Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Биоанализ клеток Caco-2 для измерения биодоступности пищевого железа

Published: April 28, 2022 doi: 10.3791/63859
Automatic Translation
1
1United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service, Robert Holley Center for Agriculture and Health

Summary

Биоанализ клеток Caco-2 на биодоступность железа (Fe) представляет собой экономически эффективный и универсальный подход к оценке биодоступности Fe из продуктов питания, пищевых продуктов, добавок, блюд и даже режимов диеты. Тщательно подтвержденный для исследований на людях, он представляет собой современное состояние для исследований биодоступности Fe.

Abstract

Знание биодоступности Fe имеет решающее значение для оценки питательных качеств Fe в пищевых продуктах. Измерение биодоступности Fe in vivo ограничено стоимостью, пропускной способностью и предостережениями, присущими изотопной маркировке пищевого Fe. Таким образом, существует острая необходимость в подходе, который был бы высокопроизводительным и экономически эффективным. Биоанализ клеток Caco-2 был разработан для удовлетворения этой потребности. Биоанализ клеток Caco-2 для биодоступности Fe использует смоделированное желудочное и кишечное пищеварение в сочетании с культурой кишечной эпителиальной клеточной линии человека, известной как Caco-2. В клетках Caco-2 поглощение Fe стимулирует внутриклеточное образование ферритина, белка хранения Fe, легко измеряемого с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). Ферритин образуется пропорционально поглощению Fe; Таким образом, измеряя выработку ферритина клеток Caco-2, можно оценить поглощение кишечного Fe из смоделированных пищевых перевариваний в энтероцит.

Благодаря этому подходу модель воспроизводит ключевой начальный шаг, который определяет биодоступность пищевых продуктов Fe. С момента своего создания в 1998 году этот модельный подход тщательно сравнивался с факторами, которые, как известно, влияют на биодоступность Fe человека. Кроме того, он был применен в параллельных исследованиях, с тремя исследованиями эффективности человека, оценивающими биообогащенные культуры Fe. Во всех случаях биоанализ правильно предсказал относительные количества биодоступности Fe от факторов, культур и общего рациона. В данной статье представлены подробные методы изучения клеточной культуры Caco-2 в сочетании с процессом переваривания in vitro и ИФА клеточного ферритина, необходимыми для проведения биоанализа клеток Caco-2 на биодоступность Fe.

Introduction

Чтобы полностью понять исследовательскую потребность и преимущества биоанализа клеток Caco-2 для биодоступности Fe, необходимо сначала понять подходы, которые существовали до появления этой модели. Измерение биодоступности Fe из пищи или пищи in vivo является сложной задачей, особенно когда комбинации продуктов питания должны быть оценены в еде или диете. Изотопная маркировка была наиболее распространенным подходом к измерению биодоступности Fe за последние 50 лет1. Изотопная маркировка используется для одноразовых и многоразовых исследований и непрактична для долгосрочных исследований. Стабильные изотопы Fe, такие как 57Fe и 58Fe, являются наиболее часто используемыми; тем не менее, исследования были проведены с радиоизотопами, такими как 59Fe, с использованием подсчета всего тела2. Для растительных продуктов изотопная маркировка была выполнена с помощью внешней или внутренней маркировки. Для внешней маркировки известное количество изотопа добавляют в пищу или шрот. Затем пища смешивается, и 15-30-минутный период равновесия включается в протокол перед потреблением. Гидропонная культура, добавляющая изотоп в питательный раствор для включения его в растение во время его роста и развития, необходима для внутренней маркировки растительных продуктов. Плюсы и минусы каждого подхода обсуждаются ниже.

Внешняя изотопная маркировка
В начале-середине 1970-х годов поглощение Fe человеком изучалось путем внешней маркировки Fe в пищевых продуктах, при этом известное количество изотопа добавлялось к известному количеству Fe в пище или пище, смешивалось и уравновешивалось в течение 15-30 мин перед измерениями. Использовались различные количества внешних изотопов, варьирующиеся от 1% до 100% внутреннего Fe, но чаще всего в диапазоне 7%-30%3. Внешняя маркировка основана на предположении, что внешний изотоп Fe полностью уравновешивается с внутренним Fe пищи или пищи. Затем измеряется поглощение внешнего изотопа, и каждый атом внешнего изотопа рассчитывается как представляющий заданное число собственных атомов Fe. Этот расчет основан на относительных молярных количествах. В 1983 году многочисленные валидационные исследования этого метода были обобщены в обзорном документе4. Валидация метода проводилась путем одновременного сравнения процента поглощения внешней изотопной метки с процентом поглощения внутренней изотопной метки. Таким образом, отношение внешней и внутренней абсорбции, близкое к 1, предполагает, что каждый пул Fe был одинаково поглощен. В то время соотношение, близкое к 1, также считалось представляющим равновесие внешнего изотопа с внутренним Fe пищи или пищи. Отношение внешнего к внутреннему поглощению Fe варьировалось от средних значений от 0,40 до 1,62 со средним (±SD) отношением 1,08 ± 0,14 в 63 сравнениях. Важно отметить, что во всех исследованиях, обобщенных в этом обзоре, ни одно из них напрямую не проверяло равновесие внешней метки с внутренним Fe. Резюмируя, авторы обзора пришли к следующему выводу:

«Метод внешней маркировки доказал свою эффективность для нескольких продуктов питания при определенных экспериментальных условиях. Но, этот метод пока нельзя считать доказанным в отношении всех видов продуктов питания. Метод внешней метки не подходит для мониторинга всасывания железа из диеты, содержащей нерастворимые формы железа. Обоснованность этого метода основывается на базовом предположении, что внешняя метка полностью обменивается со всем эндогенным негемовым пищевым железом. В настоящее время неизвестно, насколько полностью различные формы негемового железа помечены внешней меткой. Это важно в свете исследований, которые показали, что ингибиторы железа могут влиять на внешнюю метку иначе, чем некоторые формы негемового железа в пищевых продуктах. Исследования пищевых факторов, которые могут нарушить полный изотопный обмен, скудны. Таким образом, интерпретация данных о биодоступности из исследований внешних меток требует рассмотрения ингибиторов обмена, которые могут присутствовать в пище или рационе».

С 1983 года было опубликовано только два исследования, в которых оценивалась точность внешней маркировки Fe 3,5. В обоих этих исследованиях уравновешивание внешней изотопной этикетки напрямую сравнивалось с внутренним Fe продуктов, которые в этих исследованиях были основными продовольственными культурами. Были протестированы белые, красные и черные сорта бобов, а также чечевица и кукуруза. Используя установленные методы переваривания in vitro и измерение растворимости Fe и осаждения, оба исследования показали, что внешняя изотопная маркировка не всегда приводит к полному уравновешиванию, с доказательствами того, что для некоторых сортов бобов неправильное равновесие может быть очень высоким в зависимости от количества внешнего изотопа и цвета семенной оболочки3. Несмотря на выводы обзорной статьи 1983 года, исследования внешней маркировки бобов продолжались 6,7,8,9,10,11,12. Ни одно из этих исследований не включало тестирование уравновешивания внешней метки с внутренним Fe.

Встроенная маркировка
Внутренняя маркировка растительной пищи для оценки биодоступности Fe устраняет вопросы точности уравновешивания во внешней маркировке. Однако такой подход не может дать большое количество материала из-за потребности в тепличном пространстве для гидропонной культуры. Гидропонная культура является трудоемкой, требует большого количества дорогостоящего стабильного изотопа и часто приводит к росту растений, различному с точки зрения урожайности и концентрации Fe семян. Из-за стоимости внутренняя маркировка подходит только для небольших исследований, направленных на понимание механизмов, лежащих в основе поглощения Fe или факторов, влияющих на поглощение Fe из пищевых продуктов. Производство 1-2 кг основной продовольственной культуры обходится примерно в 20 000-30 000 долларов США только за материалы, в зависимости от изотопного и гидропонного подхода13,14.

Учитывая проблемы, связанные с изотопной маркировкой, исследователи стремились разработать подходы in vitro. Ранние методы использовали смоделированную желудочную и кишечную пищу в сочетании с измерением растворимости Fe или диализуемости Fe в качестве оценки биодоступности15. Такие исследования быстро обнаружили, что диализуемость Fe не является последовательной мерой биодоступности, поскольку Fe может быть растворимым, плотно связанным с соединениями и, следовательно, не подлежащим обмену, что приводит к переоценке биодоступности. Для решения этих проблем была разработана методология использования клеточной линии кишечника человека, тем самым добавив живой компонент и позволив измерить поглощение Fe16. Клетки кишечника человека - клетки Caco-2 - возникли из рака толстой кишки человека и широко использовались в исследованиях поглощения питательных веществ. Эта клеточная линия полезна, так как в культуре клетки дифференцируются в энтероциты, которые функционируют аналогично клеткам границы кисти тонкой кишки. Исследования показали, что клетки Caco-2 проявляют соответствующие транспортеры и реакцию на факторы, влияющие на поглощение Fe17,18.

Первоначальные исследования, в которых использовались радиоизотопы для измерения поглощения Fe в клетках Caco-2, были уточнены для измерения поглощения Fe на основе образования ферритина клеток Caco-2. Измерение ферритина в клетках caco-2 повысило пропускную способность образца и свело на нет проблемы обработки радиоизотопов и уравновешивания внешнего Fe с внутренним Fe19,20. Измерение поглощения fe через образование ферритина позволило исследователям изучить широкий спектр продуктов питания, включая комплексные блюда21. Таким образом, смоделированное (in vitro) пищеварение в сочетании с поглощением Fe клеток Caco-2 обеспечило лучшую физиологическую оценку поглощения Fe из пищевых продуктов. Важно отметить, что эта модель в первую очередь определяет относительные различия в биодоступности Fe. Как и многие полезные клеточные линии, клетки Caco-2 также показали изменчивость реакции, но сохранили последовательные относительные различия в поглощении Fe между продуктами. Правильная техника и тщательное внимание к деталям могут улучшить последовательный ответ на образование ферритина в клетках Caco-2.

Модель клеточного сбраживания in vitro / Caco-2 также известна как биоанализ клеток Caco-2. Этот анализ был тщательно подтвержден путем прямого сравнения с исследованиями на людях и животных22. В дополнение к прямому параллельному сравнению биоанализа с испытаниями эффективности на людях, было показано, что эта модель демонстрирует качественно аналогичную реакцию в поглощении Fe с реакцией людей 18,19,23. Поэтому, как подход in vitro, биоанализ клеток Caco-2 заслуживает высокого доверия в качестве инструмента скрининга для оценки питания Fe из пищевых продуктов. Он широко применяется к многочисленным продуктам питания и пищевым продуктам 21,24,25,26,27,28.

С момента своего создания в 1998 году биоанализ клеток Caco-2 продвинул область питания Fe, поскольку он помог выявить факторы, влияющие на поглощение кишечника Fe. При этом эта модель разработала и уточнила исследовательские цели для более окончательных и менее дорогостоящих исследований на людях. Можно также утверждать, что использование модели сводит на нет необходимость в некоторых испытаниях на людях.

Таким образом, относительная доставка Fe из пищи или пищи может быть измерена с помощью биоанализа клеток Caco-2. Независимо от количества Fe в исследуемом приеме пищи, биоанализ определяет относительное количество Fe, поглощенного энтероцитом - первой стадией процесса абсорбции. Это наиболее важный шаг в определении биодоступности Fe, так как чаще всего цель состоит в том, чтобы измерить с намерением улучшить или, по крайней мере, контролировать питательные качества Fe в пище. Учитывая, что статус железа регулируется абсорбцией, и, таким образом, поглощение Fe регулируется у людей с дефицитом Fe для удовлетворения потребностей в питании, стандартные условия модели разработаны таким образом, чтобы поглощение Fe клетками было максимальным. Таким образом, биоанализ обеспечивает истинную меру потенциала пищи для доставки Fe.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве удобной точки отсчета для читателей следующая методология описывает конкретные условия культивирования и материалы, необходимые для измерения биодоступности Fe из 20 экспериментальных образцов, плюс требуемый контроль качества в ходе биоанализа. Увеличение количества образцов сверх этой емкости не рекомендуется из-за времени, необходимого для различных клеточных культур и этапов переваривания in vitro в рамках биоанализа.

1. Выбор количества образцов

  1. Для твердых или жидких пищевых продуктов определите количество пищи, которое можно считать репрезентативным для образца, подлежащего тестированию.
    1. При тестировании на биодоступность Fe из сорта бобов используйте 100-150 г семян бобов и обработайте это количество однородным образцом.
    2. Для жидких образцов, таких как обогащенные соки, молочные продукты и спортивные напитки, убедитесь, что пища хорошо перемешана перед отбором проб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество семенного материала фасоли, упомянутое выше, имеет важное значение для учета внутренних различий между семенами этой основной культуры.

2. Подготовка образцов

  1. Смойте почву и пыль с любого образца пищи дистиллированной деионизированной водой перед обработкой.
  2. Обработайте соответствующее количество образца в соответствии с экспериментальными целями, такими как метод приготовления пищи и измельчения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для приготовления пищи и обработки крайне важно использовать посуду и оборудование, которые не являются потенциальным источником загрязняющих веществ Fe. Оборудование из нержавеющей стали не загрязняется; однако такое оборудование, как шлифовальные станки для каменных мельниц, чугунная посуда и любое оборудование, не относящееся к нержавеющей стали, содержащее Fe, может добавлять значительное количество загрязняющих веществ Fe. Стандартная кофемолка из нержавеющей стали часто подходит для измельчения.
  3. Лиофилизировать и измельчить до однородного порошка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После гомогенизации исследования показали, что три независимых воспроизведения анализа достаточны для каждого измеряемого продукта.
    1. Если однородности образца трудно достичь, пересмотрите рецептуру или обработку продукта. Если это невозможно, добавьте репликации, если неоднородность не является серьезной.
    2. Для большинства однородных твердых продуктов используйте 0,5 г лиофилизированного образца на реплику. При необходимости используйте до 1,0 г образца на реплику, но проверьте, дает ли более 0,5 г пользу в степени отклика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количества, превышающие 0,5 г твердой пищи, могут засорить мембрану диализа (см. Ниже).
    3. Используйте 1-2 мл жидких образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лиофилизация часто не требуется для жидких образцов.

3. Культура клеток Како-2

  1. Стоковые культуры
    1. Приобретите ячейки Caco-2 у сертифицированного поставщика.
    2. Культивируйте клетки из флаконов при 37 °C в инкубаторе с 5% атмосферойCO2 воздуха (постоянная влажность) с использованием модифицированной среды Dulbecco's Eagle's Medium (DMEM), дополненной 25 мМ HEPES (рН 7,2), 10% (v/v) фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% антибиотически-антимикотическим раствором.
    3. Как только достаточное количество клеток доступно, обычно после 7-10 дней культивирования, засейте клетки в колбы, не покрытые коллагеном, с плотностью 30 000 клеток /см2.
    4. Выбирайте размер колбы в зависимости от количества ячеек, доступных и необходимых для посева многоскважинных пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, колбы T225 (225 см2) лучше всегоподходят для экспериментов, где используются 11 многоязычных (6-луночных; 9,66 см2/лунка) пластин (10 пластин для сравнения образцов, 1 пластина для контроля качества) на биоанализ.
    5. Выращивайте клетки в колбах в течение 7 дней, меняя среду через день, и используйте на7-й день для посева многолуночных пластин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать диапазон прохождения не более 10-15 пассажей с момента, когда клетки начинают из стоковой культуры и впоследствии используют в серии экспериментов. Проходы клеточной культуры должны быть ограничены, так как широкий диапазон проходов может привести к адаптивным изменениям в клеточной линии и, таким образом, изменчивости в реакции модели.
  2. Клеточная культура на многоязычных пластинах
    1. Засейте клетки Caco-2 плотностью 50 000 клеток/см2 в 6-луночных пластинах, покрытых коллагеном.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг обычно работает лучше всего, если он выполняется в среду. Следующие шаги сделают очевидным, почему этот день недели является оптимальным.
    2. Выращивайте клетки в течение 12 дней при 37 °C в инкубаторе с 5% CO2 атмосферой воздуха (постоянная влажность) с использованием DMEM, дополненного 25 мМ HEPES (рН 7,2), 10% (v/v) FBS и 1% антибиотико-антимикотическим раствором.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Культивирование клеточных монослоев более 12 дней может привести к разрастанию клеток. Предыдущие исследования ясно показали, что в этих условиях через 12 дней после посева клеточный монослой является зрелым, хорошо прикрепленным к пластине и оптимальным по консистенции ответа 29,30,31. Выращивание клеток дольше, например, до 19-21 дня, приводит к чрезмерному росту клеток, и среда быстро истощается питательными веществами, что приводит к нездоровым монослоям.
    3. В течение 12-дневного периода меняйте среду, по крайней мере, каждые 2 дня по последовательному ежедневному графику.
    4. На12-й день после посева заменить питательную среду 2 мл минимальной необходимой среды (MEM [pH 7]), дополненной 10 мМ PIPES (пиперазин-N,N'-бис-[2-этанесульфоновая кислота]), 1% антибиотически-антимикотическим раствором, гидрокортизоном (4 мг/л), инсулином (5 мг/л), селеном (5 мкг/л), трийодтиронином (34 мкг/л) и эпидермальным фактором роста (20 мкг/л).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если бы посев был начат в среду, то12-й день был бы понедельником.
    5. На следующий день (т.е. на 13-й день) удалите МЭМ и замените его 1 мл МЭМ (рН 7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг будет происходить во вторник. Это день, когда начинается биоанализ; таким образом, 13-дневный график дает преимущество последовательного еженедельного графика, позволяя проводить биоанализ последовательно в один и тот же будний день.

4. Пищеварение in vitro

  1. Подготовка вставных колец
    1. Создайте стерилизованное вставное кольцо с помощью силиконового уплотнительного кольца, оснащенного кислотной диализной мембраной (рисунок 1А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте вкладыши за 1 день (т.е. понедельник, день 12) дня биоанализа и храните в воде 18 МОм при 4 °C до готовности к использованию.
    2. В день биоанализа (вторник, день 13) снимите вставки из холодильника, слейте воду и замените воду на 0,5 М HCl. Оставьте ее при комнатной температуре в ламинарной вытяжке не менее чем на 1 ч перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен до удаления MEM из культуральных пластин. Кислотная промывка мембраны служит для удаления возможного загрязнения Fe и стерилизует вставное кольцо и мембрану.
    3. Слейте 0,5 М HCl со вкладышей и промойте стерильной водой 18 МОм. Хранить в стерильной воде 18 МОм комнатной температуры в ламинарной проточной вытяжке до готовности к использованию.
    4. Вставьте в каждую скважину кольцо из 6-луночных пластин с ячейками Caco-2, тем самым создав двухкамерную систему. Верните пластины со вставками в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг должен быть выполнен сразу после добавления свежих 1,0 мл MEM в каждую скважину (см. Шаг 3.2.5.).
  2. Приготовление раствора пепсина
    1. В день эксперимента готовят раствор пепсина, растворяя 0,145 г пепсина в 50 мл 0,1 М HCl. Аккуратно взбалтывайте раствор на платформенном шейкере в течение 30 мин при комнатной температуре.
  3. Приготовление панкреатин-желчного раствора
    1. В тот же день, что и эксперимент, готовят 0,1 М NaHCO3 , растворяя 2,1 г NaHCO3 в 250 мл воды 18 МОм.
    2. Смешайте 0,35 г панкреатина и 2,1 г экстракта желчи в 175 мл 0,1 М NaHCO3.
    3. После солюбилизации панкреатина и желчи добавляют 87,5 г слабой катионообменной смолы (см. Таблицу материалов) и перемешивают путем встряхивания в течение 30 мин при комнатной температуре.
    4. Вылейте навозную жижу в большую колонну и соберите элюат.
    5. Элюируют колонку дополнительными 70 мл 0,1 М NaHCO3, собирая этот объем в раствор желчи панкреатина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целью смолы является удаление загрязняющего Fe, обычно встречающегося в экстрактах панкреатин-желчи.
  4. Инициируют экстракоррозионное пищеварение.
    1. Взвешивают образец в стерильной центрифужной трубке (полипропилен) объемом 50 мл с последующим добавлением 10 мл физиологического раствора при рН 2, содержащего 140 мМ NaCl и 5 мМ KCl.
    2. Инициируют процесс желудочного сбраживания, добавляя 0,5 мл приготовленного раствора пепсина свиней к образцу и инкубируют на качающемся шейкере в низкой, щадящей установке в течение 1 ч при 37 °C.
    3. После этого периода инициируют процесс кишечного пищеварения каждого образца, регулируя рН до 5,5-6,0 с 1,0 М NaHCO3.
    4. Добавьте 2,5 мл раствора панкреатин-желчи в каждую пробирку и отрегулируйте рН до 6,9-7,0 с 1,0 М NaHCO3.
    5. После того, как pH отрегулирован, выровняйте объем в каждой трубке, используя раствор 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl (pH 6,7), измеряя вес трубки с целевым значением 15 г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для некоторых продуктов может потребоваться довести общий объем до 16 г или 17 г, в зависимости от буферной способности продуктов.
    6. Перенесите 1,5 мл каждого кишечного переваривания в верхнюю камеру (т.е. содержащую вставное кольцо с диализной мембраной) соответствующего колодца 6-луночной культуральной пластины, содержащей клетки Caco-2 (рисунок 1B).
    7. Замените крышку пластины и инкубируйте при 37 °C (5% CO2 воздушной атмосферы) на качающемся шейкере при 6 колебаниях/мин в течение 2 ч.
    8. Снимите вставное кольцо с дайджестом и добавьте дополнительный 1 мл MEM (рН 7) в каждую лунку.
    9. Верните пластину для культивирования клеток в инкубатор (37 °C; 5% CO2 в атмосфере воздуха) еще на 22 ч.
    10. Через 22 ч удаляют питательную среду клеток и добавляют 2,0 мл воды 18 МОм в клеточный монослой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вода будет осмотически лизировать клетки.
    11. Соберите весь клеточный лизат в стандартные полипропиленовые микроцентрифужные трубки или аналогичные для последующего анализа клеточного белка и клеточного ферритина.

5. Измерение ферритина клеток Caco-2 и клеточного белка

  1. Используйте лизат клеток из шага 4.4.10. для измерения клеточного ферритина и белка.
    1. Чтобы измерить содержание ферритина в клетках Caco-2, следуйте инструкциям набора (см. Таблицу материалов), за исключением увеличения времени инкубации с 30 мин до 2 ч для конъюгата мышиного анти-ферритинового антитела-пероксидазы хрена (HRP).
    2. Чтобы измерить клеточный белок, следуйте инструкциям, приведенным в наборе клеточного белка (см. Таблицу материалов).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Идентификация и измерение биодоступности Fe в основных продовольственных культурах
Одной из основных причин разработки этой модели было выявление факторов, влияющих на биодоступность Fe в основных продовольственных культурах, и предоставление селекционерам инструмента, который позволил бы им идентифицировать и развивать сорта с повышенной биодоступностью Fe. Фасоль обыкновенная (Phaseolus vulgaris) была выбрана во всем мире в качестве культуры для биофортификации Fe; таким образом, модель широко применяется для оценки питательных качеств Fe в широком диапазоне классов рынка бобов и программ разведения бобов. Например, желтые бобы являются классом развивающихся рынков в Соединенных Штатах. В таких регионах, как Восточная Африка, они очень популярны и широко известны как быстрые приготовления пищи и считаются многими «легко усваиваемыми». Недавние исследования с помощью биоанализа клеток Caco-2 показали, что некоторые сорта желтых бобов могут иметь высокую биодоступность Fe по сравнению с другими цветовыми классами (рисунок 2). В этом исследовании сорта мантеки были идентифицированы как имеющие высокую биодоступность Fe по сравнению с контрольными группами белого и красного цвета. Более того, результаты были последовательными в течение двух последовательных лет сбора урожая. Такие сравнения просто невозможны в других моделях, особенно в моделях in vivo , из-за высокой стоимости и гораздо более низкой пропускной способности испытаний на животных и людях.

Оценка влияния пищевой промышленности на биодоступность Fe
Биоанализ клеток Caco-2 также может быть применен для оценки влияния пищевой промышленности на биодоступность Fe. Например, результаты на рисунке 3 получены из анализа бобов и макаронных изделий на основе бобов нескольких цветовых классов. Результаты показывают, как переработка бобов в муку увеличила биодоступность Fe из белых (Snowdon, Alpena и Samurai) и желтых (Canario) сортов бобов. Для разновидностей клюквы (Etna), красной почки (Red Hawk) и черной (Zenith) биодоступность Fe снизилась в приготовлениях макаронной муки. Соответствующие анализы показали, что переработка бобов в муку разрушает клеточные стенки семядолии бобов, тем самым делая внутриклеточный Fe доступным для поглощения. Поглощение железа увеличилось в макаронных изделиях из белых и желтых бобов, поскольку семенные оболочки этих сортов не содержали полифенольных соединений, которые ингибируют биодоступность Fe. Напротив, семенные оболочки клюквы, красной почки и черных бобов содержат высокие уровни ингибирующих полифенолов, что снижает поглощение Fe. Эти результаты ясно указывают на полезность модели в выявлении факторов, которые могут влиять на питательные качества Fe, которые в противном случае остались бы незамеченными.

Figure 1
Рисунок 1: Установка вставьте кольцо для поглощения Fe клеток Caco-2. (A) Изображение клеток Caco-2 и вставьте кольцо с прикрепленной мембраной диализа. (B) Диаграмма общей процедуры переваривания in vitro в сочетании с поглощением Fe клеток Caco-2 в пределах одной лунки многолуночной пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Показатели биодоступности железа несмоченных и приготовленных генотипов цельных семян в разнообразной панели желтых бобов. (A) Полевой сезон 2015 года; (B) полевой сезон 2016. Значения являются средними (стандартными отклонениями) трехкратных измерений из двух полевых реплик на генотип (n = 6). Генотипы классифицируются по оси X по кулинарным классам, ранжированным от самого быстрого приготовления генотипа до самого медленного приготовления. * Значительно более низкий (p < 0,05) показатель биодоступности железа, чем в других записях YBP. ** Значительно более высокие (p < 0,05) показатели биодоступности железа, чем у других генотипов YBP. Эта цифра была изменена с32. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Биодоступность железа, выраженная в виде образования ферритина в клетках Caco-2 (нанограмм ферритина на миллиграмм клеточного белка) сортов бобов и соответствующих им спагетти на основе бобов. (A) Три сорта белых бобов и соответствующие им спагетти на основе бобов; (B) четыре разновидности цветных бобов и соответствующие им спагетти на основе бобов. Значения представляют собой среднее (± стандартное отклонение) шести измерений от каждой разновидности. Синяя дефисная линия указывает на биодоступность железа необогащенных макаронных изделий из твердых сортов пшеницы, экструдированных, приготовленных и обработанных таким же образом, как спагетти на основе бобов. * Значительно (p ≤ 0,05) более высокое образование ферритина в клетках Caco-2, чем в целых бобах после приготовления. ** Значительно (p ≤ 0,05) более низкое образование ферритина в клетках Caco-2, чем у целых бобов после приготовления. Эта цифра была изменена с33. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

С момента его создания были опубликованы многочисленные исследования, которые описывают этот метод для биоанализа клеток Caco-2. Основные условия остались относительно неизменными со времени первоначальной публикации в 1998 году18. Однако за последние 20 лет многочисленные технические детали были уточнены и стандартизированы, чтобы обеспечить беспрецедентную последовательность в ответе биоанализа. Тщательное и точное следование клеточной культуре и условиям переваривания in vitro являются ключом к последовательной и чувствительной реакции биоанализа.

Исходя из нашего опыта в обучении многочисленных людей использованию этого метода, наиболее распространенной борьбой является правильная культура клеток Caco-2. Последовательная культивирование здоровых монослоев является ключом к здоровым и отзывчивым монослоям клеток Caco-2. Если уровни клеточного белка не очень последовательны от колодца к колодцу и не находятся в пределах диапазона клеточного белка, указанного в протоколе, исследователь должен пересмотреть условия клеточной культуры на предмет отклонения от протокола. Альтернативно, может существовать низкоуровневое загрязнение микроорганизмами, инкубатор клеточной культуры может работать неправильно или среда клеточного культивирования может быть неправильно сформулирована.

Процесс пищеварения in vitro является еще одним источником потенциальных проблем. Удаление загрязняющего Fe из пищеварительных ферментов имеет решающее значение. Несмотря на заявления производителя, разумно периодически проверять концентрацию Fe ферментов и убедиться, что процесс удаления Fe (см. протокол) эффективен. Если загрязнение Fe присутствует в пищеварительных ферментах, то базовый контроль качества пищеварения даст значения ферритина клеток, превышающие рекомендуемый диапазон.

Опытный и обученный исследователь должен быть в состоянии проанализировать 20 экспериментальных образцов, плюс контроль качества, за один прогон биоанализа. Таким образом, для каждого запуска биоанализа необходимо примерно 12 шестилуночных пластин. Более высокое количество образцов на биоанализ не рекомендуется, поскольку сроки титрования рН во время процесса пищеварения могут быть слишком длительными, что приводит к потенциальному несоответствию между временами переваривания образца.

Недостатков у этой модели относительно немного. Для этого требуются исследователи, обладающие высокой квалификацией в области клеточной культуры и способные уделять точное внимание деталям и протоколу. Лабораторное пространство должно быть чистым от источников загрязнения Fe, а реагенты и другие материалы должны регулярно контролироваться на предмет загрязнения Fe. Таким образом, пользователь должен иметь возможность или доступ к приборам для измерения концентрации Fe. Эта модель является лишь относительной или полуколичественной мерой. Однако при правильном использовании эталонных элементов управления модель может обеспечить некоторые количественные оценки поглощения Fe. Действительно, уравнение преобразования коэффициентов поглощения контрольного и испытательного материала было получено19.

Биоанализ работает по следующему принципу: клетки Caco-2 производят больше ферритинового белка в ответ на увеличение клеточных концентраций Fe. Поэтому биодоступность Fe пропорциональна увеличению производства ферритина клеток Caco-2. Это увеличение выражается в соотношении клеточного ферритина к общему клеточному белку Како-2 (нанограмм ферритина на миллиграмм общего клеточного белка) после воздействия на переваренный образец19. Измерения ферритина производятся с использованием набора ИФА (см. Таблицу материалов), протестированного на реакцию в этом биоанализе. Общие концентрации белка в клетках количественно оцениваются с помощью набора для анализа белка. Как упоминалось ранее, в условиях, используемых для этого метода, типичные уровни клеточного белка Caco-2 в шестилуночной пластине варьируются от 2,0 мг до 2,6 мг клеточного белка на лунку. Значения за пределами этого диапазона указывают на нездоровые клеточные культуры, возможный чрезмерный рост клеток или плохую технику посева клеток. В течение данного пробега биоанализа значения должны варьироваться только до 0,2 мг на лунку. Кроме того, при плотности посева и условиях культивирования, используемых в данной методологии, через 13 дней после посева наблюдается существенная активность фермента границы кустарника, что указывает на созревание большинства, если не всего, клеточного монослоя 28,29,30. Контролируйте клеточные монослои в течение 13 дней до использования на предмет загрязнения или стресса, такого как образование вакуоли или разрывы в образовании монослоя. Если такие условия очевидны, клетки не следует считать действительными для использования в биоанализе.

Чтобы контролировать реакцию биоанализа Caco-2, каждый эксперимент должен проводиться с несколькими средствами контроля качества, включая пустой дайджест, содержащий только физиологически сбалансированный физиологический раствор и желудочно-кишечные ферменты. Эти средства контроля гарантируют отсутствие загрязнения Fe в биоанализе. Значения ферритина клеток Како-2, подвергающихся воздействию пустого пищеварительного тракта, обычно варьируются от 1 нг до 6 нг клеточного белка ферритина/мг. Исходный уровень ферритина в этом диапазоне также указывает на то, что клетки находятся в относительно низком fe-статусе и, таким образом, должны проявлять максимальную чувствительность к имеющемуся Fe.

В течение первых 15 лет использования дополнительный контроль качества включал 1) пустой дайджест с FeCl3 (66 мкМ) и 2) пустой дайджест FeCl3 (66 мкМ) плюс добавление 1,3 мМ аскорбиновой кислоты. Значения ферритина для дигеста FeCl3 обычно находились в диапазоне 30-50 нг клеточного белка ферритина/мг, а дигест FeCl3 с аскорбиновой кислотой находился в диапазоне 250-400 нг клеточного белка ферритина/мг. В последние годы пустой дайджест остается средством контроля качества; однако мы перешли на использование образца пищи с аскорбиновой кислотой и без нее в соотношении 20:1, аскорбат:Fe. Использованный образец пищи представлял собой муку из белых бобов, которая содержит приблизительно 65 мкг Fe/г образца. Эти средства контроля качества дают более узкий и последовательный диапазон ответа, давая 20-30 нг ферритина / мг клеточного белка для муки из белых бобов и 70-150 нг ферритина / мг клеточного белка для белой бобовой муки плюс аскорбат. Следует отметить, что новый диапазон значений взят из упомянутого комплекта в Таблице материалов, который, как правило, немного ниже, чем ныне несуществующий комплект Ramco ELISA. На момент публикации этой рукописи с помощью ссылочного комплекта были получены данные только за 2-3 месяца.

Важно распознавать результаты и условия клеточной культуры, которые указывают на недействительный или неподдельный запуск биоанализа. Во-первых, как указано в способах, если условия пустого переваривания дают концентрации ферритина в клетках выше, чем предложенный диапазон, это может указывать на загрязнение Fe среды клеточного культуры, пищеварительных ферментов или мембраны диализа. Допустимые концентрации Fe для клеточной культуральной среды и пищеварительных ферментов составляют <20 мкг Fe/мл. Значения, выходящие за рамки диапазона для других средств контроля качества, особенно если они находятся на низкой стороне, также указывают на то, что достоверность результатов сомнительна.

Таким образом, эта модель очень чувствительна к биодоступному Fe, так как условия клеточной культуры предназначены для создания клеток с низким Fe-статусом; таким образом, их механизмы поглощения Fe сильно регулируются. Это надежная модель, способная обеспечить высокую пропускную способность. Любая пища или диета, которые могут быть скормлены человеку, могут быть оценены в этой модели, и, следовательно, биоанализ имеет широкий спектр применений. Селекционеры растений могут использовать эту модель для измерения биодоступности Fe в основных продуктах питания, выявляя признаки и хромосомные области, которые влияют на биодоступность Fe. Ученые в области пищевых продуктов могут применять модель для определения оптимальных составов и оценки эффектов обработки для обеспечения адекватной биодоступности Fe. Диетологи могут использовать модель для оценки и мониторинга биодоступности диетического Fe из отдельных продуктов, комбинаций продуктов питания и даже планов диеты. Он был тщательно проверен в испытаниях на людях, правильно предсказывая направление и величину эффектов в каждом применении. Таким образом, сочетая смоделированное пищеварение с поглощением Fe эпителиальными клетками кишечника, эта модель представляет собой критический первый шаг в процессе абсорбции Fe и, следовательно, способна предсказать доставку или биодоступность Fe из пищевых продуктов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У автора нет конфликта интересов.

Acknowledgments

Автор глубоко признателен за технические усилия Yongpei Chang и Mary Bodis. Чрезвычайно успешное применение этой модели в области питания является прямым результатом их опыта и внимания к деталям. Разработка этой модели полностью финансировалась Министерством сельского хозяйства СОЕДИНЕННЫХ Штатов, Службой сельскохозяйственных исследований.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M HCl Fisher Scientific A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade
18 megaohm water Also known as distilled, deionized water
3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt Sigma Aldrich Co T6397
6-well plates Costar 3506 Use for bioassay experiments
ascorbic acid Sigma Aldrich Co A0278
bile extract Sigma Aldrich Co B8631
Caco-2 cells American Type Culture Collection HTB-37 HTB-37 is a common variety.
Cell culture flasks T225 Falcon  353138
Cell culture flasks T25 Corning 430639
Cell culture flasks T75 Corning 430641U
Chelex-100 Bio-Rad Laboratories Inc 142832 Known as the weak cation exchange resin in the protocol
collagen Corning 354236
dialysis membrane Spectrum Laboratories Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium Gibco 12100046 DMEM
epidermal growth factor Sigma Aldrich Co E4127-5X.1MG
Ferritin ELISA Assay Kit Eagle Biosciences FRR31-K01
fetal bovine serum R&D Systems S12450 Optima
HEPES Sigma Aldrich Co H3375
Hydrocortisone-Water Soluble Sigma Aldrich Co H0396
insert ring Corning Costar not sold Transwell, for 6 well plate, without membrane
insulin Sigma Aldrich Co I2643
KCl Sigma Aldrich Co P9333
large column VWR International KT420400-1530
Minimum Essential Medium Gibco 41500034 MEM
NaCl Fisher Scientific S271
pancreatin Sigma Aldrich Co P1750
PIPES disodium salt Sigma Aldrich Co Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768
porcine pepsin Sigma Aldrich Co P6887 or (P7012-25G Sigma
protein assay kit Bio-Rad Laboratories Inc Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 Measurement of Caco-2 cell protein
silicone o rings Web Seal, Inc Rochester NY 2-215S500
sodium bicarbonate Fisher Scientific S233
Sodium selenite Sigma Aldrich Co S5261
ZellShield Minerva Biolabs 13-0050 Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
  2. Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
  3. Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
  4. Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
  5. Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
  6. Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
  7. Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
  8. Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
  9. Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
  10. Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
  11. Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
  12. Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
  13. Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
  14. Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
  15. Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
  16. Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
  17. Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
  18. Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
  19. Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
  20. Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
  21. Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
  22. Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
  23. Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
  24. Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
  25. Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
  26. Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
  27. Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
  28. Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
  29. Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
  30. Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
  31. Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
  32. Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
  33. Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).

Tags

Биология выпуск 182
Биоанализ клеток Caco-2 для измерения биодоступности пищевого железа
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell… More

Glahn, R. P. The Caco-2 Cell Bioassay for Measurement of Food Iron Bioavailability. J. Vis. Exp. (182), e63859, doi:10.3791/63859 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter