Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 لقياس التوافر البيولوجي للحديد الغذائي

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63859
Automatic Translation
1
1United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Robert Holley Center for Agriculture and Health

Summary

يمثل الفحص الحيوي لخلايا Caco-2 للتوافر البيولوجي للحديد (Fe) نهجا فعالا من حيث التكلفة ومتعدد الاستخدامات لتقييم التوافر البيولوجي للحديد من الأطعمة والمنتجات الغذائية والمكملات الغذائية والوجبات وحتى أنظمة النظام الغذائي. تم التحقق من صحته بدقة للدراسات البشرية ، وهو يمثل أحدث ما توصلت إليه دراسات التوافر البيولوجي Fe.

Abstract

معرفة التوافر البيولوجي Fe أمر بالغ الأهمية لتقييم الجودة الغذائية للFe في الأطعمة. في الجسم الحي ، يكون قياس التوافر البيولوجي ل Fe محدودا بالتكلفة والإنتاجية والمحاذير المتأصلة في وضع العلامات النظيرية للأغذية Fe. وبالتالي، هناك حاجة ماسة إلى نهج يتسم بالإنتاجية العالية والفعالية من حيث التكلفة. تم تطوير المقايسة الحيوية لخلية Caco-2 لتلبية هذه الحاجة. يستخدم الفحص الحيوي لخلية Caco-2 للتوافر البيولوجي Fe محاكاة الهضم المعدي والمعوي إلى جانب زراعة خط الخلايا الظهارية المعوية البشرية المعروف باسم Caco-2. في خلايا Caco-2 ، يحفز امتصاص Fe التكوين داخل الخلايا للفيريتين ، وهو بروتين تخزين Fe يمكن قياسه بسهولة بواسطة مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). أشكال الفيريتين بما يتناسب مع امتصاص Fe ؛ وبالتالي ، من خلال قياس إنتاج الفيريتين في خلايا Caco-2 ، يمكن للمرء تقييم امتصاص Fe المعوي من هضم الطعام المحاكي إلى الخلايا المعوية.

من خلال هذا النهج ، يكرر النموذج الخطوة الأولية الرئيسية التي تحدد التوافر البيولوجي للفيب الغذائي. منذ إنشائه في عام 1998 ، تمت مقارنة هذا النهج النموذجي بدقة بالعوامل المعروفة بتأثيرها على التوافر البيولوجي البشري للفي. علاوة على ذلك ، تم تطبيقه في دراسات موازية ، مع ثلاث دراسات للفعالية البشرية لتقييم المحاصيل المدعمة بيولوجيا Fe. في جميع الحالات ، تنبأت المقايسة الحيوية بشكل صحيح بالكميات النسبية من التوافر البيولوجي Fe من العوامل والمحاصيل والنظام الغذائي العام. تقدم هذه الورقة طرقا مفصلة حول زراعة خلايا Caco-2 إلى جانب عملية الهضم في المختبر وخلية الفيريتين ELISA اللازمة لإجراء المقايسة الحيوية لخلية Caco-2 للتوافر البيولوجي Fe.

Introduction

لفهم الحاجة البحثية والاستفادة من المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 للتوافر البيولوجي Fe بشكل كامل ، يجب على المرء أولا فهم النهج التي كانت موجودة قبل ظهور هذا النموذج. يعد قياس التوافر البيولوجي للFe من طعام أو وجبة في الجسم الحي مهمة صعبة ، خاصة عندما تحتاج مجموعات من الطعام إلى تقييمها في وجبة أو نظام غذائي. كان وضع العلامات النظيرية هو النهج الأكثر شيوعا لقياس التوافر البيولوجي للFe على مدى السنوات ال 50 الماضية1. يستخدم وضع العلامات النظيرية للدراسات ذات الوجبة الواحدة والوجبات المتعددة وهو غير عملي للدراسات طويلة الأجل. النظائر المستقرة من Fe مثل 57Fe و 58Fe هي الأكثر استخداما. ومع ذلك ، فقد أجريت دراسات على النظائر المشعة مثل 59Fe ، باستخدام عد الجسم كله2. بالنسبة للأغذية النباتية ، تم وضع العلامات النظيرية عن طريق وضع العلامات الخارجية أو الداخلية. لوضع العلامات الخارجية ، تتم إضافة كمية معروفة من النظائر إلى الطعام أو الوجبة. ثم يتم خلط الطعام ، ويتم دمج فترة توازن 15-30 دقيقة في البروتوكول قبل الاستهلاك. الثقافة المائية - إضافة النظير إلى محلول المغذيات لدمجه في النبات أثناء نموه وتطوره - مطلوب لوضع العلامات الجوهرية على الأطعمة النباتية. وترد أدناه مناقشة لإيجابيات وسلبيات كل نهج.

وضع العلامات النظيرية الخارجية
في أوائل إلى منتصف 1970s ، تمت دراسة امتصاص Fe البشري عن طريق وضع العلامات الخارجية على Fe في الأطعمة ، حيث تتم إضافة كمية معروفة من النظائر إلى الكمية المعروفة من Fe في الطعام أو الوجبة ، مختلطة ، ومتوازنة لمدة 15-30 دقيقة قبل القياسات. تم استخدام كميات مختلفة من النظائر الخارجية ، تتراوح من 1٪ إلى 100٪ من Fe الجوهري ، ولكن الأكثر شيوعا في حدود 7٪ -30٪ 3. يعتمد وضع العلامات الخارجية على افتراض أن نظير Fe الخارجي يحصل على توازن كامل مع Fe الجوهري للطعام أو الوجبة. ثم يتم قياس امتصاص النظائر الخارجية، ويتم حساب كل ذرة من النظير الخارجي لتمثيل عدد معين من ذرات Fe الجوهرية. يعتمد هذا الحساب على الكميات المولية النسبية. في عام 1983 ، تم تلخيص دراسات التحقق المتعددة من صحة التقنية في ورقة مراجعة4. تم التحقق من صحة التقنية عن طريق مقارنة النسبة المئوية لامتصاص الملصق النظيري الخارجي في وقت واحد مع النسبة المئوية لامتصاص الملصق النظيري الداخلي. وبالتالي ، فإن نسبة الامتصاص الخارجي إلى الامتصاص الداخلي بالقرب من 1 تشير إلى أن كل تجمع من Fe تم امتصاصه بالتساوي. في ذلك الوقت ، اعتبرت نسبة قريبة من 1 أيضا أنها تمثل توازن النظير الخارجي مع Fe الجوهري للطعام أو الوجبة. وتراوحت نسب امتصاص الحديد الخارجي إلى الجوهري بين القيم المتوسطة من 0.40 إلى 1.62، مع متوسط نسبة (±SD) من 1.08 ± 0.14 في 63 مقارنة. من المهم ملاحظة أنه في جميع الدراسات الملخصة في هذه المراجعة ، لم يختبر أي منها بشكل مباشر توازن التسمية الخارجية مع Fe الجوهري. باختصار ، خلص مؤلفو المراجعة إلى ما يلي:

