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Biology

खाद्य आयरन जैव उपलब्धता के मापन के लिए कैको -2 सेल बायोसे

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63859
Automatic Translation
1
1United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Robert Holley Center for Agriculture and Health

Summary

लोहे (एफई) जैव उपलब्धता के लिए कैको -2 सेल बायोसे खाद्य पदार्थों, खाद्य उत्पादों, पूरक आहार, भोजन और यहां तक कि आहार आहार से एफई जैव उपलब्धता का आकलन करने के लिए एक लागत प्रभावी और बहुमुखी दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। मानव अध्ययन के लिए पूरी तरह से मान्य, यह एफई जैव उपलब्धता के अध्ययन के लिए कला की स्थिति का प्रतिनिधित्व करता है।

Abstract

खाद्य पदार्थों में फे की पोषण गुणवत्ता के आकलन के लिए फे जैव उपलब्धता का ज्ञान महत्वपूर्ण है। विवो में फे जैव उपलब्धता का माप लागत, थ्रूपुट और भोजन फे के आइसोटोपिक लेबलिंग में निहित चेतावनियों द्वारा सीमित है। इस प्रकार, एक दृष्टिकोण की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता मौजूद है जो उच्च-थ्रूपुट और लागत प्रभावी है। इस आवश्यकता को पूरा करने के लिए कैको -2 सेल बायोसे विकसित किया गया था। फे जैव उपलब्धता के लिए कैको -2 सेल बायोसे नकली गैस्ट्रिक और आंतों के पाचन का उपयोग करता है जो मानव आंतों के उपकला सेल लाइन की संस्कृति के साथ मिलकर काको -2 के रूप में जाना जाता है। कैको -2 कोशिकाओं में, फे अपटेक फेरिटिन के इंट्रासेल्युलर गठन को उत्तेजित करता है, एक एफई स्टोरेज प्रोटीन आसानी से एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख (एलिसा) द्वारा मापा जाता है। फेरिटिन फे अपटेक के अनुपात में बनता है; इस प्रकार, कैको -2 सेल फेरिटिन उत्पादन को मापकर, कोई भी एंटरोसाइट में नकली भोजन पचाने से आंतों के फे अपटेक का आकलन कर सकता है।

इस दृष्टिकोण के माध्यम से, मॉडल महत्वपूर्ण प्रारंभिक चरण को दोहराता है जो खाद्य फे जैव उपलब्धता को निर्धारित करता है। 1998 में इसकी स्थापना के बाद से, इस मॉडल दृष्टिकोण को मानव फे जैव उपलब्धता को प्रभावित करने के लिए ज्ञात कारकों की कड़ाई से तुलना की गई है। इसके अलावा, इसे समानांतर अध्ययनों में लागू किया गया है, जिसमें तीन मानव प्रभावकारिता अध्ययन फे बायोफोर्टिफाइड फसलों का मूल्यांकन करते हैं। सभी मामलों में, बायोएसे ने कारकों, फसलों और समग्र आहार से फे जैवउपलब्धता की सापेक्ष मात्रा की सही भविष्यवाणी की। यह पेपर इन विट्रो पाचन प्रक्रिया और सेल फेरिटिन एलिसा के साथ मिलकर कैको -2 सेल संस्कृति पर विस्तृत तरीके प्रदान करता है जो फे जैव उपलब्धता के लिए कैको -2 सेल बायोसे का संचालन करने के लिए आवश्यक है।

Introduction

फे जैव उपलब्धता के लिए कैको -2 सेल बायोसे की अनुसंधान आवश्यकता और लाभ को पूरी तरह से समझने के लिए, किसी को पहले उन दृष्टिकोणों को समझना चाहिए जो इस मॉडल के आगमन से पहले थे। विवो में भोजन या भोजन से फे जैव उपलब्धता का मापन एक चुनौतीपूर्ण कार्य है, खासकर जब भोजन या आहार में भोजन के संयोजन का मूल्यांकन करने की आवश्यकता होती है। आइसोटोपिक लेबलिंग पिछले 50 वर्षों में फे जैव उपलब्धता के माप के लिए सबसे आम दृष्टिकोण रहाहै 1. आइसोटोपिक लेबलिंग का उपयोग एकल-भोजन और बहु-भोजन अध्ययन के लिए किया जाता है और दीर्घकालिक अध्ययन के लिए अव्यावहारिक है। फे के स्थिर आइसोटोप जैसे कि 57फे और 58फे सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं; हालाँकि, पूरे शरीर की गिनती2 का उपयोग करते हुए, 59फे जैसे रेडियो आइसोटोप के साथ अध्ययन किए गए हैं। पौधों के खाद्य पदार्थों के लिए, आइसोटोपिक लेबलिंग बाहरी या आंतरिक लेबलिंग के माध्यम से किया गया है। बाह्य लेबलिंग के लिए, भोजन या भोजन में आइसोटोप की एक ज्ञात मात्रा जोड़ी जाती है। भोजन तब मिश्रित होता है, और खपत से पहले प्रोटोकॉल में 15-30 मिनट संतुलन अवधि शामिल की जाती है। हाइड्रोपोनिक संस्कृति-पौधे में शामिल करने के लिए पोषक तत्व समाधान में आइसोटोप को जोड़ना, जबकि यह बढ़ता है और विकसित होता है-पौधों के खाद्य पदार्थों के आंतरिक लेबलिंग के लिए आवश्यक है। प्रत्येक दृष्टिकोण के पेशेवरों और विपक्षों पर नीचे चर्चा की गई है।

बाह्य समस्थानिक लेबलिंग
1970 के दशक के मध्य में, खाद्य पदार्थों में फे के बाहरी लेबलिंग द्वारा मानव फे अवशोषण का अध्ययन किया गया था, जिसमें भोजन या भोजन में फे की ज्ञात मात्रा में आइसोटोप की एक ज्ञात मात्रा जोड़ी जाती है, माप से पहले 15-30 मिनट के लिए मिश्रित और संतुलित किया जाता है। विभिन्न मात्रा में बाह्य समस्थानिकों का उपयोग किया गया है, जो आंतरिक फे के 1% से 100% तक हैं, लेकिन आमतौर पर 7% -30% 3 की सीमा में। बाहरी लेबलिंग इस धारणा पर आधारित है कि बाहरी फे आइसोटोप भोजन या भोजन के आंतरिक फे के साथ पूरी तरह से संतुलित हो जाता है। बाह्य आइसोटोप अवशोषण को तब मापा जाता है, और बाह्य आइसोटोप के प्रत्येक परमाणु की गणना आंतरिक फे परमाणुओं की दी गई संख्या का प्रतिनिधित्व करने के लिए की जाती है। यह गणना सापेक्ष दाढ़ मात्रा पर आधारित है। 1983 में, तकनीक के कई सत्यापन अध्ययनों को एक समीक्षा पत्र4 में संक्षेप में प्रस्तुत किया गया था। तकनीक का सत्यापन एक आंतरिक आइसोटोपिक लेबल के प्रतिशत अवशोषण के लिए बाहरी आइसोटोपिक लेबल के प्रतिशत अवशोषण की तुलना करके किया गया था। इस प्रकार, 1 के करीब आंतरिक अवशोषण के लिए बाहरी का अनुपात बताता है कि फे का प्रत्येक पूल समान रूप से अवशोषित था। उस समय, 1 के करीब एक अनुपात को भोजन या भोजन के आंतरिक फे के साथ बाहरी आइसोटोप के संतुलन का प्रतिनिधित्व करने के लिए भी माना जाता था। आंतरिक फे अवशोषण के लिए बाह्य का अनुपात 0.40 से 1.62 के औसत मूल्यों से लेकर, 63 तुलनाओं में 1.08 ± 0.14 के औसत (±एसडी) अनुपात के साथ था। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, इस समीक्षा में संक्षेप में प्रस्तुत सभी अध्ययनों में, किसी ने भी सीधे आंतरिक फे के साथ बाहरी लेबल के संतुलन का परीक्षण नहीं किया। संक्षेप में, समीक्षा के लेखकों ने निम्नलिखित निष्कर्ष निकाला:

"बाहरी टैग तकनीक कुछ प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत कई खाद्य पदार्थों के लिए मान्य साबित हुई है। लेकिन, इस पद्धति को अभी तक सभी प्रकार के खाद्य पदार्थों के संबंध में सिद्ध नहीं माना जा सकता है। बाहरी टैग विधि एक आहार से लोहे के अवशोषण की निगरानी के लिए उपयुक्त नहीं है जिसमें लोहे के अघुलनशील रूप होते हैं। इस तकनीक की वैधता मूल धारणा पर निर्भर करती है कि बाहरी टैग सभी अंतर्जात नॉनहेम खाद्य लोहे के साथ पूरी तरह से आदान-प्रदान करता है। वर्तमान में यह ज्ञात नहीं है कि नॉनहेम आयरन के विभिन्न रूपों को बाहरी टैग द्वारा पूरी तरह से कैसे लेबल किया जाता है। यह उन अध्ययनों के प्रकाश में महत्वपूर्ण है जिन्होंने सुझाव दिया है कि लौह अवरोधक खाद्य पदार्थों में नॉनहेम आयरन के कुछ रूपों की तुलना में बाहरी टैग को अलग तरह से प्रभावित कर सकते हैं। खाद्य कारकों पर अनुसंधान जो एक पूर्ण समस्थानिक विनिमय को बाधित कर सकता है, कम है। इस प्रकार, बाह्य टैग अनुसंधान से जैव उपलब्धता डेटा की व्याख्या के लिए विनिमय के अवरोधकों पर विचार करने की आवश्यकता होती है जो भोजन या आहार में मौजूद हो सकते हैं।

1983 के बाद से, केवल दो अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं जिन्होंने एफई 3,5 के बाहरी लेबलिंग की सटीकता का मूल्यांकन किया है। इन दोनों अध्ययनों में, एक बाहरी आइसोटोपिक लेबल के संतुलन की तुलना सीधे खाद्य पदार्थों के आंतरिक फे के साथ की गई थी, जो इन अध्ययनों में, मुख्य खाद्य फसलें थीं। मसूर और मक्का के साथ सफेद, लाल और काली बीन किस्मों का परीक्षण किया गया। इन विट्रो पाचन तकनीकों और फे घुलनशीलता और वर्षा के माप का उपयोग करते हुए, दोनों अध्ययनों से पता चला है कि बाह्य आइसोटोपिक लेबलिंग के परिणामस्वरूप लगातार पूर्ण संतुलन नहीं होता है, इस सबूत के साथ कि, कुछ बीन किस्मों के लिए, बाहरी आइसोटोप और बीज कोट रंग3 की मात्रा के आधार पर गलत अनुक्रमण बहुत अधिक हो सकता है। 1983 के समीक्षा पत्र के निष्कर्षों के बावजूद, बीन्स के बाहरी लेबलिंग अध्ययन 6,7,8,9,10,11,12 जारी रहे। इनमें से किसी भी अध्ययन में आंतरिक फे के साथ बाहरी लेबल के संतुलन का परीक्षण शामिल नहीं था।

आंतरिक लेबलिंग
फे जैव उपलब्धता के आकलन के लिए पौधे के भोजन की आंतरिक लेबलिंग बाहरी लेबलिंग में संतुलन के सटीकता के मुद्दों को समाप्त करती है। हालांकि, हाइड्रोपोनिक संस्कृति के लिए ग्रीनहाउस स्थान की आवश्यकता के कारण यह दृष्टिकोण बड़ी मात्रा में सामग्री नहीं दे सकता है। हाइड्रोपोनिक संस्कृति श्रम-गहन है, महंगे स्थिर आइसोटोप की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है, और अक्सर उपज और बीज फे एकाग्रता के मामले में पौधे की वृद्धि अलग-अलग होती है। लागत के कारण, आंतरिक लेबलिंग केवल छोटे पैमाने पर अध्ययन के लिए उपयुक्त है जिसका उद्देश्य एफई अपटेक अंतर्निहित तंत्र या खाद्य पदार्थों से फे अपटेक को प्रभावित करने वाले कारकों को समझना है। आइसोटोप और हाइड्रोपोनिक दृष्टिकोण 13,14 के आधार पर अकेले सामग्री के लिए 1-2 किलोग्राम स्टेपल खाद्य फसल का उत्पादन लगभग $ 20,000- $30,000 खर्च करता है।

आइसोटोपिक लेबलिंग से जुड़ी चुनौतियों को देखते हुए, जांचकर्ताओं ने इन विट्रो दृष्टिकोण विकसित करने की मांग की। प्रारंभिक तरीकों ने नकली गैस्ट्रिक और आंतों के भोजन का उपयोग किया, जैव उपलब्धता के अनुमान के रूप में फे घुलनशीलता या फे डायलिज़ेबिलिटी के माप के साथ मिलकर15. इस तरह के अध्ययनों में जल्दी से पाया गया कि फे डायलिज़ेबिलिटी जैव उपलब्धता का एक सुसंगत उपाय नहीं था क्योंकि फे घुलनशील हो सकता है, यौगिकों से कसकर बंधा हो सकता है और इसलिए, विनिमेय नहीं है, जिससे जैव उपलब्धता का अधिक अनुमान लगाया जा सकता है। इन मुद्दों को हल करने के लिए, मानव आंतों की कोशिका रेखा का उपयोग करने की पद्धति विकसित हुई, जिससे एक जीवित घटक जोड़ा गया और फे अपटेक16 के माप को सक्षम किया गया। मानव आंतों की कोशिकाएं-कैको -2 कोशिकाएं-मानव बृहदान्त्र कार्सिनोमा से उत्पन्न हुई हैं और पोषक तत्वों के तेज अध्ययन में व्यापक रूप से उपयोग की जाती हैं। यह सेल लाइन उपयोगी है, क्योंकि संस्कृति में, कोशिकाएं एंटरोसाइट्स में अंतर करती हैं जो छोटी आंत की ब्रश सीमा कोशिकाओं के समान कार्य करती हैं। अध्ययनों से पता चला है कि कैको -2 कोशिकाएं उपयुक्त ट्रांसपोर्टरों और उन कारकों की प्रतिक्रिया प्रदर्शित करती हैं जो फे अपटेक17,18 को प्रभावित करते हैं।

प्रारंभिक अध्ययन, कैको -2 कोशिकाओं में फे अपटेक को मापने के लिए रेडियो आइसोटोप का उपयोग करते हुए, कैको -2 सेल फेरिटिन गठन के आधार पर फे अपटेक को मापने के लिए परिष्कृत किया गया था। कैको -2 सेल फेरिटिन माप ने नमूना थ्रूपुट को बढ़ाया और रेडियो आइसोटोप हैंडलिंग के मुद्दों को नकार दिया और आंतरिक फे19,20 के साथ बाहरी फे का संतुलन। फेरिटिन गठन के माध्यम से फे अपटेक के मापन ने शोधकर्ताओं को जटिल भोजन सहित खाद्य पदार्थों की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने में सक्षम बनाया21. इस प्रकार, नकली (इन विट्रो) पाचन कैको -2 सेल फे अपटेक के साथ मिलकर खाद्य पदार्थों से फे अपटेक का बेहतर शारीरिक मूल्यांकन प्रदान करता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि यह मॉडल मुख्य रूप से एफई जैव उपलब्धता में सापेक्ष अंतर निर्धारित करता है। कई उपयोगी सेल लाइनों की तरह, कैको -2 कोशिकाओं ने भी जवाबदेही में परिवर्तनशीलता दिखाई है लेकिन खाद्य पदार्थों के बीच फे अपटेक में लगातार सापेक्ष अंतर बनाए रखा है। उचित तकनीक और विस्तार पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने से कैको -2 कोशिकाओं में लगातार सेल फेरिटिन गठन प्रतिक्रिया में सुधार हो सकता है।

इन विट्रो पाचन/कैको-2 सेल मॉडल को कैको-2 सेल बायोएसे के रूप में भी जाना जाता है। इस परख को मानव और पशु अध्ययन 22 की सीधी तुलना के माध्यम सेअच्छी तरह से मान्य किया गया है। मानव प्रभावकारिता परीक्षणों के लिए बायोएसे की प्रत्यक्ष समानांतर तुलना के अलावा, इस मॉडल को मनुष्योंके 18,19,23 के लिए फे अपटेक में गुणात्मक रूप से समान प्रतिक्रिया प्रदर्शित करने के लिए दिखाया गया है। इसलिए, इन विट्रो दृष्टिकोण के रूप में, कैको -2 सेल बायोसे खाद्य पदार्थों से फे पोषण का मूल्यांकन करने के लिए स्क्रीनिंग टूल के रूप में उच्च विश्वसनीयता की गारंटी देता है। यह व्यापक रूप से कई खाद्य पदार्थों और खाद्य उत्पादों 21,24,25,26,27,28 पर लागू किया गया है।

1998 में अपनी स्थापना के बाद से, कैको -2 सेल बायोएसे ने फे पोषण के क्षेत्र को उन्नत किया है क्योंकि इसने आंतों के फे अपटेक को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान करने में मदद की है। ऐसा करने में, इस मॉडल ने अधिक निश्चित और कम महंगे मानव अध्ययन के लिए अनुसंधान उद्देश्यों को विकसित और परिष्कृत किया है। कोई यह भी तर्क दे सकता है कि मॉडल का उपयोग कुछ मानव परीक्षणों की आवश्यकता को नकारता है।

संक्षेप में, भोजन या भोजन से फे की सापेक्ष डिलीवरी को कैको -2 सेल बायोसे के साथ मापा जा सकता है। परीक्षण भोजन में फे की मात्रा के बावजूद, बायोएसे एंटरोसाइट में उठाए गए फे की सापेक्ष मात्रा को परिभाषित करता है- अवशोषण प्रक्रिया का पहला चरण। यह फे जैव उपलब्धता को परिभाषित करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि अक्सर लक्ष्य सुधार करने के इरादे से मापना है या, कम से कम, भोजन में फे की पोषण गुणवत्ता की निगरानी करना है। यह देखते हुए कि लोहे की स्थिति अवशोषण द्वारा विनियमित होती है, और इस प्रकार पोषण संबंधी जरूरतों को पूरा करने के लिए फे-कमी वाले व्यक्तियों में फे अपटेक को अपग्रेड किया जाता है, मॉडल की मानक स्थितियों को डिज़ाइन किया जाता है ताकि कोशिकाओं द्वारा फे अपटेक अधिकतम हो। इस तरह, बायोएसे फे को वितरित करने के लिए भोजन की क्षमता का एक सच्चा उपाय प्रदान करता है।

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Protocol

नोट: पाठकों के लिए संदर्भ के एक सुविधाजनक बिंदु के रूप में, निम्नलिखित पद्धति 20 प्रयोगात्मक नमूनों से फे जैव उपलब्धता के माप के लिए आवश्यक विशिष्ट संस्कृति स्थितियों और सामग्रियों का वर्णन करती है, साथ ही बायोसे के एक रन में आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण भी। इस क्षमता से परे नमूनों की संख्या बढ़ाने की सिफारिश विभिन्न सेल संस्कृति और बायोसे के भीतर इन विट्रो पाचन चरणों के लिए आवश्यक समय के कारण नहीं की जाती है।

1. नमूनों की मात्रा का चयन

  1. ठोस या तरल खाद्य पदार्थों के लिए, भोजन की मात्रा निर्धारित करें जिसे परीक्षण किए जाने वाले नमूने का प्रतिनिधि माना जा सकता है।
    1. एक बीन किस्म से फे जैव उपलब्धता के लिए परीक्षण में, 100-150 ग्राम बीन बीज का उपयोग करें और इस राशि को एक सजातीय नमूने में संसाधित करें।
    2. फोर्टिफाइड जूस, दूध उत्पादों और खेल पेय पदार्थों जैसे तरल नमूनों के लिए, सुनिश्चित करें कि नमूनाकरण से पहले भोजन अच्छी तरह से मिश्रित है।
      नोट: ऊपर वर्णित बीन बीज सामग्री की मात्रा इस प्रधान फसल के बीज के बीच अंतर्निहित अंतर के लिए आवश्यक है।

2. नमूनों की तैयारी

  1. प्रसंस्करण से पहले आसुत-विआयनीकृत पानी के साथ किसी भी खाद्य नमूने से मिट्टी और धूल कुल्ला।
  2. प्रयोगात्मक उद्देश्यों के अनुसार नमूने की उचित मात्रा को संसाधित करें, जैसे कि खाना पकाने की विधि और मिलिंग द्वारा।
    नोट: खाना पकाने और प्रसंस्करण के लिए, कुकवेयर और उपकरण का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो दूषित फे का संभावित स्रोत नहीं है। स्टेनलेस स्टील उपकरण दूषित नहीं करता है; हालाँकि, पत्थर की चक्की, कच्चा लोहा कुकवेयर, और फे युक्त किसी भी गैर-स्टेनलेस स्टील उपकरण जैसे उपकरण दूषित फे की महत्वपूर्ण मात्रा जोड़ सकते हैं। एक मानक स्टेनलेस स्टील कॉफी की चक्की अक्सर पीसने के लिए पर्याप्त होती है।
  3. लियोफिलाइज़ करें और एक सजातीय पाउडर में पीस लें।
    नोट: एक बार होमोजेनाइज्ड होने के बाद, शोध से पता चला है कि विश्लेषण की तीन स्वतंत्र प्रतिकृतियां मापा जा रहा प्रत्येक भोजन के लिए पर्याप्त हैं।
    1. यदि नमूना एकरूपता प्राप्त करना मुश्किल है, तो उत्पाद के निर्माण या प्रसंस्करण को संशोधित करें। यदि यह संभव नहीं है, तो गैर-समरूपता गंभीर नहीं है, तो प्रतिकृतियां जोड़ें।
    2. अधिकांश सजातीय ठोस खाद्य पदार्थों के लिए, प्रति प्रतिकृति 0.5 ग्राम लियोफिलाइज्ड नमूने का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो प्रति प्रतिकृति नमूने के 1.0 ग्राम तक का उपयोग करें, लेकिन जांचें कि क्या 0.5 ग्राम से अधिक प्रतिक्रिया की डिग्री में लाभ देता है।
      नोट: ठोस खाद्य पदार्थों के 0.5 ग्राम से अधिक मात्रा डायलिसिस झिल्ली को रोक सकती है (नीचे देखें)।
    3. तरल नमूनों के 1-2 एमएल का उपयोग करें।
      नोट: तरल नमूनों के लिए लियोफिलाइजेशन अक्सर आवश्यक नहीं होता है।

3. कैको -2 सेल संस्कृति

  1. स्टॉक संस्कृतियों
    1. एक प्रमाणित आपूर्तिकर्ता से कैको -2 कोशिकाओं का अधिग्रहण करें।
    2. 25 एमएम एचईपीईएस (पीएच7.2 ), 10% (वी / वी) भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक दुलबेको के संशोधित ईगल के माध्यम (डीएमईएम) का उपयोग करके 5% सीओ 2 वायु वातावरण (निरंतर आर्द्रता) के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक शीशियों से कोशिकाओं को संस्कृति करें।
    3. एक बार पर्याप्त कोशिकाएं उपलब्ध होने के बाद, आमतौर पर संस्कृति के 7-10 दिनों के बाद, 30,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर गैर-कोलेजन-लेपित फ्लास्क में कोशिकाओं को बीज दें।
    4. उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या के आधार पर फ्लास्क आकार चुनें और मल्टीवेल प्लेटों को बोने के लिए आवश्यक है।
      नोट: सामान्य तौर पर, टी 225 (225 सेमी2) फ्लास्क प्रयोगों के लिए सबसे अच्छा काम करते हैं जहां 11 मल्टीवेल (6-अच्छी तरह से; 9.66 सेमी2/अच्छी तरह से) प्लेटों का उपयोग किया जाता है (नमूना तुलना के लिए 10 प्लेटें, गुणवत्ता नियंत्रण के लिए 1 प्लेट) प्रति बायोसे।
    5. 7 दिनों के लिए फ्लास्क में कोशिकाओं को विकसित करें, हर दूसरे दिन माध्यम को बदलें, और मल्टीवेल प्लेटों को बोने के लिए 7वें दिन का उपयोग करें।
      नोट: जब कोशिकाओं को स्टॉक संस्कृति से शुरू किया जाता है और बाद में प्रयोगों की एक श्रृंखला में उपयोग किया जाता है, तो 10-15 मार्ग से अधिक की मार्ग सीमा का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सेल संस्कृति मार्ग सीमित होना चाहिए क्योंकि मार्ग की एक विस्तृत श्रृंखला के परिणामस्वरूप सेल लाइन में अनुकूली परिवर्तन हो सकते हैं और इस प्रकार, मॉडल की प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता हो सकती है।
  2. मल्टीवेल प्लेटों पर सेल संस्कृति
    1. 6-अच्छी तरह से कोलेजन-लेपित प्लेटों में 50,000 कोशिकाओं / सेमी2 के घनत्व पर कैको -2 कोशिकाओं को बीज दें।
      नोट: यह चरण आमतौर पर सबसे अच्छा काम करता है अगर बुधवार को किया जाता है। निम्नलिखित कदम यह स्पष्ट कर देंगे कि सप्ताह का यह दिन इष्टतम क्यों है।
    2. 25 एमएम एचईपीईएस (पीएच7.2 ), 10% (वी / वी) एफबीएस, और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक डीएमईएम का उपयोग करके 5% सीओ 2 वायु वातावरण (निरंतर आर्द्रता) के साथ इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 12 दिनों के लिए कोशिकाओं को बढ़ाएं।
      नोट: 12 दिनों से अधिक समय तक सेल मोनोलेयर संवर्धन के परिणामस्वरूप सेल अतिवृद्धि हो सकती है। पिछले शोध से स्पष्ट रूप से पता चला है कि, इन शर्तों के तहत, बोने के 12 दिनों बाद, सेल मोनोलेयर परिपक्व है, प्लेट से अच्छी तरह से जुड़ा हुआ है, और प्रतिक्रिया 29,30,31 की स्थिरता में इष्टतम है। कोशिकाओं को लंबे समय तक बढ़ाना, जैसे कि 19-21 दिनों तक, सेल अतिवृद्धि का परिणाम होता है, और मीडिया पोषक तत्वों में तेजी से कम हो जाता है, जिसके परिणामस्वरूप अस्वास्थ्यकर मोनोलेयर होते हैं।
    3. 12 दिन की अवधि के दौरान, एक सुसंगत दैनिक कार्यक्रम पर कम से कम हर 2 दिनों में माध्यम बदलें।
    4. बोने के बाद 12वें दिन, संस्कृति माध्यम को न्यूनतम आवश्यक माध्यम (एमईएम [पीएच 7]) के 2 एमएल के साथ प्रतिस्थापित करें, जिसमें 10 एमएम पाइप्स (पिपराज़ीन-एन, एन'-बिस-[2-एथेनेसल्फोनिक एसिड]), 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान, हाइड्रोकार्टिसोन (4 मिलीग्राम / एल), इंसुलिन (5 मिलीग्राम /
      नोट: यदि बुधवार को बीजारोपण शुरू किया गया था, तो 12वें दिन सोमवार होगा।
    5. अगले दिन (यानी, दिन 13), एमईएम को हटा दें और इसे 1 एमएल एमईएम (पीएच 7) के साथ बदलें।
      नोट: यह चरण मंगलवार को होगा। यह वह दिन है जब बायोसे शुरू होता है; इस प्रकार, 13 दिन का शेड्यूल एक सुसंगत साप्ताहिक अनुसूची का लाभ देता है, जिससे बायोसे को एक ही कार्यदिवस पर लगातार आयोजित किया जा सकता है।

4. इन विट्रो पाचन

  1. सम्मिलित छल्ले की तैयारी
    1. एक एसिड धोया डायलिसिस झिल्ली (चित्रा 1 ए) के साथ फिट एक सिलिकॉन ओ अंगूठी का उपयोग कर एक निष्फल डालने की अंगूठी बनाएँ।
      नोट: बायोसे के दिन के 1 दिन पहले (यानी, सोमवार, दिन 12) आवेषण तैयार करें और उपयोग करने के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर 18 एमΩ पानी में स्टोर करें।
    2. बायोएसे के दिन (मंगलवार, दिन 13), रेफ्रिजरेटर से आवेषण निकालें, नाली, और पानी को 0.5 एम एचसीएल के साथ बदलें।
      नोट: यह कदम संस्कृति प्लेटों से एमईएम को हटाने से पहले किया जाना चाहिए। झिल्ली की एसिड धुलाई संभावित दूषित फे को हटाने और डालने की अंगूठी और झिल्ली को निष्फल करने का कार्य करती है।
    3. आवेषण से 0.5 एम एचसीएल निकालें और बाँझ 18 एमΩ पानी के साथ कुल्ला। उपयोग करने के लिए तैयार होने तक लामिना प्रवाह हुड में कमरे के तापमान पर बाँझ 18 एमΩ पानी में स्टोर करें।
    4. कैको -2 कोशिकाओं के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक कुएं में एक अंगूठी डालें, जिससे दो-कक्ष प्रणाली बन सके। इनक्यूबेटर को आवेषण के साथ प्लेटें लौटाएं।
      नोट: यह चरण प्रत्येक कुएं में एमईएम के ताजा 1.0 एमएल जोड़े जाने के ठीक बाद किया जाना चाहिए (चरण 3.2.5 देखें।
  2. पेप्सिन समाधान की तैयारी
    1. प्रयोग के दिन, 0.1 एम एचसीएल के 50 मिलीलीटर में पेप्सिन के 0.145 ग्राम को भंग करके पेप्सिन समाधान तैयार करें कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए एक मंच शेकर पर समाधान को धीरे से हिलाएं।
  3. अग्नाशय-पित्त समाधान की तैयारी
    1. प्रयोग के रूप में एक ही दिन, 18 एमΩ पानी के 250 मिलीलीटर में एनएएचसीओ 3 के 2.1 ग्राम कोभंग करके 0.1 एम एनएएचसीओ3 तैयार करें।
    2. 0.1 एम एनएएचसीओ 3 के 175 एमएल में0.35 ग्राम अग्नाशय और 2.1 ग्राम पित्त निकालने मिलाएं।
    3. एक बार जब अग्नाशय और पित्त निकालने घुलनशील हो जाते हैं, तो एक कमजोर धनायन विनिमय राल के 87.5 ग्राम जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मिलाकर मिलाएं।
    4. घोल को एक बड़े कॉलम में डालें और एल्यूएट इकट्ठा करें।
    5. 0.1 एम एनएएचसीओ3 के अतिरिक्त 70 एमएल के साथ कॉलम को एल्यूट करें, इस मात्रा को अग्नाशय पित्त समाधान में एकत्र करें।
      नोट: राल का उद्देश्य आमतौर पर अग्नाशय-पित्त अर्क में पाए जाने वाले दूषित फे को हटाना है।
  4. इन विट्रो पाचन में शुरू करें।
    1. एक बाँझ 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब (पॉलीप्रोपाइलीन) में नमूने का वजन करें, इसके बाद पीएच 2 पर 10 एमएल शारीरिक खारा के अलावा, जिसमें 140 एमएम एनएसीएल और 5 एमएम केसीएल शामिल हैं।
    2. नमूने में तैयार पोर्सिन पेप्सिन समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़कर गैस्ट्रिक पाचन प्रक्रिया शुरू करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए कम, कोमल सेटिंग पर एक रॉकिंग शेकर पर सेते हैं।
    3. इस अवधि के बाद, पीएच को 1.0 एम एनएएचसीओ3 के साथ 5.5-6.0 में समायोजित करके प्रत्येक नमूने की आंतों की पाचन प्रक्रिया शुरू करें।
    4. प्रत्येक नमूना ट्यूब के लिए अग्नाशय-पित्त समाधान के 2.5 एमएल जोड़ें और पीएच को 1.0 एम एनएएचसीओ3 के साथ 6.9-7.0 में समायोजित करें।
    5. एक बार पीएच समायोजित हो जाने के बाद, 140 एमएम एनएसीएल, 5 एमएम केसीएल (पीएच 6.7) समाधान का उपयोग करके प्रत्येक ट्यूब में वॉल्यूम को बराबर करें, 15 ग्राम के लक्ष्य मूल्य के साथ ट्यूब के वजन को मापें।
      नोट: कुछ खाद्य पदार्थों के लिए, खाद्य पदार्थों की बफरिंग क्षमता के आधार पर कुल मात्रा को 16 ग्राम या 17 ग्राम तक लाने की आवश्यकता हो सकती है।
    6. प्रत्येक आंतों के पचाने के 1.5 एमएल को ऊपरी कक्ष में स्थानांतरित करें (यानी, डायलिसिस झिल्ली के साथ सम्मिलित अंगूठी युक्त) 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के संबंधित कुएं के कैको -2 कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) से युक्त।
    7. प्लेट कवर को बदलें और2 घंटे के लिए 6 दोलनों / मिनट पर एक रॉकिंग शेकर पर 37 डिग्री सेल्सियस (5% सीओ 2 वायु वातावरण) पर सेते हैं।
    8. डाइजेस्ट के साथ डालने की अंगूठी निकालें और प्रत्येक कुएं में अतिरिक्त 1 एमएल एमईएम (पीएच 7) जोड़ें।
    9. एक अतिरिक्त22 घंटे के लिए इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस; 5% सीओ 2 वायु वातावरण) के लिए सेल संस्कृति प्लेट लौटें।
    10. 22 घंटे के बाद, सेल संस्कृति माध्यम को हटा दें और सेल मोनोलेयर में 18 एमΩ पानी के 2.0 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: पानी आसमाटिक रूप से कोशिकाओं को लाइज करेगा।
    11. बाद के सेल प्रोटीन और सेल फेरिटिन विश्लेषण के लिए मानक पॉलीप्रोपाइलीन माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों या इसी तरह के पूरे सेल लाइसेट को हार्वेस्ट करें।

5. कैको -2 सेल फेरिटिन और सेल प्रोटीन का मापन

  1. चरण 4.4.10 से सेल लाइसेट का उपयोग करें। सेल फेरिटिन और प्रोटीन के माप के लिए।
    1. कैको -2 कोशिकाओं की फेरिटिन सामग्री को मापने के लिए, माउस एंटी-फेरिटिन एंटीबॉडी-हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) संयुग्म के लिए इनक्यूबेशन समय को 30 मिनट से 2 घंटे तक बढ़ाने के अपवाद के साथ किट के निर्देशों ( सामग्री की तालिका देखें) का पालन करें।
    2. सेल प्रोटीन को मापने के लिए, सेल प्रोटीन किट में दिए गए निर्देशों का पालन करें ( सामग्री की तालिका देखें)।

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Representative Results

मुख्य खाद्य फसलों में एफई जैव उपलब्धता की पहचान और मापन
इस मॉडल को विकसित करने के प्राथमिक कारणों में से एक मुख्य खाद्य फसलों में फे जैव उपलब्धता को प्रभावित करने वाले कारकों की पहचान करना और पौधों के प्रजनकों के लिए एक उपकरण प्रदान करना था जो उन्हें बढ़ी हुई एफई जैव उपलब्धता के साथ किस्मों की पहचान करने और विकसित करने में सक्षम बनाएगा। आम बीन (फेजोलस वल्गरिस) को विश्व स्तर पर फे बायोफोर्टिफिकेशन के लिए एक फसल के रूप में लक्षित किया गया है; इस प्रकार, बीन बाजार वर्गों और बीन प्रजनन कार्यक्रमों की एक विस्तृत श्रृंखला में फे की पोषण गुणवत्ता का मूल्यांकन करने के लिए मॉडल को बड़े पैमाने पर लागू किया गया है। उदाहरण के लिए, संयुक्त राज्य अमेरिका में पीले सेम एक उभरते बाजार वर्ग हैं। पूर्वी अफ्रीका जैसे क्षेत्रों में, वे अत्यधिक लोकप्रिय हैं और व्यापक रूप से तेजी से खाना पकाने के लिए जाने जाते हैं और कई लोगों द्वारा "पचाने में आसान" माना जाता है। कैको -2 सेल बायोसे के साथ हाल के अध्ययनों से पता चला है कि पीले सेम की कुछ किस्मों में अन्य रंग वर्गों (चित्रा 2) के सापेक्ष उच्च फे जैवउपलब्धता हो सकती है। इस अध्ययन में, मंटेका किस्मों को सफेद और लाल रंग वर्गों के संदर्भ नियंत्रण के सापेक्ष फे जैव उपलब्धता में उच्च होने के रूप में पहचाना गया था। इसके अलावा, परिणाम लगातार दो फसल वर्षों में सुसंगत थे। इस तरह की तुलना अन्य मॉडलों में संभव नहीं है, विशेष रूप से विवो मॉडल में , उच्च लागत और पशु और मानव परीक्षणों के बहुत कम थ्रूपुट के कारण।

एफई जैव उपलब्धता पर खाद्य प्रसंस्करण प्रभावों का मूल्यांकन
सीएसीओ -2 सेल बायोसे को एफई जैव उपलब्धता पर खाद्य प्रसंस्करण प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3 में परिणाम कई रंग वर्गों के सेम और बीन-आधारित पास्ता के विश्लेषण से हैं। परिणाम दर्शाते हैं कि कैसे एक आटे में बीन्स को संसाधित करने से सफेद (स्नोडन, अल्पेना और समुराई) और पीले (कैनारियो) बीन किस्मों से फे जैव उपलब्धता में वृद्धि हुई। क्रैनबेरी (एटना), लाल गुर्दे (रेड हॉक), और काले (जेनिथ) किस्मों के लिए, पास्ता आटा तैयार करने में फे जैव उपलब्धता कम हो गई। संबंधित विश्लेषणों से पता चला है कि बीन्स को आटे में संसाधित करने से बीन्स की कोटिलेडोन सेल की दीवारों को बाधित किया जाता है, इस प्रकार इंट्रासेल्युलर फे को तेज करने के लिए सुलभ बना दिया जाता है। सफेद और पीले बीन पास्ता में लोहे का तेज बढ़ गया क्योंकि इन किस्मों के बीज कोट में पॉलीफेनोलिक यौगिक नहीं थे जो फे जैव उपलब्धता को रोकते हैं। इसके विपरीत, क्रैनबेरी, लाल गुर्दे और काले सेम के बीज कोट में निरोधात्मक पॉलीफेनोल के उच्च स्तर होते हैं, इस प्रकार फे अपटेक कम हो जाते हैं। ये परिणाम स्पष्ट रूप से उन कारकों को उजागर करने में मॉडल की उपयोगिता को इंगित करते हैं जो फे की पोषण गुणवत्ता को प्रभावित कर सकते हैं, जो अन्यथा अज्ञात हो जाएंगे।

Figure 1
चित्रा 1: कैको -2 सेल फे अपटेक के लिए रिंग सेटअप डालें ( ए ) कैको -2 कोशिकाओं की छवि और संलग्न डायलिसिस झिल्ली के साथ अंगूठी डालें। (बी) बहु-अच्छी तरह से प्लेट के एक कुएं के भीतर कैको -2 सेल फे अपटेक के साथ युग्मित इन विट्रो पाचन के लिए समग्र प्रक्रिया का आरेख। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: पीले सेम के एक विविध पैनल में बिना सोक और पके हुए पूरे बीज जीनोटाइप के लौह जैवउपलब्धता स्कोर। (बी) फील्ड सीजन 2016। मान प्रति जीनोटाइप (एन = 6) दो क्षेत्र प्रतिकृतियों से ट्रिप्लिकेट माप के साधन (मानक विचलन) हैं। जीनोटाइप को खाना पकाने की कक्षा द्वारा एक्स-अक्ष पर वर्गीकृत किया जाता है, जो सबसे तेज़ खाना पकाने वाले जीनोटाइप से सबसे धीमी-खाना पकाने की प्रविष्टि तक रैंक किया जाता है। * अन्य वाईबीपी प्रविष्टियों की तुलना में काफी कम (पी < 0.05) लौह जैव उपलब्धता स्कोर। ** अन्य वाईबीपी जीनोटाइप की तुलना में काफी अधिक (पी < 0.05) लौह जैव उपलब्धता स्कोर। इस आंकड़े को32 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: बीन किस्मों और उनके संबंधित बीन-आधारित स्पेगेटिस के कैको -2 सेल फेरिटिन गठन (सेल प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम फेरिटिन का नैनोग्राम) के रूप में व्यक्त लौह जैव उपलब्धता। (बी) चार रंगीन बीन किस्में और उनके संबंधित बीन-आधारित स्पेगेटिस। मान प्रत्येक किस्म से छह मापों के साधन (मानक विचलन ±) हैं। नीली हाइफ़नेटेड लाइन एक गैर-गढ़वाले ड्यूरम गेहूं पास्ता नियंत्रण की लोहे की जैव उपलब्धता को इंगित करती है, जिसे बीन-आधारित स्पेगेटिस के समान तरीके से बाहर निकाला, पकाया और संसाधित किया जाता है। * खाना पकाने के बाद पूरे सेम की तुलना में महत्वपूर्ण रूप से (पी ≤ 0.05) उच्च कैको -2 सेल फेरिटिन गठन। ** खाना पकाने के बाद पूरे सेम की तुलना में महत्वपूर्ण रूप से (पी ≤ 0.05) कम कैको -2 सेल फेरिटिन गठन। यह आंकड़ा33 से संशोधित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इसकी स्थापना के बाद से, कई अध्ययन प्रकाशित किए गए हैं जो कैको -2 सेल बायोसे के लिए इस पद्धति का वर्णन करते हैं। 199818 में प्रारंभिक प्रकाशन के बाद से बुनियादी स्थितियां अपेक्षाकृत अपरिवर्तित रही हैं। हालांकि, पिछले 20 वर्षों में, बायोएसे की प्रतिक्रिया में अभूतपूर्व स्थिरता पैदा करने के लिए कई तकनीकी विवरणों को परिष्कृत और मानकीकृत किया गया है। सेल संस्कृति और इन विट्रो पाचन स्थितियों के लिए सावधानीपूर्वक और सटीक पालन बायोएसे की सुसंगत और संवेदनशील प्रतिक्रिया की कुंजी है।

इस पद्धति के उपयोग में कई व्यक्तियों को प्रशिक्षित करने में हमारे अनुभव से, सबसे आम संघर्ष कैको -2 कोशिकाओं की उचित संस्कृति है। स्वस्थ मोनोलेयर की सुसंगत संस्कृति स्वस्थ और उत्तरदायी कैको -2 सेल मोनोलेयर की कुंजी है। यदि सेल प्रोटीन का स्तर अच्छी तरह से अत्यधिक सुसंगत नहीं है और प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध सेल प्रोटीन की सीमा के भीतर नहीं है, तो अन्वेषक को प्रोटोकॉल से विचलन के लिए सेल संस्कृति की स्थिति की फिर से जांच करनी चाहिए। वैकल्पिक रूप से, निम्न-स्तरीय सूक्ष्मजीव संदूषण मौजूद हो सकता है, सेल संस्कृति इनक्यूबेटर ठीक से काम नहीं कर रहा है, या सेल संस्कृति माध्यम ठीक से तैयार नहीं किया जा सकता है।

इन विट्रो पाचन प्रक्रिया संभावित समस्याओं का एक और स्रोत है। पाचन एंजाइमों से दूषित फे को हटाना महत्वपूर्ण है। निर्माता के दावों के बावजूद, समय-समय पर एंजाइमों की फे एकाग्रता की जांच करना और यह सुनिश्चित करना समझदारी है कि फे हटाने की प्रक्रिया (प्रोटोकॉल देखें) प्रभावी है। यदि फे संदूषण पाचन एंजाइमों में मौजूद है, तो बेसलाइन डाइजेस्ट गुणवत्ता नियंत्रण अनुशंसित सीमा से अधिक सेल फेरिटिन मूल्यों का उत्पादन करेगा।

एक अनुभवी और प्रशिक्षित अन्वेषक बायोएसे के एक रन में 20 प्रयोगात्मक नमूनों, प्लस गुणवत्ता नियंत्रण का विश्लेषण करने में सक्षम होना चाहिए। इस प्रकार, बायोएसे के प्रत्येक रन के लिए लगभग 12 छह-अच्छी तरह से प्लेटों की आवश्यकता होती है। बायोएसे प्रति नमूनों की उच्च संख्या की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि पाचन प्रक्रिया के दौरान पीएच अनुमापन का समय बहुत लंबा हो सकता है, जिससे नमूना पाचन समय के बीच संभावित असंगति हो सकती है।

इस मॉडल के नुकसान अपेक्षाकृत कम हैं। इसके लिए जांचकर्ताओं की आवश्यकता होती है जो सेल संस्कृति में अत्यधिक कुशल हैं और विस्तार और प्रोटोकॉल पर सटीक ध्यान देने में सक्षम हैं। प्रयोगशाला स्थान को फे संदूषण के स्रोतों से साफ होना चाहिए, और अभिकर्मकों और अन्य सामग्रियों को नियमित रूप से फे संदूषण के लिए निगरानी की जानी चाहिए। इस प्रकार, उपयोगकर्ता के पास फे एकाग्रता के माप के लिए इंस्ट्रूमेंटेशन की क्षमता या पहुंच होनी चाहिए। यह मॉडल केवल एक सापेक्ष या अर्ध-मात्रात्मक उपाय है। हालांकि, संदर्भ नियंत्रण के उचित उपयोग के साथ, मॉडल फे अवशोषण के कुछ मात्रात्मक अनुमान प्रदान कर सकता है। दरअसल, नियंत्रण बनाम परीक्षण सामग्री के अवशोषण अनुपात का एक रूपांतरण समीकरण19 उत्पन्न किया गया है।

बायोएसे निम्नलिखित सिद्धांत के अनुसार काम करता है: कैको -2 कोशिकाएं सेलुलर फे सांद्रता में वृद्धि के जवाब में अधिक फेरिटिन प्रोटीन का उत्पादन करती हैं। इसलिए, फे जैव उपलब्धता कैको -2 सेल फेरिटिन उत्पादन में वृद्धि के लिए आनुपातिक है। इस वृद्धि को सेल फेरिटिन के अनुपात के रूप में कुल कैको -2 सेल प्रोटीन (कुल सेल प्रोटीन के प्रति मिलीग्राम फेरिटिन का नैनोग्राम) एक पचाए गए नमूने के संपर्क में आने के बाद व्यक्त किया जाता है19. फेरिटिन माप इस बायोएसे में प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किए गए एलिसा किट (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके किए जाते हैं। कुल सेल प्रोटीन सांद्रता एक प्रोटीन परख किट का उपयोग कर मात्रा निर्धारित कर रहे हैं. जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, इस पद्धति के लिए उपयोग की जाने वाली शर्तों के तहत, छह अच्छी तरह से प्लेट में विशिष्ट कैको -2 सेल प्रोटीन का स्तर 2.0 मिलीग्राम से 2.6 मिलीग्राम सेल प्रोटीन प्रति अच्छी तरह से होता है। इस श्रेणी के बाहर के मान अस्वास्थ्यकर सेल संस्कृतियों, कोशिकाओं के संभावित अतिवृद्धि, या खराब सेल बोने की तकनीक को इंगित करते हैं। बायोएसे के दिए गए रन के भीतर, मूल्यों को केवल 0.2 मिलीग्राम प्रति अच्छी तरह से भिन्न होना चाहिए। इसके अलावा, इस पद्धति में उपयोग किए जाने वाले बीजारोपण घनत्व और संस्कृति की स्थिति के तहत, बोने के बाद 13 दिनों में पर्याप्त ब्रश सीमा एंजाइम गतिविधि होती है, जो सेल मोनोलेयर 28,29,30 के अधिकांश, यदि सभी नहीं, की परिपक्वता का संकेत देती है। संदूषण या तनाव के लिए उपयोग करने से पहले 13 दिनों में सेल मोनोलेयर की निगरानी करें, जैसे रिक्तिका गठन या मोनोलेयर गठन में अंतराल। यदि ऐसी स्थितियां स्पष्ट हैं, तो कोशिकाओं को बायोसे में उपयोग के लिए वैध नहीं माना जाना चाहिए।

कैको -2 बायोएसे की जवाबदेही की निगरानी के लिए, प्रत्येक प्रयोग को कई गुणवत्ता नियंत्रणों के साथ चलाया जाना चाहिए, जिसमें एक खाली डाइजेस्ट भी शामिल है, जिसमें केवल शारीरिक रूप से संतुलित खारा और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल एंजाइम शामिल हैं। ये नियंत्रण यह सुनिश्चित करते हैं कि बायोसे में कोई एफई संदूषण नहीं है। खाली डाइजेस्ट के संपर्क में आने वाली कैको -2 कोशिकाओं के फेरिटिन मूल्य आमतौर पर फेरिटिन / मिलीग्राम सेल प्रोटीन के 1 एनजी से 6 एनजी तक होते हैं। इस सीमा में बेसलाइन फेरिटिन यह भी इंगित करता है कि कोशिकाएं अपेक्षाकृत कम फे स्थिति में हैं और इस प्रकार, उपलब्ध फे के लिए अधिकतम संवेदनशीलता प्रदर्शित करनी चाहिए।

उपयोग के शुरुआती 15 वर्षों के लिए, अतिरिक्त गुणवत्ता नियंत्रण में 1) एफईसीएल3 (66 μM) के साथ एक खाली डाइजेस्ट और 2) FeCl3 (66 μM) का एक खाली डाइजेस्ट और 1.3 एमएम एस्कॉर्बिक एसिड के अलावा शामिल है। एफईसीएल3 डाइजेस्ट के लिए फेरिटिन मान आमतौर पर फेरिटिन / मिलीग्राम सेल प्रोटीन के 30-50 एनजी की सीमा में थे, और एस्कॉर्बिक एसिड के साथ एफईसीएल3 डाइजेस्ट फेरिटिन / मिलीग्राम सेल प्रोटीन के 250-400 एनजी की सीमा में था। हाल के वर्षों में, रिक्त डाइजेस्ट एक गुणवत्ता नियंत्रण बना हुआ है; हालाँकि, हमने 20: 1 के अनुपात में एस्कॉर्बिक एसिड के साथ और बिना भोजन के नमूने का उपयोग करने के लिए स्विच किया है, एस्कॉर्बेट: फे। इस्तेमाल किया गया भोजन का नमूना एक सफेद बीन आटा था जिसमें लगभग 65 μg Fe / g नमूना होता है। ये गुणवत्ता नियंत्रण प्रतिक्रिया की एक संकीर्ण और अधिक सुसंगत सीमा देते हैं, सफेद बीन के आटे के लिए सेल प्रोटीन के 20-30 एनजी फेरिटिन / मिलीग्राम और सफेद बीन आटा प्लस एस्कॉर्बेट के लिए 70-150 एनजी फेरिटिन / यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि मूल्यों की नई श्रृंखला सामग्री की तालिका में संदर्भित किट से है, जो अब-निष्क्रिय रैमको एलिसा किट की तुलना में थोड़ा कम है। इस पांडुलिपि के प्रकाशन के रूप में, संदर्भित किट के साथ केवल 2-3 महीने का डेटा प्राप्त किया गया है।

परिणामों और सेल संस्कृति स्थितियों को पहचानना महत्वपूर्ण है जो बायोएसे के अमान्य या उप-इष्टतम रन को इंगित करते हैं। सबसे पहले, जैसा कि विधियों में कहा गया है, यदि रिक्त पाचन स्थितियां सुझाई गई सीमा से अधिक सेल फेरिटिन सांद्रता उत्पन्न करती हैं, तो यह सेल संस्कृति मीडिया, पाचन एंजाइमों या डायलिसिस झिल्ली के फे संदूषण का संकेत हो सकता है। सेल संस्कृति मीडिया और पाचन एंजाइमों के लिए स्वीकार्य फे सांद्रता <20 μg Fe / अन्य गुणवत्ता नियंत्रणों के लिए सीमा के बाहर मान, खासकर यदि वे कम पक्ष पर हैं, तो यह भी इंगित करता है कि परिणामों की वैधता संदिग्ध है।

संक्षेप में, यह मॉडल जैव उपलब्ध फे के प्रति अत्यधिक संवेदनशील है, क्योंकि सेल संस्कृति की स्थिति कम फे स्थिति की कोशिकाओं को बनाने के लिए डिज़ाइन की गई है; इस प्रकार, फे अपटेक के लिए उनके तंत्र अत्यधिक अपग्रेड किए जाते हैं। यह एक मजबूत मॉडल है जो उच्च थ्रूपुट में सक्षम है। मनुष्यों को खिलाए जा सकने वाले किसी भी भोजन या आहार का मूल्यांकन इस मॉडल में किया जा सकता है और इसलिए, बायोएसे में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला है। प्लांट प्रजनक इस मॉडल का उपयोग मुख्य खाद्य पदार्थों में फे जैव उपलब्धता को मापने के लिए कर सकते हैं, उन लक्षणों और गुणसूत्र क्षेत्रों की पहचान कर सकते हैं जो फे जैव उपलब्धता को प्रभावित करते हैं। खाद्य वैज्ञानिक इष्टतम योगों को निर्धारित करने और पर्याप्त एफई जैव उपलब्धता सुनिश्चित करने के लिए प्रसंस्करण के प्रभावों का मूल्यांकन करने के लिए मॉडल को लागू कर सकते हैं। पोषण विशेषज्ञ व्यक्तिगत खाद्य पदार्थों, खाद्य संयोजनों और यहां तक कि आहार योजनाओं से आहार फे जैव उपलब्धता का मूल्यांकन और निगरानी करने के लिए मॉडल का उपयोग कर सकते हैं। यह मानव परीक्षणों के लिए पूरी तरह से मान्य किया गया है, हर आवेदन में प्रभावों की दिशा और परिमाण की सही भविष्यवाणी करता है। इस प्रकार, आंतों के उपकला सेल फे अपटेक के साथ नकली पाचन के संयोजन से, यह मॉडल फे अवशोषण प्रक्रिया में महत्वपूर्ण पहले चरण का प्रतिनिधित्व करता है और इसलिए, खाद्य पदार्थों से फे की डिलीवरी या जैव उपलब्धता की भविष्यवाणी करने में सक्षम है।

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Disclosures

लेखक के हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

लेखक योंगपेई चांग और मैरी बोडिस के तकनीकी प्रयासों के लिए गहराई से आभारी हैं। पोषण के क्षेत्र में इस मॉडल का अत्यंत सफल अनुप्रयोग उनकी विशेषज्ञता और विस्तार पर ध्यान देने का प्रत्यक्ष परिणाम है। इस मॉडल के विकास को पूरी तरह से वित्त पोषित किया गया था संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि विभाग, कृषि अनुसंधान सेवा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M HCl Fisher Scientific A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma Aldrich Co T6397
6-well plates Costar 3506 Use for bioassay experiments
ascorbic acid Sigma Aldrich Co A0278
bile extract Sigma Aldrich Co B8631
Caco-2 cells American Type Culture Collection HTB-37 HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225 Falcon  353138
Cell culture flasks T25 Corning 430639
Cell culture flasks T75 Corning 430641U
Chelex-100 Bio-Rad Laboratories Inc 142832 Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen Corning 354236
dialysis membrane Spectrum Laboratories Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Gibco 12100046 DMEM
epidermal growth factor Sigma Aldrich Co E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit Eagle Biosciences FRR31-K01
fetal bovine serum R&D Systems S12450 Optima
HEPES Sigma Aldrich Co H3375
Hydrocortisone-Water Soluble Sigma Aldrich Co H0396
insert ring Corning Costar not sold Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin Sigma Aldrich Co I2643
KCl Sigma Aldrich Co P9333
large column VWR International KT420400-1530
Minimum Essential Medium Gibco 41500034 MEM
NaCl Fisher Scientific S271
pancreatin Sigma Aldrich Co P1750
PIPES disodium salt Sigma Aldrich Co Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin Sigma Aldrich Co P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit Bio-Rad Laboratories Inc Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings Web Seal, Inc Rochester NY 2-215S500
sodium bicarbonate Fisher Scientific S233
Sodium selenite Sigma Aldrich Co S5261
ZellShield Minerva Biolabs 13-0050 Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific

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References

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जीव विज्ञान अंक 182
खाद्य आयरन जैव उपलब्धता के मापन के लिए कैको -2 सेल बायोसे
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Glahn, R. P. The Caco-2 Cell… More

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability. J. Vis. Exp. (182), e63859, doi:10.3791/63859 (2022).

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