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Biochemistry

मेटाबोलिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सेनेसेंट और गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों का मापन

Published: April 6, 2022 doi: 10.3791/63835
Automatic Translation
1, 1, 2
1Laboratory of Genetics and Genomics, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health, 2Translational Gerontology Branch, National Institute on Aging Intramural Research Program, National Institutes of Health

Summary

यह प्रोटोकॉल स्पंदित SILAC, untargeted मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण, और प्रोटीन आधे जीवन की एक सुव्यवस्थित गणना के साथ senescent और गैर-विभाजित कोशिकाओं के चयापचय लेबलिंग के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।

Abstract

बढ़ते सबूतों से पता चला है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में सेनेसेंट कोशिकाओं का संचय अल्जाइमर और पार्किंसंस रोगों जैसे न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों में योगदान देता है। सेलुलर सेनेसेंस स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी की एक स्थिति है जो आमतौर पर उप-घातक तनावों के संपर्क में आने के जवाब में होती है। हालांकि, अन्य गैर-विभाजित कोशिकाओं की तरह, सेनेसेंट कोशिकाएं चयापचय रूप से सक्रिय रहती हैं और कई कार्यों को पूरा करती हैं जिनके लिए अद्वितीय ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल मांगों और इंट्रासेल्युलर और स्रावित प्रोटिओम में व्यापक परिवर्तन की आवश्यकता होती है। यह समझना कि सेनेसेंस के दौरान प्रोटीन संश्लेषण और क्षय दर कैसे बदलती है, सेलुलर सेनेसेंस के अंतर्निहित तंत्र को रोशन कर सकती है और सेनेसेंट कोशिकाओं द्वारा बढ़ी हुई बीमारियों के लिए संभावित चिकित्सीय रास्ते पा सकती है। यह पेपर मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ संयोजन में सेल संस्कृति (पीएसएलसी) में अमीनो एसिड द्वारा स्पंदित स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके गैर-विभाजित कोशिकाओं में प्रोटीन आधे जीवन के प्रोटीन के आधे जीवन के प्रोटिओम-स्केल मूल्यांकन के लिए एक विधि का वर्णन करता है। pSILAC में अमीनो एसिड के स्थिर भारी आइसोटोप युक्त संस्करणों के साथ कोशिकाओं का चयापचय लेबलिंग शामिल है। आधुनिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण के साथ युग्मित, pSILAC जटिल मिश्रण में सैकड़ों या हजारों प्रोटीन के प्रोटीन टर्नओवर के माप को सक्षम बनाता है। चयापचय लेबलिंग के बाद, प्रोटीन की टर्नओवर गतिशीलता को मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पता लगाए गए पेप्टाइड्स में भारी आइसोटोप के सापेक्ष संवर्धन के आधार पर निर्धारित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में, एक वर्कफ़्लो को सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट संस्कृतियों की पीढ़ी के लिए वर्णित किया गया है और इसी तरह गिरफ्तार quiescent fibroblasts, साथ ही साथ एक सरलीकृत, एकल-समय बिंदु pSILAC लेबलिंग समय-पाठ्यक्रम जो प्रत्याशित प्रोटीन टर्नओवर दरों के कवरेज को अधिकतम करता है। इसके अलावा, एक पाइपलाइन pSILAC मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा के विश्लेषण और स्प्रेडशीट का उपयोग करके प्रोटीन गिरावट दरों की उपयोगकर्ता के अनुकूल गणना के लिए प्रस्तुत की जाती है। इस प्रोटोकॉल के आवेदन को सेनेसेंट कोशिकाओं से परे किसी भी गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं जैसे न्यूरॉन्स तक बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

सेनेसेंस को पहली बार रेप्लिकेटिव थकावट1 तक पहुंचने के बाद सुसंस्कृत प्राथमिक कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित अनिश्चितकालीन विकास गिरफ्तारी की स्थिति के रूप में पहचाना गया था। तब से यह दिखाया गया है कि सेनेसेंस कई सेलुलर अपमानों के जवाब में उत्पन्न हो सकता है, जिसमें जीनोटॉक्सिक, माइटोकॉन्ड्रियल और ऑन्कोजेनिक तनाव शामिल हैं, दूसरोंके बीच 2। जबकि सीनेसेंस में कई शारीरिक रूप से महत्वपूर्ण भूमिकाएं हैं, जैसे कि ट्यूमर दमन और घाव भरने, उम्र बढ़ने के दौरान सेनेसेंट कोशिकाओं का संचय स्वास्थ्य3 पर हानिकारक प्रभावों के एक मेजबान के साथ जुड़ा हुआ है, जिसमें कई न्यूरोडीजेनेरेटिव स्थितियां 4,5,6 शामिल हैं। सेलुलर सेनेसेंस कई मस्तिष्क कोशिका प्रकारों में होता है, जिसमें न्यूरॉन्स 7,8,9,10, एस्ट्रोसाइट्स11, माइक्रोग्लिया12, और ओलिगोडेंड्रोसाइट अग्रदूत13 शामिल हैं, और न्यूरोडीजेनेरेशन और संज्ञानात्मक शिथिलता में योगदान देता है। एमिलॉइड बीटा ओलिगोमर्स, अल्जाइमर रोग 14 के हॉलमार्क में से एक, न्यूरोनल सेनेसेंस13,15,16 में तेजी लाने के लिए दिखाया गया है। सेनेसेंट कोशिकाओं की एक बढ़ी हुई व्यापकता को पार्किंसंस रोग17 के साथ भी जोड़ा गया है, विशेष रूप से पर्यावरणीय तनाव11,18 से उत्पन्न होता है। महत्वपूर्ण रूप से, पूर्व-नैदानिक मॉडल में सेनेसेंट कोशिकाओं का चयनात्मक उन्मूलन जीवनकाल का विस्तार करता है और उम्र से संबंधित बीमारियों की एक भीड़ को कम करता है 3,5,12 और संज्ञानात्मक घाटे में सुधार करताहै 8,11,12,13। सेनेसेंट कोशिकाएं इस प्रकार कई उम्र से संबंधित स्थितियों के उपचार के लिए आशाजनक चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उभरी हैं।

सेनेसेंट कोशिकाओं का अधिकांश हानिकारक प्रभाव सेनेसेंस-संबद्ध स्रावी फेनोटाइप (एसएएसपी) के कारण होता है, जो सेनेसेंट कोशिकाओं द्वारा स्रावित बायोएक्टिव अणुओं का एक जटिल मिश्रण है जो स्थानीय सूजन, एंजियोजेनेसिस, एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स के विनाश और आसपास के ऊतकों में सेनेसेंस का प्रसार कर सकता है 19,20,21 . एसएएसपी सेनेसेंस की एक दिलचस्प जैविक घटना का भी प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि इसे सेल चक्र गिरफ्तारी की स्थिति के दौरान काफी ट्रांसक्रिप्शनल और ट्रांसलेशनल प्रयास की आवश्यकता होती है। वास्तव में, सेनेसेंट कोशिकाओं को राइबोसोम बायोजेनेसिस22,23,24 में कमी का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गया है जो प्रोटीन संश्लेषण को कम करना चाहिए। इसके बजाय, सेनेसेंट कोशिकाएं कुछ प्रोटीनों, विशेष रूप से एसएएसपी कारकों का दृढ़ता से अनुवाद करती हैं, और आसपास के ऊतक25 के चयापचय को प्रभावित करती हैं। इस प्रकार, यह समझने में काफी रुचि है कि कैसे एक स्थायी सेल चक्र गिरफ्तारी से गुजरने वाली सेनेसेंट कोशिकाएं प्रोटीन होमोस्टैसिस को बनाए रखना जारी रखती हैं, जबकि एक ही समय में एसएएसपी कारकों और अन्य चुनिंदा प्रोटीनों को मजबूती से व्यक्त करती हैं।

यह विधि वर्णन करती है कि सेल कल्चर (पीएसआईएलएसी) में अमीनो एसिड द्वारा मास स्पेक्ट्रोमेट्री और स्पंदित-स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग कैसे किया जाए ताकि विश्व स्तर पर प्रोटिओम-वाइड स्केल पर सेनेसेंट कोशिकाओं में प्रोटीन के आधे जीवन को मापा जा सके। पारंपरिक SILAC में, सुसंस्कृत कोशिकाओं को प्रोटीन बहुतायत के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अमीनो एसिड के भारी और हल्के गैर-रेडियोधर्मी आइसोटोप के साथ पूरी तरह से चयापचय रूप से लेबल किया जाता है। इस विधि को पहले सुसंस्कृतफाइब्रोब्लास्ट्स 26 के एसएएसपी में व्यापक और मात्रात्मक रूप से बहुतायत परिवर्तनों का आकलन करने के लिए लागू किया गया है। पीएसआईएलएसी में, कोशिकाओं को इसी तरह भारी आइसोटोप की नाड़ी के साथ चयापचय रूप से लेबल किया जाता है जो प्रकाश आइसोटोप के साथ पूर्व-लेबलिंग का अनुसरण करता है, और फिर एक या एक से अधिक समय अंतराल पर काटा जाता है। पहले से मौजूद प्रकाश आइसोटोप के संदर्भ में भारी आइसोटोप को शामिल करने की दरों का उपयोग तब सापेक्ष प्रोटीन टर्नओवर दरों की गणना करने के लिए किया जाता है। आम तौर पर, आर्जिनिन और लाइसिन के आइसोटोप का उपयोग किया जाता है क्योंकि ट्रिप्सिन उन अवशेषों पर क्लीव्स करता है; इस प्रकार, मानक पाचन से सभी पेप्टाइड्स में संभावित रूप से भारी लेबल होगा। पेप्टाइड्स के जोड़े जो केवल भारी लाइसिन या आर्जिनिन की उपस्थिति या अनुपस्थिति से भिन्न होते हैं, रासायनिक रूप से समान होते हैं और एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर द्वारा विभेदित और परिमाणित किए जा सकते हैं। मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद, पेप्टाइड्स को परिणामी पेप्टाइड पहचान में आइसोटोपिक लेबल की उपस्थिति या अनुपस्थिति के आधार पर नए संश्लेषित या पूर्व-मौजूदा के रूप में पहचाना जा सकता है। प्रोटीन टर्नओवर दरों को तब प्रकाश (12सी -14एन) पेप्टाइड्स पर भारी (13सी -15एन) के अनुपात को घातीय विकास या क्षय27,28 के लिए गतिज मॉडल के लिए दिए गए प्रोटीन के लिए फिट करके निर्धारित किया जा सकता है। pSILAC का उपयोग प्रोटीन टर्नओवर दरों29,30,31,32 की कई तुलनाओं में किया गया है और वर्तमान में प्रोटीन आधे जीवन के माप के लिए सबसे व्यापक और उच्च-थ्रूपुट विधि है।

यह प्रोटोकॉल संस्कृति में इसी तरह के विकास-गिरफ्तार क्विसेंट कोशिकाओं के साथ समानांतर में सेनेसेंट कोशिकाओं की तैयारी का विवरण देता है, जिसके बाद पीएसएलसी के साथ चयापचय लेबलिंग होती है। कोशिकाओं को तब काटा जाता है, लिसेट में homogenized, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री अधिग्रहण और विश्लेषण के लिए संसाधित किया जाता है। मास स्पेक्ट्रोमेट्री से प्राप्त डेटा का उपयोग तब एक सरलीकृत मात्रात्मक विधि का उपयोग करके प्रोटीन के आधे जीवन को निर्धारित करने के लिए किया जाता है, जिसमें एक एकल समय बिंदु और एक स्प्रेडशीट में किए गए आधे जीवन की गणना को नियोजित किया जाता है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, प्रोटीन आधे जीवन के अनुमानों को एक व्यापक और मात्रात्मक तरीके से मापा जा सकता है जो प्रोटीन संश्लेषण या टर्नओवर के अवरोधकों का उपयोग करने वाले प्रोटोकॉल की तुलना में अनियंत्रित सेलुलर स्थितियों के लिए अधिक प्रामाणिक है।

Protocol

1. आयनीकरण विकिरण (आईआर) के संपर्क में आने से सेनेसेंट प्रदान की गई कोशिकाओं और कोशिकाओं की तैयारी

नोट: सेलुलर senescence और quiescence कई तरीकों का उपयोग कर प्रेरित किया जा सकता है, के रूप में विस्तार से कहीं और 33,34,35 में वर्णित है. सेनेसेंस और क्विसेंस को प्रेरित करने के लिए उपयोग की जाने वाली उत्तेजनाएं कोशिका प्रकार के ब्याज और जांच के तहत जैविक प्रश्न पर निर्भर हो सकती हैं। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली कोशिकाएं व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं।

  1. एक क्रायोवियल से मानव द्विगुणित आईएमआर -90 फाइब्रोब्लास्ट (~ 1 x 106 कोशिकाओं) को पिघलाएं और उन्हें 150 मिमी प्लेट पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) (तालिका 1) के साथ पूरक डीएमईएम के 20 मिलीलीटर में प्लेट करें।
  2. शारीरिक ऑक्सीजन की स्थिति (3% O 2, 5% CO 2, 37 °C) पर कोशिकाओं को विकसित करें और 10% FBS-युक्त मीडिया में संस्कृतियों का विस्तार करें जब तक कि क्विसेंट और सेनेसेंट कोशिकाओं के लिए पर्याप्त प्रतिकृति स्थापित नहीं की गई है (प्रति शर्त कम से कम 3-5 प्रतिकृतियों की सिफारिश की जाती है)।
    नोट: शारीरिक (3%) ऑक्सीजन पर कोशिकाओं को संवर्धित करना प्राथमिक मानव फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाओं के लिए आदर्श है, लेकिन अन्य सेल प्रकारों के लिए उपयुक्त संस्कृति की स्थिति अलग-अलग हो सकती है और इसे मामले-दर-मामले के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए।
  3. आयनीकरण विकिरण (IR) के 15 ग्रे (Gy) के लिए कोशिकाओं को उजागर करके सेनेसेंट कोशिकाओं को उत्पन्न करें।
    नोट: विकिरण जोखिम की तीव्रता सेल प्रकार के अनुसार भिन्न हो सकती है। जबकि 15 Gy का उपयोग यहां किया जाता है, 10 Gy भी फाइब्रोब्लास्ट के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विकिरण खुराक है; अन्य कोशिकाओं, जैसे मोनोसाइट्स, को 5 Gy के रूप में कम खुराक की आवश्यकता हो सकती है। खुराक आमतौर पर सेनेसेंस प्रेरण के खिलाफ व्यवहार्यता का वजन करके अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जाती है।
    1. 10% FBS युक्त मीडिया में IR के लिए 40% -60% संगम पर कोशिकाओं को बेनकाब करें।
    2. IR एक्सपोज़र के बाद, 10% FBS युक्त ताजा मीडिया में बदलें।
    3. 8 दिनों के लिए हर 2 दिनों में मीडिया (20 मिलीलीटर, जिसमें 10% FBS शामिल है) बदलें।
      नोट: कोशिकाओं को कम confluency पर IR के संपर्क में लाया जाता है क्योंकि IR-उपचारित कोशिकाएं बढ़ती बंद होने से पहले संस्कृति में विस्तारित होंगी। इस प्रयोग में, कोशिकाओं को सेनेसेंस की स्थापना के दौरान विभाजित कोशिकाओं को विभाजित नहीं किया गया था, और जब वे अधिक confluent बन गए, तो उन्होंने अभी भी फसल पर सेनेसेंट सेल मार्करों को प्रदर्शित किया। फाइब्रोब्लास्ट्स में, सेनेसेंट फेनोटाइप 7-10 दिनों के भीतर विकसित होता है।
  4. 0.2% FBS (सीरम भुखमरी) (तालिका 1) युक्त मीडिया के लिए मढ़वाया proliferating कोशिकाओं पर मीडिया को बदलकर quiescent नियंत्रण कोशिकाओं उत्पन्न करें।
    1. बढ़ती कोशिकाओं को जारी रखें जो मीडिया में क्विसेंस नियंत्रण के लिए उपयोग की जाएंगी, जिसमें 10% एफबीएस होता है, जब तक कि सेनेसेंट कोशिकाओं को आईआर के संपर्क में आने के बाद दिन 4 तक नहीं किया जाता है, जब आवश्यक हो तो विभाजित हो जाता है।
    2. IR के बाद 4 वें दिन, क्विसेंट कोशिकाओं के मीडिया को 0.2% FBS (तालिका 1) वाले मीडिया के 20 मिलीलीटर में बदलें और एक और 6 दिनों के लिए बढ़ते रहें, हर 2 दिनों में मीडिया को बदलते रहें।
      नोट: यहां तक कि 0.2% FBS युक्त मीडिया में, fibroblasts कुछ हद तक बढ़ने के लिए जारी रहेगा और फसल के अंत तक confluent दिखाई दे सकता है। अंगूठे के एक नियम के रूप में, quiescent कोशिकाओं को इकट्ठा करने का लक्ष्य रखें जब वे सेनेसेंट सेल संस्कृतियों के समान confluency तक पहुंच गए हों।

2. स्पंदित SILAC और lysates की फसल के लिए कोशिकाओं की लेबलिंग

  1. दोनों senescent और quiescent कोशिकाओं (12 प्लेटों) पर मीडिया बदलें SILAC लाइट (तालिका 1) के लिए और 2 दिनों के लिए बढ़ते हैं।
    नोट: यह लेबलिंग पृष्ठभूमि शोर को कम करने में मदद करती है क्योंकि 13सी और 15एन की कम प्राकृतिक बहुतायत है। इस चरण को अभिकर्मक-सीमित स्थितियों में छोड़ा जा सकता है, लेकिन इसके परिणामस्वरूप नए प्रोटीन संश्लेषण का थोड़ा अधिक अनुमान लगाया जाएगा।
  2. चयापचय लेबलिंग के लिए SILAC DMEM (तालिका 1) के साथ मीडिया को बदलें।
    नोट: SILAC DMEM मीडिया विशेष रूप से चयापचय लेबलिंग के लिए arginine और लाइसिन के विशुद्ध रूप से हल्के या भारी आइसोटोप शामिल करने के लिए तैयार कर रहे हैं। उन्हें 2.2.1 या 2.2.2 में मानक DMEM योगों के साथ प्रतिस्थापित नहीं किया जाना चाहिए।
    1. तीन सेनेसेंट और तीन क्विसेंट प्लेटों के लिए, मीडिया को SILAC लाइट (तालिका 1) के 30 मिलीलीटर के साथ बदलें और मीडिया को बदले बिना 3 दिनों के लिए बढ़ें।
    2. कम से कम तीन सेनेसेंट और तीन क्विसेंट प्लेटों के लिए, मीडिया को SILAC हेवी (टेबल 1) के 30 मिलीलीटर के साथ बदलें और मीडिया को बदले बिना 3 दिनों के लिए बढ़ें।
      नोट: इस बिंदु पर एक विकल्प है कि उन्हें अतिरिक्त 3 दिनों के लिए लेबल करने के बजाय तुरंत प्रकाश-लेबल वाली कोशिकाओं को क्या किया जाएगा। एक एकल समय बिंदु के लिए, बैच प्रभाव को कम करने के लिए इस प्रोटोकॉल में किए गए समान अवधि के लिए भारी और हल्के लेबल वाले कोशिकाओं को लेबल करना बेहतर है।
  3. प्रत्येक डिश में पूर्व-गर्म ट्रिप्सिन अभिकर्मक के 5 मिलीलीटर जोड़कर और 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके संस्कृति प्लेटों से कोशिकाओं को अलग करें।
  4. संस्कृति के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही मीडिया के 5 मिलीलीटर में अलग कोशिकाओं को फिर से निलंबित कर दिया (या तो SILAC लाइट या SILAC हेवी) 10 मिलीलीटर की कुल मात्रा में।
  5. lysates के निष्कर्षण और senescence मार्करों के सत्यापन के लिए कोशिकाओं फसल.
    1. प्रत्येक निलंबन के लिए, 0.6 x 106 कोशिकाओं को 6-अच्छी तरह से पकवान में 0.2% एफबीएस युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर में कोशिकाओं के एलीकोट करें (दो व्यंजन, SILAC लाइट सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए एक और SILAC भारी सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए एक) और रात भर के इनक्यूबेशन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: इन प्लेटों (substep 2.5.1) senescence-संबद्ध β-galactosidase (SA-πGal) गतिविधि (चरण 3.1) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
    2. प्रत्येक निलंबन के लिए, एक माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में कोशिकाओं के 1 x 106 को एलीकोट करें और 1 मिनट के लिए पूरी गति से टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में नीचे स्पिन करें। supernatant निकालें और फिनोल के 1 मिलीलीटर में गोली resuspend; इस चरण में, आरएनए को पूरी तरह से शुद्ध किया जा सकता है जैसा कि फिनोल आपूर्तिकर्ता के मैनुअल में वर्णित है या -80 डिग्री सेल्सियस पर दीर्घकालिक रूप से संग्रहीत किया गया है।
      सावधानी: फिनोल संक्षारक है और दस्ताने और एक प्रयोगशाला कोट के साथ एक हुड में विशेष रूप से संभाला जाना चाहिए।
      नोट: निकाले गए आरएनए का उपयोग रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन (आरटी) का उपयोग करके एसएएसपी कारकों को एन्कोडिंग करने वाले एमआरएनए का पता लगाने के लिए किया जाएगा, जिसके बाद वास्तविक समय, मात्रात्मक (क्यू) पीसीआर (आरटी-क्यूपीसीआर) विश्लेषण (चरण 3.2) होगा। सेनेसेंस प्रेरण के लिए एक और विश्वसनीय परख 5-एथिल डाइहाइड्रॉक्सी यूरिडिन (ईडीयू) निगमन के लिए एक परीक्षण है, जो कोशिकाओं की उपस्थिति को इंगित करता है। प्रसार की अनुपस्थिति का उपयोग क्विसेंस और सेनेसेंस की पुष्टि करने के लिए किया जा सकता है।
    3. शेष कोशिकाओं को बर्फ में स्थानांतरित करें और 300 x g और 4 °C पर नीचे स्पिन करें।
  6. supernatant निकालें और संस्कृति माध्यम से भ्रूण गोजातीय सीरम से मीडिया / ट्रिप्सिन और बहिर्जात प्रोटीन संदूषण को हटाने के लिए ठंडे पीबीएस के 1 मिलीलीटर में दो बार कोशिकाओं को धोएं।
  7. कोशिकाओं को फिर से नीचे स्पिन करें, supernatant को हटा दें, और लाइसिस के लिए आगे बढ़ें।
  8. ताजा तैयार 8 एम यूरिया 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट लाइसिस बफर (तालिका 1) के 150 μL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें, और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण।
  9. 4 डिग्री सेल्सियस पर मध्यम शक्ति पर 30 s चालू / बंद के साथ 2.5 मिनट के लिए एक पानी sonicator में lysates sonicate।
  10. एक पूर्व गर्म 95 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक और 4 मिनट के लिए denature करने के लिए lysates स्थानांतरण.
  11. लिसेट नीचे स्पिन; लिसेट को अब -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है या परिमाणीकरण के लिए तुरंत उपयोग किया जा सकता है।
  12. लाइसिस बफर में प्रत्येक lysate के लिए 1:10 dilutions का एक 30 μL स्टॉक करें।
  13. BCA परख किट के साथ प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए 1/10x Lysis बफर ddH2O. Lysates में पतला में तैयार एक मानक वक्र का उपयोग कर अब अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.

3. senescence-संबद्ध β-Galactosidase (SA-πGal) गतिविधि और senescence-संबद्ध mRNA के RT-qPCR विश्लेषण द्वारा senescence का सत्यापन

नोट:: इन चरणों के लिए प्रारंभिक सामग्री चरण 2.5 के दौरान एकत्रित किया गया है

  1. 6-अच्छी तरह से प्लेटों से शुरू करते हुए जो सबस्टेप 2.5.1 में स्थापित किए गए थे, निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करते हुए सेनेसेंस β-गैलेक्टोसिडेस स्टेनिंग किट का उपयोग करके एसए-πगल गतिविधि के लिए कोशिकाओं का विश्लेषण करें। रंग सक्षम के साथ brightfield के तहत धुंधला कल्पना, के रूप में पहले36 वर्णित है.
    नोट: SA-πGal को सेनेसेंट बनाम quiescent नियंत्रण स्थितियों में धनात्मक कोशिकाओं (दृश्यमान नीला रंग) के प्रतिशत की तुलना करके परिमाणित किया जाता है। कोशिकाओं का एक न्यूनतम 70% SA-πGal सकारात्मक होना चाहिए senescence की सफल पुष्टि के लिए. Quiescent नियंत्रण कोशिकाओं SA-πGal के लिए 10% से कम सकारात्मक होना चाहिए।
  2. फिनोल निलंबन (substep 2.5.2) से आरएनए निकालें और SASP कारकों (IL6, CXCL8, IL1B), सेल चक्र मार्करों (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21), और senescence के अन्य संकेतकों (LMNB1 और PCNA का नुकसान) एन्कोडिंग mRNA के स्तर में वृद्धि के लिए RT-qPCR का उपयोग करके विश्लेषण करें।
    नोट: आरएनए अस्थिर है और इसलिए इसे RNase-मुक्त उपकरण, ताजा दस्ताने, और बर्फ पर तब तक संभाला जाना चाहिए जब तक कि प्रोटोकॉल में अन्यथा नोट न किया गया हो।
    1. फिनोल निलंबन से शुरू करते हुए, फिनोल के प्रति 1 मिलीलीटर क्लोरोफॉर्म के 200 μL जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 x g पर नीचे स्पिन करें।
    2. ध्यान से जलीय चरण को हटा दें और आइसोप्रोपेनॉल की 1: 1 मात्रा, ग्लाइकोजन सह-precipitant के 15 μg जोड़ें, और फिर आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. इनक्यूबेशन बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 x g पर centrifugation द्वारा आरएनए को गोली मार दें, इसके बाद 75% EtOH में वॉश किया जाता है जो फिनोल की 1 मात्रा के बराबर होता है। न्यूक्लिएज मुक्त आसुत पानी के 50 μL में आरएनए को फिर से निलंबित करना; आरएनए को अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    4. आरएनए नमूनों के लिए, न्यूक्लिएज मुक्त आसुत पानी के 38 μL, 10x DNAse प्रतिक्रिया बफर के 10 μL, और DNase I के 2 μL जोड़ें, मिश्रण के बाद।
      नोट: substep 3.2.3 में सभी अभिकर्मकों का एक सामान्य मिश्रण उत्पन्न करना नमूनों के लिए समान वितरण के लिए उपचार के लिए नमूनों की संख्या से गुणा सबसे अच्छा अभ्यास है।
    5. 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर DNase I-उपचारित आरएनए नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    6. एक फिनोल / क्लोरोफॉर्म / आइसोमाइल अल्कोहल (25: 24: 1) मिश्रण की 1 मात्रा का उपयोग करके नमूनों से DNase को 5 मिनट के लिए एक टेबलटॉप सेंट्रीफ्यूज में अधिकतम गति से भंवर और कताई करके निकालें; आरएनए जलीय चरण में निहित होगा।
    7. आरएनए को अवक्षेपित करने के लिए उप-चरणों को 3.2.2 और 3.2.3 दोहराएं। न्यूक्लिएज मुक्त आसुत जल के 20 μL में पुन: निलंबित; आरएनए को अनिश्चित काल के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    8. रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के 200 यू, 100 pMol यादृच्छिक प्राइमरों के साथ शुद्ध आरएनए के 0.5-1.0 μg को इनक्यूबेट करके शुद्ध आरएनए से cDNA उत्पन्न करें, और रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज के साथ आपूर्ति किए गए 1x प्रतिक्रिया बफर में एक dNTP मिश्रण के 10 mM; 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, फिर 50 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए, 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम निष्क्रियता चरण के साथ।
    9. RT चरण (substep 3.2.3) से cDNA का विश्लेषण करें quiescent नियंत्रण और वास्तविक समय, मात्रात्मक (q) PCR विश्लेषण का उपयोग करके senescent कोशिकाओं से mRNA मार्करों के स्तर का आकलन करने के लिए जाना जाता है (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21, IL1B, IL6, और CXCL8 mRNAs) या कम (LMNB1 और PCNA mRNA) के रूप में कहीं और वर्णित के रूप में senescence के साथ। ACTB mRNA, हाउसकीपिंग प्रोटीन β-एक्टिन को एन्कोडिंग करता है, अक्सर इनपुट सामग्री में अंतर को सामान्य करने के लिए एक अच्छा mRNA होता है। उपयोग किए गए प्राइमर तालिका 2 में हैं।
      नोट:: सापेक्ष RT-qPCR विश्लेषण लक्ष्य प्राइमर जोड़े और एक संदर्भ प्राइमर जोड़ी के बीच समान बाध्यकारी दक्षता की मान्यताओं पर निर्भर करता है। इन मान्यताओं को नए प्राइमर सेट के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए जैसा कि कहीं औरविस्तृत है। इसके अतिरिक्त, संदर्भ मार्करों की तुलना की जा रही सेल प्रकारों के बीच स्थिर होना चाहिए, और सेनेसेंट कोशिकाओं के लिए कई अतिरिक्त विकल्प पहले पहचाने गएहैं 38।

4. में समाधान ट्रिप्सिन पाचन

नोट: इस बिंदु से आगे, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के दौरान अशुद्धियों से हस्तक्षेप को रोकने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री-ग्रेड बफ़र्स, सॉल्वैंट्स और रसायनों का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। सभी buffers तरल क्रोमैटोग्राफी अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए अनुकूल सामग्री से बना होना चाहिए, जिसमें पानी और एसिटोनिट्राइल शामिल हैं। उपयुक्त रसायनों और सॉल्वैंट्स की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें।

  1. नई ट्यूबों में प्रत्येक प्रोटीन के नमूने के 50 μg को एलीकोट करें और लाइसिस बफर के साथ समान मात्रा में लाएं।
  2. प्रत्येक नमूने के लिए, डाइसल्फ़ाइड बांड को कम करने के लिए 20 mM की अंतिम एकाग्रता में DTT जोड़ें।
  3. झटकों के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें, और फिर नमूनों को कमरे के तापमान (आरटी, ~ 10 मिनट) पर ठंडा करने की अनुमति दें।
  4. 40 mM की अंतिम एकाग्रता के लिए iodoacetamide जोड़ें अपरिवर्तनीय रूप से sulfhydryl समूहों है कि पिछले चरण में कम कर दिया गया था alkylate करने के लिए। 30 मिनट के लिए अंधेरे में आरटी पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  5. 50 mM अमोनियम बाइकार्बोनेट से बने बफर के साथ प्रत्येक नमूने को 1 M यूरिया से नीचे पतला करें। जांचें कि पीएच स्ट्रिप्स पर नमूना की एक छोटी राशि को पिपेट करके पीएच लगभग 8 है या नहीं।
  6. शुरुआती प्रोटीन के 50 μg के लिए प्रत्येक नमूने में ट्रिप्सिन के 1 μg जोड़ें, या 1:50 ट्रिप्सिन: प्रोटीन अनुपात पर, द्रव्यमान द्वारा, यदि एक अलग प्रोटीन मात्रा को पचाते हैं। उदाहरण के लिए, 150 μg प्रोटीन के पाचन के लिए ट्रिप्सिन के 3 μg जोड़ा जाएगा।
  7. पेप्टाइड्स में प्रोटीन को पचाने के लिए मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  8. प्रोटीन पाचन को बुझाने के लिए प्रत्येक नमूने की मात्रा के अनुसार, 1% तक फॉर्मिक एसिड जोड़ें।
    नोट: प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है। -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को फ्रीज करें और यदि आवश्यक हो तो बाद की तारीख में अगले चरण तक जारी रखें।

5. ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) के साथ नमूना सफाई अप

नोट:: इस ठोस चरण निष्कर्षण प्रोटोकॉल ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस और एक वैक्यूम कई गुना सेटअप की आवश्यकता है। अन्य समकक्ष ठोस-चरण निष्कर्षण (एसपीई) प्रोटोकॉल को मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले शोधकर्ता के विवेक पर किया जा सकता है।

  1. प्रत्येक नमूने के लिए एक निष्कर्षण कारतूस का उपयोग करके, एक वैक्यूम कई गुना पर ठोस चरण निष्कर्षण कारतूस रखकर एसपीई के लिए तैयार करें।
    नोट:: SPE प्रोटोकॉल में उपयोग किया जा करने के लिए sorbent की मात्रा के लिए निर्माता के दिशानिर्देशों को देखें। पेप्टाइड नमूनों के 50 μg के लिए, यह 10 मिलीग्राम sorbent कारतूस का उपयोग करने की सिफारिश की है।
  2. एसपीई क्षालन बफर (तालिका 1) के 800 μL जोड़कर प्रत्येक एसपीई कारतूस की स्थिति और कारतूस के माध्यम से विलायक को आकर्षित करने के लिए वैक्यूम सक्शन का उपयोग करें।
  3. चरण 5.2 को दोहराएँ।
  4. एसपीई वॉश बफर (तालिका 1) के 800 μL जोड़कर प्रत्येक कारतूस को संतुलित करें और कारतूस के माध्यम से बफर खींचने के लिए वैक्यूम सक्शन का उपयोग करें।
  5. चरण 5.4 को कुल तीन बार के लिए दो अतिरिक्त बार दोहराएं।
  6. एसपीई कारतूस में पेप्टाइड नमूनों को लोड करें और कारतूस के माध्यम से नमूने खींचने के लिए वैक्यूम सक्शन का उपयोग करें।
    नोट: इस बिंदु पर, पेप्टाइड्स कारतूस के अंदर sorbent करने के लिए बाध्य कर रहे हैं।
  7. एसपीई वॉश बफर के साथ प्रत्येक कारतूस को धोएं और कारतूस के माध्यम से बफर खींचने के लिए वैक्यूम सक्शन का उपयोग करें।
  8. कुल तीन धोने के लिए चरण 5.7 को दो अतिरिक्त बार दोहराएं।
  9. क्षालन चरण से पहले, प्रत्येक कारतूस के नीचे वैक्यूम कई गुना के भीतर संग्रह ट्यूबों की व्यवस्था करें, ध्यान से संग्रह ट्यूबों और कारतूस के बीच संरेखण सुनिश्चित करें।
  10. पेप्टाइड्स को दूर करने के लिए, प्रत्येक कारतूस के लिए एसपीई क्षालन बफर के 800 μL जोड़ें और वैक्यूम सक्शन के साथ संग्रह ट्यूबों में पेप्टाइड्स को एल्यूट करें।
  11. SPE क्षालन बफ़र के 400 μL के साथ चरण 5.10 दोहराएँ।
  12. वैक्यूम कई गुना से पेप्टाइड नमूनों को हटा दें और एक वैक्यूम कंसंट्रेटर में पूरी तरह से सूख जाएं (सुखाने में लगभग 3 घंटे लगते हैं)।
    नोट: प्रयोग यहाँ रोका जा सकता है। -80 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को फ्रीज करें और यदि आवश्यक हो तो बाद की तारीख में जारी रखें।

6. डेटा निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

  1. पानी में 0.2% फॉर्मिक एसिड से बने बफर में 400 एनजी / μL की एकाग्रता पर पेप्टाइड नमूनों को फिर से निलंबित करें।
  2. पेप्टाइड्स के पुन: घुलनशीलता में सहायता करने के लिए, 5 मिनट के लिए नमूनों को भंवर करें। फिर, एक पानी स्नान sonicator में 5 मिनट के लिए नमूनों sonicate.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 15,000 x g पर नमूनों को सेंट्रीफ्यूज करके किसी भी अघुलनशील सामग्री को गोली मारें। एमएस शीशियों में पेप्टाइड supernatants स्थानांतरण.
  4. 1:30 iRT: नमूना की एकाग्रता पर प्रत्येक नमूने के लिए पसंद के अनुक्रमित अवधारण समय (iRT) पेप्टाइड मानकों को जोड़ें, मात्रा के अनुसार।
  5. तरल-क्रोमैटोग्राफी टैंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस / एमएस) विश्लेषण का उपयोग करके प्रोटिओमिक विश्लेषण के लिए नमूने प्रस्तुत करें।
    1. मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा द्वारा अनलक्षित विश्लेषण के लिए अनुशंसित LC-MS/MS सेटिंग्स का उपयोग करें. विश्लेषण के लिए उदाहरण सेटिंग्स चित्रा 3 में दिखाए गए हैं, जो नैनो-प्रवाह मोड में नैनो तरल क्रोमैटोग्राफी सिस्टम के लिए युग्मित एक ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमीटर पर विश्लेषण के लिए कॉन्फ़िगर किया गया है। एक उदाहरण प्रोटोकॉल का पालन करता है।
    2. एक जाल स्तंभ (1 सेमी लंबा x 100 μm व्यास) पर प्रत्येक नमूने के 1 μg (5 μL) लोड करें और उन्हें लोडिंग सॉल्वेंट (तालिका 1) के साथ 5 मिनट के लिए 10 μL / मिनट की प्रवाह दर पर धोएं।
    3. एक विश्लेषणात्मक स्तंभ (50 सेमी लंबा x 100 μm व्यास) पर एक 400 nL / मिनट प्रवाह दर के साथ नमूनों को लोड करें।
    4. एक कार्बनिक विलायक (0.2% फॉर्मिक एसिड और 99.8% एसिटोनिट्राइल) और अकार्बनिक विलायक (99.8% पानी में 0.2% फॉर्मिक एसिड) के साथ 90 मिनट रैखिक ढाल पर पेप्टाइड्स को एल्यूट करें, जो 5% से 35% कार्बनिक विलायक तक होता है।
    5. MS1 सर्वेक्षण स्कैन (60,000 रिज़ॉल्यूशन, 3e6 AGC लक्ष्य, 100 ms अधिकतम संचय समय, और 400-1,600 m/z द्रव्यमान रेंज) के एक निरंतर चक्र के साथ डेटा-निर्भर मोड में मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा प्राप्त करें, इसके बाद 20 डेटा-निर्भर MS2 स्कैन (15,000 रिज़ॉल्यूशन, 1e5 AGC लक्ष्य, 25 ms अधिकतम इंजेक्शन समय, और 1.6 m/ z चौड़ाई अलगाव खिड़कियां) HCD विखंडन के साथ (25 ms अधिकतम इंजेक्शन समय, और 1.6 m/ z चौड़ाई अलगाव खिड़कियां) HCD विखंडन (27% की सामान्यीकृत टक्कर ऊर्जा) के साथ।
  6. सभी नमूनों के एमएस अधिग्रहण के बाद, पेप्टाइड पीक क्षेत्रों की पहचान और परिमाणीकरण के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटिओमिक्स विश्लेषण सॉफ्टवेयर टूल में कच्चे द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री फ़ाइलों को आयात करें।
    नोट:: इस प्रयोग में पेप्टाइड्स और प्रोटीन की पहचान के लिए, शुभंकर डेटाबेस खोज उपकरण की समीक्षा की गई UniProt मानव proteome अनुक्रम डेटाबेस (Proteome ID: UP000005640) के साथ उपयोग किया गया था। निम्न खोज पैरामीटर शुभंकर में निर्दिष्ट किए गए थे:
    • मात्रा: SILAC K+8 R+10 [MD] एंजाइम: ट्रिप्सिन/p निश्चित संशोधन: carbamidomethyl (C)
    • चर संशोधनों: एसिटाइल (प्रोटीन एन-टर्म), Gln->pyro-Glu (N-term Q), ऑक्सीकरण (M), लेबल: 13C (6)15N (2) (K), लेबल: 13C (6)15N (4) (R)
    • पेप्टाइड द्रव्यमान सहिष्णुता: 10 पीपीएम
    • टुकड़ा बड़े पैमाने पर सहिष्णुता: 0.08 दा
    • अधिकतम छूटी दरारें: 2
    • सभी अनिर्दिष्ट पैरामीटर डिफ़ॉल्ट थे
  7. proteome मात्रा सॉफ्टवेयर उपकरण में भारी और हल्के पेप्टाइड्स के लिए पेप्टाइड पीक क्षेत्रों की मात्रा निर्धारित करें। इस प्रयोग में चोटी के क्षेत्रों के परिमाणीकरण के लिए, मुक्त और ओपन-सोर्स स्काईलाइन सॉफ्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग39,40 किया गया था। प्रोटीन आधे जीवन के अनुमान के लिए भारी और हल्के पेप्टाइड पीक क्षेत्रों का निर्यात करें।

7. प्रोटीन आधा जीवन की गणना

  1. SILAC विश्लेषण कार्यपुस्तिका (तालिका 3) को 1 नाम की पहली शीट पर खोलें ) कच्चा डेटा और UniProt आईडी, जीन नाम, भारी चोटी क्षेत्रों, और संकेतित स्तंभों में हल्के चोटी क्षेत्रों में चिपकाएँ (SH = Senescent-Heavy, SL = Senescent-Light, CH = Control (quiescent)-Heavy, CL = Control (quiescent)-Light)।
  2. 2-4 शीट खोलें और सुनिश्चित करें कि UniProt ID और जीन कॉलम विश्लेषण से पहचाने गए प्रोटीन की संख्या से मेल खाते हैं (इन प्रयोगों ने 841 प्रोटीन की पहचान की)। पहचाने गए प्रोटीन को कवर करने के लिए खींचे जाने के बाद बाकी कॉलम स्वचालित रूप से डेटा से भर जाएंगे।
  3. 4) विश्लेषण नामक चौथे पत्रक को खोलें और उन पंक्तियों को निकालें जहां स्तंभ G और H इंगित करते हैं कि नमूना सीमा से बाहर है; उन पंक्तियों को रखें जो सीमा के भीतर पढ़ती हैं। पांचवीं शीट में ज्वालामुखी प्लॉट स्वचालित रूप से पॉप्युलेट हो जाएगा।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल वैश्विक स्तर पर सेनेसेंट और गैर-विभाजित, क्विसेंट नियंत्रण कोशिकाओं के बीच प्रोटीन के आधे जीवन की तुलना करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, जो पीएसएलसी और न्यूनतम समय बिंदुओं का उपयोग करके नियंत्रण कोशिकाओं का उपयोग करता है। यह प्रोटोकॉल संस्कृति में सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं की पीढ़ी का विवरण देता है, 3 दिनों में आर्जिनिन और लाइसिन के स्थिर आइसोटोप के साथ कोशिकाओं की चयापचय लेबलिंग, मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा भारी और हल्के पेप्टाइड आइसोटोप की सापेक्ष बहुतायत को मापता है, और स्प्रेडशीट सूत्रों का उपयोग करके प्रोटीन आधे जीवन की एक सीधी और सुलभ गणना (चित्रा 1)। यह विधि अत्यधिक लचीली है और इसे कई सेल प्रकारों और स्थितियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल के लिए सेनेसेंट कोशिकाओं की पीढ़ी के हिस्से के रूप में, सेनेसेंस सत्यापन के दो तरीकों का उपयोग किया जाता है: माइक्रोस्कोपी द्वारा विज़ुअलाइज़ की गई एसए-πगल-पॉजिटिव कोशिकाएं और आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण का उपयोग करके सेनेसेंट मार्करों के बढ़े हुए स्तर में वृद्धि हुई है। सेनेसेंट मार्करों के माप को दो कोशिकाओं की आबादी की तुलना के लिए क्विसेंट और सेनेसेंट कोशिकाओं के बीच स्पष्ट अंतर उत्पन्न करना चाहिए, जिसे वैध माना जाना चाहिए। SA-πGal गतिविधि के लिए, सेनेसेंट कोशिकाओं को नीला दिखाई देना चाहिए जबकि क्विसेंट नियंत्रण कोशिकाओं में कोई या बहुत कम रंग नहीं होता है (चित्रा 2A)। इस परख को कोशिकाओं की कुल संख्या के प्रतिशत के रूप में सकारात्मक, नीले रंग के दाग वाली कोशिकाओं की गिनती करके परिमाणित किया जा सकता है, और फिर क्विसेंट नियंत्रण और सेनेसेंट कोशिकाओं के बीच प्रतिशत सकारात्मकता दर की तुलना की जा सकती है। यह महत्वपूर्ण है कि इस प्रोटोकॉल को दोनों सेल राज्यों की तुलना के लिए एक ही समय में किया जाए; SA-πGal गतिविधि धुंधला समाधान के पीएच पर निर्भर करती है, इसलिए परिणाम assays के बीच काफी भिन्न हो सकते हैं और एक गुणात्मक उपाय माना जाना चाहिए।

सेनेसेंट मार्करों के आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण से एमएएनएस के उच्च स्तर को एसएएसपी कारकों (आईएल 6, सीसीएल 8, आईएल 1 बी) और सेल चक्र अवरोधकों (सीडीकेएन 2 ए / पी 16, सीडीकेएन 1 ए / पी 21) को एन्कोडिंग करने के उच्च स्तर को दिखाया जाएगा। यद्यपि सेल प्रकार, संस्कृति की स्थिति और सेनेसेंट इनड्यूसर41,42 के आधार पर कुछ भिन्नता की उम्मीद की जाती है, लेकिन अधिकांश सेनेसेंट कोशिकाएं आईएल 6, सीसीएल 8 और सीडीकेएन 1 ए / पी 21 एमआरएनए के पांच गुना से अधिक उच्च स्तर ों को प्रदर्शित करती हैं, जो क्विसेंट नियंत्रण कोशिकाओं की तुलना में होती हैं; इसके विपरीत, LMNB1 और PCNA mRNA के स्तर, प्रसार मार्करों को एन्कोडिंग करते हुए, क्विसेंट कोशिकाओं (चित्रा 2B) की तुलना में सेनेसेंट कोशिकाओं में कम या अनुपस्थित होना चाहिए। एक साथ लिया, SA-πGal सकारात्मकता का एक महत्वपूर्ण प्रतिशत और senescence-संबद्ध mRNA मार्करों के एक पैनल की अपेक्षित अभिव्यक्ति एक प्रयोग में senescence के प्रेरण की पुष्टि करने के लिए पर्याप्त हैं।

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रसंस्करण प्रोटीन नमूनों में इन-सॉल्यूशन पाचन (2 दिन) और ठोस-चरण निष्कर्षण (4-6 ज) शामिल हैं। Untargeted प्रोटिओमिक विश्लेषण करने के लिए, परिणामी पेप्टाइड्स को डेटा-निर्भर अधिग्रहण (DDA) का उपयोग करके LC-MS/MS विश्लेषण के लिए प्रस्तुत किया जाता है। Orbitrap उपकरणों पर, एक DDA विधि मास स्पेक्ट्रोमेट्री साधन सॉफ्टवेयर विधि संपादक में निर्दिष्ट किया जा सकता है। इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर सेटिंग्स को चित्र 3 ए में दिखाया गया है। तरल क्रोमैटोग्राफी सेटिंग्स को विधि संपादक के भीतर भी निर्दिष्ट किया जा सकता है। इस अध्ययन के लिए, बढ़ते कार्बनिक चरण (एसिटोनिट्राइल) के साथ एक 90 मिनट रैखिक ढाल का उपयोग किया गया था (चित्रा 3 बी)। एक सफल अधिग्रहण के बाद, कुल आयन वर्तमान (टीआईसी) में विधि के रैखिक ढाल भाग के दौरान एक तीव्र संकेत होना चाहिए (चित्रा 3 सी)। यह प्रोटोकॉल एक ऑर्बिटरैप उपकरण पर एक उदाहरण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, लेकिन प्रोटीन आधे जीवन की गणना किसी भी मास स्पेक्ट्रोमीटर से प्राप्त डेटा पर की जा सकती है जिसे डीडीए-मोड में एकत्र किया गया था, जो कई प्रकार के उपकरणों (जैसे, ऑर्बिटरैप्स और टाइम-ऑफ-फ्लाइट उपकरणों) और विक्रेताओं पर उपलब्ध है। अधिग्रहण सेटिंग्स उपयोग किए गए उपकरण के प्रकार और कॉन्फ़िगरेशन के लिए अद्वितीय होंगी, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सुविधा द्वारा सुझाई गई सेटिंग्स का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। यह विधि गैर-डीडीए विधियों (एसआरएम, पीआरएम, डीआईए) के साथ भी संगत है, जब तक कि भारी और हल्के चोटियों के लिए मात्रात्मक क्रोमैटोग्राफिक पीक क्षेत्रों को कच्चे डेटा फ़ाइलों से निकाला जा सकता है और स्प्रेडशीट सूत्रों में दर्ज किया जा सकता है।

कच्चे मास स्पेक्ट्रोमेट्री फ़ाइलों पेप्टाइड्स और प्रोटीन की पहचान करने के लिए कई उपलब्ध प्रोटिओमिक डेटाबेस खोज उपकरणों में से एक के साथ खोज की जाती है। उदाहरण के लिए, इस अध्ययन ने शुभंकर43 खोज इंजन का उपयोग किया। भारी और हल्के पेप्टाइड्स के परिमाणीकरण के लिए क्रोमैटोग्राफिक पीक क्षेत्रों को प्राप्त करने के लिए, डेटाबेस खोज परिणामों को एक प्रोटिओमिक सॉफ़्टवेयर में आयात किया जाता है जो स्काईलाइन39,40 जैसे क्रोमैटोग्राफिक पीक क्षेत्रों में सक्षम होता है। पेप्टाइड्स के निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम की परीक्षा (चित्रा 4) भारी और हल्के पेप्टाइड संकेतों के सापेक्ष अनुपात को प्रकट करेगी। सेनेसेंट कोशिकाओं में हल्के पेप्टाइड सिग्नल के सापेक्ष भारी पेप्टाइड सिग्नल का एक कम अनुपात धीमी प्रोटीन टर्नओवर दर (चित्रा 4 ए) को इंगित करता है, और प्रकाश के सापेक्ष एक उच्च भारी पेप्टाइड सिग्नल एक तेज प्रोटीन टर्नओवर दर (चित्रा 4 बी) को इंगित करता है। बिना लेबल वाले नमूनों को बहुत कम या कोई भारी पेप्टाइड संकेत नहीं दिखाना चाहिए। बिना लेबल वाले नमूनों में किसी भी स्पष्ट भारी पेप्टाइड सिग्नल को पृष्ठभूमि शोर माना जाता है और अंतिम गणना के दौरान घटाया जाएगा। सभी उपचार और लेबलिंग स्थितियों के लिए हल्के और भारी पेप्टाइड्स के लिए क्रोमैटोग्राफिक पीक क्षेत्रों का परिमाणीकरण प्रोटीन टर्नओवर दरों और सांख्यिकीय विश्लेषण की बाद की गणना के लिए निर्यात किया जाना चाहिए।

एकल समय बिंदु विश्लेषण का उपयोग करके, प्रोटीन आधे जीवन का परिमाणीकरण प्रदर्शन करने के लिए सरल है और स्प्रेडशीट में आसानी से किया जा सकता है। तालिका 3 में, मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहचाने गए 695 प्रोटीनों के लिए आधे जीवन की गणना की गई थी। नमूनों में प्रत्येक प्रोटीन के लिए प्रोटीन-स्तर के भारी और हल्के आइसोटोप बहुतायत से शुरू ( 1) कच्चे डेटा शीट के लिए इनपुट), एक प्रतिशत भारी आइसोटोप (अनुपात, आर कहा जाता है) फिर स्वचालित रूप से शीट पर गणना की जाती है शीर्षक 2) अनुपात एच | H + L. इस चरण में, भारी लेबल वाले नमूनों से आर को बिना लेबल वाले नमूनों से आर को घटाकर सामान्यीकृत किया जाता है ताकि क्विसेंट और सेनेसेंट ट्रिप्लिकेट के लिए अंतिम आर का उत्पादन किया जा सके। चूंकि बिना लेबल वाले नमूनों में कोई बहिर्जात रूप से जोड़ा गया भारी आइसोटोप नहीं होना चाहिए, इसलिए उनका उपयोग पृष्ठभूमि संकेत को खत्म करने के लिए किया जाता है। R से, kdeg (टर्नओवर दर) की गणना निम्न सूत्र का उपयोग करके की जाती है:

Equation 1

आधे जीवन (एच, दिनों में) प्रत्येक प्रोटीन के लिए quiescent नियंत्रण और senescent तीन प्रतिलिपि (शीट शीर्षक 3) आधा जीवन (दिन)) में निम्नलिखित सूत्र का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है:

Equation 2

इन आधे जीवन को तब प्रत्येक प्रोटीन के साथ-साथ पी-मूल्य के लिए एक क्विसेंट और सेनेसेंट माध्य आधे जीवन के साथ-साथ एक क्विसेंट और सेनेसेंट ट्रिपलिकेट्स के बीच औसत किया जाता है। परिकलित आधे जीवन को तब उन मानों के लिए फ़िल्टर किया जाता है जो नकारात्मक होते हैं, जो तब होता है जब हल्के-लेबल वाले कोशिकाओं (पृष्ठभूमि) से भारी सिग्नल भारी लेबल वाले कोशिकाओं से भारी सिग्नल से अधिक होता है। इस फ़िल्टरिंग के परिणामस्वरूप 841 से 707 प्रोटीन ों को यहां प्रस्तुत परिणामों के लिए वैध आधे जीवन के साथ पहचाना गया।

आधे जीवन को तब क्विसेंट नियंत्रण कोशिकाओं (log2FC ) पर सेनेसेंट के लॉग 2 अनुपात के रूप में रिपोर्ट किया जाता है और ज्वालामुखी प्लॉट (चित्रा 5) में प्लॉट किया जाता है। उदाहरण के लिए, 5) विश्लेषण शीट को देखकर, जमावट II थ्रोम्बिन रिसेप्टर (F2R) प्रोटीन को 0.51 दिनों (कॉलम बी) की क्विसेंट कोशिकाओं में आधा जीवन और 1.07 दिनों (कॉलम सी) की सेनेसेंट कोशिकाओं में आधा जीवन देखा जा सकता है, जिसने 0.001 के पी-मान के साथ ~ 1.06 (कॉलम डी) का एक लॉग2एफसी प्राप्त किया।

Figure 1
चित्र1: senescent और quiescent नियंत्रण कक्षों के लिए pSILAC वर्कफ़्लो का आरेख. मानव आईएमआर -90 फाइब्रोब्लास्ट का उपयोग प्रोटीन आधे जीवन की तुलना के लिए क्विसेंट (कम-सीरम) या सेनेसेंट (आईआर) सेल संस्कृतियों को तैयार करने के लिए किया गया था। कोशिकाओं को तब SILAC लाइट या SILAC भारी मीडिया के साथ आइसोटोपिक आर्जिनिन और लाइसिन के साथ 3 दिनों के लिए लेबल किया गया था। लिसेट को कोशिकाओं से निकाला गया था, पचाया गया था, डिसाल्ट किया गया था, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण किया गया था। भारी और हल्के पेप्टाइड आइसोटोप चोटियां क्रमशः नए संश्लेषित और पहले से मौजूद पेप्टाइड्स के अनुरूप हैं। आधे जीवन की गणना घातीय क्षय के लिए एक समीकरण का उपयोग करके की गई थी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: SA-πGal और RT-qPCR विश्लेषणों का उपयोग करके सेनेसेंट फेनोटाइप्स का सत्यापन। (A) सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं को फसल के समय 6-अच्छी तरह से प्लेट में फिर से चढ़ाया जाता है और SA-πGal के लिए SA-πGal स्टेनिंग किट का उपयोग करके दाग दिया जाता है। सेल शरीर में नीला रंग सेनेसेंस के लिए सकारात्मक है। छवियों को 10x आवर्धन पर रंग के साथ ब्राइटफील्ड में लिया जाता है, लाल रंग में आकार मार्कर। (बी) आरटी-क्यूपीसीआर विश्लेषण एक असंबंधित प्रयोग से सेनेसेंट कोशिकाओं (लाल) और साइकिल चालन कोशिकाओं (ग्रे) की तुलना करता है। CDKN1A/p21, CXCL8, और IL6 mRNA के स्तर में वृद्धि senescence का संकेत है, जैसा कि LMNB1 mRNA स्तरों में कमी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: डेटा-निर्भर अधिग्रहण (DDA) स्कैन और Q-Exactive HF ऑर्बिटरैप मास स्पेक्ट्रोमीटर पर pSILAC संस्कृतियों के तरल क्रोमैटोग्राफी ग्रेडिएंट के लिए प्रतिनिधि विधियां। (A) एक pSILAC प्रयोग से पूरे सेल lysates के डेटा-निर्भर विश्लेषण के लिए उपकरण सॉफ़्टवेयर में अनुशंसित उपकरण सेटिंग्स। (बी) उदाहरण तरल क्रोमैटोग्राफी प्रवाह ढाल विधि सेटिंग्स। पेप्टाइड्स को 5% से 35% बफर बी (0.2% फॉर्मिक एसिड और 99.8% एसिटोनिट्राइल) तक 90 मिनट के रैखिक ग्रेडिएंट पर अलग किया जाता है, इसके बाद 80% बफर बी के साथ 10 मिनट की धुलाई होती है, और 5% बफर बी के साथ 25 मिनट का संतुलन होता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि ने सेनेसेंस के दौरान परिवर्तित टर्नओवर के साथ पेप्टाइड्स के आयन क्रोमैटोग्राम निकाले। (ए) पेप्टाइड FQMTQEVVCDECPNVK ++ के क्रोमैटोग्राफिक पीक क्षेत्रों में प्रोटीन DnaJ होमोलॉग उपपरिवार B सदस्य 11 (DNAJB11) से सेनेसेंट और गैर-सेनेसेंट कोशिकाओं में। SILAC के 3 दिनों के बाद, senescent कोशिकाओं quiescent (गैर-senescent) कोशिकाओं की तुलना में इस पेप्टाइड में कम भारी आइसोटोप को शामिल करते हैं, जैसा कि हल्के पेप्टाइड (लाल) के सापेक्ष भारी आइसोटोप युक्त पेप्टाइड (नीले) के चरम क्षेत्र में कमी से संकेत मिलता है, यह दर्शाता है कि इस पेप्टाइड ने सेनेसेंट कोशिकाओं में कारोबार को कम कर दिया है। (बी) पेप्टाइड VQAQVIQETIVPK++ के क्रोमैटोग्राफिक पीक क्षेत्रों में प्रोटीन Splicing Factor 3a Subunit 1 (SF3A1) से सेनेसेंट और गैर-सेनेसेंट कोशिकाओं में। SILAC के 3 दिनों के बाद, सेनेसेंट कोशिकाएं क्विसेंट (गैर-सेनेसेंट) कोशिकाओं की तुलना में इस पेप्टाइड में भारी आइसोटोप के उच्च अनुपात को शामिल करती हैं, जैसा कि हल्के पेप्टाइड (लाल) के सापेक्ष भारी आइसोटोप युक्त पेप्टाइड (नीले) के चरम क्षेत्र में कमी से संकेत मिलता है, यह दर्शाता है कि इस पेप्टाइड ने सेनेसेंट कोशिकाओं में कारोबार में वृद्धि की है। अनलेबल (दिन 0) की स्थिति दोनों पेप्टाइड्स के लिए भारी आइसोटोप का कोई निगमन नहीं दिखाती है, जैसा कि अपेक्षित था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: pSILAC लेबलिंग से निर्धारित senescent और quiescent कोशिकाओं में प्रोटीन आधे जीवन की तुलना। (ए) ज्वालामुखी प्लॉट 695 पहचाने गएप्रोटीनों में से प्रत्येक के लिए सेनेसेंट / नियंत्रण (क्विसेंट) के लॉग 2 अनुपात को प्रदर्शित करता है; इस प्रयोग में, लाइट एंड हेवी लेबलिंग मीडिया में कोई ग्लूकोज नहीं था और कोई फिनोल लाल नहीं था। (बी) शीर्ष 10 प्रोटीन ों को दिखाने वाली तालिकाएं जिनमें क्विसेंट कोशिकाओं बनाम सेनेसेंट कोशिकाओं (क्रमशः बाएं और दाएं) में सबसे अधिक वृद्धि या कमी हुई आधे जीवन होते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: मीडिया और बफ़र्स इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 2: RT-qPCR प्राइमर इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाते हैं। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

तालिका 3: प्रोटीन आधे जीवन, गुना परिवर्तन, और टी-परीक्षणों की गणना के लिए SILAC विश्लेषण कार्यपुस्तिका। इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Discussion

pSILAC एक शक्तिशाली तकनीक है जो कई सेलुलर स्थितियों में प्रोटीन टर्नओवर दरों के वैश्विक परिमाणीकरण को सक्षम बनाती है। यह पेपर psILAC के उपयोग का विवरण देता है ताकि सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं के बीच वैश्विक प्रोटीन आधे जीवन की तुलना की जा सके, जिसमें सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं की तैयारी के लिए निर्देश, SILAC लेबलिंग और कटाई, और अंततः डीडीए मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके विश्लेषण शामिल है। इसके अतिरिक्त, एक दो-चरणीय परीक्षण को सेनेसेंस फेनोटाइप के सत्यापन के लिए वर्णित किया गया है, जिसमें SA-πGal और RT-qPCR विश्लेषण का उपयोग किया गया है, जो mRNA एन्कोडिंग सेनेसेंस-संबद्ध प्रोटीन का उपयोग करता है। वर्णित दो दृष्टिकोणों के साथ सेनेसेंस के सत्यापन के अलावा, प्रोटिओमिक स्तर पर सेनेसेंट और क्विसेंट कोशिकाओं के बीच ज्ञात सेनेसेंस मार्करों में परिवर्तन की तलाश में मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के बाद सेनेसेंस का एक तीसरा सत्यापन किया जा सकता है। सेनेसेंस से जुड़े प्रोटीन जिन्हें ऊंचा किए जाने की उम्मीद है, उनमें पी 16, पी 21 और बीसीएल 2 शामिल हैं, दूसरों के बीच, कहीं और44,45 का वर्णन किया गया है। ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल में, आयनीकरण विकिरण का उपयोग सेनेसेंस और सीरम भुखमरी के प्रेरण के लिए किया गया था। सेनेसेंस के प्रेरण के लिए, कई विकल्प उपलब्ध हैं और उनमेंसे 41,42,46 में पर्याप्त विषमता है। वर्तमान में, कोई संवेदनशील विधि नहीं है जिसे "सबसे अधिक शारीरिक" माना जाता है, इसलिए सेनेसेंट प्रेरक का विकल्प काफी हद तक प्रयोग के संदर्भ पर आधारित है। हालांकि, सेनेसेंस के बारे में एक सामान्य घटना बताने के लक्ष्य के साथ प्रयोगों को कम से कम दो अलग-अलग सेनेसेंट प्रेरकों का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सेनेसेंस प्रतिमानों की सीमा पर चर्चा करना इस पेपर के दायरे से परे है, लेकिन सेनेसेंस को प्रेरित करने के लिए कुछ सामान्य तरीकों में डीएनए क्षति (आईआर, डोक्सोरुबिसिन, रेप्लिकेटिव थकावट) को ट्रिगर करना, ऑन्कोजेनिक प्रोटीन (एचआरएएस, बीआरएएफ) को व्यक्त करना और माइटोकॉन्ड्रिया फ़ंक्शन2 को बाधित करना शामिल है।

सेनेसेंट इनड्यूसर की पसंद के अलावा, नियंत्रण कोशिकाओं की पसंद एक समान रूप से महत्वपूर्ण विचार है। सेनेसेंट कोशिकाएं, परिभाषा के अनुसार, अनिश्चित विकास गिरफ्तारी के तहत हैं, इसलिए अन्य विकास-गिरफ्तार कोशिकाओं की तुलना अक्सर चुनी जाती है। PSILAC के लिए, सेल चक्र गिरफ्तार कोशिकाएं आम तौर पर बेहतर होती हैं क्योंकि वे दोहराते नहीं हैं और इस प्रकार प्रोटीन अर्ध-जीवन गणना47 के लिए उपयोग करना आसान होता है। हालांकि, चूंकि सुसंस्कृत कोशिकाएं अक्सर कुछ विभाजित कोशिकाओं को बनाए रखती हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि सेल चक्र गिरफ्तारी को प्रेरित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीके कोशिकाओं से त्रुटि को कम करने के लिए यथासंभव समरूप प्रतिक्रिया उत्पन्न करते हैं जो अभी भी फैल रहे हैं। पीएसएलसी का उपयोग करके साइकिल चलाने वाली कोशिकाओं के लिए प्रोटीन गिरावट दर की गणना करने के लिए उस दर की क्षतिपूर्ति करने के लिए अतिरिक्त गणना की आवश्यकता होती है जिस पर प्रोटीन को बेटी कोशिकाओं में पतला किया जाता है27। हालांकि, quiescent विकास की गिरफ्तारी ही जटिलताओं के बिना नहीं है। सेल चक्र गिरफ्तारी के लिए दो सामान्य तरीके हैं: सीरम अभाव और संपर्क निषेध48। संपर्क निषेध के माध्यम से सभी कोशिकाओं को क्विसेंट नहीं बनाया जा सकता है, हालांकि कुछ फाइब्रोब्लास्ट्स को कई दिनों के बाद क्विसेंस का प्रदर्शन करने के लिए दिखाया गयाहै। इस विधि ने सीरम अभाव का उपयोग किया क्योंकि यह आमतौर पर सेनेसेंट कोशिकाओं की तुलना के लिए उपयोग किया जाता है, हालांकि इसे सटीक तुलना के लिए समान रूप से सीरम-वंचित होने की आवश्यकता होती है। सीरम एमटीओआर कॉम्प्लेक्स को सक्रिय करता है, और इस प्रकार सीरम अभाव में सेल चक्र गिरफ्तारी50 के अलावा सेल पर कई डाउनस्ट्रीम प्रभाव होते हैं। विशेष रूप से, सेनेसेंट कोशिकाओं को सीरम अभाव या एमटीओआर निषेध51,52 पर कम एसएएसपी प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है।

पीएसआईएलएसी में विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि परीक्षण करने के लिए कितने समय अंक हैं। इस प्रोटोकॉल ने एक ही समय बिंदु (हल्के या भारी लेबलिंग के 3 दिनों) पर कोशिकाओं को एकत्र किया, जो परिणामी विश्लेषण को काफी हद तक सरल बनाता है। समय बिंदु का चयन प्रयोग के उद्देश्य पर आधारित होना चाहिए। वैश्विक विश्लेषण के लिए, 3 दिनों से अधिकांश प्रोटीन पर कब्जा करने की उम्मीद है, हालांकि अल्पकालिक प्रोटीन के लिए आधे जीवन जो 3 दिनों के भीतर पूरी तरह से कारोबार करते हैं (सभी प्रकाश संकेत खो जाते हैं) को इस समय बिंदु पर मापा नहीं जा सकता है। इसके विपरीत, 3 दिनों में बहुत कम टर्नओवर वाले लंबे समय तक रहने वाले प्रोटीन को भी मापना मुश्किल होता है और अक्सर बेहद बड़े आधे जीवन (हफ्तों के क्रम में) होने के रूप में दिखाई देते हैं जो आमतौर पर बहुत कम भारी सिग्नल संचय का परिणाम होते हैं। भारी और हल्के पेप्टाइड संकेतों के अनुपात में गैर-रैखिक संबंध के कारण कम और लंबे समय तक नए संश्लेषित प्रोटीन के प्रतिशत बनाम, अतिरिक्त लेबलिंग समय बिंदुओं को जोड़कर आधे जीवन की मात्रा में सुधार किया जा सकता है। दो सेल राज्यों के बीच सापेक्ष तुलना के लिए, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में, एक अनुमानित आधा जीवन पर्याप्त हो सकता है, लेकिन मात्रात्मक सटीकता में सुधार के लिए अतिरिक्त टाइमपॉइंट का उपयोग किया जा सकता है।

यह प्रोटोकॉल वर्णन करता है कि प्रोटीन टर्नओवर का एक अनलक्षित डीडीए-आधारित विश्लेषण कैसे किया जाए। हालांकि, प्रोटीन टर्नओवर गणना को आम तौर पर किसी भी अधिग्रहण योजना पर लागू किया जा सकता है जो भारी और हल्के पेप्टाइड जोड़े की सापेक्ष बहुतायत प्राप्त करने में सक्षम है। उदाहरण के लिए, MS2-आधारित विधियों जैसे डेटा-स्वतंत्र अधिग्रहण (DIA/SWATH) को टर्नओवर दरों की गणना के लिए सफलतापूर्वक53 भी लागू किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रोटोकॉल में वर्णित उपकरणों के अलावा अन्य इंस्ट्रूमेंटेशन और सॉफ़्टवेयर पाइपलाइनों का उपयोग डीडीए विश्लेषण, प्रोटीन पहचान और प्रोटीन परिमाणीकरण करने के लिए किया जा सकता है। पेप्टाइड पीक क्षेत्रों को निकालने के लिए स्काईलाइन जैसे प्रोटीन परिमाणीकरण सॉफ़्टवेयर प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करते समय, दस्तावेज़ कार्यक्षेत्र में निकाले गए आयन क्रोमैटोग्राम का मैन्युअल रूप से निरीक्षण करने, उन चोटियों की पहचान करने की सलाह दी जाती है जो गलती से एकीकृत और गैर-मात्रात्मक चोटियों की पहचान करते थे, और तदनुसार दस्तावेज़ को क्यूरेट करते हैं। ट्यूटोरियल का एक व्यापक संग्रह स्काईलाइन (skyline.ms) के लिए ऑनलाइन उपलब्ध है।

pSILAC बेहतर मल्टीप्लेक्सिंग (proteome कवरेज) और थ्रूपुट के कारण सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन आधे जीवन के वैश्विक परिमाणीकरण के लिए सबसे आदर्श तरीकों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है। जबकि pSILAC संश्लेषण या गिरावट की प्रत्यक्ष दर प्रदान नहीं करता है, क्योंकि हल्के और भारी संकेत में परिवर्तन कारकों के संगम के कारण होता है, pSILAC स्थितियों और विभिन्न सेल प्रकारों के बीच तुलना के लिए अत्यधिक उपयोगी है। कम-थ्रूपुट विधियां अक्सर दो प्रकारों में आती हैं: 1) प्रोटीन संश्लेषण को अवरुद्ध करने के लिए साइक्लोहेक्सिमाइड के साथ कोशिकाओं का उपचार और क्षय की निगरानी के अलावा समय अंतराल पर फसल, या 2) प्रोटीन क्षय के अवरोधक के साथ कोशिकाओं का उपचार और प्रोटीन के संचय की निगरानी करने के लिए समय अंतराल पर फसल, इस प्रकार प्रोटीन क्षय दर का अनुमान लगाया जाता है। दोनों विधियों की सीमा यह है कि इस तरह के उपचार अनिवार्य रूप से सेलुलर फिजियोलॉजी में पर्याप्त परिवर्तन का कारण बनेंगे। इसके विपरीत, pSILAC को कोई पर्याप्त हस्तक्षेप की आवश्यकता नहीं होती है और सैद्धांतिक रूप से सेलुलर फिजियोलॉजी पर कोई पता लगाने योग्य प्रभाव नहीं पड़ता है क्योंकि आइसोटोपिक अमीनो एसिड अपने गैर-आइसोटोपिक समकक्षों से केवल एक न्यूट्रॉन से भिन्न होते हैं। इस प्रकार, पीएसएलसी के लिए यहां वर्णित विधि गैर-विभाजित कोशिकाओं में सबसे अधिक शारीरिक प्रोटीन आधे जीवन के वैश्विक माप के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करती है।

प्रोटीन टर्नओवर में परिवर्तन उम्र बढ़ने, उम्र से संबंधित बीमारियों, न्यूरोडीजेनेरेशन और दीर्घायु54,55 के लिए घनिष्ठ संबंध है। यह प्रोटोकॉल सेनेसेंस कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों को मापने के लिए सेल संस्कृति में अमीनो एसिड के स्थिर आइसोटोप लेबलिंग का उपयोग करके इन संबंधों से पूछताछ करने की एक विधि का वर्णन करता है। हालांकि, चूहों जैसे पूरे जीवों में विवो में उम्र बढ़ने और न्यूरोडीजेनेरेशन के संदर्भ में अध्ययन करने के लिए कई अनुरूप तरीके मौजूद हैं। दरअसल, इन अध्ययनों ने उम्र से संबंधित बीमारियों 56,57,58,59 के संदर्भ में प्रोटीन टर्नओवर दर को मापने के महत्व पर जोर दिया है।

इस अध्ययन में, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में रहने वाले राइबोसोमल प्रोटीन और प्रोटीन क्रमशः सेनेसेंट कोशिकाओं में कम और बढ़े हुए आधे जीवन के साथ प्रोटीन की दो श्रेणियों के रूप में खड़े थे। जबकि निश्चित निष्कर्षों के लिए स्थिर-राज्य स्तरों के आगे के विश्लेषण की आवश्यकता होती है, इन परिणामों से आगे पता चलता है कि सेनेसेंट कोशिकाएं राइबोसोमल प्रोटीन के आधे जीवन में कमी के माध्यम से विशिष्ट रूप से अनुवाद को विनियमित कर सकती हैं। आगे बढ़ते हुए, माउस मॉडल में विवो में सेलुलर सेनेसेंस और न्यूरोडीजेनेरेशन के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए स्थिर आइसोटोप लेबलिंग दृष्टिकोण को लागू करना इस प्रोटोकॉल द्वारा वर्णित आइसोटोप लेबलिंग दृष्टिकोण का एक आशाजनक विस्तार होगा।

Disclosures

लेखकों के पास कोई खुलासा नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ (एनआईएच) और इंट्राम्यूरल रिसर्च प्रोग्राम (आईआरपी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑन एजिंग (एनआईए) द्वारा समर्थित किया गया था। एन.बी. दीर्घायु प्रोत्साहन अनुदान, और आहार की खुराक (ओडीएस) विद्वानों के कार्यक्रम के कार्यालय द्वारा समर्थित था। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetonitrile (LC-MS grade) Grainger AH015
Ammonium Bicarbonate Millipore-Sigma 9830
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermoFisher 15240062
BCA Assay Kit ThermoFisher 23227
Dithiothreotol (DTT) Sigma D9779
DMEM, high glucose, HEPES ThermoFisher 12430112
dNTP Mix ThermoFisher R0191
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated ThermoFisher 10082147
Formic Acid Sigma 27001
Gammacel 40 Exactor Best Theratronics Cesium Irradiator for cells
GlycoBlue ThermoFisher AM2238
Iodoacetamide (IAA) Sigma I1149 Light sensitive
IMR-90 primary lung fibroblasts ATCC CCL-186
iRT Kit (indexed retention time) Biognosys Ki-3002-2 Indexed Retention Time Peptide Standards
Isopropanol ThermoFisher 423835000
Mascot Matrix Science Mascot Daemon 2.8 Proteomic database searching software
Maxima Reverse Transcritase (200 U/µL) ThermoFisher EP0742
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) ThermoFisher 11140050
Nano LC System ThermoFisher ULTIM3000RSLCNANO
Oasis HLB Solid Phase Extraction Cartirdges Waters 186000383
Orbitrap Mass Spectrometer ThermoFisher Q Exactive HF Orbitrap
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0 ThermoFisher 327110025
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher 10010023
Pierce SILAC Protein Quantitation Kit (Trypsin) -DMEM ThermoFisher A33972
QuantStudio 6 Real-Time PCR System ThermoFisher
Random Hexamer Primer ThermoFisher SO142
Senescence β-Galactosidase Staining Kit Cell Signaling 9860
Skyline University of Washington Skyline-Daily v21.2.1.424 Free and open source qantiative proteomic software. Available on www.skyline.ms
Sonicator waterbath Branson CPX-952-516R
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018 Referred to as phenol in text; hazardous
TRYPle Express ThermoFisher 12605010
Trypsin (sequencing grade) Promega V5113
TURBO Dnase (2U/ uL) ThermoFisher AM2238
Urea ThermoFisher 29700
Water (LC-MS grade) Grainger AH365

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मेटाबोलिक लेबलिंग और मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ सेनेसेंट और गैर-विभाजित सुसंस्कृत कोशिकाओं में प्रोटीन टर्नओवर दरों का मापन
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Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N.… More

Payea, M., Gorospe, M., Basisty, N. Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (182), e63835, doi:10.3791/63835 (2022).

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