"أثبتت تقنية العلامة الخارجية أنها صالحة للعديد من الأطعمة في ظل ظروف تجريبية معينة. ولكن ، لا يمكن اعتبار هذه الطريقة مثبتة فيما يتعلق بجميع أنواع الأطعمة. طريقة العلامة الخارجية ليست مناسبة لمراقبة امتصاص الحديد من نظام غذائي يحتوي على أشكال غير قابلة للذوبان من الحديد. تعتمد صحة هذه التقنية على الافتراض الأساسي بأن العلامة الخارجية تتبادل تماما مع جميع حديد الطعام غير الهيم الداخلي. في الوقت الحاضر ، من غير المعروف كيف يتم تصنيف الأشكال المختلفة للحديد غير الهيم بالكامل بواسطة علامة خارجية. هذا مهم في ضوء الدراسات التي اقترحت أن مثبطات الحديد قد تؤثر على العلامة الخارجية بشكل مختلف عن بعض أشكال الحديد غير الهيم في الأطعمة. البحوث حول العوامل الغذائية التي يمكن أن تضعف التبادل الكامل للنظائر ضئيلة. وبالتالي ، فإن تفسير بيانات التوافر البيولوجي من أبحاث العلامات الخارجية يتطلب النظر في مثبطات التبادل التي قد تكون موجودة في الطعام أو النظام الغذائي. "

منذ عام 1983 ، تم نشر دراستين فقط قيمتا دقة وضع العلامات الخارجية ل Fe 3,5. وفي كلتا الدراستين، تمت مقارنة توازن الملصق النظيري الخارجي مباشرة مع الحديد الجوهري للأغذية، والتي كانت، في هاتين الدراستين، محاصيل غذائية أساسية. تم اختبار أصناف الفاصوليا البيضاء والحمراء والسوداء ، إلى جانب العدس والذرة. باستخدام تقنيات الهضم المختبرية الراسخة وقياس قابلية ذوبان الحديد وهطول الأمطار ، أظهرت كلتا الدراستين أن وضع العلامات النظيرية الخارجية لا يؤدي باستمرار إلى التوازن الكامل ، مع وجود أدلة على أنه بالنسبة لبعض أنواع الفاصوليا ، يمكن أن يكون سوء التوازن مرتفعا جدا اعتمادا على كمية النظائر الخارجية ولون معطف البذور3. على الرغم من استنتاجات ورقة المراجعة لعام 1983 ، استمرت دراسات وضع العلامات الخارجية للفاصوليا6،7،8،9،10،11،12. لم تتضمن أي من هذه الدراسات اختبار توازن الملصق الخارجي مع Fe الداخلي.

وضع العلامات الجوهرية
إن وضع العلامات الجوهرية للأغذية النباتية لتقييم التوافر البيولوجي للFe يلغي قضايا الدقة المتعلقة بالتوازن في وضع العلامات الخارجية. ومع ذلك ، لا يمكن لهذا النهج أن يسفر عن كميات كبيرة من المواد بسبب الحاجة إلى مساحة الدفيئة للزراعة المائية. الزراعة المائية كثيفة العمالة ، وتتطلب كمية عالية من النظائر المستقرة باهظة الثمن ، وغالبا ما تؤدي إلى نمو النبات بشكل مختلف من حيث الغلة وتركيز Fe البذور. نظرا للتكلفة ، فإن وضع العلامات الجوهرية مناسب فقط للدراسات الصغيرة التي تهدف إلى فهم الآليات الكامنة وراء امتصاص Fe أو العوامل التي تؤثر على امتصاص Fe من الأطعمة. يكلف إنتاج 1-2 كجم من محصول غذائي أساسي حوالي 20،000-30،000 دولار للمواد وحدها ، اعتمادا على النظائر والنهج المائي13،14.

وبالنظر إلى التحديات المرتبطة بوضع العلامات النظيرية، سعى الباحثون إلى وضع نهج في المختبر. استخدمت الطرق المبكرة محاكاة الغذاء المعدي والمعوي ، إلى جانب قياس قابلية ذوبان الحديد أو قابلية اللالة Fe كتقدير للتوافر البيولوجي15. وسرعان ما وجدت هذه الدراسات أن قابلية التحلل بالالحديد لم تكن مقياسا ثابتا للتوافر البيولوجي لأن الحديد يمكن أن يكون قابلا للذوبان ومرتبطا بإحكام بالمركبات، وبالتالي غير قابل للتبادل، مما يؤدي إلى المبالغة في تقدير التوافر البيولوجي. لمعالجة هذه القضايا ، تطورت منهجية استخدام خط الخلايا المعوية البشرية ، وبالتالي إضافة عنصر حي وتمكين قياس امتصاص Fe16. نشأت الخلايا المعوية البشرية - خلايا Caco-2 - من سرطان القولون البشري وتم استخدامها على نطاق واسع في دراسات امتصاص المغذيات. هذا الخط الخلوي مفيد لأنه في الثقافة ، تتمايز الخلايا إلى خلايا معوية تعمل بشكل مشابه لخلايا حدود الفرشاة في الأمعاء الدقيقة. وقد أظهرت الدراسات أن خلايا Caco-2 تظهر الناقلات المناسبة والاستجابة للعوامل التي تؤثر على امتصاص Fe17,18.

تم تنقيح الدراسات الأولية ، باستخدام النظائر المشعة لقياس امتصاص Fe في خلايا Caco-2 ، لقياس امتصاص Fe بناء على تكوين الفيريتين في خلية Caco-2. وأدى قياس الفيريتين الخلوي Caco-2 إلى تعزيز إنتاجية العينات ونفي قضايا مناولة النظائر المشعة وتوازن Fe الخارجي مع Fe19,20 الداخلي. مكن قياس امتصاص Fe عن طريق تكوين الفيريتين الباحثين من دراسة مجموعة واسعة من الأطعمة ، بما في ذلك الوجبات المعقدة21. وبالتالي ، فإن محاكاة الهضم (في المختبر) إلى جانب امتصاص Fe لخلية Caco-2 قدمت تقييما فسيولوجيا أفضل لامتصاص Fe من الأطعمة. من المهم ملاحظة أن هذا النموذج يحدد في المقام الأول الاختلافات النسبية في التوافر البيولوجي Fe. مثل العديد من خطوط الخلايا المفيدة ، أظهرت خلايا Caco-2 أيضا تباينا في الاستجابة ولكنها حافظت على اختلافات نسبية متسقة في امتصاص Fe بين الأطعمة. يمكن للتقنية المناسبة والاهتمام الدقيق بالتفاصيل تحسين استجابة تكوين الفيريتين الخلوية المتسقة في خلايا Caco-2.

يعرف نموذج الهضم في المختبر / خلية Caco-2 أيضا باسم الفحص الحيوي لخلية Caco-2. تم التحقق من صحة هذا الفحص بدقة من خلال المقارنة المباشرة مع الدراسات البشرية والحيوانية22. بالإضافة إلى المقارنة المتوازية المباشرة للفحص الحيوي مع تجارب الفعالية البشرية ، فقد ثبت أن هذا النموذج يظهر استجابة مماثلة نوعيا في امتصاص Fe لتلك الموجودة لدى البشر18،19،23. لذلك ، كنهج في المختبر ، فإن الفحص الحيوي لخلية Caco-2 يضمن مصداقية عالية كأداة فحص لتقييم تغذية Fe من الأطعمة. وقد تم تطبيقه على نطاق واسع على العديد من الأطعمة والمنتجات الغذائية21،24،25،26،27،28.

منذ إنشائها في عام 1998 ، طورت المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 مجال تغذية Fe لأنها ساعدت في تحديد العوامل التي تؤثر على امتصاص Fe المعوي. ومن خلال القيام بذلك، طور هذا النموذج وصقل أهدافا بحثية لإجراء دراسات بشرية أكثر تحديدا وأقل تكلفة. يمكن للمرء أيضا أن يجادل بأن استخدام النموذج ينفي الحاجة إلى بعض التجارب البشرية.

باختصار ، يمكن قياس التسليم النسبي ل Fe من طعام أو وجبة باستخدام الفحص الحيوي لخلية Caco-2. بغض النظر عن كمية Fe في وجبة الاختبار ، تحدد المقايسة الحيوية الكمية النسبية من Fe التي يتم تناولها في الخلايا المعوية - الخطوة الأولى من عملية الامتصاص. هذه هي الخطوة الأكثر أهمية في تعريف التوافر البيولوجي للFe ، حيث أن الهدف في معظم الأحيان هو القياس بقصد تحسين أو ، على الأقل ، مراقبة الجودة الغذائية ل Fe في الطعام. بالنظر إلى أن حالة الحديد يتم تنظيمها عن طريق الامتصاص ، وبالتالي يتم تنظيم امتصاص Fe في الأفراد الذين يعانون من نقص Fe لتلبية الاحتياجات الغذائية ، تم تصميم الشروط القياسية للنموذج بحيث يكون امتصاص Fe من قبل الخلايا هو الحد الأقصى. وبهذه الطريقة ، توفر المقايسة الحيوية مقياسا حقيقيا لإمكانات الطعام لتوصيل Fe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: كنقطة مرجعية ملائمة للقراء، تصف المنهجية التالية ظروف الاستزراع المحددة والمواد اللازمة لقياس التوافر البيولوجي للFe من 20 عينة تجريبية، بالإضافة إلى ضوابط الجودة المطلوبة، في جولة من الفحص البيولوجي. لا ينصح بزيادة عدد العينات بما يتجاوز هذه القدرة بسبب الوقت اللازم لزراعة الخلايا المختلفة وخطوات الهضم في المختبر داخل الفحص الحيوي.

1. اختيار كمية العينات

  1. بالنسبة للأطعمة الصلبة أو السائلة ، حدد كمية الطعام التي يمكن اعتبارها ممثلة للعينة المراد اختبارها.
    1. في اختبار التوافر البيولوجي Fe من مجموعة متنوعة من الفاصوليا ، استخدم 100-150 جم من بذور الفاصوليا وقم بمعالجة هذه الكمية إلى عينة متجانسة.
    2. بالنسبة للعينات السائلة مثل العصائر المدعمة ومنتجات الحليب والمشروبات الرياضية ، تأكد من خلط الطعام جيدا قبل أخذ العينات.
      ملاحظة: كمية مادة بذور الفاصوليا المذكورة أعلاه ضرورية لحساب الاختلافات المتأصلة بين بذور هذا المحصول الأساسي.

2. إعداد العينات

  1. شطف التربة والغبار من أي عينة طعام بالماء المقطر منزوع الأيونات قبل المعالجة.
  2. معالجة الكمية المناسبة من العينة وفقا للأهداف التجريبية ، مثل طريقة الطهي والطحن.
    ملاحظة: بالنسبة للطهي والمعالجة، من الأهمية بمكان استخدام أدوات الطهي والمعدات التي لا تشكل مصدرا محتملا للملوثات Fe. معدات الفولاذ المقاوم للصدأ لا تلوث ؛ ومع ذلك ، فإن معدات مثل مطاحن الطحن الحجرية ، وأدوات الطهي المصنوعة من الحديد الزهر ، وأي معدات غير من الفولاذ المقاوم للصدأ تحتوي على Fe يمكن أن تضيف كميات كبيرة من Fe الملوثات. غالبا ما تكون مطحنة القهوة القياسية المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ كافية للطحن.
  3. التجفيد وطحن إلى مسحوق متجانس.
    ملاحظة: بمجرد تجانسها ، أظهرت الأبحاث أن ثلاثة تكرارات مستقلة للتحليل كافية لكل طعام يتم قياسه.
    1. إذا كان من الصعب تحقيق تجانس العينة، فقم بمراجعة صياغة المنتج أو معالجته. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، فأضف النسخ المتماثلة إذا لم يكن عدم التجانس شديدا.
    2. بالنسبة لمعظم الأطعمة الصلبة المتجانسة ، استخدم 0.5 جم من العينة المجففة بالتجميد لكل نسخة متماثلة. إذا لزم الأمر ، استخدم ما يصل إلى 1.0 جم من العينة لكل نسخة متماثلة ، ولكن تحقق مما إذا كان أكثر من 0.5 جم يحقق فائدة في درجة الاستجابة.
      ملاحظة: كميات أعلى من 0.5 غرام من الأطعمة الصلبة قد تسد غشاء غسيل الكلى (انظر أدناه).
    3. استخدم 1-2 مل من العينات السائلة.
      ملاحظة: غالبا ما يكون التجفيد غير ضروري للعينات السائلة.

