Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Caco-2-cellbioassay för mätning av biotillgänglighet för livsmedelsjärn

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63859
Automatic Translation
1
1United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Robert Holley Center for Agriculture and Health

Summary

Caco-2-cellbioassay för järn (Fe) biotillgänglighet representerar ett kostnadseffektivt och mångsidigt tillvägagångssätt för att bedöma Fe-biotillgänglighet från livsmedel, livsmedelsprodukter, kosttillskott, måltider och till och med dietregimer. Grundligt validerad till mänskliga studier, representerar den senaste tekniken för studier av Fe biotillgänglighet.

Abstract

Kunskap om Fe-biotillgänglighet är avgörande för bedömningen av näringskvaliteten hos Fe i livsmedel. In vivo-mätning av Fe-biotillgänglighet begränsas av kostnad, genomströmning och de försiktighetsåtgärder som är inneboende i isotopmärkning av maten Fe. Det finns således ett kritiskt behov av ett tillvägagångssätt som är högt genomströmnings- och kostnadseffektivt. Caco-2-cellbioassay utvecklades för att tillgodose detta behov. Caco-2-cellbioassay för Fe-biotillgänglighet använder simulerad mag- och tarmsmältning i kombination med odling av en human tarmepitelcellinje som kallas Caco-2. I Caco-2-celler stimulerar Fe-upptag den intracellulära bildningen av ferritin, ett Fe-lagringsprotein som lätt mäts med enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA). Ferritinformer i proportion till Fe-upptaget; genom att mäta Caco-2-cellferritinproduktionen kan man således bedöma tarmens Fe-upptag från simulerade matsmältningar till enterocyten.

Via detta tillvägagångssätt replikerar modellen det viktigaste inledande steget som bestämmer livsmedels-Fe-biotillgängligheten. Sedan starten 1998 har denna modellmetod noggrant jämförts med faktorer som är kända för att påverka mänsklig Fe-biotillgänglighet. Dessutom har det tillämpats i parallella studier, med tre humana effektstudier som utvärderar Fe biofortifierade grödor. I alla fall förutspådde bioassay korrekt de relativa mängderna Fe-biotillgänglighet från faktorerna, grödorna och den totala kosten. Detta dokument ger detaljerade metoder för Caco-2-cellodling i kombination med in vitro-matsmältningsprocessen och cellferritin ELISA som är nödvändig för att genomföra Caco-2-cellbioassay för Fe-biotillgänglighet.

Introduction

För att fullt ut förstå forskningsbehovet och nyttan av Caco-2-cellbioassay för Fe-biotillgänglighet måste man först förstå de tillvägagångssätt som fanns på plats före tillkomsten av denna modell. Mätningen av Fe-biotillgängligheten från ett livsmedel eller en måltid in vivo är en utmanande uppgift, särskilt när kombinationer av livsmedel måste bedömas i en måltid eller kost. Isotopmärkning har varit det vanligaste tillvägagångssättet för mätning av Fe-biotillgänglighet under de senaste 50 åren1. Isotopmärkning används för studier av en måltid och flera måltider och är opraktiskt för långtidsstudier. Stabila isotoper av Fe såsom 57Fe och 58Fe är de vanligaste; studier har dock utförts med radioisotoper som 59Fe, med användning av helkroppsräkning2. För vegetabiliska livsmedel har isotopmärkning gjorts via yttre eller inneboende märkning. För yttre märkning tillsätts en känd mängd isotop till maten eller måltiden. Maten blandas sedan och en jämviktsperiod på 15-30 minuter införlivas i protokollet före konsumtionen. Hydroponisk kultur - att lägga till isotopen till näringslösningen för att införliva den i växten medan den växer och utvecklas - krävs för den inneboende märkningen av vegetabiliska livsmedel. Fördelarna och nackdelarna med varje tillvägagångssätt diskuteras nedan.

Extrinsisk isotopmärkning
I början till mitten av 1970-talet studerades human Fe-absorption genom yttre märkning av Fe i livsmedel, vari en känd mängd isotop tillsätts till den kända mängden Fe i maten eller måltiden, blandad och jämvikt i 15-30 minuter före mätningar. Olika mängder yttre isotoper har använts, allt från 1% till 100% av den inneboende Fe, men oftast i intervallet 7% -30% 3. Extrinsisk märkning bygger på antagandet att den yttre Fe-isotopen blir helt jämställd med matens eller måltidens inneboende Fe. Extrinsisk isotopabsorption mäts sedan, och varje atom i den yttre isotopen beräknas för att representera ett givet antal inneboende Fe-atomer. Denna beräkning baseras på de relativa molära mängderna. År 1983 sammanfattades flera valideringsstudier av tekniken i ett översiktspapper4. Validering av tekniken gjordes genom att samtidigt jämföra den procentuella absorptionen av den yttre isotopetiketten med den procentuella absorptionen av en inneboende isotopetikett. Således tyder ett förhållande mellan den yttre och inneboende absorptionen nära 1 på att varje pool av Fe absorberades lika. Vid den tiden ansågs ett förhållande nära 1 också representera jämvikt mellan den yttre isotopen och matens eller måltidens inneboende Fe. Förhållandet mellan yttre och inneboende Fe-absorption varierade från medelvärden på 0,40 till 1,62, med ett medelvärde (±SD) på 1,08 ± 0,14 i 63 jämförelser. Det är viktigt att notera att i alla studier som sammanfattas i denna översyn testade ingen direkt jämvikten mellan den yttre etiketten och den inneboende Fe. Sammanfattningsvis drog författarna till översynen följande slutsatser:

" Den yttre taggtekniken har visat sig vara giltig för flera livsmedel under vissa experimentella förhållanden. Men denna metod kan ännu inte anses vara bevisad när det gäller alla typer av livsmedel. Den yttre taggmetoden är inte lämplig för att övervaka järnabsorptionen från en diet som innehåller olösliga former av järn. Giltigheten av denna teknik bygger på det grundläggande antagandet att den yttre taggen utbyter helt med allt endogent nonheme matjärn. För närvarande är det inte känt hur fullständigt de olika formerna av nonheme järn är märkta med en yttre tagg. Detta är viktigt mot bakgrund av studier som har föreslagit att järnhämmare kan påverka den yttre taggen annorlunda än vissa former av nonheme järn i livsmedel. Forskning om livsmedelsfaktorer som kan försämra ett fullständigt isotoputbyte är knapphändig. Således kräver tolkning av biotillgänglighetsdata från extrinsisk taggforskning övervägande av utbyteshämmare som kan finnas i maten eller kosten.

Sedan 1983 har endast två studier publicerats som utvärderade noggrannheten i yttre märkning av Fe 3,5. I båda dessa studier jämfördes jämvikten av en yttre isotopetikett direkt med livsmedlens inneboende Fe, som i dessa studier var basmatgrödor. Vita, röda och svarta bönsorter testades, tillsammans med linser och majs. Med hjälp av etablerade in vitro-rötningstekniker och mätning av Fe-löslighet och nederbörd visade båda studierna att yttre isotopmärkning inte konsekvent resulterar i full jämvikt, med bevis för att för vissa bönsorter kan felbalansen vara mycket hög beroende på mängden yttre isotop och fröbeläggningsfärg3. Trots slutsatserna i 1983 års översiktsdokument fortsatte extrinsiska märkningsstudier av bönor 6,7,8,9,10,11,12. Ingen av dessa studier inkluderade testning av jämvikten mellan den yttre etiketten och den inneboende Fe.

Inneboende märkning
Inneboende märkning av växtmat för bedömning av Fe-biotillgänglighet eliminerar noggrannhetsproblemen med jämvikt vid yttre märkning. Detta tillvägagångssätt kan emellertid inte ge stora mängder material på grund av kravet på växthusutrymme för hydroponisk kultur. Hydroponisk odling är arbetsintensiv, kräver en stor mängd dyra stabila isotoper och resulterar ofta i växttillväxt som skiljer sig åt när det gäller utbyte och frö Fe-koncentration. På grund av kostnaden är inneboende märkning endast lämplig för småskaliga studier som syftar till att förstå mekanismer som ligger till grund för Fe-upptag eller faktorer som påverkar Fe-upptag från livsmedel. Produktion av 1-2 kg av en basföda kostar cirka $ 20,000- $ 30,000 för material ensam, beroende på isotopen och hydroponisk metod13,14.

Med tanke på de utmaningar som är förknippade med isotopmärkning försökte utredarna utveckla in vitro-metoder. Tidiga metoder använde simulerad mag- och tarmmat, i kombination med mätning av Fe-löslighet eller Fe-dialyserbarhet som en uppskattning av biotillgänglighet15. Sådana studier fann snabbt att Fe-dialyserbarhet inte var ett konsekvent mått på biotillgänglighet eftersom Fe kan vara lösligt, tätt bundet till föreningar och därför inte utbytbart, vilket leder till överskattning av biotillgängligheten. För att ta itu med dessa problem utvecklades metodiken för att använda en mänsklig tarmcellinje, vilket tillförde en levande komponent och möjliggjorde mätning av Fe-upptag16. De mänskliga tarmcellerna-Caco-2-celler-härstammar från ett humant kolonkarcinom och har använts i stor utsträckning i näringsupptagsstudier. Denna cellinje är användbar eftersom cellerna i odling differentieras till enterocyter som fungerar på samma sätt som tunntarmens borstgränsceller. Studier har visat att Caco-2-celler uppvisar lämpliga transportörer och svar på faktorer som påverkar Fe-upptag17,18.

De inledande studierna, som använde radioisotoper för att mäta Fe-upptag i Caco-2-celler, förfinades för att mäta Fe-upptag baserat på Caco-2-cellferritinbildning. Caco-2-cellferritinmätning förbättrade provgenomströmningen och förnekade problem med radioisotophantering och jämvikt mellan yttre Fe och inneboende Fe19,20. Mätning av Fe-upptag via ferritinbildning gjorde det möjligt för forskare att studera ett brett spektrum av livsmedel, inklusive komplexa måltider21. Således gav simulerad (in vitro) matsmältning i kombination med Caco-2-cells Fe-upptag en bättre fysiologisk bedömning av Fe-upptag från livsmedel. Det är viktigt att notera att denna modell främst bestämmer relativa skillnader i Fe-biotillgänglighet. Liksom många användbara cellinjer har Caco-2-celler också visat variation i lyhördhet men har bibehållit konsekventa relativa skillnader i Fe-upptag mellan livsmedel. Korrekt teknik och noggrann uppmärksamhet på detaljer kan förbättra konsekvent cellferritinbildningssvar i Caco-2-celler.

In vitro-digestion/Caco-2-cellmodellen är också känd som Caco-2-cellbioassay. Denna analys har validerats grundligt genom direkt jämförelse med studier på människor och djur22. Förutom den direkta parallella jämförelsen av bioassay med humana effektstudier har denna modell visat sig uppvisa ett kvalitativt liknande svar i Fe-upptag som hos människor18,19,23. Därför, som ett in vitro-tillvägagångssätt, garanterar Caco-2-cellbioassay hög trovärdighet som ett screeningverktyg för att utvärdera Fe-näring från livsmedel. Det har tillämpats i stor utsträckning på många livsmedel och livsmedelsprodukter 21,24,25,26,27,28.

Sedan starten 1998 har Caco-2-cellbioassay avancerat fältet Fe-näring eftersom det har hjälpt till att identifiera faktorer som påverkar intestinal Fe-upptag. På så sätt har denna modell utvecklat och förfinat forskningsmål för mer definitiva och mindre kostsamma mänskliga studier. Man kan också hävda att användningen av modellen förnekar behovet av vissa mänskliga prövningar.

Sammanfattningsvis kan den relativa leveransen av Fe från en mat eller måltid mätas med Caco-2-cellbioassay. Oavsett mängden Fe i testmjölet definierar bioassay den relativa mängden Fe som tas upp i enterocyten - det första steget i absorptionsprocessen. Detta är det viktigaste steget för att definiera Fe-biotillgänglighet, eftersom målet oftast är att mäta med avsikt att förbättra eller åtminstone övervaka näringskvaliteten hos Fe i ett livsmedel. Med tanke på att järnstatus regleras av absorption, och därmed är Fe-upptaget uppreglerat hos Fe-bristfälliga individer för att tillgodose näringsbehov, är modellens standardvillkor utformade så att Fe-upptaget av cellerna är maximalt. På detta sätt ger bioassay ett verkligt mått på matens potential att leverera Fe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Som en lämplig referenspunkt för läsarna beskriver följande metod de specifika odlingsförhållanden och material som krävs för mätning av Fe-biotillgänglighet från 20 experimentella prover, plus de nödvändiga kvalitetskontrollerna, i en körning av bioassay. Att öka antalet prover utöver denna kapacitet rekommenderas inte på grund av den tid som krävs för olika cellodlings- och in vitro-matsmältningssteg i bioassayen.

1. Välja mängden prover

  1. För fasta eller flytande livsmedel, bestäm en mängd livsmedel som kan anses vara representativ för provet som ska testas.
    1. Vid testning för Fe-biotillgänglighet från en bönsort, använd 100-150 g bönfrö och bearbeta denna mängd till ett homogent prov.
    2. För flytande prover som berikade juicer, mjölkprodukter och sportdrycker, se till att maten är väl blandad före provtagning.
      OBS: Mängden bönfrömaterial som nämns ovan är viktigt för att ta hänsyn till de inneboende skillnaderna mellan frön från denna stapelgröda.

2. Beredning av prover

  1. Skölj av jord och damm från alla livsmedelsprover med destillerat avjoniserat vatten före bearbetning.
  2. Bearbeta lämplig mängd prov enligt de experimentella målen, t.ex. genom tillagningsmetod och malning.
    OBS: För matlagning och bearbetning är det viktigt att använda köksredskap och utrustning som inte är en potentiell källa till förorenande Fe. Utrustning i rostfritt stål förorenar inte; Utrustning som stenkvarnsslipmaskiner, köksredskap av gjutjärn och all utrustning som inte är rostfritt stål som innehåller Fe kan dock lägga till betydande mängder förorenande Fe. En vanlig kaffekvarn i rostfritt stål är ofta tillräcklig för slipning.
  3. Lyofilisera och slipa till ett homogent pulver.
    OBS: När den väl har homogeniserats har forskning visat att tre oberoende replikationer av analys är tillräckliga för varje mat som mäts.
    1. Om provhomogenitet är svår att uppnå, revidera formuleringen eller bearbetningen av produkten. Om detta inte är möjligt, lägg till replikeringar om den icke-homogeniteten inte är allvarlig.
    2. För de flesta homogena fasta livsmedel, använd 0,5 g frystorkat prov per replikat. Använd vid behov upp till 1,0 g prov per replikat, men kontrollera om mer än 0,5 g ger en fördel i svarsgraden.
      OBS: Mängder högre än 0,5 g fasta livsmedel kan täppa till dialysmembranet (se nedan).
    3. Använd 1-2 ml flytande prover.
      OBS: Lyofilisering är ofta inte nödvändig för flytande prover.

3. Caco-2 cellodling

  1. Aktiekulturer
    1. Skaffa Caco-2-celler från en certifierad leverantör.
    2. Odla cellerna från stamflaskor vid 37 °C i en inkubator med en 5% CO 2-luftatmosfär (konstant luftfuktighet) med Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) kompletterat med 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika-antimykotisk lösning.
    3. När tillräckligt många celler finns tillgängliga, vanligtvis efter 7-10 dagars odling, frös cellerna i icke-kollagenbelagda kolvar med en densitet av 30 000 celler/cm2.
    4. Välj kolvstorlek beroende på antalet tillgängliga celler och behövs för sådd av multiwellplattor.
      OBS: I allmänhet fungerar T225 (225 cm 2) kolvarna bäst för experiment där 11 multiwell (6-brunn; 9,66 cm2 / brunn) plattor används (10 plattor för provjämförelser, 1 platta för kvalitetskontroller) per bioassay.
    5. Odla celler i kolvar i 7 dagar, byt medium varannan dag och använd den 7:e dagen för sådd av multiwellplattorna.
      OBS: Det rekommenderas att använda ett passageintervall på högst 10-15 passager från när cellerna startas från stamodling och därefter används i en serie experiment. Cellodlingspassager bör begränsas eftersom ett brett spektrum av passager kan resultera i adaptiva förändringar i cellinjen och därmed variation i modellens respons.
  2. Cellodling på multiwellplattor
    1. Frö Caco-2-cellerna med en densitet av 50 000 celler/cm2 i 6-brunns kollagenbelagda plattor.
      OBS: Detta steg fungerar vanligtvis bäst om det görs på en onsdag. Följande steg kommer att göra det uppenbart varför denna veckodag är optimal.
    2. Odla cellerna i 12 dagar vid 37 ° C i en inkubator med en 5% CO 2-luftatmosfär (konstant luftfuktighet) med DMEM kompletterat med 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) FBS och 1% antibiotika-antimykotisk lösning.
      OBS: Odling av cellmonolager längre än 12 dagar kan resultera i cellöverväxt. Tidigare forskning har tydligt visat att under dessa förhållanden, vid 12 dagar efter sådd, är cellmonolagret moget, fäst väl på plattan och optimalt i konsistensen av svaret 29,30,31. Att odla cellerna längre, till exempel upp till 19-21 dagar, resulterar i cellöverväxt och mediet tappar snabbt näringsämnen, vilket resulterar i ohälsosamma monolager.
    3. Under 12-dagarsperioden, byt medium minst var 2: e dag på ett konsekvent dagligt schema.
    4. På den 12: e dagen efter sådd, byt ut odlingsmediet med 2 ml Minimum Essential Medium (MEM [pH 7]) kompletterat med 10 mM PIPES (piperazin-N,N'-bis-[2-etansulfonsyra]), 1% antibiotika-antimykotisk lösning, hydrokortison (4 mg / L), insulin (5 mg / L), selen (5 μg / L), trijodtyronin (34 μg / L) och epidermal tillväxtfaktor (20 μg / L).
      OBS: Om seedningen startades på en onsdag, skulle den 12: e dagen vara en måndag.
    5. Följande dag (dvs. dag 13), ta bort MEM och ersätt den med 1 ml MEM (pH 7).
      OBS: Detta steg skulle inträffa på en tisdag. Detta är dagen då bioassay börjar; Således ger 13-dagarsschemat fördelen med ett konsekvent veckoschema, vilket gör att bioassay kan genomföras konsekvent på samma vardag.

4. Matsmältning in vitro

  1. Beredning av insatsringar
    1. Skapa en steriliserad insatsring med en O-ring av silikon försedd med ett syratvättat dialysmembran (figur 1A).
      OBS: Förbered insatserna 1 dag i förväg (dvs. måndag, dag 12) på bioassayens dag och förvara i 18 MΩ vatten vid 4 °C tills de är klara att användas.
    2. På bioassayens dag (tisdag, dag 13), ta bort insatserna från kylskåpet, dränera och byt ut vattnet med 0,5 M HCl. Låt det stå i rumstemperatur i en laminär flödeshuv i minst 1 h före användning.
      OBS: Detta steg bör göras innan MEM tas bort från odlingsplattorna. Syratvätt av membranet tjänar till att avlägsna eventuell förorenande Fe och steriliserar insatsringen och membranet.
    3. Töm 0,5 M HCl från insatserna och skölj med sterilt 18 MΩ vatten. Förvara i sterilt 18 MΩ vatten vid rumstemperatur i en laminär flödeshuv tills den är klar att användas.
    4. Sätt in en ring i varje brunn på 6-brunnsplattorna med Caco-2-celler och skapa därigenom ett tvåkammarsystem. Sätt tillbaka plattorna med insatserna till inkubatorn.
      OBS: Detta steg bör göras strax efter att färsk 1,0 ml MEM har lagts till i varje brunn (se steg 3.2.5.).
  2. Beredning av pepsinlösning
    1. På experimentdagen, förbered pepsinlösningen genom att lösa 0,145 g pepsin i 50 ml 0,1 M HCl. Skaka lösningen försiktigt på en plattformsskakare i 30 minuter vid rumstemperatur.
  3. Framställning av pankreatin-galllösning
    1. Samma dag som experimentet, förbered 0,1 M NaHCO 3 genom att lösa 2,1 g NaHCO3 i 250 ml 18 MΩ vatten.
    2. Blanda 0,35 g pankreatin och 2,1 g gallextrakt i 175 ml 0,1 MNaHCO3.
    3. När pankreatin och gallextrakt har solubiliserats, tillsätt 87,5 g av ett svagt katjonbytarharts (se materialtabellen) och blanda genom att skaka i 30 minuter vid rumstemperatur.
    4. Häll uppslamningen i en stor kolonn och samla eluatet.
    5. Eluera kolonnen med ytterligare 70 ml 0,1 M NaHCO3, samla denna volym i pankreatingalllösningen.
      OBS: Syftet med hartset är att avlägsna förorenande Fe som vanligtvis finns i pankreatin-gallextrakten.
  4. Initiera in vitro-matsmältningen.
    1. Väg upp provet i ett sterilt 50 ml centrifugrör (polypropen), följt av tillsats av 10 ml fysiologisk saltlösning vid pH 2, innehållande 140 mM NaCl och 5 mM KCl.
    2. Påbörja magsäcksuppslutningen genom att tillsätta 0,5 ml av den beredda pepsinlösningen för svin till provet och inkubera på en gungande skakapparat vid en låg, mild inställning i 1 timme vid 37 °C.
    3. Efter denna period, initiera tarmuppslutningsprocessen för varje prov genom att justera pH till 5,5-6,0 med 1,0 M NaHCO3.
    4. Tillsätt 2,5 ml av pankreatingalllösningen till varje provrör och justera pH-värdet till 6,9-7,0 med 1,0 M NaHCO3.
    5. När pH-värdet har justerats, utjämna volymen i varje rör med 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6.7) lösning, mät rörets vikt med ett målvärde på 15 g.
      OBS: För vissa livsmedel kan man behöva få den totala volymen till 16 g eller 17 g, beroende på matens buffringskapacitet.
    6. Överför 1,5 ml av varje tarmsmältning till den övre kammaren (dvs. innehållande insatsringen med dialysmembranet) av en motsvarande brunn i odlingsplattan med 6 brunnar innehållande Caco-2-cellerna (figur 1B).
    7. Sätt tillbaka plattskyddet och inkubera vid 37 °C (5 % CO 2-luftatmosfär) på en gungande skakapparat vid 6 svängningar/min i2 timmar.
    8. Ta bort insatsringen med smältningen och tillsätt ytterligare 1 ml MEM (pH 7) till varje brunn.
    9. Återför cellodlingsplattan till inkubatorn (37 °C; 5 % CO2-luftatmosfär ) i ytterligare 22 timmar.
    10. Efter 22 timmar, ta bort cellodlingsmediet och tillsätt 2,0 ml 18 MΩ vatten till cellmonoskiktet.
      OBS: Vattnet kommer osmotiskt att lysera cellerna.
    11. Skörda hela celllysatet i standardmikrocentrifugrör av polypropen eller liknande för efterföljande cellprotein- och cellferritinanalyser.

5. Mätning av Caco-2-cellferritin och cellprotein

  1. Använd celllysatet från steg 4.4.10. för mätning av cellferritin och protein.
    1. För att mäta ferritinhalten i Caco-2-cellerna, följ satsens instruktioner (se materialtabellen), med undantag för att öka inkubationstiden från 30 min till 2 timmar för musens anti-ferritinantikropp-pepparrotsperoxidas (HRP) konjugat.
    2. För att mäta cellprotein, följ instruktionerna i cellproteinsatsen (se materialförteckningen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Identifiering och mätning av Fe-biotillgänglighet i basgrödor
En av de främsta anledningarna till att utveckla denna modell var att identifiera faktorer som påverkar Fe-biotillgängligheten i baslivsmedelsgrödor och tillhandahålla ett verktyg för växtförädlare som skulle göra det möjligt för dem att identifiera och utveckla sorter med förbättrad Fe-biotillgänglighet. Den vanliga bönan (Phaseolus vulgaris) har riktats globalt som en gröda för Fe-biofortifiering; Således har modellen tillämpats i stor utsträckning för att utvärdera näringskvaliteten hos Fe i ett brett spektrum av bönmarknadsklasser och bönavelsprogram. Till exempel är gula bönor en tillväxtmarknadsklass i USA. I regioner som Östafrika är de mycket populära och är allmänt kända för att vara snabbkokta och anses av många vara "lätta att smälta". Nyligen genomförda studier med Caco-2-cellbioassay har visat att vissa sorter av gula bönor kan ha hög Fe-biotillgänglighet i förhållande till andra färgklasser (figur 2). I denna studie identifierades Manteca-sorterna som höga i Fe-biotillgänglighet i förhållande till referenskontroller av de vita och rödfläckiga färgklasserna. Dessutom var resultaten konsekventa under två på varandra följande skördeår. Sådana jämförelser är helt enkelt inte genomförbara i andra modeller, särskilt in vivo-modeller , på grund av de höga kostnaderna och den mycket lägre genomströmningen av försök på djur och människor.

Utvärdering av livsmedelsbearbetningseffekter på Fe-biotillgängligheten
Caco-2-cellbioassay kan också tillämpas för att utvärdera livsmedelsbearbetningseffekter på Fe-biotillgänglighet. Resultaten i figur 3 kommer till exempel från en analys av bönor och bönbaserad pasta i flera färgklasser. Resultaten visar hur bearbetning av bönorna till ett mjöl ökade Fe-biotillgängligheten från vita (Snowdon, Alpena och Samurai) och gula (Canario) bönsorter. För tranbär (Etna), röd njure (Red Hawk) och svart (Zenith) sorter minskade Fe biotillgängligheten i pastamjölberedningarna. Relaterade analyser visade att bearbetning av bönorna till ett mjöl störde bönornas cotyledoncellväggar, vilket gjorde den intracellulära Fe tillgänglig för upptag. Järnupptaget ökade i den vita och gula bönpastan eftersom fröskikten av dessa sorter inte innehöll polyfenoliska föreningar som hämmar Fe-biotillgängligheten. Däremot innehåller fröskikten av tranbär, röd njure och svarta bönor höga nivåer av hämmande polyfenoler, vilket minskar Fe-upptaget. Dessa resultat indikerar tydligt modellens användbarhet när det gäller att exponera faktorer som kan påverka näringskvaliteten hos Fe, som annars skulle gå oupptäckt.

Figure 1
Bild 1: Infoga ringinställning för Caco-2-cells Fe-upptag. (A) Bild av Caco-2-celler och insatsring med fäst dialysmembran. B) Diagram över det övergripande förfarandet för uppslutning in vitro i kombination med Fe-upptag i Caco-2-celler i en enda brunn på flerbrunnsplattan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Järnbiotillgänglighetspoäng för odränkta och kokta helfrögenotyper i en mångsidig panel av gula bönor . (A) Fältsäsongen 2015. (B) fältsäsongen 2016. Värden är medelvärden (standardavvikelse) för tredubbla mätningar från två fältreplikat per genotyp (n = 6). Genotyper kategoriseras på x-axeln efter matlagningskurs, rankade från den snabbaste matlagningsgenotypen till den långsammaste matlagningsposten. *Betydligt lägre (p < 0,05) järnbiotillgänglighetspoäng än de andra YBP-posterna. ** Signifikant högre (p < 0,05) järnbiotillgänglighetspoäng än de andra YBP-genotyperna. Denna siffra modifierades från32. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Järnbiotillgänglighet uttryckt som Caco-2-cells ferritinbildning (nanogram ferritin per milligram cellprotein) av bönsorter och deras motsvarande bönbaserade spagettis. A) Tre sorter av gröna bönor och motsvarande bönbaserade spagettis baserade på dessa. B) Fyra färgade bönsorter och motsvarande bönbaserade spagettis. Värden är medelvärdet (± standardavvikelsen) för sex mätningar från varje sort. Den blå bindestreckslinjen indikerar järnbiotillgängligheten för en icke-berikad durumvetepastakontroll extruderad, kokt och bearbetad på samma sätt som den bönbaserade spagettin. *Signifikant (p ≤ 0,05) högre Caco-2-cells ferritinbildning än hela bönor efter tillagning. ** Signifikant (p ≤ 0,05) lägre Caco-2-cellferritinbildning än hela bönor efter tillagning. Denna siffra modifierades från33. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Sedan starten har många studier publicerats som beskriver denna metod för Caco-2-cellbioassay. Grundförutsättningarna har varit relativt oförändrade sedan den första publiceringen 199818. Under de senaste 20 åren har dock många tekniska detaljer förfinats och standardiserats för att ge oöverträffad konsistens i bioassayens svar. Noggrann och exakt följsamhet till cellkulturen och in vitro-matsmältningsförhållandena är nyckeln till det konsekventa och känsliga svaret från bioassayen.

Från vår erfarenhet av att träna många individer i användningen av denna metod är den vanligaste kampen den korrekta kulturen av Caco-2-cellerna. Konsekvent odling av friska monolager är nyckeln till friska och lyhörda Caco-2-cellmonolager. Om cellproteinnivåerna inte är mycket konsekventa från brunn till brunn och inte inom det intervall av cellprotein som anges i protokollet, bör prövaren ompröva cellodlingsförhållandena för avvikelse från protokollet. Alternativt kan mikroorganismkontaminering på låg nivå existera, cellodlingsinkubatorn kanske inte fungerar korrekt eller cellodlingsmediet kanske inte är korrekt formulerat.

In vitro-matsmältningsprocessen är en annan källa till potentiella problem. Avlägsnande av förorenande Fe från matsmältningsenzymerna är avgörande. Trots tillverkarens påståenden är det klokt att regelbundet kontrollera Fe-koncentrationen av enzymerna och se till att Fe-borttagningsprocessen (se protokoll) är effektiv. Om Fe-kontaminering är närvarande i matsmältningsenzymerna, kommer kvalitetskontrollen vid baslinjen att ge cellferritinvärden som överstiger det rekommenderade intervallet.

En erfaren och utbildad utredare bör kunna analysera 20 experimentella prover, plus kvalitetskontrollerna, i en enda körning av bioassayen. Således behövs cirka 12 sexbrunnsplattor för varje körning av bioassayen. Högre antal prover per bioassay rekommenderas inte eftersom tidpunkten för pH-titrering under rötningsprocessen kan vara för lång, vilket leder till potentiell inkonsekvens mellan provets uppslutningstider.

Nackdelarna med denna modell är relativt få. Det kräver utredare som är mycket skickliga i cellodling och kan exakt uppmärksamma detaljer och protokoll. Laboratorieutrymmet måste vara rent från källor till Fe-kontaminering, och reagenser och andra material bör rutinmässigt övervakas för Fe-kontaminering. Således bör användaren ha kapacitet eller tillgång till instrumentering för mätning av Fe-koncentration. Denna modell är bara ett relativt eller semikvantitativt mått. Men med korrekt användning av referenskontroller kan modellen ge vissa kvantitativa uppskattningar av Fe-absorptionen. Faktum är att en omvandlingsekvation av absorptionsförhållanden mellan kontroll kontra testmaterial har genererats19.

Bioassay fungerar enligt följande princip: Caco-2-celler producerar mer ferritinprotein som svar på ökningar av cellulära Fe-koncentrationer. Därför är Fe-biotillgängligheten proportionell mot ökningen av Caco-2-cellferritinproduktionen. Denna ökning uttrycks som ett förhållande mellan cellferritin och totalt Caco-2-cellprotein (nanogram ferritin per milligram totalt cellprotein) efter exponering för ett smält prov19. Ferritinmätningar görs med hjälp av ett ELISA-kit (se materialtabellen) som testats för respons i denna bioassay. Totala cellproteinkoncentrationer kvantifieras med hjälp av ett proteinanalyskit. Som tidigare nämnts, under de förhållanden som används för denna metod, varierar typiska Caco-2-cellproteinnivåer i en sexbrunnsplatta från 2,0 mg till 2,6 mg cellprotein per brunn. Värden utanför detta intervall indikerar ohälsosamma cellkulturer, möjlig överväxt av celler eller dålig cellsåddsteknik. Inom en given körning av bioanalysen bör värdena endast variera upp till 0,2 mg per brunn. Under de såddtätheter och odlingsförhållanden som används i denna metod finns det dessutom en betydande borstgränsenzymaktivitet vid 13 dagar efter sådd, vilket indikerar mognad av de flesta, om inte alla, cellmonolagret28,29,30. Övervaka cellmonolager under de 13 dagarna före användning för kontaminering eller stress, såsom vakuolbildning eller luckor i monolagerbildning. Om sådana förhållanden är uppenbara bör cellerna inte anses vara giltiga för användning i bioassayen.

För att övervaka lyhördheten hos Caco-2-bioanalysen bör varje experiment köras med flera kvalitetskontroller, inklusive en blank digest, som endast innehåller den fysiologiskt balanserade saltlösningen och gastrointestinala enzymer. Dessa kontroller säkerställer att det inte finns någon Fe-kontaminering i bioassayen. Ferritinvärden för Caco-2-celler som utsätts för blindsmältningen varierar vanligtvis från 1 ng till 6 ng ferritin/mg-cellprotein. Baslinjeferritin i detta intervall indikerar också att cellerna har relativt låg Fe-status och därmed bör uppvisa maximal känslighet för tillgänglig Fe.

Under de första 15 användningsåren omfattade ytterligare kvalitetskontroller 1) en blindprovsuppslutning med FeCl3 (66 μM) och 2) en blindkokning avFeCl3 (66 μM) plus tillsats av 1,3 mM askorbinsyra. Ferritinvärdena för FeCl3-smältningen låg vanligtvis i intervallet 30-50 ng ferritin / mg-cellprotein, och FeCl3-smältningen med askorbinsyra låg i intervallet 250-400 ng ferritin / mg-cellprotein. Under senare år är den tomma smältningen fortfarande en kvalitetskontroll; vi har dock gått över till att använda ett matprov med och utan askorbinsyra i förhållandet 20:1, askorbat:Fe. Matprovet som användes var ett vitt bönmjöl som innehåller cirka 65 μg Fe/g prov. Dessa kvalitetskontroller ger ett smalare och mer konsekvent svarsintervall, vilket ger 20-30 ng ferritin / mg cellprotein för det vita bönmjölet och 70-150 ng ferritin / mg cellprotein för det vita bönmjölet plus askorbat. Det bör noteras att det nya värdeintervallet kommer från det refererade kitet i materialtabellen, vilket tenderar att vara något lägre än det nu nedlagda Ramco ELISA-paketet. Från och med publiceringen av detta manuskript har endast 2-3 månaders data förvärvats med det refererade kitet.

Det är viktigt att känna igen resultaten och cellodlingsförhållandena som indikerar en ogiltig eller suboptimal körning av bioassayen. För det första, som anges i metoderna, om de tomma smältningsförhållandena ger cellferritinkoncentrationer högre än det föreslagna intervallet, kan detta vara ett tecken på Fe-kontaminering av cellodlingsmediet, matsmältningsenzymerna eller dialysmembranet. Godtagbara Fe-koncentrationer för cellodlingsmediet och matsmältningsenzymerna är <20 μg Fe/ml. Värden utanför intervallet för de andra kvalitetskontrollerna, särskilt om de är på den låga sidan, indikerar också att resultatens giltighet är tveksam.

Sammanfattningsvis är denna modell mycket känslig för biotillgänglig Fe, eftersom cellodlingsförhållandena är utformade för att skapa celler med låg Fe-status; således är deras mekanismer för Fe-upptag starkt uppreglerade. Det är en robust modell som kan ha hög genomströmning. All mat eller diet som kan matas till människor kan bedömas i denna modell och därför har bioassay ett brett spektrum av applikationer. Växtförädlare kan använda denna modell för att mäta Fe-biotillgängligheten i baslivsmedel, identifiera egenskaper och kromosomala regioner som påverkar Fe-biotillgängligheten. Livsmedelsforskare kan tillämpa modellen för att bestämma optimala formuleringar och utvärdera effekterna av bearbetning för att säkerställa adekvat Fe-biotillgänglighet. Nutritionists kan använda modellen för att utvärdera och övervaka diet Fe biotillgänglighet från enskilda livsmedel, matkombinationer och till och med dietplaner. Det har validerats grundligt till mänskliga försök, korrekt förutsäga riktningen och storleken på effekterna i varje ansökan. Således, genom att kombinera simulerad matsmältning med intestinal epitelcell Fe-upptag, representerar denna modell det kritiska första steget i Fe-absorptionsprocessen och kan därför förutsäga leverans eller biotillgänglighet av Fe från livsmedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författaren har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Författaren är djupt tacksam för Yongpei Changs och Mary Bodis tekniska ansträngningar. Den extremt framgångsrika tillämpningen av denna modell inom näringsområdet är ett direkt resultat av deras expertis och uppmärksamhet på detaljer. Utvecklingen av denna modell finansierades helt av Förenta staternas jordbruksdepartement, jordbruksforskningstjänst.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M HCl Fisher Scientific A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma Aldrich Co T6397
6-well plates Costar 3506 Use for bioassay experiments
ascorbic acid Sigma Aldrich Co A0278
bile extract Sigma Aldrich Co B8631
Caco-2 cells American Type Culture Collection HTB-37 HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225 Falcon  353138
Cell culture flasks T25 Corning 430639
Cell culture flasks T75 Corning 430641U
Chelex-100 Bio-Rad Laboratories Inc 142832 Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen Corning 354236
dialysis membrane Spectrum Laboratories Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Gibco 12100046 DMEM
epidermal growth factor Sigma Aldrich Co E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit Eagle Biosciences FRR31-K01
fetal bovine serum R&D Systems S12450 Optima
HEPES Sigma Aldrich Co H3375
Hydrocortisone-Water Soluble Sigma Aldrich Co H0396
insert ring Corning Costar not sold Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin Sigma Aldrich Co I2643
KCl Sigma Aldrich Co P9333
large column VWR International KT420400-1530
Minimum Essential Medium Gibco 41500034 MEM
NaCl Fisher Scientific S271
pancreatin Sigma Aldrich Co P1750
PIPES disodium salt Sigma Aldrich Co Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin Sigma Aldrich Co P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit Bio-Rad Laboratories Inc Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings Web Seal, Inc Rochester NY 2-215S500
sodium bicarbonate Fisher Scientific S233
Sodium selenite Sigma Aldrich Co S5261
ZellShield Minerva Biolabs 13-0050 Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
  2. Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
  3. Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
  4. Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
  5. Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
  6. Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
  7. Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
  8. Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
  9. Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
  10. Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
  11. Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
  12. Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
  13. Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
  14. Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
  15. Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
  16. Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
  17. Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
  18. Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
  19. Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
  20. Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
  21. Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
  22. Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
  23. Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
  24. Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
  25. Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
  26. Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
  27. Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
  28. Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
  29. Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
  30. Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
  31. Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
  32. Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
  33. Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).

Tags

Biologi utgåva 182
Caco-2-cellbioassay för mätning av biotillgänglighet för livsmedelsjärn
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell… More

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability. J. Vis. Exp. (182), e63859, doi:10.3791/63859 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter