Summary
Demir (Fe) biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan, gıda ürünlerinden, takviyelerden, yemeklerden ve hatta diyet rejimlerinden Fe biyoyararlanımını değerlendirmek için uygun maliyetli ve çok yönlü bir yaklaşımı temsil eder. İnsan çalışmalarına tamamen doğrulanmış, Fe biyoyararlanımı çalışmaları için en son teknolojiyi temsil eder.
Abstract
Fe biyoyararlanımı bilgisi, gıdalardaki Fe'nin beslenme kalitesinin değerlendirilmesinde kritik öneme sahiptir. Fe biyoyararlanımının in vivo ölçümü, maliyet, verim ve Fe gıdasının izotopik etiketlenmesine özgü uyarılarla sınırlıdır. Bu nedenle, yüksek verimli ve uygun maliyetli bir yaklaşıma kritik bir ihtiyaç vardır. Caco-2 hücre biyotahlili bu ihtiyacı karşılamak için geliştirilmiştir. Fe biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlili, Caco-2 olarak bilinen bir insan bağırsak epitel hücre hattının kültürü ile birlikte simüle edilmiş gastrik ve bağırsak sindirimini kullanır. Kako-2 hücrelerinde, Fe alımı, enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile kolayca ölçülebilen bir Fe depolama proteini olan ferritinin hücre içi oluşumunu uyarır. Ferritin, Fe alımı ile orantılı olarak oluşur; Böylece, Caco-2 hücreli ferritin üretimini ölçerek, simüle edilmiş gıda sindirimlerinden enterosit içine bağırsak Fe alımı değerlendirilebilir.
Bu yaklaşımla, model gıda Fe biyoyararlanımını belirleyen temel ilk adımı çoğaltır. 1998'deki kuruluşundan bu yana, bu model yaklaşımı, insan Fe biyoyararlanımını etkilediği bilinen faktörlerle titizlikle karşılaştırılmıştır. Ayrıca, Fe biyofortifiye mahsulleri değerlendiren üç insan etkinliği çalışması ile paralel çalışmalarda uygulanmıştır. Her durumda, biyotahlil, faktörlerden, mahsullerden ve genel diyetten Fe biyoyararlanımının göreceli miktarlarını doğru bir şekilde tahmin etmiştir. Bu yazıda, Fe biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotahlilini yapmak için gerekli olan in vitro sindirim süreci ve hücre ferritin ELISA ile birlikte Caco-2 hücre kültürü hakkında ayrıntılı yöntemler sunulmaktadır.
Introduction
Fe biyoyararlanımı için Caco-2 hücre biyotestinin araştırma ihtiyacını ve yararını tam olarak anlamak için, önce bu modelin ortaya çıkmasından önce yürürlükte olan yaklaşımları anlamak gerekir. Bir gıdadan veya yemekten in vivo Fe biyoyararlanımının ölçülmesi, özellikle gıda kombinasyonlarının bir öğünde veya diyette değerlendirilmesi gerektiğinde zorlu bir iştir. İzotopik etiketleme, son 50 yılda Fe biyoyararlanımının ölçümü için en yaygın yaklaşım olmuştur1. İzotopik etiketleme, tek öğünlü ve çok öğünlü çalışmalar için kullanılır ve uzun süreli çalışmalar için pratik değildir. 57Fe ve 58Fe gibi kararlı Fe izotopları en yaygın kullanılanlardır; Bununla birlikte, 59Fe gibi radyoizotoplarla, tüm vücut sayımı2 kullanılarak çalışmalar yapılmıştır. Bitkisel gıdalar için, izotopik etiketleme dışsal veya içsel etiketleme yoluyla yapılmıştır. Dışsal etiketleme için, yiyeceğe veya yemeğe bilinen miktarda izotop eklenir. Gıda daha sonra karıştırılır ve tüketimden önce protokole 15-30 dakikalık bir denge süresi dahil edilir. Hidroponik kültür - izotopu, büyürken ve gelişirken bitkiye dahil etmek için besin çözeltisine eklemek - bitki besinlerinin içsel etiketlenmesi için gereklidir. Her yaklaşımın artıları ve eksileri aşağıda tartışılmaktadır.
Dışsal izotopik etiketleme
1970'lerin başından ortalarına kadar, insan Fe emilimi, gıdalarda Fe'nin dışsal etiketlenmesiyle incelendi; burada gıda veya öğündeki bilinen Fe miktarına bilinen miktarda izotop eklendi, karıştırıldı ve ölçümlerden önce 15-30 dakika boyunca dengelendi. İntrinsik Fe'nin% 1 ila% 100'ü arasında değişen, ancak en yaygın olarak% 7-% 30 aralığında olan çeşitli miktarlarda dışsal izotoplar kullanılmıştır3. Dışsal etiketleme, dışsal Fe izotopunun, gıda veya yemeğin içsel Fe'si ile tamamen dengelendiği varsayımına dayanır. Dışsal izotop absorpsiyonu daha sonra ölçülür ve dışsal izotopun her bir atomu, belirli sayıda içsel Fe atomunu temsil edecek şekilde hesaplanır. Bu hesaplama göreceli azı dişi miktarlarına dayanmaktadır. 1983 yılında, tekniğin çoklu validasyon çalışmaları bir derleme makalesinde özetlenmiştir4. Tekniğin doğrulanması, ekstrinsik izotopik etiketin emilim yüzdesini aynı anda içsel izotopik etiketin emilim yüzdesi ile karşılaştırarak yapıldı. Bu nedenle, dışsal ve içsel absorpsiyonun 1'e yakın bir oranı, her bir Fe havuzunun eşit olarak emildiğini göstermektedir. O zamanlar, 1'e yakın bir oranın dışsal izotopun yiyecek veya öğünün içsel Fe'si ile dengelenmesini temsil ettiği düşünülüyordu. Dışsal ve intrinsik Fe absorpsiyon oranları ortalama değerler 0.40 ila 1.62 arasında değişmekte olup, 63 karşılaştırmada ortalama (±SD) oranı 1.08 ± 0.14 olarak belirlenmiştir. Bu derlemede özetlenen tüm çalışmalarda, hiçbirinin dışsal etiketin içsel Fe ile dengesini doğrudan test etmediğini belirtmek önemlidir. Özetle, incelemenin yazarları aşağıdaki sonuca varmışlardır:
"Dışsal etiket tekniğinin, belirli deneysel koşullar altında birçok gıda için geçerli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak, bu yöntem henüz her türlü gıda ile ilgili olarak kanıtlanmış olarak kabul edilemez. Dışsal etiket yöntemi, çözünmeyen demir formları içeren bir diyetten demir emilimini izlemek için uygun değildir. Bu tekniğin geçerliliği, dışsal etiketin tüm endojen nonheme gıda demiri ile tamamen değiştiği temel varsayımına dayanır. Şu anda, farklı nonheme demir formlarının dışsal bir etiketle nasıl tamamen etiketlendiği bilinmemektedir. Bu, demir inhibitörlerinin dışsal etiketi gıdalardaki bazı nonheme demir formlarından farklı şekilde etkileyebileceğini öne süren çalışmalar ışığında önemlidir. Tam bir izotopik değişimi bozabilecek gıda faktörleri üzerine yapılan araştırmalar yetersizdir. Bu nedenle, dışsal etiket araştırmalarından elde edilen biyoyararlanım verilerinin yorumlanması, gıda veya diyette bulunabilecek değişim inhibitörlerinin dikkate alınmasını gerektirir. "
1983'ten bu yana, Fe 3,5'in dışsal etiketlemesinin doğruluğunu değerlendiren sadece iki çalışma yayınlanmıştır. Her iki çalışmada da, dışsal izotopik bir etiketin dengesi, bu çalışmalarda temel gıda bitkileri olan gıdaların içsel Fe'si ile doğrudan karşılaştırılmıştır. Beyaz, kırmızı ve siyah fasulye çeşitleri, mercimek ve mısır ile birlikte test edildi. Yerleşik in vitro sindirim tekniklerini ve Fe çözünürlüğü ve çökeltme ölçümünü kullanarak, her iki çalışma da dışsal izotopik etiketlemenin tutarlı bir şekilde tam denge ile sonuçlanmadığını, bazı fasulye çeşitleri için yanlış dengenin dışsal izotop miktarına ve tohum kabuğu rengine bağlı olarak çok yüksek olabileceğine dair kanıtlarla göstermiştir3. 1983 tarihli gözden geçirme makalesinin sonuçlarına rağmen, fasulyenin dışsal etiketleme çalışmaları 6,7,8,9,10,11,12 devam etmiştir. Bu çalışmaların hiçbiri, dışsal etiketin içsel Fe ile dengesini test etmeyi içermedi.
İçsel etiketleme
Fe biyoyararlanımının değerlendirilmesi için bitki gıdalarının içsel olarak etiketlenmesi, dışsal etiketlemede dengenin doğruluk sorunlarını ortadan kaldırır. Bununla birlikte, bu yaklaşım, hidroponik kültür için sera alanı gereksinimi nedeniyle büyük miktarda malzeme veremez. Hidroponik kültür emek yoğundur, yüksek miktarda pahalı kararlı izotop gerektirir ve genellikle verim ve tohum Fe konsantrasyonu açısından farklı bitki büyümesine neden olur. Maliyet nedeniyle, içsel etiketleme yalnızca Fe alımının altında yatan mekanizmaları veya gıdalardan Fe alımını etkileyen faktörleri anlamayı amaçlayan küçük ölçekli çalışmalar için uygundur. 1-2 kg temel gıda mahsulünün üretimi, izotop ve hidroponik yaklaşım13,14'e bağlı olarak, yalnızca malzemeler için yaklaşık 20.000-30.000 $ 'a mal olmaktadır.
İzotopik etiketleme ile ilgili zorluklar göz önüne alındığında, araştırmacılar in vitro yaklaşımlar geliştirmeye çalıştılar. Erken yöntemler, simüle edilmiş mide ve bağırsak gıdalarını kullandı ve biyoyararlanımın bir tahmini olarak Fe çözünürlüğü veya Fe diyalizbilitesinin ölçülmesi ile birleşti15. Bu tür çalışmalar hızlı bir şekilde, Fe diyalize edilebilirliğinin, Fe'nin çözünür olabileceği, bileşiklere sıkıca bağlanabileceği ve bu nedenle değiştirilemediği ve biyoyararlanımın abartılmasına yol açabileceği için tutarlı bir biyoyararlanım ölçüsü olmadığını bulmuştur. Bu sorunları ele almak için, bir insan bağırsak hücresi hattını kullanma metodolojisi gelişti, böylece canlı bir bileşen eklendi ve Fe alımının ölçülmesini sağladı16. İnsan bağırsak hücreleri - Kako-2 hücreleri - bir insan kolon karsinomundan kaynaklanmıştır ve besin alım çalışmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu hücre çizgisi, kültürde, hücreler ince bağırsağın fırça sınır hücrelerine benzer şekilde işlev gören enterositlere farklılaştığı için yararlıdır. Çalışmalar, Kako-2 hücrelerinin uygun taşıyıcıları ve Fe alımını etkileyen faktörlere yanıt verdiğini göstermiştir17,18.
Caco-2 hücrelerinde Fe alımını ölçmek için radyoizotopları kullanan ilk çalışmalar, Caco-2 hücresi ferritin oluşumuna dayanarak Fe alımını ölçmek için rafine edildi. Kako-2 hücreli ferritin ölçümü, numune verimini arttırdı ve radyoizotop işleme ve dışsal Fe'nin içsel Fe19,20 ile dengelenmesi sorunlarını reddetti. Ferritin oluşumu yoluyla Fe alımının ölçülmesi, araştırmacıların karmaşık yemekler de dahil olmak üzere çok çeşitli yiyecekleri incelemelerini sağladı21. Böylece, simüle edilmiş (in vitro) sindirim, Caco-2 hücresi Fe alımı ile birleştiğinde, gıdalardan Fe alımının daha iyi bir fizyolojik değerlendirmesini sağlamıştır. Bu modelin öncelikle Fe biyoyararlanımındaki göreceli farklılıkları belirlediğine dikkat etmek önemlidir. Birçok yararlı hücre hattı gibi, Caco-2 hücreleri de duyarlılıkta değişkenlik göstermiştir, ancak gıdalar arasındaki Fe alımında tutarlı göreceli farklılıklar sağlamıştır. Uygun teknik ve detaylara dikkat etmek, Caco-2 hücrelerinde tutarlı hücre ferritin oluşum yanıtını artırabilir.
In vitro sindirim / Caco-2 hücre modeli, Caco-2 hücre biyotahlili olarak da bilinir. Bu tahlil, insan ve hayvan çalışmaları ile doğrudan karşılaştırılarak tamamen doğrulanmıştır22. Biyotahlilin insan etkinliği denemeleriyle doğrudan paralel karşılaştırılmasına ek olarak, bu modelin Fe alımında 18,19,23 insanlarınkine nitel olarak benzer bir yanıt sergilediği gösterilmiştir. Bu nedenle, in vitro bir yaklaşım olarak, Caco-2 hücre biyotahlili, gıdalardan Fe beslenmesini değerlendirmek için bir tarama aracı olarak yüksek güvenilirliği garanti eder. Çok sayıda gıda ve gıda ürününe yaygın olarak uygulanmıştır 21,24,25,26,27,28.
1998'deki kuruluşundan bu yana, Caco-2 hücre biyotahlili, bağırsak Fe alımını etkileyen faktörlerin belirlenmesine yardımcı olduğu için Fe beslenme alanını geliştirmiştir. Bunu yaparken, bu model daha kesin ve daha az maliyetli insan çalışmaları için araştırma hedefleri geliştirmiş ve rafine etmiştir. Modelin kullanılmasının bazı insan denemelerine olan ihtiyacı ortadan kaldırdığı da iddia edilebilir.
Özetle, Fe'nin bir gıdadan veya yemekten göreceli olarak verilmesi, Caco-2 hücre biyotahlili ile ölçülebilir. Test yemeğindeki Fe miktarından bağımsız olarak, biyotahlil, enterosit içine alınan göreceli Fe miktarını tanımlar - emilim sürecinin ilk adımı. Bu, Fe biyoyararlanımını tanımlamadaki en önemli adımdır, çünkü çoğu zaman amaç, bir gıdadaki Fe'nin beslenme kalitesini iyileştirmek veya en azından izlemek amacıyla ölçmektir. Demir durumunun emilim ile düzenlendiği ve dolayısıyla Fe alımının Fe eksikliği olan bireylerde beslenme ihtiyaçlarını karşılamak için yukarı regüle edildiği göz önüne alındığında, modelin standart koşulları, hücreler tarafından Fe alımının maksimum olacağı şekilde tasarlanmıştır. Bu şekilde, biyotahlil, gıdanın Fe'yi sağlama potansiyelinin gerçek bir ölçüsünü sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: Okuyucular için uygun bir referans noktası olarak, aşağıdaki metodoloji, 20 deneysel numuneden Fe biyoyararlanımının ölçülmesi için gereken spesifik kültür koşullarını ve malzemelerini ve ayrıca biyotahlil kapsamında gerekli kalite kontrollerini açıklamaktadır. Bu kapasitenin ötesinde numune sayısının arttırılması, çeşitli hücre kültürü için gereken süre ve biyotahlildeki in vitro sindirim adımları nedeniyle önerilmez.
1. Numune miktarının seçilmesi
- Katı veya sıvı gıdalar için, test edilecek numuneyi temsil ettiği düşünülebilecek bir yiyecek miktarı belirleyin.
- Bir fasulye çeşidinden Fe biyoyararlanımını test ederken, 100-150 g fasulye tohumu kullanın ve bu miktarı homojen bir numuneye işleyin.
- Takviye edilmiş meyve suları, süt ürünleri ve spor içecekleri gibi sıvı numuneler için, numune almadan önce yiyeceğin iyice karıştırıldığından emin olun.
NOT: Yukarıda belirtilen fasulye tohumu materyalinin miktarı, bu temel mahsulün tohumları arasındaki doğal farklılıkları hesaba katmak için esastır.
2. Numunelerin hazırlanması
- İşlemden önce herhangi bir gıda numunesindeki toprağı ve tozu damıtılmış-deiyonize su ile durulayın.
- Pişirme yöntemi ve frezeleme gibi deneysel hedeflere göre uygun miktarda numuneyi işleyin.
NOT: Pişirme ve işleme için, potansiyel bir kirletici Fe kaynağı olmayan tencere ve ekipmanların kullanılması kritik öneme sahiptir. Paslanmaz çelik ekipman kirletmez; Bununla birlikte, taş değirmeni öğütücüler, dökme demir tencere ve Fe içeren paslanmaz çelik olmayan ekipmanlar gibi ekipmanlar önemli miktarda kirletici Fe ekleyebilir. Standart bir paslanmaz çelik kahve değirmeni genellikle taşlama için yeterlidir. - Liyofilize edin ve homojen bir toza öğütün.
NOT: Homojenleştirildikten sonra, araştırmalar ölçülen her gıda için üç bağımsız analiz kopyasının yeterli olduğunu göstermiştir.- Numune homojenliğinin sağlanması zorsa, ürünün formülasyonunu veya işlenmesini gözden geçirin. Bu mümkün değilse, homojenlik düzeyi ciddi değilse çoğaltmalar ekleyin.
- Çoğu homojen katı gıda için, replikasyon başına 0.5 g liyofilize numune kullanın. Gerekirse, çoğaltma başına 1,0 g'a kadar numune kullanın, ancak 0,5 g'dan fazlasının yanıt derecesinde bir fayda sağlayıp sağlamadığını kontrol edin.
NOT: 0,5 g katı gıdadan daha yüksek miktarlar diyaliz zarını tıkayabilir (aşağıya bakınız). - 1-2 mL sıvı numune kullanın.
NOT: Liyofilizasyon genellikle sıvı numuneler için gerekli değildir.
3. Kako-2 hücre kültürü
- Stok kültürleri
- Caco-2 hücrelerini sertifikalı bir tedarikçiden satın alın.
- 25 mM HEPES (pH 7.2),% 10 (v / v) fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) kullanarak% 5 CO2 hava atmosferine (sabit nem) sahip bir inkübatörde 37 ° C'de stok şişelerinden elde edilen hücreleri kültürleyin.
- Yeterli hücre mevcut olduğunda, genellikle 7-10 günlük kültürden sonra, hücreleri kollajen kaplı olmayan şişelerde 30.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın.
- Çok kuyulu plakaların tohumlanması için mevcut ve gerekli hücre sayısına bağlı olarak şişe boyutunu seçin.
NOT: Genel olarak, T225 (225 cm2) şişeler, biyotahlil başına 11 çok kuyulu (6 kuyulu; 9,66 cm2/kuyu) plakanın kullanıldığı deneyler için en iyi sonucu verir (numune karşılaştırmaları için 10 plaka, kalite kontrolleri için 1 plaka). - 7 gün boyunca şişelerde hücreleri büyütün, ortamı her gün değiştirin ve 7. günde çok kuyulu plakaları tohumlamak için kullanın.
NOT: Hücrelerin stok kültüründen başlatıldığı ve daha sonra bir dizi deneyde kullanıldığı zamandan itibaren 10-15 pasajdan fazla olmayan bir geçiş aralığının kullanılması önerilir. Hücre kültürü pasajları sınırlandırılmalıdır, çünkü geniş bir pasaj yelpazesi hücre hattında adaptif değişikliklere ve dolayısıyla modelin yanıtında değişkenliğe neden olabilir.
- Çok kuyulu plakalarda hücre kültürü
- Caco-2 hücrelerini 6 delikli kollajen kaplı plakalarda 50.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın.
NOT: Bu adım genellikle Çarşamba günü yapıldığında en iyi sonucu verir. Aşağıdaki adımlar, haftanın bu gününün neden en uygun olduğunu açıkça ortaya koyacaktır. - 25 mM HEPES (pH 7.2),% 10 (v / v) FBS ve% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ile desteklenmiş DMEM kullanarak% 5 CO2 hava atmosferine (sabit nem) sahip bir inkübatörde hücreleri 37 ° C'de 12 gün boyunca büyütün.
NOT: Hücre monokatmanlarının 12 günden daha uzun süre kültürlenmesi, hücre büyümesine neden olabilir. Önceki araştırmalar, bu koşullar altında, tohumlamadan sonraki 12 günde, hücre tek katmanının olgunlaştığını, plakaya iyi tutturulduğunu ve yanıt 29,30,31 tutarlılığında optimal olduğunu açıkça göstermiştir. Hücrelerin 19-21 güne kadar daha uzun süre büyütülmesi, hücre aşırı büyümesine neden olur ve ortam besinlerde hızla tükenir ve sağlıksız tek katmanlara neden olur. - 12 günlük süre boyunca, ortamı tutarlı bir günlük programda en az 2 günde bir değiştirin.
- Tohumlama sonrası 12. günde, kültür ortamını 10 mM BORULAR (piperazin-N, N'-bis-[2-etansülfonik asit],% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti, hidrokortizon (4 mg / L), insülin (5 mg / L), selenyum (5 μg / L), triiodotironin (34 μg / L) ve epidermal büyüme faktörü (20 μg / L) ile desteklenmiş 2 mL Minimum Esansiyel Ortam (MEM [pH 7]) ile değiştirin.
NOT: Tohumlama Çarşamba günü başlamışsa, 12. gün Pazartesi günü olacaktır. - Ertesi gün (yani, 13. gün), MEM'i çıkarın ve 1 mL MEM (pH 7) ile değiştirin.
NOT: Bu adım Salı günü gerçekleşir. Bu, biyotahlilin başladığı gündür; Böylece, 13 günlük program, biyotahlilin aynı hafta içi tutarlı bir şekilde yapılmasına izin veren tutarlı bir haftalık programın avantajını sağlar.
- Caco-2 hücrelerini 6 delikli kollajen kaplı plakalarda 50.000 hücre /cm2 yoğunlukta tohumlayın.
4. In vitro sindirim
- Kesici uç halkalarının hazırlanması
- Asitle yıkanmış diyaliz membranı ile donatılmış silikon bir O-ring kullanarak sterilize edilmiş bir kesici uç halkası oluşturun (Şekil 1A).
NOT: Ekleri biyotahlil gününden 1 gün önceden (yani Pazartesi, 12. gün) hazırlayın ve kullanıma hazır olana kadar 4 °C'de 18 MΩ suda saklayın. - Biyotahlil gününde (Salı, 13. gün), ekleri buzdolabından çıkarın, boşaltın ve suyu 0,5 M HCl ile değiştirin.
NOT: Bu adım, MEM'i kültür plakalarından çıkarmadan önce yapılmalıdır. Membranın asitle yıkanması, olası kirletici Fe'yi gidermeye yarar ve kesici uç halkasını ve membranı sterilize eder. - 0,5 M HCl'yi kesici uçlardan boşaltın ve steril 18 MΩ su ile durulayın. Steril 18 MΩ suda, kullanıma hazır olana kadar laminer bir davlumbazda oda sıcaklığında saklayın.
- Caco-2 hücreli 6 delikli plakaların her bir kuyucuğuna bir halka yerleştirin, böylece iki odacıklı bir sistem oluşturun. Plakaları eklerle birlikte inkübatöre iade edin.
NOT: Bu adım, her bir kuyucuğa taze 1,0 mL MEM eklendikten hemen sonra yapılmalıdır (bkz. Adım 3.2.5.).
- Asitle yıkanmış diyaliz membranı ile donatılmış silikon bir O-ring kullanarak sterilize edilmiş bir kesici uç halkası oluşturun (Şekil 1A).
- Pepsin çözeltisinin hazırlanması
- Deney gününde, 0.145 g pepsini 50 mL'lik 0.1 M HCl'de çözerek pepsin çözeltisini hazırlayın. çözeltiyi oda sıcaklığında 30 dakika boyunca bir platform çalkalayıcı üzerinde hafifçe çalkalayın.
- Pankreatin-safra çözeltisinin hazırlanması
- Deneyle aynı gün, 250 mL 18 MΩ suda 2.1 g NaHCO 3'üçözerek 0.1 M NaHCO3 hazırlayın.
- 0.35 g pankreatin ve 2.1 g safra ekstraktını 175 mL'lik 0.1 M NaHCO3'te karıştırın.
- Pankreatin ve safra ekstresi çözündükten sonra, 87.5 g zayıf bir katyon değişim reçinesi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayarak karıştırın.
- Bulamacı büyük bir sütuna dökün ve elüatı toplayın.
- Kolonu ek 70 mL 0.1 M NaHCO3 ile süzün ve bu hacmi pankreatin safra çözeltisine toplayın.
NOT: Reçinenin amacı, pankreatin-safra ekstraktlarında yaygın olarak bulunan kirletici Fe'yi uzaklaştırmaktır.
- İn vitro sindirimi başlatın.
- Numuneyi steril bir 50 mL santrifüj tüpünde (polipropilen) tartın, ardından pH 2'de 140 mM NaCl ve 5 mM KCl içeren 10 mL fizyolojik salin ilavesi yapın.
- Hazırlanan domuz pepsin çözeltisinin 0,5 mL'sini numuneye ekleyerek gastrik sindirim işlemini başlatın ve 37 ° C'de 1 saat boyunca düşük, yumuşak bir ayarda sallanan bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin.
- Bu süreyi takiben, pH'ı 1.0 M NaHCO3 ile 5.5-6.0'a ayarlayarak her numunenin bağırsak sindirim sürecini başlatın.
- Her numune tüpüne 2,5 mL pankreatin-safra çözeltisi ekleyin ve 1,0 M NaHCO3 ile pH'ı 6,9-7,0'a ayarlayın.
- pH ayarlandıktan sonra, 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7) çözeltisi kullanarak her tüpteki hacmi eşitleyin ve tüpün ağırlığını 15 g hedef değerle ölçün.
NOT: Bazı gıdalar için, gıdaların tamponlama kapasitesine bağlı olarak toplam hacmin 16 g veya 17 g'a getirilmesi gerekebilir. - Her bağırsak sindiriminin 1,5 mL'sini, Kako-2 hücrelerini içeren 6 delikli kültür plakasının karşılık gelen bir kuyucuğunun üst odasına (yani, diyaliz zarı ile ekleme halkasını içeren) aktarın (Şekil 1B).
- Plaka kapağını değiştirin ve 37 °C'de (% 5 CO 2 hava atmosferi)sallanan bir çalkalayıcıda 2 saat boyunca 6 salınım/dak'da inkübe edin.
- Kesici uç halkasını sindirimle birlikte çıkarın ve her bir oyuğa ilave 1 mL MEM (pH 7) ekleyin.
- Hücre kültürü plakasını inkübatöre (37 °C; % 5 CO2 hava atmosferi) 22 saat daha geri koyun.
- 22 saat sonra, hücre kültürü ortamını çıkarın ve hücre tek katmanına 2.0 mL 18 MΩ su ekleyin.
NOT: Su, hücreleri ozmotik olarak lize edecektir. - Tüm hücre lizatını standart polipropilen mikrosantrifüj tüplerine veya sonraki hücre proteini ve hücre ferritin analizleri için benzerlerine toplayın.
5. Kako-2 hücre ferritin ve hücre proteininin ölçümü
- Adım 4.4.10'daki lizat hücresini kullanın. hücre ferritin ve protein ölçümü için.
- Caco-2 hücrelerinin ferritin içeriğini ölçmek için, fare anti-ferritin antikoru-yaban turpu peroksidaz (HRP) konjugatı için kuluçka süresini 30 dakikadan 2 saate çıkarmak dışında, kitin talimatlarını izleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız).
- Hücre proteinini ölçmek için, hücre proteini kitinde verilen talimatları izleyin ( bkz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Temel gıda ürünlerinde Fe biyoyararlanımının tanımlanması ve ölçülmesi
Bu modelin geliştirilmesinin başlıca nedenlerinden biri, temel gıda ürünlerinde Fe biyoyararlanımını etkileyen faktörleri belirlemek ve bitki yetiştiricileri için gelişmiş Fe biyoyararlanımına sahip çeşitleri tanımlamalarını ve geliştirmelerini sağlayacak bir araç sağlamaktı. Ortak fasulye (Phaseolus vulgaris), Fe biyofortifikasyonu için bir ürün olarak küresel olarak hedeflenmiştir; Bu nedenle, model, Fe'nin beslenme kalitesini çok çeşitli fasulye pazarı sınıflarında ve fasulye ıslah programlarında değerlendirmek için kapsamlı bir şekilde uygulanmıştır. Örneğin, sarı fasulye Amerika Birleşik Devletleri'nde gelişmekte olan bir pazar sınıfıdır. Doğu Afrika gibi bölgelerde, oldukça popülerdirler ve yaygın olarak hızlı pişirildikleri bilinmektedir ve birçok kişi tarafından "sindirimi kolay" olarak kabul edilirler. Caco-2 hücre biyotahlili ile yapılan son çalışmalar, bazı sarı fasulye çeşitlerinin diğer renk sınıflarına göre yüksek Fe biyoyararlanımına sahip olabileceğini göstermiştir (Şekil 2). Bu çalışmada, Manteca çeşitlerinin, beyaz ve kırmızı benekli renk sınıflarının referans kontrollerine göre Fe biyoyararlanımında yüksek olduğu belirlenmiştir. Dahası, sonuçlar art arda iki hasat yılı boyunca tutarlıydı. Bu tür karşılaştırmalar, hayvan ve insan denemelerinin yüksek maliyeti ve çok daha düşük verimi nedeniyle diğer modellerde, özellikle de in vivo modellerde mümkün değildir.
Fe biyoyararlanımı üzerindeki gıda işleme etkilerinin değerlendirilmesi
Caco-2 hücre biyotahlili, Fe biyoyararlanımı üzerindeki gıda işleme etkilerini değerlendirmek için de uygulanabilir. Örneğin, Şekil 3'teki sonuçlar, birden fazla renk sınıfındaki fasulye ve fasulye bazlı makarnaların analizinden alınmıştır. Sonuçlar, fasulyelerin bir un haline getirilmesinin beyaz (Snowdon, Alpena ve Samuray) ve sarı (Canario) fasulye çeşitlerinden Fe biyoyararlanımını nasıl artırdığını göstermektedir. Kızılcık (Etna), kırmızı böbrek (Kızıl Şahin) ve siyah (Zenith) çeşitleri için, makarna unu preparatlarında Fe biyoyararlanımı azalmıştır. İlgili analizler, fasulyelerin bir un haline getirilmesinin, fasulyenin kotiledon hücre duvarlarını bozduğunu ve böylece hücre içi Fe'yi alım için erişilebilir hale getirdiğini göstermiştir. Beyaz ve sarı fasulyeli makarnalarda demir alımı artmıştır, çünkü bu çeşitlerin tohum katları Fe biyoyararlanımını inhibe eden polifenolik bileşikler içermemektedir. Buna karşılık, kızılcık, kırmızı böbrek ve siyah fasulyenin tohum katları yüksek düzeyde inhibitör polifenoller içerir, böylece Fe alımını azaltır. Bu sonuçlar, modelin Fe'nin beslenme kalitesini etkileyebilecek faktörleri ortaya çıkarmadaki yararlılığını açıkça göstermektedir, aksi takdirde tespit edilemeyecekti.
Şekil 1: Caco-2 hücresi Fe alımı için halka kurulumu ekleyin. (A) Caco-2 hücrelerinin görüntüsü ve bağlı diyaliz membranlı halka takın. (B) Çok kuyucuklu plakanın tek bir kuyucuğunda Caco-2 hücresi Fe alımı ile birlikte in vitro sindirim için genel prosedürün diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Çeşitli sarı fasulye panelinde ıslatılmamış ve pişmiş bütün tohum genotiplerinin demir biyoyararlanım skorları. (A) Tarla sezonu 2015; (B) saha sezonu 2016. Değerler, genotip başına iki alan replikasyonundan (n = 6) üçlü ölçümlerin ortalamalarıdır (standart sapma). Genotipler, en hızlı pişirme genotipinden en yavaş pişirme girişine kadar sıralanan pişirme sınıfına göre x ekseninde kategorize edilir. *Diğer YBP girişlerine göre anlamlı derecede düşük (p < 0.05) demir biyoyararlanım skorumu. **Diğer YBP genotiplerine göre anlamlı derecede daha yüksek (p < 0.05) demir biyoyararlanım skorları. Bu rakam32'den değiştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Fasulye çeşitlerinin ve bunlara karşılık gelen fasulye bazlı spagettilerin Caco-2 hücre ferritin oluşumu (hücre proteininin miligramı başına ferritin nanogramı) olarak ifade edilen demir biyoyararlanımı. (A) Üç beyaz fasulye çeşidi ve bunlara karşılık gelen fasulye bazlı spagettis; (B) Dört renkli fasulye çeşidi ve bunlara karşılık gelen fasulye bazlı spagetti. Değerler, her çeşitten altı ölçümün ortalamasıdır (standart sapma ±). Mavi tireli çizgi, fasulye bazlı spagettilerle aynı şekilde ekstrüde edilmiş, pişirilmiş ve işlenmiş takviye edilmemiş bir durum buğdayı makarna kontrolünün demir biyoyararlanımını gösterir. * Pişirme sonrası bütün fasulyeden anlamlı derecede (p ≤ 0.05) daha yüksek Kako-2 hücreli ferritin oluşumu. ** Pişirme sonrası tam fasulyeden önemli ölçüde (p ≤ 0.05) daha düşük Kako-2 hücreli ferritin oluşumu. Bu rakam33'ten değiştirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kuruluşundan bu yana, Caco-2 hücre biyotahlili için bu yöntemi tanımlayan çok sayıda çalışma yayınlanmıştır. Temel koşullar, 1998'deki ilk yayından bu yana nispeten değişmeden kalmıştır18. Bununla birlikte, son 20 yılda, biyotahlilin yanıtında benzeri görülmemiş bir tutarlılık sağlamak için çok sayıda teknik ayrıntı rafine edilmiş ve standartlaştırılmıştır. Hücre kültürüne ve in vitro sindirim koşullarına dikkatli ve hassas bir şekilde bağlılık, biyotahlilin tutarlı ve hassas tepkisinin anahtarıdır.
Bu yöntemin kullanımında çok sayıda bireyi eğitme konusundaki deneyimlerimizden, en yaygın mücadele Caco-2 hücrelerinin uygun kültürüdür. Sağlıklı tek katmanların tutarlı kültürü, sağlıklı ve duyarlı Caco-2 hücre tek katmanlarının anahtarıdır. Hücre proteini seviyeleri kuyudan kuyuya doğru yüksek oranda tutarlı değilse ve protokolde listelenen hücre proteini aralığında değilse, araştırmacı protokolden sapma için hücre kültürü koşullarını yeniden incelemelidir. Alternatif olarak, düşük seviyeli mikroorganizma kontaminasyonu mevcut olabilir, hücre kültürü inkübatörü düzgün çalışmayabilir veya hücre kültürü ortamı uygun şekilde formüle edilemeyebilir.
İn vitro sindirim süreci, potansiyel sorunların bir başka kaynağıdır. Kirletici Fe'nin sindirim enzimlerinden uzaklaştırılması kritik öneme sahiptir. Üretici iddialarına rağmen, enzimlerin Fe konsantrasyonunu periyodik olarak kontrol etmek ve Fe giderme işleminin (protokole bakınız) etkili olduğundan emin olmak akıllıca olacaktır. Sindirim enzimlerinde Fe kontaminasyonu varsa, temel sindirim kalite kontrolü, önerilen aralığın üzerinde hücre ferritin değerleri verecektir.
Deneyimli ve eğitimli bir araştırmacı, biyotahlilin tek bir çalışmasında 20 deneysel numuneyi ve kalite kontrollerini analiz edebilmelidir. Bu nedenle, biyotahlilin her çalışması için yaklaşık 12 altı kuyucuklu plakaya ihtiyaç vardır. Çürütme prosesi sırasında pH titrasyonu zamanlaması çok uzun olabileceğinden ve numune çürütme süreleri arasında potansiyel tutarsızlığa yol açabileceğinden, biyotahlil başına daha fazla sayıda numune önerilmemektedir.
Bu modelin dezavantajları nispeten azdır. Hücre kültüründe oldukça yetenekli olan ve detaylara ve protokole tam dikkat gösterebilen araştırmacılar gerektirir. Laboratuvar alanı Fe kontaminasyon kaynaklarından arındırılmalı ve reaktifler ve diğer malzemeler Fe kontaminasyonu açısından rutin olarak izlenmelidir. Bu nedenle, kullanıcı Fe konsantrasyonunun ölçümü için enstrümantasyona sahip olmalı veya erişebilmelidir. Bu model yalnızca göreceli veya yarı nicel bir ölçüdür. Bununla birlikte, referans kontrollerin doğru kullanımı ile model, Fe emiliminin bazı nicel tahminlerini sağlayabilir. Gerçekten de, kontrolün test malzemesine karşı absorpsiyon oranlarının bir dönüşüm denklemi oluşturulmuştur19.
Biyotahlil aşağıdaki prensibe göre çalışır: Kako-2 hücreleri, hücresel Fe konsantrasyonlarındaki artışlara yanıt olarak daha fazla ferritin proteini üretir. Bu nedenle, Fe biyoyararlanımı Caco-2 hücre ferritin üretimindeki artışla orantılıdır. Bu artış, sindirilmiş bir numuneye maruz kaldıktan sonra hücre ferritininin toplam Caco-2 hücre proteinine (toplam hücre proteininin miligramı başına nanogram ferritin) oranı olarak ifade edilir19. Ferritin ölçümleri, bu biyotahlilde yanıt için test edilen bir ELISA kiti (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak yapılır. Toplam hücre protein konsantrasyonları, bir protein tahlil kiti kullanılarak ölçülür. Daha önce de belirtildiği gibi, bu yöntem için kullanılan koşullar altında, altı kuyucuklu bir plakadaki tipik Caco-2 hücre proteini seviyeleri, kuyucuk başına 2.0 mg ila 2.6 mg hücre proteini arasında değişmektedir. Bu aralığın dışındaki değerler, sağlıksız hücre kültürlerini, hücrelerin olası aşırı büyümesini veya zayıf hücre tohumlama tekniğini gösterir. Biyotahlilin belirli bir çalışmasında, değerler kuyu başına sadece 0.2 mg'a kadar değişmelidir. Ayrıca, bu metodolojide kullanılan tohumlama yoğunlukları ve kültür koşulları altında, tohumlamadan 13 gün sonra önemli fırça sınır enzim aktivitesi vardır, bu da hücre tek katmanlı 28,29,30'un hepsi olmasa da çoğunun olgunlaşmasını gösterir. Vakuol oluşumu veya tek katmanlı oluşumdaki boşluklar gibi kontaminasyon veya stres için kullanımdan önceki 13 gün boyunca hücre monokatmanlarını izleyin. Bu koşullar belirginse, hücreler biyotahlilde kullanım için geçerli kabul edilmemelidir.
Caco-2 biyotestinin yanıtını izlemek için, her deney, sadece fizyolojik olarak dengelenmiş salin ve gastrointestinal enzimleri içeren boş bir sindirim de dahil olmak üzere çeşitli kalite kontrolleri ile yapılmalıdır. Bu kontroller biyotahlilde Fe kontaminasyonu olmamasını sağlar. Boş sindirime maruz kalan Caco-2 hücrelerinin ferritin değerleri tipik olarak 1 ng ila 6 ng ferritin / mg hücre proteini arasında değişir. Bu aralıktaki bazal ferritin aynı zamanda hücrelerin nispeten düşük Fe durumunda olduğunu ve bu nedenle mevcut Fe'ye maksimum duyarlılık göstermesi gerektiğini gösterir.
İlk 15 yıllık kullanım için, ek kalite kontrolleri arasında 1) FeCl 3 (66 μM) ile boş bir sindirim ve 2) boş bir FeCl 3 (66 μM) sindirimi ve ayrıca1.3 mM askorbik asit ilavesi yer aldı. FeCl3 sindirimi için ferritin değerleri tipik olarak 30-50 ng ferritin / mg hücre proteini aralığındaydı ve askorbik asitli FeCl3 sindirimi 250-400 ng ferritin / mg hücre proteini aralığındaydı. Daha yakın yıllarda, boş özet bir kalite kontrolü olmaya devam etmektedir; Bununla birlikte, 20: 1, askorbat: Fe oranında askorbik asitli ve askorbik asit içermeyen bir gıda örneği kullanmaya geçtik. Kullanılan gıda örneği, yaklaşık 65 μg Fe / g numune içeren beyaz fasulye unuydu. Bu kalite kontrolleri, beyaz fasulye unu için 20-30 ng ferritin / mg hücre proteini ve beyaz fasulye unu artı askorbat için 70-150 ng ferritin / mg hücre proteini veren daha dar ve daha tutarlı bir yanıt aralığı sağlar. Yeni değer aralığının, şu anda geçersiz olan Ramco ELISA kitinden biraz daha düşük olma eğiliminde olan Malzeme Tablosundaki referans kitinden olduğu belirtilmelidir. Bu makalenin yayınlanmasından itibaren, atıfta bulunulan kit ile sadece 2-3 aylık veri elde edilmiştir.
Biyotahlilin geçersiz veya yetersiz bir şekilde yürütüldüğünü gösteren sonuçları ve hücre kültürü koşullarını tanımak önemlidir. İlk olarak, yöntemlerde belirtildiği gibi, boş sindirim koşulları önerilen aralıktan daha yüksek hücre ferritin konsantrasyonları verirse, bu hücre kültürü ortamının, sindirim enzimlerinin veya diyaliz zarının Fe kontaminasyonunun göstergesi olabilir. Hücre kültürü ortamı ve sindirim enzimleri için kabul edilebilir Fe konsantrasyonları <20 μg Fe / mL'dir. Diğer kalite kontrolleri için aralığın dışındaki değerler, özellikle de düşük taraftaylarsa, sonuçların geçerliliğinin sorgulanabilir olduğunu da göstermektedir.
Özetle, bu model biyolojik olarak kullanılabilir Fe'ye karşı oldukça hassastır, çünkü hücre kültürü koşulları düşük Fe statüsüne sahip hücreler oluşturmak için tasarlanmıştır; Bu nedenle, Fe alımı için mekanizmaları oldukça yukarı regüle edilmiştir. Yüksek verim sağlayabilen sağlam bir modeldir. İnsanlara beslenebilecek herhangi bir yiyecek veya diyet bu modelde değerlendirilebilir ve bu nedenle biyotahlil geniş bir uygulama alanına sahiptir. Bitki yetiştiricileri bu modeli, temel gıdalardaki Fe biyoyararlanımını ölçmek, Fe biyoyararlanımını etkileyen özellikleri ve kromozomal bölgeleri tanımlamak için kullanabilirler. Gıda bilimcileri, optimal formülasyonları belirlemek ve yeterli Fe biyoyararlanımını sağlamak için işlemenin etkilerini değerlendirmek için modeli uygulayabilirler. Beslenme uzmanları, bireysel gıdalardan, gıda kombinasyonlarından ve hatta diyet planlarından diyet Fe biyoyararlanımını değerlendirmek ve izlemek için modeli kullanabilirler. Her uygulamadaki etkilerin yönünü ve büyüklüğünü doğru bir şekilde tahmin ederek insan denemelerine kapsamlı bir şekilde doğrulanmıştır. Bu nedenle, simüle edilmiş sindirimi bağırsak epitel hücresi Fe alımı ile birleştirerek, bu model Fe emilim sürecinde kritik ilk adımı temsil eder ve bu nedenle Fe'nin gıdalardan verilmesini veya biyoyararlanımını tahmin edebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarın çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Yazar, Yongpei Chang ve Mary Bodis'in teknik çabaları için derinden minnettardır. Bu modelin beslenme alanında son derece başarılı bir şekilde uygulanması, uzmanlıklarının ve detaylara gösterilen özenin doğrudan bir sonucudur. Bu modelin geliştirilmesi tamamen Amerika Birleşik Devletleri Tarım Bakanlığı, Tarımsal Araştırma Servisi tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