3. زراعة خلايا كاكو-2

  1. ثقافات الأسهم
    1. احصل على خلايا Caco-2 من مورد معتمد.
    2. استزرع الخلايا من قوارير المخزون عند 37 درجة مئوية في حاضنة ذات غلاف جوي هوائي 5٪ من ثاني أكسيد الكربون 2 (رطوبة ثابتة) باستخدام وسيط النسر المعدل من دولبيكو (DMEM) مع 25 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني7.2 ) ، و 10٪ (v / v) مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية الفطرية.
    3. بمجرد توفر خلايا كافية ، عادة بعد 7-10 أيام من الزراعة ، قم بزرع الخلايا في قوارير غير مغلفة بالكولاجين بكثافة 30000 خلية / سم2.
    4. اختر حجم القارورة اعتمادا على عدد الخلايا المتاحة واللازمة لبذر ألواح متعددة الآبار.
      ملاحظة: بشكل عام ، تعمل قوارير T225 (225 سم 2) بشكل أفضل للتجارب حيث يتم استخدام 11 لوحة متعددة الآبار (6 آبار ؛ 9.66 سم2 / بئر) (10 لوحات لمقارنات العينات ، لوحة واحدة لضوابط الجودة) لكل فحص حيوي.
    5. تنمو الخلايا في قوارير لمدة 7 أيام ، وتغيير الوسط كل يوم ، واستخدامهافي اليوم السابع لبذر لوحات متعددة الآبار.
      ملاحظة: يوصى باستخدام نطاق مرور لا يزيد عن 10-15 مقطعا من وقت بدء الخلايا من مزرعة المخزون واستخدامها لاحقا في سلسلة من التجارب. يجب أن تكون ممرات زراعة الخلايا محدودة لأن مجموعة واسعة من الممرات يمكن أن تؤدي إلى تغييرات تكيفية في خط الخلية ، وبالتالي ، التباين في استجابة النموذج.
  2. زراعة الخلايا على لوحات متعددة الآبار
    1. زرع خلايا Caco-2 بكثافة 50000 خلية / سم2 في ألواح مغلفة بالكولاجين من 6 آبار.
      ملاحظة: عادة ما تعمل هذه الخطوة بشكل أفضل إذا تم تنفيذها يوم الأربعاء. ستوضح الخطوات التالية سبب كون هذا اليوم من الأسبوع هو الأمثل.
    2. تنمو الخلايا لمدة 12 يوما عند 37 درجة مئوية في حاضنة ذات جو جوي هوائي 5٪ CO 2 (رطوبة ثابتة) باستخدام DMEM مكمل ب 25 mM HEPES (الرقم الهيدروجيني7.2 ) ، و 10٪ (v / v) FBS ، و 1٪ محلول مضاد للفطريات الحيوية.
      ملاحظة: يمكن أن يؤدي زراعة الطبقات الأحادية للخلية لفترة أطول من 12 يوما إلى فرط نمو الخلية. أظهرت الأبحاث السابقة بوضوح أنه في ظل هذه الظروف ، في 12 يوما بعد البذر ، تكون الطبقة الأحادية للخلية ناضجة ، متصلة جيدا باللوحة ، ومثالية في اتساق الاستجابة29،30،31. يؤدي نمو الخلايا لفترة أطول ، مثل ما يصل إلى 19-21 يوما ، إلى فرط نمو الخلايا ، وتستنفد الوسائط بسرعة في العناصر الغذائية ، مما يؤدي إلى طبقات أحادية غير صحية.
    3. خلال فترة 12 يوما ، قم بتغيير الوسيط على الأقل كل يومين وفقا لجدول يومي ثابت.
    4. في اليوم الثانيعشر بعد البذر ، استبدل وسط الاستزراع ب 2 مل من الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM [الرقم الهيدروجيني 7]) المكمل بأنابيب 10 mM (piperazine-N ، N'-bis-[2-ethanesulfonic acid]) ، محلول مضاد للفطريات مضاد للمضادات الحيوية بنسبة 1٪ ، هيدروكورتيزون (4 مجم / لتر) ، الأنسولين (5 مجم / لتر) ، السيلينيوم (5 ميكروغرام / لتر) ، ثلاثي يودوثيرونين (34 ميكروغرام / لتر) ، وعامل نمو البشرة (20 ميكروغرام / لتر).
      ملاحظة: إذا بدأ البذر يوم الأربعاء ،فسيكون اليوم 12 يوم الاثنين.
    5. في اليوم التالي (أي اليوم 13) ، قم بإزالة MEM واستبدله ب 1 مل من MEM (الرقم الهيدروجيني 7).
      ملاحظة: ستحدث هذه الخطوة يوم الثلاثاء. هذا هو اليوم الذي يبدأ فيه الفحص البيولوجي. وبالتالي ، فإن جدول ال 13 يوما يعطي ميزة جدول أسبوعي ثابت ، مما يسمح بإجراء الفحص الحيوي باستمرار في نفس يوم الأسبوع.

4. الهضم في المختبر

  1. إعداد حلقات الإدراج
    1. قم بإنشاء حلقة إدراج معقمة باستخدام حلقة O من السيليكون مزودة بغشاء غسيل الكلى المغسول بالأحماض (الشكل 1A).
      ملاحظة: قم بإعداد إدخالات 1 يوم مقدما (أي الاثنين ، اليوم 12) من يوم الفحص الحيوي وتخزينها في 18 MΩ ماء عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للاستخدام.
    2. في يوم الفحص الحيوي (الثلاثاء ، اليوم 13) ، قم بإزالة الإدخالات من الثلاجة ، واستنزافها ، واستبدل الماء ب 0.5 M HCl. اتركه في درجة حرارة الغرفة في غطاء تدفق صفائحي لمدة 1 ساعة على الأقل قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يجب القيام بهذه الخطوة قبل إزالة MEM من لوحات الثقافة. يعمل الغسيل الحمضي للغشاء على إزالة Fe الملوث المحتمل وتعقيم حلقة الإدراج والغشاء.
    3. يصفى 0.5 M HCl من الإدخالات ويشطف بالماء المعقم 18 MΩ. يخزن في ماء معقم 18 MΩ في درجة حرارة الغرفة في غطاء تدفق صفحي حتى يصبح جاهزا للاستخدام.
    4. أدخل حلقة في كل بئر من لوحات 6 آبار مع خلايا Caco-2 ، وبالتالي إنشاء نظام من غرفتين. أعد الألواح مع الإدخالات إلى الحاضنة.
      ملاحظة: يجب أن تتم هذه الخطوة مباشرة بعد إضافة 1.0 مل من MEM الطازج إلى كل بئر (انظر الخطوة 3.2.5).
  2. تحضير محلول البيبسين
    1. في يوم التجربة ، قم بإعداد محلول البيبسين عن طريق إذابة 0.145 جم من البيبسين في 50 مل من 0.1 M HCl. هز المحلول بلطف على شاكر المنصة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تحضير محلول البنكرياس الصفراوي
    1. في نفس يوم التجربة ، قم بإعداد 0.1 M NaHCO 3 عن طريق إذابة 2.1 جم من NaHCO3 في 250 مل من ماء 18 MΩ.
    2. مزيج 0.35 غرام من البنكرياس و 2.1 غرام من مستخلص الصفراء في 175 مل من 0.1 م NaHCO3.
    3. بمجرد ذوبان البنكرياس ومستخلص الصفراء ، أضف 87.5 جم من راتنج تبادل الكاتيون الضعيف (انظر جدول المواد) واخلطه عن طريق الاهتزاز لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. صب الطين في عمود كبير وجمع التوضيح.
    5. قم بإخراج العمود ب 70 مل إضافية من 0.1 M NaHCO3 ، وجمع هذا الحجم في محلول الصفراء البنكرياتين.
      ملاحظة: الغرض من الراتنج هو إزالة الملوثات Fe الموجودة عادة في مستخلصات البنكرياس الصفراوي.
  4. بدء الهضم في المختبر .
    1. قم بوزن العينة في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 50 مل (بولي بروبيلين) ، متبوعا بإضافة 10 مل من المياه المالحة الفسيولوجية عند الرقم الهيدروجيني 2 ، تحتوي على 140 mM NaCl و 5 mM KCl.
    2. ابدأ عملية هضم المعدة بإضافة 0.5 مل من محلول البيبسين الخنزير المحضر إلى العينة واحتضنه على شاكر هزاز في وضع منخفض ولطيف لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. بعد هذه الفترة ، ابدأ عملية الهضم المعوي لكل عينة عن طريق ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5.5-6.0 مع 1.0 M NaHCO3.
    4. أضف 2.5 مل من محلول البنكرياس الصفراوي إلى كل أنبوب عينة واضبط الرقم الهيدروجيني إلى 6.9-7.0 مع 1.0 M NaHCO3.
    5. بمجرد ضبط الرقم الهيدروجيني ، قم بمعادلة الحجم في كل أنبوب باستخدام محلول 140 mM NaCl ، 5 mM KCl (الرقم الهيدروجيني 6.7) ، وقياس وزن الأنبوب بقيمة مستهدفة تبلغ 15 جم.
      ملاحظة: بالنسبة لبعض الأطعمة ، قد يحتاج المرء إلى رفع الحجم الإجمالي إلى 16 جم أو 17 جم ، اعتمادا على سعة التخزين المؤقت للأطعمة.
    6. نقل 1.5 مل من كل هضم معوي إلى الغرفة العلوية (أي التي تحتوي على حلقة الإدراج مع غشاء غسيل الكلى) لبئر مقابل لصفيحة الثقافة المكونة من 6 آبار تحتوي على خلايا Caco-2 (الشكل 1B).
    7. استبدل غطاء اللوحة واحتضنها عند 37 درجة مئوية (5٪ CO 2 الغلاف الجوي الجوي) على شاكر هزاز عند 6 تذبذبات / دقيقة لمدة2 ساعة.
    8. قم بإزالة حلقة الإدراج مع الملخص وأضف 1 مل إضافي من MEM (الرقم الهيدروجيني 7) إلى كل بئر.
    9. أعد لوحة زراعة الخلايا إلى الحاضنة (37 درجة مئوية ؛ 5٪ CO2 الغلاف الجوي الهوائي) لمدة 22 ساعة إضافية.
    10. بعد 22 ساعة ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا وإضافة 2.0 مل من ماء 18 MΩ إلى الطبقة الأحادية للخلية.
      ملاحظة: سيقوم الماء بتحليل الخلايا بشكل تناضحي.
    11. قم بحصاد الخلية بأكملها في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة القياسية من البولي بروبيلين أو ما شابه ذلك لتحليلات بروتين الخلية والفيريتين الخلوي اللاحقة.

5. قياس فيريتين خلية كاكو-2 وبروتين الخلية

  1. استخدم محلل الخلايا من الخطوة 4.4.10. لقياس الفيريتين الخلوي والبروتين.
    1. لقياس محتوى الفيريتين في خلايا Caco-2 ، اتبع تعليمات المجموعة (انظر جدول المواد) ، باستثناء زيادة وقت الحضانة من 30 دقيقة إلى 2 ساعة لاقتران البيروكسيديز المضاد للأجسام المضادة للفيريتين والفجل (HRP).
    2. لقياس بروتين الخلية، اتبع التعليمات الواردة في مجموعة بروتين الخلية (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تحديد وقياس التوافر البيولوجي للFe في المحاصيل الغذائية الأساسية
وكان أحد الأسباب الرئيسية لتطوير هذا النموذج هو تحديد العوامل التي تؤثر على التوافر البيولوجي للFe في المحاصيل الغذائية الأساسية وتوفير أداة لمربي النباتات من شأنها أن تمكنهم من تحديد وتطوير الأصناف ذات التوافر البيولوجي المعزز للفي. وقد استهدفت الفاصوليا الشائعة (Phaseolus vulgaris) على الصعيد العالمي كمحصول للتحصين البيولوجي للفي؛ وبالتالي ، تم تطبيق النموذج على نطاق واسع لتقييم الجودة الغذائية ل Fe في مجموعة واسعة من فئات سوق الفاصوليا وبرامج تربية الفاصوليا. على سبيل المثال ، الفاصوليا الصفراء هي فئة الأسواق الناشئة في الولايات المتحدة. في مناطق مثل شرق أفريقيا ، تحظى بشعبية كبيرة ومن المعروف على نطاق واسع أنها سريعة الطهي ويعتبرها الكثيرون "سهلة الهضم". وقد أظهرت الدراسات الحديثة التي أجريت باستخدام المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 أن أنواعا معينة من الفاصوليا الصفراء يمكن أن يكون لها توافر بيولوجي مرتفع للFe مقارنة بفئات الألوان الأخرى (الشكل 2). في هذه الدراسة ، تم تحديد أصناف Manteca على أنها عالية في التوافر البيولوجي Fe بالنسبة للضوابط المرجعية لفئات الألوان البيضاء والحمراء. علاوة على ذلك ، كانت النتائج متسقة عبر عامين متتاليين من الحصاد. وهذه المقارنات ببساطة غير مجدية في النماذج الأخرى، ولا سيما في النماذج الحية ، بسبب التكلفة العالية والإنتاجية المنخفضة بكثير للتجارب الحيوانية والبشرية.

تقييم آثار تجهيز الأغذية على التوافر البيولوجي للفيب
يمكن أيضا تطبيق المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 لتقييم تأثيرات معالجة الأغذية على التوافر البيولوجي Fe. على سبيل المثال ، النتائج الواردة في الشكل 3 هي من تحليل الفاصوليا والمعكرونة القائمة على الفاصوليا من فئات ألوان متعددة. توضح النتائج كيف أن معالجة الفاصوليا في دقيق زادت من التوافر البيولوجي للFe من أصناف الفاصوليا البيضاء (سنودون ، ألبينا ، والساموراي) والصفراء (Canario). بالنسبة لأصناف التوت البري (إتنا) والكلى الحمراء (الصقر الأحمر) والأسود (الذروة) ، انخفض التوافر البيولوجي للFe في مستحضرات دقيق المعكرونة. أظهرت التحليلات ذات الصلة أن معالجة الفاصوليا في دقيق تعطل جدران خلايا النبتة في الفاصوليا ، مما يجعل Fe داخل الخلايا في متناول الامتصاص. زاد امتصاص الحديد في معكرونة الفاصوليا البيضاء والصفراء لأن معاطف البذور من هذه الأصناف لم تحتوي على مركبات البوليفينول التي تمنع التوافر البيولوجي للفي. في المقابل ، تحتوي معاطف بذور التوت البري والكلى الحمراء والفاصوليا السوداء على مستويات عالية من البوليفينول المثبط ، مما يقلل من امتصاص Fe. تشير هذه النتائج بوضوح إلى فائدة النموذج في الكشف عن العوامل التي يمكن أن تؤثر على الجودة الغذائية ل Fe ، والتي لولاها لما تم اكتشافها.

Figure 1
الشكل 1: أدخل إعداد الحلقة لامتصاص Fe لخلية Caco-2. (A) صورة لخلايا Caco-2 وأدخل حلقة مع غشاء غسيل الكلى المرفق. (ب) رسم تخطيطي للإجراء العام للهضم في المختبر إلى جانب امتصاص Fe لخلية Caco-2 داخل بئر واحد من الصفيحة متعددة الآبار. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: درجات التوافر البيولوجي للحديد من الأنماط الوراثية للبذور الكاملة غير المنقوعة والمطبوخة في مجموعة متنوعة من الفاصوليا الصفراء. (أ) موسم الحقل 2015 ؛ (ب) الموسم الميداني 2016. القيم هي وسائل (الانحراف المعياري) للقياسات الثلاثية من اثنين من تكرارات الحقل لكل نمط وراثي (n = 6). يتم تصنيف الأنماط الجينية على المحور X حسب فئة الطهي ، مرتبة من النمط الوراثي الأسرع للطهي إلى أبطأ دخول للطهي. * درجة التوافر البيولوجي للحديد أقل بكثير (p < 0.05) من إدخالات YBP الأخرى. ** أعلى بكثير (p < 0.05) درجات التوافر البيولوجي للحديد من الأنماط الوراثية YBP الأخرى. تم تعديل هذا الرقم من32. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التوافر الأحيائي للحديد معبرا عنه بتكوين فيريتين خلية كاكو-2 (نانوغرام من الفيريتين لكل ملليغرام من بروتين الخلية) من أصناف الفاصوليا والسباغيتات القائمة على الفاصوليا المقابلة لها. (أ) ثلاثة أنواع من الفاصوليا البيضاء والسباغيتات القائمة على الفاصوليا المقابلة لها. (ب) أربعة أنواع من الفاصوليا الملونة وما يقابلها من معكرونة قائمة على الفول. القيم هي الوسيلة (± الانحراف المعياري) لستة قياسات من كل صنف. يشير الخط الأزرق الواصلة إلى التوافر البيولوجي للحديد لمعكرونة القمح القاسي غير المدعمة التي يتم قذفها وطهيها ومعالجتها بنفس طريقة السباغيتي القائمة على الفول. * بشكل ملحوظ (ص ≤ 0.05) أعلى تكوين فيريتين خلية كاكو-2 من الفاصوليا الكاملة بعد الطهي. ** بشكل ملحوظ (ص ≤ 0.05) انخفاض تكوين فيريتين خلية كاكو-2 من الفاصوليا الكاملة بعد الطهي. تم تعديل هذا الرقم من33. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

منذ إنشائها ، تم نشر العديد من الدراسات التي تصف هذه الطريقة للفحص الحيوي لخلية Caco-2. وظلت الظروف الأساسية دون تغيير نسبيا منذ النشر الأولي في عام 199818. ومع ذلك ، على مدى السنوات ال 20 الماضية ، تم تنقيح العديد من التفاصيل التقنية وتوحيدها لتحقيق اتساق غير مسبوق في استجابة الفحص البيولوجي. إن الالتزام الدقيق والدقيق بزراعة الخلايا وظروف الهضم في المختبر هي مفتاح الاستجابة المتسقة والحساسة للفحص الحيوي.

من تجربتنا في تدريب العديد من الأفراد على استخدام هذه الطريقة ، فإن النضال الأكثر شيوعا هو الثقافة المناسبة لخلايا Caco-2. تعد الثقافة المتسقة للطبقات الأحادية الصحية مفتاحا لطبقات أحادية الخلايا Caco-2 الصحية والمستجيبة. إذا لم تكن مستويات البروتين الخلوي متسقة للغاية من بئر إلى بئر وليس ضمن نطاق بروتين الخلية المدرج في البروتوكول ، فيجب على الباحث إعادة النظر في ظروف زراعة الخلايا للانحراف عن البروتوكول. بدلا من ذلك ، قد يكون هناك تلوث منخفض المستوى للكائنات الحية الدقيقة ، أو قد لا تعمل حاضنة زراعة الخلايا بشكل صحيح ، أو قد لا يتم صياغة وسط زراعة الخلايا بشكل صحيح.

عملية الهضم في المختبر هي مصدر آخر للمشاكل المحتملة. إزالة الملوثات Fe من الإنزيمات الهضمية أمر بالغ الأهمية. على الرغم من ادعاءات الشركة المصنعة ، من الحكمة التحقق بشكل دوري من تركيز Fe للإنزيمات والتأكد من أن عملية إزالة Fe (انظر البروتوكول) فعالة. إذا كان تلوث الحديد موجودا في الإنزيمات الهضمية ، فإن مراقبة جودة الهضم الأساسية ستنتج قيم فيريتين خلوية تزيد عن النطاق الموصى به.

يجب أن يكون الباحث المتمرس والمدرب قادرا على تحليل 20 عينة تجريبية ، بالإضافة إلى ضوابط الجودة ، في تشغيل واحد من الفحص الحيوي. وبالتالي ، هناك حاجة إلى ما يقرب من 12 لوحة من ستة آبار لكل تشغيل للفحص الحيوي. لا ينصح بأعداد أكبر من العينات لكل فحص حيوي لأن توقيت معايرة الأس الهيدروجيني أثناء عملية الهضم يمكن أن يكون طويلا جدا ، مما يؤدي إلى عدم اتساق محتمل بين أوقات هضم العينة.

عيوب هذا النموذج قليلة نسبيا. وهو يتطلب محققين يتمتعون بمهارات عالية في زراعة الخلايا وقادرين على الاهتمام الدقيق بالتفاصيل والبروتوكول. يجب أن تكون مساحة المختبر نظيفة من مصادر تلوث Fe ، ويجب مراقبة الكواشف والمواد الأخرى بشكل روتيني بحثا عن تلوث Fe. وبالتالي ، يجب أن يكون لدى المستخدم القدرة أو الوصول إلى الأجهزة لقياس تركيز Fe. هذا النموذج هو مجرد مقياس نسبي أو شبه كمي. ومع ذلك ، مع الاستخدام السليم للضوابط المرجعية ، يمكن للنموذج توفير بعض التقديرات الكمية لامتصاص الحديد. في الواقع ، تم إنشاء معادلة تحويل لنسب امتصاص التحكم مقابل مواد الاختبار19.

يعمل الفحص الحيوي وفقا للمبدأ التالي: تنتج خلايا Caco-2 المزيد من بروتين الفيريتين استجابة للزيادات في تركيزات Fe الخلوية. لذلك ، يتناسب التوافر البيولوجي Fe مع الزيادة في إنتاج الفيريتين الخلوي Caco-2. يتم التعبير عن هذه الزيادة كنسبة من فيريتين الخلية إلى إجمالي بروتين خلية Caco-2 (نانوجرام من الفيريتين لكل ملليغرام من بروتين الخلية الكلي) بعد التعرض لعينة مهضومة19. يتم إجراء قياسات الفيريتين باستخدام مجموعة ELISA (انظر جدول المواد) التي تم اختبارها للاستجابة في هذا الفحص الحيوي. يتم تحديد تركيزات بروتين الخلية الكلية باستخدام مجموعة فحص البروتين. كما ذكرنا سابقا ، في ظل الظروف المستخدمة لهذه الطريقة ، تتراوح مستويات بروتين خلايا Caco-2 النموذجية في لوحة من ستة آبار من 2.0 ملغ إلى 2.6 ملغ من بروتين الخلية لكل بئر. تشير القيم خارج هذا النطاق إلى مزارع الخلايا غير الصحية ، أو فرط النمو المحتمل للخلايا ، أو تقنية بذر الخلايا الضعيفة. خلال فترة معينة من الفحص الحيوي ، يجب أن تختلف القيم فقط حتى 0.2 ملغ لكل بئر. علاوة على ذلك ، في ظل كثافات البذر وظروف الاستزراع المستخدمة في هذه المنهجية ، هناك نشاط إنزيم كبير لحدود الفرشاة في 13 يوما بعد البذر ، مما يشير إلى نضج معظم ، إن لم يكن كل ، الطبقة الأحادية الخلية28،29،30. راقب الطبقات الأحادية للخلية طوال ال 13 يوما السابقة للاستخدام للتلوث أو الإجهاد ، مثل تكوين الفجوة أو الفجوات في تكوين الطبقة الأحادية. إذا كانت هذه الشروط واضحة ، فلا ينبغي اعتبار الخلايا صالحة للاستخدام في الفحص الحيوي.

لمراقبة استجابة الفحص الحيوي Caco-2 ، يجب تشغيل كل تجربة بالعديد من ضوابط الجودة ، بما في ذلك هضم فارغ ، يحتوي فقط على محلول ملحي متوازن فسيولوجيا وإنزيمات الجهاز الهضمي. تضمن هذه الضوابط عدم وجود تلوث Fe في الفحص الحيوي. تتراوح قيم الفيريتين لخلايا Caco-2 المعرضة للهضم الفارغ عادة من 1 نانوغرام إلى 6 نانوغرام من بروتين خلية الفيريتين / ملغ. يشير الفيريتين الأساسي في هذا النطاق أيضا إلى أن الخلايا في حالة Fe منخفضة نسبيا ، وبالتالي ، يجب أن تظهر حساسية قصوى للFe المتاحة.

بالنسبة للسنوات ال 15 الأولى من الاستخدام ، شملت ضوابط الجودة الإضافية 1) هضم فارغ مع FeCl 3 (66 ميكرومتر) و 2) هضم فارغ من FeCl 3 (66 ميكرومتر) بالإضافة إلى إضافة حمض الأسكوربيك1.3 مللي متر. كانت قيم الفيريتين لهضم FeCl 3 عادة في حدود 30-50 نانوغرام من بروتين خلية الفيريتين / ملغ ، وكان هضم FeCl3 مع حمض الأسكوربيك في حدود 250-400 نانوغرام من بروتين خلية الفيريتين / ملغ. وفي السنوات الأخيرة، ظل الخلاصة الفارغة تشكل مراقبة للجودة؛ ومع ذلك ، فقد تحولنا إلى استخدام عينة طعام مع وبدون حمض الأسكوربيك بنسبة 20: 1 ، ascorbate: Fe. كانت عينة الطعام المستخدمة عبارة عن دقيق الفاصوليا البيضاء الذي يحتوي على حوالي 65 ميكروغرام Fe / g من العينة. تعطي ضوابط الجودة هذه نطاقا أضيق وأكثر اتساقا من الاستجابة ، مما ينتج عنه 20-30 نانوغرام من الفيريتين / ملغ من بروتين الخلية لدقيق الفاصوليا البيضاء و 70-150 نانوغرام من الفيريتين / ملغ من بروتين الخلية لدقيق الفاصوليا البيضاء بالإضافة إلى الأسكوربات. وتجدر الإشارة إلى أن النطاق الجديد للقيم مأخوذ من المجموعة المشار إليها في جدول المواد، والتي تميل إلى أن تكون أقل قليلا من مجموعة Ramco ELISA التي توقفت الآن. اعتبارا من نشر هذه المخطوطة ، تم الحصول على 2-3 أشهر فقط من البيانات باستخدام المجموعة المشار إليها.

من المهم التعرف على النتائج وظروف زراعة الخلايا التي تشير إلى تشغيل غير صالح أو دون المستوى الأمثل للفحص الحيوي. أولا ، كما هو مذكور في الطرق ، إذا كانت ظروف الهضم الفارغة تنتج تركيزات فيريتين للخلية أعلى من النطاق المقترح ، فقد يكون هذا مؤشرا على تلوث Fe لوسائط زراعة الخلايا أو الإنزيمات الهضمية أو غشاء غسيل الكلى. تركيزات Fe المقبولة لوسائط زراعة الخلايا والإنزيمات الهضمية هي <20 ميكروغرام Fe / mL. وتشير القيم الخارجة عن نطاق ضوابط الجودة الأخرى، ولا سيما إذا كانت على الجانب المنخفض، إلى أن صحة النتائج مشكوك فيها.

باختصار ، هذا النموذج حساس للغاية ل Fe المتاح بيولوجيا ، حيث تم تصميم ظروف زراعة الخلايا لإنشاء خلايا ذات حالة Fe منخفضة. وبالتالي ، فإن آلياتها لامتصاص Fe منظمة للغاية. إنه نموذج قوي قادر على الإنتاجية العالية. يمكن تقييم أي طعام أو نظام غذائي يمكن إطعامه للبشر في هذا النموذج ، وبالتالي ، فإن الفحص الحيوي له مجموعة واسعة من التطبيقات. يمكن لمربي النباتات استخدام هذا النموذج لقياس التوافر البيولوجي للFe في الأطعمة الأساسية ، وتحديد السمات والمناطق الكروموسومية التي تؤثر على التوافر البيولوجي Fe. يمكن لعلماء الأغذية تطبيق النموذج لتحديد التركيبات المثلى وتقييم آثار المعالجة لضمان التوافر البيولوجي الكافي للفي. يمكن لخبراء التغذية استخدام النموذج لتقييم ومراقبة التوافر البيولوجي الغذائي للFe من الأطعمة الفردية ، ومجموعات الطعام ، وحتى خطط النظام الغذائي. وقد تم التحقق من صحته بدقة للتجارب البشرية ، والتنبؤ بشكل صحيح باتجاه وحجم الآثار في كل تطبيق. وبالتالي ، من خلال الجمع بين الهضم المحاكي وامتصاص Fe للخلايا الظهارية المعوية ، يمثل هذا النموذج الخطوة الأولى الحاسمة في عملية امتصاص Fe ، وبالتالي فهو قادر على التنبؤ بتوصيل Fe أو توافره البيولوجي من الأطعمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحب البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويعرب المؤلف عن امتنانه العميق للجهود التقنية التي بذلها يونغبي تشانغ وماري بوديس. التطبيق الناجح للغاية لهذا النموذج في مجال التغذية هو نتيجة مباشرة لخبرتهم واهتمامهم بالتفاصيل. تم تمويل تطوير هذا النموذج بالكامل من قبل وزارة الزراعة الأمريكية ، دائرة البحوث الزراعية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M HCl Fisher Scientific A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma Aldrich Co T6397
6-well plates Costar 3506 Use for bioassay experiments
ascorbic acid Sigma Aldrich Co A0278
bile extract Sigma Aldrich Co B8631
Caco-2 cells American Type Culture Collection HTB-37 HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225 Falcon  353138
Cell culture flasks T25 Corning 430639
Cell culture flasks T75 Corning 430641U
Chelex-100 Bio-Rad Laboratories Inc 142832 Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen Corning 354236
dialysis membrane Spectrum Laboratories Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Gibco 12100046 DMEM
epidermal growth factor Sigma Aldrich Co E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit Eagle Biosciences FRR31-K01
fetal bovine serum R&D Systems S12450 Optima
HEPES Sigma Aldrich Co H3375
Hydrocortisone-Water Soluble Sigma Aldrich Co H0396
insert ring Corning Costar not sold Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin Sigma Aldrich Co I2643
KCl Sigma Aldrich Co P9333
large column VWR International KT420400-1530
Minimum Essential Medium Gibco 41500034 MEM
NaCl Fisher Scientific S271
pancreatin Sigma Aldrich Co P1750
PIPES disodium salt Sigma Aldrich Co Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin Sigma Aldrich Co P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit Bio-Rad Laboratories Inc Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings Web Seal, Inc Rochester NY 2-215S500
sodium bicarbonate Fisher Scientific S233
Sodium selenite Sigma Aldrich Co S5261
ZellShield Minerva Biolabs 13-0050 Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
  2. Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
  3. Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
  4. Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
  5. Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
  6. Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
  7. Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
  8. Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
  9. Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
  10. Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
  11. Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
  12. Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
  13. Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
  14. Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
  15. Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
  16. Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
  17. Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
  18. Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
  19. Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
  20. Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
  21. Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
  22. Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
  23. Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
  24. Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
  25. Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
  26. Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
  27. Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
  28. Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
  29. Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
  30. Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
  31. Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
  32. Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
  33. Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).

Tags

علم الأحياء ، العدد 182 ،
المقايسة الحيوية لخلايا Caco-2 لقياس التوافر البيولوجي للحديد الغذائي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell… More

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability. J. Vis. Exp. (182), e63859, doi:10.3791/63859 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter