL6-, CXCL8- und CDKN1A/p21-mRNAs im Vergleich zu ruhenden Kontrollzellen; Umgekehrt sollten die Spiegel von LMNB1- und PCNA-mRNAs, die für Proliferationsmarker kodieren, in seneszenten Zellen im Vergleich zu ruhenden Zellen niedrig oder nicht vorhanden sein (Abbildung 2B). Zusammengenommen reichen ein signifikanter Prozentsatz der SA-βGal-Positivität und die erwartete Expression eines Panels von seneszenzassoziierten mRNA-Markern aus, um die Induktion der Seneszenz in einem Experiment zu bestätigen.
Die Verarbeitung von Proteinproben für die Massenspektrometrie-Analyse besteht aus dem Aufschluss in Lösung (2 Tage) und der Festphasenextraktion (4-6 h). Um eine ungezielte proteomische Analyse durchzuführen, werden die resultierenden Peptide zur LC-MS/MS-Analyse mittels datenabhängiger Erfassung (DDA) eingereicht. Auf Orbitrap-Instrumenten kann eine DDA-Methode im Methodeneditor der Massenspektrometrie-Instrumentensoftware spezifiziert werden. Die in dieser Studie verwendeten Massenspektrometereinstellungen sind in Abbildung 3A dargestellt. Flüssigkeitschromatographie-Einstellungen können auch im Methodeneditor festgelegt werden. Für diese Studie wurde ein linearer 90-minütiger Gradient mit zunehmender organischer Phase (Acetonitril) verwendet (Abbildung 3B). Nach einer erfolgreichen Erfassung sollte der Gesamtionenstrom (TIC) während des linearen Gradientenabschnitts der Methode ein intensives Signal enthalten (Abbildung 3C). Dieses Protokoll beschreibt ein Beispielprotokoll auf einem Orbitrap-Instrument, aber die Berechnung der Proteinhalbwertszeiten kann mit Daten durchgeführt werden, die von jedem Massenspektrometer erhalten wurden, das im DDA-Modus gesammelt wurde, das auf verschiedenen Arten von Instrumenten (z. B. Orbitraps und Time-of-Flight-Instrumenten) und Anbietern verfügbar ist. Die Erfassungseinstellungen sind für den Typ und die Konfiguration des verwendeten Instruments einzigartig, und es wird empfohlen, die von der Massenspektrometrieeinrichtung vorgeschlagenen Einstellungen zu verwenden. Diese Methode ist auch mit Nicht-DDA-Methoden (SRM, PRM, DIA) kompatibel, solange quantitative chromatographische Peakflächen für schwere und leichte Peaks aus den Rohdatendateien extrahiert und in die Tabellenkalkulationsformeln eingegeben werden können.
Rohe Massenspektrometriedateien werden mit einem der vielen verfügbaren proteomischen Datenbank-Suchwerkzeuge durchsucht, um Peptide und Proteine zu identifizieren. Zum Beispiel verwendete diese Studie die Suchmaschine Mascot43. Um chromatographische Peakbereiche für die Quantifizierung schwerer und leichter Peptide zu erhalten, werden Datenbanksuchergebnisse in eine proteomische Software importiert, die chromatographische Peakbereiche wie Skyline 39,40 unterstützt. Die Untersuchung der extrahierten Ionenchromatogramme von Peptiden (Abbildung 4) zeigt den relativen Anteil schwerer und leichter Peptidsignale. Ein geringerer Anteil des schweren Peptidsignals im Verhältnis zum leichten Peptidsignal in seneszenten Zellen weist auf eine langsamere Proteinumsatzrate hin (Abbildung 4A), und ein höheres schweres Peptidsignal im Verhältnis zum Licht weist auf eine schnellere Proteinumsatzrate hin (Abbildung 4B). Die unmarkierten Proben sollten wenig oder kein schweres Peptidsignal zeigen. Jedes scheinbar schwere Peptidsignal in den unmarkierten Proben wird als Hintergrundrauschen betrachtet und während der endgültigen Berechnungen subtrahiert. Die Quantifizierung chromatographischer Peakbereiche für leichte und schwere Peptide für alle Behandlungs- und Markierungsbedingungen muss zur anschließenden Berechnung der Proteinumsatzraten und zur statistischen Analyse exportiert werden.
Durch die Verwendung der Einzelzeitpunktanalyse ist die Quantifizierung der Proteinhalbwertszeiten einfach durchzuführen und kann bequem in Tabellenkalkulationen durchgeführt werden. In Tabelle 3 wurden die Halbwertszeiten für 695 Proteine berechnet, die aus der Massenspektrometrie-Analyse identifiziert wurden. Ausgehend von den schweren und leichten Isotopenhäufigkeiten auf Proteinebene für jedes Protein in den Proben (Eingabe für das 1) Rohdatenblatt ) wird dann automatisch ein prozentschweres Isotop (genannt Ratio, R) auf dem Blatt mit dem Titel 2) Verhältnis H | berechnet H + L. Bei diesem Schritt wird das R aus schwer markierten Proben normalisiert, indem das R von unmarkierten Proben subtrahiert wird, um ein endgültiges R für die ruhenden und seneszenten Triplikatoren zu erhalten. Da unmarkierte Proben kein exogen zugesetztes schweres Isotop enthalten sollten, werden sie verwendet, um das Hintergrundsignal zu eliminieren. Aus R wird der kdeg (Fluktuationsrate) nach folgender Formel berechnet:
Die Halbwertszeit (H, in Tagen) wird für jedes Protein in den Ruhekontroll- und seneszenten Triplikaten (Blatt mit dem Titel 3) Halbwertszeit (Tage)) mit der folgenden Formel bestimmt:
Diese Halbwertszeiten werden dann zwischen den ruhenden und seneszenten Triplikaten gemittelt, um eine ruhige und seneszente mittlere Halbwertszeit für jedes Protein sowie einen p-Wert zu erzeugen. Berechnete Halbwertszeiten werden dann nach negativen Werten gefiltert, was auftritt, wenn das schwere Signal von hellmarkierten Zellen (der Hintergrund) größer ist als das schwere Signal von schwer markierten Zellen. Diese Filterung führte zu 707 Proteinen aus 841, die mit gültigen Halbwertszeiten für die hier vorgestellten Ergebnisse identifiziert wurden.
Die Halbwertszeit wird dann als logarithmisches2-Verhältnis von seneszenten über ruhenden Kontrollzellen (log2FC) angegeben und in einem Vulkandiagramm aufgetragen (Abbildung 5). Wenn man sich beispielsweise das 5) Analyseblatt ansieht, kann man sehen, dass das Gerinnungs-II-Thrombinrezeptor-Protein (F2R) eine Halbwertszeit in ruhenden Zellen von 0,51 Tagen (Spalte B) und eine Halbwertszeit in seneszenten Zellen von 1,07 Tagen (Spalte C) aufweist, die einen log2FC von ~ 1,06 (Spalte D) mit einem p-Wert von 0,001 ergab.
Abbildung 1: Diagramm des pSILAC-Workflows für seneszente und ruhende Kontrollzellen. Humane IMR-90-Fibroblasten wurden verwendet, um ruhende (niedrigserum) oder seneszente (IR) Zellkulturen für den Vergleich von Proteinhalbwertszeiten vorzubereiten. Die Zellen wurden dann 3 Tage lang mit SILAC Light oder SILAC Heavy media mit Isotopen-Arginin und Lysin markiert. Lysate wurden aus Zellen extrahiert, verdaut, entsalzt und mittels Massenspektrometrie analysiert. Schwere und leichte Peptidisotopenpeaks entsprechen neu synthetisierten bzw. bereits bestehenden Peptiden. Halbwertszeiten wurden mit einer Gleichung für den exponentiellen Zerfall berechnet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Validierung seneszenter Phänotypen mittels SA-βGal- und RT-qPCR-Analysen . (A) Seneszente und ruhende Zellen werden zum Zeitpunkt der Ernte zu einer 6-Well-Platte umplattiert und mit dem SA-βGal-Färbekit für SA-βGal gefärbt. Die blaue Farbe im Zellkörper ist positiv für die Seneszenz. Die Bilder werden im Hellfeld mit Farbe bei 10-facher Vergrößerung, Größenmarkierung in Rot aufgenommen. (B) RT-qPCR-Analyse, die seneszente Zellen (rot) und zyklische Zellen (grau) aus einem nicht verwandten Experiment vergleicht. Ein Anstieg der Spiegel der CDKN1A/p21-, CXCL8- und IL6-mRNAs weist auf eine Seneszenz hin, ebenso wie die Abnahme der LMNB1-mRNA-Spiegel . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Methoden für datenabhängige Akquisitionsscans (DDA) und Flüssigkeitschromatographiegradienten von pSILAC-Kulturen auf dem Q-Exactive HF Orbitrap-Massenspektrometer. (A) Empfohlene Instrumenteneinstellungen in der Gerätesoftware zur datenabhängigen Analyse von Ganzzelllysaten aus einem pSILAC-Experiment. (B) Beispieleinstellung der Flussgradientenmethode der Flüssigkeitschromatographie. Peptide werden über einen linearen 90-minütigen Gradienten von 5% bis 35% Puffer B (0,2% Ameisensäure und 99,8% Acetonitril) eluiert, gefolgt von einer 10-minütigen Wäsche mit 80% Puffer B und 25 min Gleichgewicht mit 5% Puffer B. (C) Ein repräsentatives Gesamtionenchromatogramm (TIC) einer massenspektrometrieartigen Aufnahme von IMR-90-Fibroblastenpeptiden, die mit den angegebenen Einstellungen aufgenommen wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Repräsentative extrahierte Ionenchromatogramme von Peptiden mit verändertem Umsatz während der Seneszenz . (A) Chromatographische Peakbereiche des Peptids FQMTQEVVCDECPNVK++ aus dem Protein DnaJ homolog Unterfamilie B Member 11 (DNAJB11) in seneszenten und nicht-seneszenten Zellen. Nach 3 Tagen SILAC bauen seneszente Zellen im Vergleich zu ruhenden (nicht seneszenten) Zellen weniger schwere Isotope in dieses Peptid ein, was durch eine Verringerung der Peakfläche des schweren isotopenhaltigen Peptids (blau) relativ zum leichten Peptid (rot) angezeigt wird, was darauf hindeutet, dass dieses Peptid den Umsatz in seneszenten Zellen reduziert hat. (B) Chromatographische Peakbereiche des Peptids VQAQVIQETIVPK++ aus dem Protein Spleißfaktor 3a Untereinheit 1 (SF3A1) in seneszenten und nicht-seneszenten Zellen. Nach 3 Tagen SILAC bauen seneszente Zellen einen höheren Anteil an schweren Isotopen in dieses Peptid ein als ruhende (nicht seneszente) Zellen, was durch eine Verringerung der Peakfläche des schweren isotopenhaltigen Peptids (blau) relativ zum leichten Peptid (rot) angezeigt wird, was darauf hindeutet, dass dieses Peptid den Umsatz in seneszenten Zellen erhöht hat. Die unmarkierten (Tag 0) Bedingungen zeigen wie erwartet keine Aufnahme von schweren Isotopen für beide Peptide. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 5: Vergleich der Proteinhalbwertszeiten in seneszenten und ruhenden Zellen, ermittelt aus der pSILAC-Markierung. (A) Vulkandiagramm mit dem logarithmischen2-Verhältnis von seneszent / Kontrolle (Ruhe) für jedes der 695 identifizierten Proteine; In diesem Experiment enthielten Light and Heavy-Markierungsmedien keine Glukose und kein Phenolrot. (B) Tabellen mit den Top 10 Proteinen mit den meisten erhöhten oder verringerten Halbwertszeiten in ruhenden Zellen im Vergleich zu seneszenten Zellen (links bzw. rechts). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Tabelle 1: In diesem Protokoll verwendete Medien und Puffer Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 2: In diesem Protokoll verwendete RT-qPCR-Primer Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 3: SILAC-Analyse-Arbeitsbuch zur Berechnung von Protein-Halbwertszeiten, Faltenänderungen und t-Tests. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Discussion
pSILAC ist eine leistungsstarke Technik, die die globale Quantifizierung von Proteinumsatzraten über mehrere zelluläre Bedingungen hinweg ermöglicht. Dieses Papier beschreibt die Verwendung von pSILAC zum Vergleich der globalen Proteinhalbwertszeiten zwischen seneszenten und ruhenden Zellen, einschließlich Anweisungen für die Herstellung von seneszenten und ruhenden Zellen, die SILAC-Markierung und -Ernte und schließlich die Analyse mittels DDA-Massenspektrometrie. Zusätzlich wird ein zweistufiger Test zur Validierung des Seneszenz-Phänotyps unter Verwendung der SA-βGal- und RT-qPCR-Analyse eines Panels von mRNAs, die für Seneszenz-assoziierte Proteine kodieren, beschrieben. Neben der Validierung der Seneszenz mit den beiden beschriebenen Ansätzen kann eine dritte Validierung der Seneszenz nach einer massenspektrometrietischen Analyse durchgeführt werden, indem nach Veränderungen bekannter Seneszenzmarker zwischen seneszenten und ruhenden Zellen auf proteomischer Ebene gesucht wird. Seneszenz-assoziierte Proteine, von denen erwartet wird, dass sie erhöht sind, umfassen unter anderem p16, p21 und BCL2, die an anderer Stelle beschriebenwerden 44,45. In dem oben beschriebenen Protokoll wurde ionisierende Strahlung für die Induktion von Seneszenz und Serumhunger für ruhende Zellen verwendet. Für die Induktion der Seneszenz stehen mehrere Optionen zur Verfügung und es gibt eine erhebliche Heterogenität unter ihnen41,42,46. Derzeit gibt es keine seneszente Methode, die als die "physiologischste" angesehen wird, so dass die Wahl des seneszenten Induktors weitgehend auf dem Kontext des Experiments basiert. Es wird jedoch empfohlen, Experimente mit dem Ziel, ein allgemeines Phänomen über die Seneszenz zu bestimmen, mindestens zwei verschiedene seneszente Induktoren zu verwenden. Die Diskussion der Bandbreite der Seneszenzparadigmen würde den Rahmen dieses Papiers sprengen, aber einige gängige Methoden zur Induktion von Seneszenz umfassen das Auslösen von DNA-Schäden (IR, Doxorubicin, replizierende Erschöpfung), die Expression onkogener Proteine (HRAS, BRAF) und die Störung der Mitochondrienfunktion2.
Neben der Wahl des seneszenten Induktors ist die Wahl der Kontrollzellen eine ebenso wichtige Überlegung. Seneszente Zellen stehen definitionsgemäß unter unbefristetem Wachstumsstillstand, so dass oft ein Vergleich mit anderen wachstumshemmenden Zellen gewählt wird. Für pSILAC sind Zellzyklus-blockierte Zellen im Allgemeinen vorzuziehen, da sie sich nicht replizieren und daher einfacher für Proteinhalbwertszeiten zu verwenden sind47. Da kultivierte Zellen jedoch oft einige sich teilende Zellen behalten, ist es wichtig, dass die Methoden, die zur Induktion des Zellzyklusstillstands verwendet werden, eine möglichst homogene Reaktion erzeugen, um Fehler von Zellen zu minimieren, die sich noch vermehren. Um Proteinabbauraten für zyklische Zellen mit pSILAC zu berechnen, sind zusätzliche Berechnungen erforderlich, um die Rate zu kompensieren, mit der Protein in Tochterzellen verdünnt wird27. Der Stillstand des ruhenden Wachstums selbst ist jedoch nicht ohne Komplikationen. Es gibt zwei allgemeine Methoden für den Zellzyklus-Arrest: Serumentzug und Kontakthemmung48. Nicht alle Zellen können durch Kontakthemmung zur Ruhe gebracht werden, obwohl gezeigt wurde, dass einige Fibroblasten nach mehreren Tagen der Kultivierung Ruhe zeigen49. Diese Methode verwendete Serumentzug, da sie häufiger für Vergleiche von seneszenten Zellen verwendet wird, obwohl sie erfordert, dass die seneszente Zelle für genaue Vergleiche ähnlich serumberaubt ist. Serum aktiviert den mTOR-Komplex, und somit hat Serumentzug neben dem Zellzyklus-Arrest50 mehrere nachgelagerte Effekte auf die Zelle. Insbesondere wurde gezeigt, dass seneszente Zellen bei Serumentzug oder mTOR-Hemmung eine reduzierte SASP aufweisen51,52.
Ein weiterer wichtiger Punkt, der in pSILAC zu berücksichtigen ist, ist, wie viele Zeitpunkte getestet werden sollen. Dieses Protokoll sammelte Zellen zu einem einzigen Zeitpunkt (3 Tage leichte oder schwere Markierung), was die resultierende Analyse erheblich vereinfacht. Die Wahl des Zeitpunkts sollte auf dem Ziel des Experiments basieren. Für die globale Analyse wird erwartet, dass 3 Tage eine Mehrheit der Proteine einfangen, obwohl Halbwertszeiten für kurzlebige Proteine, die innerhalb von 3 Tagen vollständig umschlagen (das gesamte Lichtsignal geht verloren), zu diesem Zeitpunkt nicht gemessen werden können. Umgekehrt sind langlebige Proteine mit sehr wenig Umsatz in 3 Tagen ebenfalls schwer zu quantifizieren und scheinen oft extrem große Halbwertszeiten (in der Größenordnung von Wochen) zu haben, die typischerweise nur eine Folge einer sehr geringen starken Signalakkumulation sind. Aufgrund der nichtlinearen Beziehung im Verhältnis von schweren und leichten Peptidsignalen zum Prozentsatz des neu synthetisierten Proteins zu kürzeren und längeren Zeitpunkten könnte die Quantifizierung von Halbwertszeiten durch Hinzufügen zusätzlicher Markierungszeitpunkte verbessert werden. Für relative Vergleiche zwischen zwei Zellzuständen, wie in diesem Protokoll, kann eine ungefähre Halbwertszeit ausreichen, aber zusätzliche Zeitpunkte können verwendet werden, um die quantitative Genauigkeit zu verbessern.
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine ungezielte DDA-basierte Analyse des Proteinumsatzes durchgeführt wird. Die Proteinumsatzberechnungen können jedoch im Allgemeinen auf jedes Akquisitionsschema angewendet werden, das in der Lage ist, die relative Häufigkeit von schweren und leichten Peptidpaaren abzuleiten. So können beispielsweise auch MS2-basierte Methoden wie die datenunabhängige Erfassung (DIA/SWATH) zur Berechnung von Fluktuationsraten erfolgreich angewendetwerden 53. Darüber hinaus können andere als die in diesem Protokoll beschriebenen Instrumentierungs- und Softwarepipelines verwendet werden, um DDA-Analysen, Proteinidentifikationen und Proteinquantifizierungen durchzuführen. Bei der Verwendung von Proteinquantifizierungssoftwareplattformen wie Skyline zur Extraktion von Peptid-Peak-Bereichen ist es ratsam, extrahierte Ionenchromatogramme im Dokumentenarbeitsbereich manuell zu inspizieren, fälschlicherweise integrierte Peaks und nicht-quantitative Peaks zu identifizieren und das Dokument entsprechend zu kuratieren. Eine umfangreiche Sammlung von Tutorials ist online für Skyline (skyline.ms) verfügbar.
pSILAC stellt aufgrund des überlegenen Multiplexings (Proteomabdeckung) und Durchsatzes eine der idealsten Methoden zur globalen Quantifizierung von Proteinhalbwertszeiten in kultivierten Zellen dar. Während pSILAC keine direkten Synthese- oder Abbauraten liefert, da die Änderung des leichten und schweren Signals auf einen Zusammenfluss von Faktoren zurückzuführen ist, ist pSILAC sehr nützlich für Vergleiche zwischen Bedingungen und verschiedenen Zelltypen. Low-Throughput-Methoden fallen oft in zwei Arten: 1) Behandlung von Zellen mit Cycloheximid, um die Proteinsynthese und -ernte in Zeitabständen nach der Zugabe zu blockieren, um den Zerfall zu überwachen, oder 2) Behandlung von Zellen mit einem Inhibitor des Proteinzerfalls und der Ernte in Zeitabständen nach der Zugabe, um die Ansammlung von Protein zu überwachen und so Proteinzerfallsraten abzuleiten. Die Einschränkung beider Methoden besteht darin, dass solche Behandlungen unweigerlich zu erheblichen Veränderungen der zellulären Physiologie führen werden. Im Gegensatz dazu erfordert pSILAC keinen wesentlichen Eingriff und hat theoretisch keine nachweisbaren Auswirkungen auf die zelluläre Physiologie, da sich isotopische Aminosäuren nur um ein einziges Neutron von ihren nicht-isotopischen Gegenstücken unterscheiden. Somit stellt die hier beschriebene Methode für pSILAC ein einfaches Protokoll zur globalen Messung der physiologischesten Proteinhalbwertszeiten in sich nicht teilenden Zellen dar.
Veränderungen des Proteinumsatzes stehen in engem Zusammenhang mit dem Altern, altersbedingten Erkrankungen, Neurodegeneration und Langlebigkeit54,55. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Abfrage dieser Beziehungen durch die Verwendung einer stabilen Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur, um Proteinumsatzraten in Seneszenzzellen zu messen. Es gibt jedoch zahlreiche analoge Methoden, um Studien im Zusammenhang mit dem Altern und der Neurodegeneration in vivo in ganzen Organismen wie Mäusen durchzuführen. Tatsächlich haben diese Studien die Bedeutung der Messung von Proteinumsatzraten im Zusammenhang mit altersbedingten Krankheitenhervorgehoben 56,57,58,59.
In dieser Studie zeichneten sich ribosomale Proteine und Proteine, die sich im endoplasmatischen Retikulum befinden, als zwei Kategorien von Proteinen mit verringerter bzw. erhöhter Halbwertszeit in seneszenten Zellen aus. Während eine weitere Analyse der Steady-State-Spiegel für endgültige Schlussfolgerungen erforderlich ist, deuten diese Ergebnisse weiter darauf hin, dass seneszente Zellen die Translation durch verringerte Halbwertszeiten ribosomaler Proteine einzigartig regulieren können. In Zukunft wird die Anwendung stabiler Isotopenmarkierungsansätze zur Untersuchung der Beziehung zwischen zellulärer Seneszenz und Neurodegeneration in vivo in Mausmodellen eine vielversprechende Erweiterung des in diesem Protokoll beschriebenen Isotopenmarkierungsansatzes sein.
Disclosures
Die Autoren haben keine Offenlegungen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health (NIH) und dem Intramural Research Program (IRP) des National Institute on Aging (NIA) unterstützt. NB wurde von Longevity Impetus Grants und dem Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Grainger | AH015 | |
| Ammonium Bicarbonate | Millipore-Sigma | 9830 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermoFisher | 15240062 | |
| BCA Assay Kit | ThermoFisher | 23227 | |
| Dithiothreotol (DTT) | Sigma | D9779 | |
| DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher | 12430112 | |
| dNTP Mix | ThermoFisher | R0191 | |
| Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated | ThermoFisher | 10082147 | |
| Formic Acid | Sigma | 27001 | |
| Gammacel 40 Exactor | Best Theratronics | Cesium Irradiator for cells | |
| GlycoBlue | ThermoFisher | AM2238 | |
| Iodoacetamide (IAA) | Sigma | I1149 | Light sensitive |
| IMR-90 primary lung fibroblasts | ATCC | CCL-186 | |
| iRT Kit (indexed retention time) | Biognosys | Ki-3002-2 | Indexed Retention Time Peptide Standards |
| Isopropanol | ThermoFisher | 423835000 | |
| Mascot | Matrix Science | Mascot Daemon 2.8 | Proteomic database searching software |
| Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) | ThermoFisher | EP0742 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | ThermoFisher | 11140050 | |
| Nano LC System | ThermoFisher | ULTIM3000RSLCNANO | |
| Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges | Waters | 186000383 | |
| Orbitrap Mass Spectrometer | ThermoFisher | Q Exactive HF Orbitrap | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 327110025 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | |
| Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM | ThermoFisher | A33972 | |
| QuantStudio 6 Real-Time PCR System | ThermoFisher | ||
| Random Hexamer Primer | ThermoFisher | SO142 | |
| Senescence β-Galactosidase Staining Kit | Cell Signaling | 9860 | |
| Skyline | University of Washington | Skyline-Daily v21.2.1.424 | Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms |
| Sonicator waterbath | Branson | CPX-952-516R | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | Referred to as phenol in text; hazardous |
| TRYPle Express | ThermoFisher | 12605010 | |
| Trypsin (sequencing grade) | Promega | V5113 | |
| TURBO Dnase (2U/ uL) | ThermoFisher | AM2238 | |
| Urea | ThermoFisher | 29700 | |
| Water (LC-MS grade) | Grainger | AH365 |
References
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