Summary
Caco-2-cellebioassay for jern (Fe) biotilgjengelighet representerer en kostnadseffektiv og allsidig tilnærming for å vurdere Fe-biotilgjengelighet fra matvarer, matvarer, kosttilskudd, måltider og til og med diettregimer. Grundig validert til menneskelige studier, representerer det toppmoderne for studier av Fe biotilgjengelighet.
Abstract
Kunnskap om Fe biotilgjengelighet er avgjørende for vurderingen av næringskvaliteten til Fe i matvarer. In vivo-måling av Fe-biotilgjengelighet er begrenset av kostnad, gjennomstrømning og forbeholdene som er forbundet med isotopisk merking av maten Fe. Dermed eksisterer det et kritisk behov for en tilnærming som er høy gjennomstrømning og kostnadseffektiv. Caco-2-cellebioassay ble utviklet for å tilfredsstille dette behovet. Caco-2-cellebioassayet for Fe-biotilgjengelighet benytter simulert mage- og tarmfordøyelse kombinert med kultur av en human tarmepitelcellelinje kjent som Caco-2. I Caco-2-celler stimulerer Fe-opptak den intracellulære dannelsen av ferritin, et Fe-lagringsprotein som lett måles ved enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA). Ferritinformer i forhold til Fe-opptak; Ved å måle Caco-2-celleferritinproduksjon kan man således vurdere intestinal Fe-opptak fra simulerte matfordøyelser inn i enterocytten.
Via denne tilnærmingen replikerer modellen det viktigste første trinnet som bestemmer mat Fe biotilgjengelighet. Siden starten i 1998 har denne modelltilnærmingen blitt grundig sammenlignet med faktorer som er kjent for å påvirke menneskelig Fe-biotilgjengelighet. Videre har det blitt brukt i parallelle studier, med tre humane effektstudier som evaluerer Fe biofortifiserte avlinger. I alle tilfeller forutslo bioassayet riktig de relative mengdene Fe-biotilgjengelighet fra faktorene, avlingene og det generelle kostholdet. Dette papiret gir detaljerte metoder for Caco-2-cellekultur kombinert med in vitro fordøyelsesprosessen og celleferritin ELISA som er nødvendig for å utføre Caco-2-cellebioassay for Fe-biotilgjengelighet.
Introduction
For å fullt ut forstå forskningsbehovet og fordelen med Caco-2-cellebioassay for Fe-biotilgjengelighet, må man først forstå tilnærmingene som var på plass før ankomsten av denne modellen. Måling av Fe-biotilgjengelighet fra mat eller måltid in vivo er en utfordrende oppgave, spesielt når kombinasjoner av mat må vurderes i et måltid eller diett. Isotopmerking har vært den vanligste tilnærmingen for måling av Fe-biotilgjengelighet de siste 50 årene1. Isotopisk merking brukes til studier med ett måltid og flere måltider og er upraktisk for langtidsstudier. Stabile isotoper av Fe som 57Fe og 58Fe er de mest brukte; Imidlertid har studier blitt utført med radioisotoper som 59Fe, ved bruk av helkroppstelling2. For plantefôr har isotopmerking blitt gjort via ekstrinsisk eller inneboende merking. For ekstrinsisk merking tilsettes en kjent mengde isotop til maten eller måltidet. Maten blandes deretter, og en 15-30 min likevektsperiode innlemmes i protokollen før forbruket. Hydroponisk kultur - tilsetning av isotopen til næringsoppløsningen for å innlemme den i planten mens den vokser og utvikler seg - er nødvendig for egen merking av plantefôr. Fordeler og ulemper ved hver tilnærming er diskutert nedenfor.
Ekstrinsisk isotopisk merking
I begynnelsen til midten av 1970-tallet ble human Fe-absorpsjon studert ved ekstrinsisk merking av Fe i matvarer, hvor en kjent mengde isotop legges til den kjente mengden Fe i maten eller måltidet, blandet og likevektet i 15-30 minutter før målinger. Ulike mengder ekstrinsiske isotoper har blitt brukt, alt fra 1% til 100% av den inneboende Fe, men oftest i området 7% -30% 3. Ekstrinsisk merking er basert på antagelsen om at den ekstrinsiske Fe-isotopen blir fullt likevektet med den inneboende Fe av maten eller måltidet. Ekstrinsisk isotopabsorpsjon måles deretter, og hvert atom av den ekstrinsiske isotopen beregnes å representere et gitt antall inneboende Fe-atomer. Denne beregningen er basert på de relative molare mengdene. I 1983 ble flere valideringsstudier av teknikken oppsummert i en oversiktsartikkel4. Validering av teknikken ble gjort ved samtidig å sammenligne prosentabsorpsjonen av den ekstrinsiske isotopetiketten med prosentabsorpsjonen av en inneboende isotopetikett. Dermed antyder et forhold mellom ekstrinsisk og inneboende absorpsjon nær 1 at hvert basseng av Fe ble absorbert likt. På den tiden ble et forhold nær 1 også ansett å representere likevekt av den ekstrinsiske isotopen med den inneboende Fe av maten eller måltidet. Forholdet mellom ekstrinsisk og intrinsisk Fe-absorpsjon varierte fra gjennomsnittsverdier på 0,40 til 1,62, med et gjennomsnittlig (±SD) forhold på 1,08 ± 0,14 i 63 sammenligninger. Det er viktig å merke seg at i alle studiene oppsummert i denne anmeldelsen, testet ingen direkte likevekten av den ekstrinsiske etiketten med den inneboende Fe. Oppsummert konkluderte forfatterne av oversikten med følgende:
– Den ekstrinsiske merketeknikken har vist seg å være gyldig for flere matvarer under visse eksperimentelle forhold. Men denne metoden kan ennå ikke betraktes som bevist med hensyn til alle typer matvarer. Den ekstrinsiske tag-metoden er ikke egnet for å overvåke jernabsorpsjon fra en diett som inneholder uoppløselige former for jern. Gyldigheten av denne teknikken er avhengig av den grunnleggende antagelsen om at den ekstrinsiske taggen utveksler helt med alt endogent nonheme matjern. For tiden er det ikke kjent hvor fullstendig de forskjellige formene for nonheme jern er merket av en ekstrinsisk tag. Dette er viktig i lys av studier som har antydet at jernhemmere kan påvirke ekstrinsisk tag annerledes enn noen former for nonheme jern i matvarer. Forskning på matfaktorer som kan svekke en komplett isotoputveksling er liten. Dermed krever tolkning av biotilgjengelighetsdata fra ekstrinsisk tagforskning vurdering av inhibitorer av utveksling som kan være tilstede i maten eller dietten.
Siden 1983 har bare to studier blitt publisert som evaluerte nøyaktigheten av ekstrinsisk merking av Fe 3,5. I begge disse studiene ble likevekten av en ekstrinsisk isotopisk etikett direkte sammenlignet med den inneboende Fe av matvarene, som i disse studiene var stiftmatavlinger. Hvite, røde og svarte bønnesorter ble testet, sammen med linser og mais. Ved å bruke etablerte in vitro fordøyelsesteknikker og måling av Fe-løselighet og nedbør, viste begge studiene at ekstrinsisk isotopmerking ikke konsekvent resulterer i full likevekt, med bevis på at for noen bønnevarianter kan ulikheten være svært høy avhengig av mengden ekstrinsisk isotop og frøbeleggfarge3. Til tross for konklusjonene fra 1983-gjennomgangspapiret fortsatte ekstrinsiske merkingsstudier av bønner 6,7,8,9,10,11,12. Ingen av disse studiene inkluderte testing av likevekten av den ekstrinsiske etiketten med den indre Fe.
Egenmerking
Egenmerking av plantefôr for vurdering av Fe-biotilgjengelighet eliminerer nøyaktighetsproblemene med likevekt i ekstrinsisk merking. Denne tilnærmingen kan imidlertid ikke gi store mengder materiale på grunn av kravet om drivhusplass for hydroponisk kultur. Hydroponisk kultur er arbeidsintensiv, krever en høy mengde dyr stabil isotop, og resulterer ofte i plantevekst forskjellig når det gjelder utbytte og frø Fe-konsentrasjon. På grunn av kostnadene er egenmerking bare egnet for småskalastudier som tar sikte på å forstå mekanismer som ligger til grunn for Fe-opptak eller faktorer som påvirker Fe-opptak fra matvarer. Produksjon av 1-2 kg av en stiftmatavling koster omtrent $ 20.000 - $ 30.000 for materialer alene, avhengig av isotop og hydroponisk tilnærming13.14.
Gitt utfordringene knyttet til isotopmerking, forsøkte etterforskerne å utvikle in vitro-tilnærminger. Tidlige metoder benyttet simulert mage- og tarmmat, kombinert med måling av Fe-løselighet eller Fe-dialyserbarhet som et estimat av biotilgjengelighet15. Slike studier fant raskt at Fe-dialyserbarhet ikke var et konsistent mål på biotilgjengelighet, da Fe kan være løselig, tett bundet til forbindelser og derfor ikke utskiftbar, noe som fører til overestimering av biotilgjengelighet. For å løse disse problemene utviklet metodikken for å utnytte en human tarmcellelinje, og dermed legge til en levende komponent og muliggjøre måling av Fe-opptak16. De humane tarmcellene - Caco-2-celler - stammer fra et humant kolonkarsinom og har blitt mye brukt i næringsopptaksstudier. Denne cellelinjen er nyttig da cellene i kultur skiller seg ut i enterocytter som fungerer på samme måte som tynntarmens børstekantceller. Studier har vist at Caco-2-celler viser passende transportører og respons på faktorer som påvirker Fe-opptaket17,18.
De første studiene, som benyttet radioisotoper for å måle Fe-opptak i Caco-2-celler, ble raffinert for å måle Fe-opptak basert på Caco-2-celleferritindannelse. Caco-2-celleferritinmåling forbedret prøvegjennomstrømning og negerte problemer med radioisotophåndtering og likevekt av ekstrinsisk Fe med inneboende Fe19,20. Måling av Fe-opptak via ferritindannelse gjorde det mulig for forskere å studere et bredt spekter av matvarer, inkludert komplekse måltider21. Dermed ga simulert (in vitro) fordøyelse kombinert med Caco-2-celle Fe-opptak en bedre fysiologisk vurdering av Fe-opptak fra matvarer. Det er viktig å merke seg at denne modellen først og fremst bestemmer relative forskjeller i Fe-biotilgjengelighet. Som mange nyttige cellelinjer har Caco-2-celler også vist variasjon i respons, men har opprettholdt konsistente relative forskjeller i Fe-opptak mellom matvarer. Riktig teknikk og nøye oppmerksomhet på detaljer kan forbedre konsistent celleferritindannelsesrespons i Caco-2-celler.
In vitro fordøyelsen / Caco-2 cellemodellen er også kjent som Caco-2 cellebioassay. Denne analysen har blitt grundig validert via direkte sammenligning med studier på mennesker og dyr22. I tillegg til den direkte parallelle sammenligningen av bioassay til humane effektforsøk, har denne modellen vist seg å vise en kvalitativt lik respons i Fe-opptak til den for mennesker18,19,23. Derfor, som en in vitro-tilnærming, garanterer Caco-2-cellebioassay høy troverdighet som et screeningsverktøy for å evaluere Fe-ernæring fra matvarer. Det har blitt mye brukt på mange matvarer og matvarer 21,24,25,26,27,28.
Siden starten i 1998 har Caco-2-cellebioassay avansert feltet Fe-ernæring, da det har bidratt til å identifisere faktorer som påvirker intestinal Fe-opptak. På denne måten har denne modellen utviklet og raffinert forskningsmål for mer definitive og mindre kostbare menneskelige studier. Man kan også argumentere for at bruken av modellen negerer behovet for noen menneskelige forsøk.
Oppsummert kan den relative leveransen av Fe fra en mat eller et måltid måles med Caco-2-cellebioassay. Uavhengig av mengden Fe i testmåltidet, definerer bioassay den relative mengden Fe tatt opp i enterocytten - det første trinnet i absorpsjonsprosessen. Dette er det viktigste trinnet i å definere Fe-biotilgjengelighet, da målet oftest er å måle med den hensikt å forbedre eller i det minste overvåke næringskvaliteten til Fe i en mat. Gitt at jernstatus reguleres av absorpsjon, og dermed Fe-opptak er oppregulert hos Fe-mangelfulle individer for å møte ernæringsmessige behov, er standardbetingelsene for modellen utformet slik at Fe-opptak av cellene er maksimalt. På denne måten gir bioassay et sant mål på potensialet til maten for å levere Fe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Som et praktisk referansepunkt for leserne beskriver følgende metodikk de spesifikke kulturforholdene og materialene som kreves for måling av Fe-biotilgjengelighet fra 20 eksperimentelle prøver, pluss de nødvendige kvalitetskontrollene, i en kjøring av bioassay. Økning av antall prøver utover denne kapasiteten anbefales ikke på grunn av tiden som kreves for ulike cellekulturer og in vitro fordøyelsestrinn i bioassay.
1. Velge antall prøver
- For faste eller flytende matvarer, bestem en mengde mat som kan betraktes som representativ for prøven som skal testes.
- Ved testing for Fe-biotilgjengelighet fra en bønnesort, bruk 100-150 g bønnefrø og behandle denne mengden til en homogen prøve.
- For flytende prøver som forsterket juice, melkeprodukter og sportsdrikker, sørg for at maten er godt blandet før prøvetaking.
MERK: Mengden bønnefrømateriale nevnt ovenfor er viktig for å ta hensyn til de iboende forskjellene mellom frø av denne stiftavlingen.
2. Klargjøring av prøver
- Skyll av jord og støv fra enhver matprøve med destillert avionisert vann før behandling.
- Behandle riktig mengde prøve i henhold til eksperimentelle mål, for eksempel ved tilberedningsmetode og fresing.
MERK: For matlaging og prosessering er det viktig å bruke kokekar og utstyr som ikke er en potensiell kilde til forurensning Fe. Rustfritt stålutstyr forurenser ikke; Utstyr som steinmøllekverner, kokekar i støpejern og utstyr i ikke-rustfritt stål som inneholder Fe, kan imidlertid tilføre betydelige mengder forurensning Fe. En standard kaffekvern i rustfritt stål er ofte tilstrekkelig for sliping. - Lyofiliser og slip til et homogent pulver.
MERK: Når homogenisert, har forskning vist at tre uavhengige replikasjoner av analyse er tilstrekkelig for hver mat som måles.- Hvis prøvehomogenitet er vanskelig å oppnå, må du revidere formuleringen eller behandlingen av produktet. Hvis dette ikke er mulig, legg til replikasjoner hvis ikke-homogeniteten ikke er alvorlig.
- For de fleste homogene faste matvarer, bruk 0,5 g lyofilisert prøve per replikasjon. Bruk om nødvendig opptil 1,0 g prøve per replikasjon, men sjekk om mer enn 0,5 g gir en fordel i responsgraden.
MERK: Mengder høyere enn 0,5 g fast føde kan tette dialysemembranen (se nedenfor). - Bruk 1-2 ml flytende prøver.
MERK: Lyofilisering er ofte ikke nødvendig for væskeprøver.
3. Caco-2 cellekultur
- Lagerkulturer
- Skaff Caco-2-celler fra en sertifisert leverandør.
- Dyrk cellene fra lagerflasker ved 37 ° C i en inkubator med en 5% CO 2 luftatmosfære (konstant fuktighet) ved bruk av Dulbeccos Modified Eagle's Medium (DMEM) supplert med 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) føtalt bovint serum (FBS) og 1% antibiotika-antimykotisk løsning.
- Når tilstrekkelige celler er tilgjengelige, vanligvis etter 7-10 dager med kultur, frø cellene i ikke-kollagenbelagte kolber med en tetthet på 30.000 celler / cm2.
- Velg kolbestørrelse avhengig av antall celler som er tilgjengelige og nødvendige for såing av flerbrønnsplater.
MERK: Generelt fungerer T225 (225 cm 2) kolber best for eksperimenter der 11 multiwell (6-brønn; 9,66 cm2 / brønn) plater brukes (10 plater for prøvesammenligninger, 1 plate for kvalitetskontroller) per bioassay. - Dyrk celler i kolber i 7 dager, bytt medium annenhver dag, og bruk på den 7.dagen for såing av multiwellplatene.
MERK: Det anbefales å bruke et passasjeområde på ikke mer enn 10-15 passasjer fra når cellene startes fra lagerkultur og deretter brukes i en rekke eksperimenter. Cellekulturpassasjer bør begrenses, da et bredt spekter av passasjer kan resultere i adaptive endringer i cellelinjen og dermed variasjon i modellens respons.
- Cellekultur på multiwellplater
- Frø Caco-2-cellene med en tetthet på 50 000 celler / cm2 i 6-brønns kollagenbelagte plater.
MERK: Dette trinnet fungerer vanligvis best hvis det gjøres på en onsdag. Følgende trinn vil gjøre det tydelig hvorfor denne dagen i uken er optimal. - Dyrk cellene i 12 dager ved 37 ° C i en inkubator med en 5% CO 2 luftatmosfære (konstant fuktighet) ved bruk av DMEM supplert med 25 mM HEPES (pH7,2 ), 10% (v / v) FBS og 1% antibiotika-antimykotisk løsning.
MERK: Dyrking av cellemonolagene lenger enn 12 dager kan føre til celleovervekst. Tidligere forskning har tydelig vist at under disse forholdene, 12 dager etter såing, er cellemonolaget modent, festet godt til platen og optimalt i konsistensen av respons 29,30,31. Å dyrke cellene lenger, for eksempel opptil 19-21 dager, resulterer i cellevekst, og media tømmer raskt næringsstoffer, noe som resulterer i usunne monolag. - I løpet av 12-dagersperioden, bytt medium minst hver 2. dag på en konsekvent daglig tidsplan.
- På den 12. dagen etter såing, erstatt kulturmediet med 2 ml minimum essensielt medium (MEM [pH 7]) supplert med 10 mM RØR (piperazin-N, N'-bis-[2-etansulfonsyre]), 1% antibiotika-antimykotisk løsning, hydrokortison (4 mg / L), insulin (5 mg / L), selen (5 μg / L), triiodothyronin (34 μg / L) og epidermal vekstfaktor (20 μg / L).
MERK: Hvis seeding ble startet på en onsdag, ville den 12. dagen være en mandag. - Neste dag (dvs. dag 13), fjern MEM og erstatt den med 1 ml MEM (pH 7).
MERK: Dette trinnet vil skje på en tirsdag. Dette er dagen da bioassay begynner; Dermed gir 13-dagers tidsplanen fordelen av en konsekvent ukeplan, slik at bioassay kan utføres konsekvent på samme ukedag.
- Frø Caco-2-cellene med en tetthet på 50 000 celler / cm2 i 6-brønns kollagenbelagte plater.
4. In vitro fordøyelse
- Forberedelse av innsatsringer
- Lag en sterilisert innsatsring med en silikon O-ring utstyrt med en syrevasket dialysemembran (figur 1A).
MERK: Klargjør innsatser 1 dag i forveien (dvs. mandag, dag 12) av bioassaydagen og oppbevar i 18 MΩ vann ved 4 °C til de er klare til bruk. - På dagen for bioassay (tirsdag, dag 13), fjern innsatsene fra kjøleskapet, avløp og erstatt vannet med 0,5 M HCl. La det stå i romtemperatur i en laminær strømningshette i minst 1 time før bruk.
MERK: Dette trinnet bør gjøres før du fjerner MEM fra kulturplatene. Syrevask av membranen tjener til å fjerne mulig forurensende Fe og steriliserer innsatsringen og membranen. - Tøm 0,5 M HCl fra innsatsene og skyll med sterilt 18 MΩ vann. Oppbevares i sterilt 18 MΩ vann ved romtemperatur i en laminær strømningshette til den er klar til bruk.
- Sett en ring inn i hver brønn i 6-brønnsplatene med Caco-2-celler, og opprett dermed et tokammersystem. Returner platene med innsatsene til inkubatoren.
MERK: Dette trinnet bør gjøres like etter at fersk 1,0 ml MEM er lagt til hver brønn (se trinn 3.2.5.).
- Lag en sterilisert innsatsring med en silikon O-ring utstyrt med en syrevasket dialysemembran (figur 1A).
- Fremstilling av pepsinoppløsning
- På dagen for forsøket, lag pepsinoppløsningen ved å oppløse 0,145 g pepsin i 50 ml 0,1 M HCl. Rist løsningen forsiktig på en plattformrister i 30 minutter ved romtemperatur.
- Fremstilling av pankreatin-galleoppløsning
- På samme dag som forsøket, tilbered 0,1 M NaHCO 3 ved å oppløse 2,1 g NaHCO3 i 250 ml 18 MΩ vann.
- Bland 0,35 g pankreatin og 2,1 g galleekstrakt i 175 ml 0,1 M NaHCO3.
- Når pankreatin og galleekstrakt er solubilisert, tilsett 87,5 g av en svak kationbytterharpiks (se materialtabellen) og bland ved risting i 30 minutter ved romtemperatur.
- Hell slammet i en stor kolonne og samle eluatet.
- Eluter kolonnen med ytterligere 70 ml 0,1 M NaHCO3, og samle dette volumet i pankreatingalleoppløsningen.
MERK: Formålet med harpiksen er å fjerne forurensning Fe som ofte finnes i pankreatin-galle ekstrakter.
- Start in vitro fordøyelsen.
- Vei ut prøven i et sterilt 50 ml sentrifugerør (polypropylen), etterfulgt av tilsetning av 10 ml fysiologisk saltvann ved pH 2, inneholdende 140 mM NaCl og 5 mM KCl.
- Start den gastriske fordøyelsesprosessen ved å tilsette 0,5 ml av den tilberedte svinepepsinoppløsningen til prøven og inkubere på en gyngerister ved lav, skånsom innstilling i 1 time ved 37 °C.
- Etter denne perioden starter du tarmfordøyelsesprosessen for hver prøve ved å justere pH til 5,5-6,0 med 1,0 M NaHCO3.
- Tilsett 2,5 ml pankreatin-galleoppløsning til hvert prøverør og juster pH til 6,9-7,0 med 1,0 M NaHCO3.
- Når pH er justert, utjevner volumet i hvert rør ved hjelp av 140 mM NaCl, 5 mM KCl (pH 6,7) løsning, måle vekten av røret med en målverdi på 15 g.
MERK: For noen matvarer kan det hende man må bringe totalvolumet til 16 g eller 17 g, avhengig av matens bufferkapasitet. - Overfør 1,5 ml av hver tarmfordøyelse til det øvre kammeret (dvs. inneholder innsatsringen med dialysemembranen) av en tilsvarende brønn av 6-brønnskulturplaten som inneholder Caco-2-cellene (figur 1B).
- Sett platedekselet på plass igjen og inkuber ved 37 °C (5 % CO 2 luftatmosfære) på en gyngerister ved 6 oscillasjoner/min i2 timer.
- Fjern innsettingsringen med fordøyelsen og tilsett ytterligere 1 ml MEM (pH 7) til hver brønn.
- Returner cellekulturplaten til inkubatoren (37 °C; 5 % CO2 luftatmosfære) i ytterligere 22 timer.
- Etter 22 timer, fjern cellekulturmediet og tilsett 2,0 ml 18 MΩ vann til cellemonolaget.
MERK: Vannet vil osmotisk lyse cellene. - Høst hele cellelysatet i standard polypropylen mikrosentrifugerør eller lignende for påfølgende celleprotein- og celleferritinanalyser.
5. Måling av Caco-2 celle ferritin og celleprotein
- Bruk cellelysatet fra trinn 4.4.10. for måling av celleferritin og protein.
- For å måle ferritininnholdet i Caco-2-cellene, følg settets instruksjoner (se materialtabellen), med unntak av å øke inkubasjonstiden fra 30 minutter til 2 timer for musens anti-ferritin antistoff-pepperrotperoksidase (HRP) konjugat.
- For å måle celleprotein, følg instruksjonene i celleproteinsettet (se materialtabellen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifisering og måling av Fe-biotilgjengelighet i basismatavlinger
En av de viktigste grunnene til å utvikle denne modellen var å identifisere faktorer som påvirker Fe-biotilgjengeligheten i stiftmatavlinger og gi et verktøy for planteoppdrettere som ville gjøre dem i stand til å identifisere og utvikle varianter med forbedret Fe-biotilgjengelighet. Den vanlige bønnen (Phaseolus vulgaris) har blitt målrettet globalt som en avling for Fe biofortification; dermed har modellen blitt brukt mye for å evaluere næringskvaliteten til Fe i et bredt spekter av bønnemarkedsklasser og bønneavlsprogrammer. For eksempel er gule bønner en fremvoksende markedsklasse i USA. I regioner som Øst-Afrika er de svært populære og er allment kjent for å være hurtigkokte og anses av mange for å være "enkle å fordøye." Nylige studier med Caco-2-cellebioassay har vist at visse varianter av gule bønner kan ha høy Fe-biotilgjengelighet i forhold til andre fargeklasser (figur 2). I denne studien ble Manteca-varianter identifisert som høye i Fe-biotilgjengelighet i forhold til referansekontroller av de hvite og rødflettede fargeklassene. Videre var resultatene konsistente over to påfølgende høstår. Slike sammenligninger er rett og slett ikke gjennomførbare i andre modeller, spesielt in vivo-modeller , på grunn av høye kostnader og mye lavere gjennomstrømning av dyre- og menneskeforsøk.
Evaluering av matprosesseringseffekter på Fe-biotilgjengelighet
Caco-2-cellebioassayet kan også brukes til å evaluere matbehandlingseffekter på Fe-biotilgjengelighet. For eksempel er resultatene i figur 3 fra en analyse av bønner og bønnebasert pasta av flere fargeklasser. Resultatene viser hvordan bearbeiding av bønnene til et mel økte Fe-biotilgjengeligheten fra hvite (Snowdon, Alpena og Samurai) og gule (Canario) bønnesorter. For tranebær (Etna), rød nyre (Red Hawk) og svarte (Zenith) varianter, Fe biotilgjengelighet redusert i pasta mel preparater. Relaterte analyser viste at behandling av bønnene til et mel forstyrret cotyledon-celleveggene i bønnene, og dermed gjorde den intracellulære Fe tilgjengelig for opptak. Jernopptaket økte i den hvite og gule bønnepastaen, da frøbeleggene i disse variantene ikke inneholdt polyfenoliske forbindelser som hemmer Fe-biotilgjengeligheten. I motsetning til dette inneholder frøbeleggene av tranebær, rød nyre og svarte bønner høye nivåer av hemmende polyfenoler, og reduserer dermed Fe-opptaket. Disse resultatene indikerer tydelig nytten av modellen i å eksponere faktorer som kan påvirke næringskvaliteten til Fe, som ellers ville gå uoppdaget.
Figur 1: Sett inn ringoppsett for Caco-2-celle Fe-opptak. (A) Bilde av Caco-2-celler og sett inn ring med festet dialysemembran. (B) Diagram over den generelle prosedyren for in vitro fordøyelse kombinert med Caco-2-celle Fe-opptak i en enkelt brønn i flerbrønnsplaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Jernbiotilgjengelighetspoeng av ugjennomvåte og kokte helfrøgenotyper i et mangfoldig panel med gule bønner. (A) Field sesongen 2015; (B) feltsesongen 2016. Verdier er midler (standardavvik) for triplikatmålinger fra to feltreplikasjoner per genotype (n = 6). Genotyper er kategorisert på x-aksen etter matlagingsklasse, rangert fra den raskest kokende genotypen til den tregeste matlagingsoppføringen. *Signifikant lavere (p < 0,05) score for jernbiotilgjengelighet enn de andre YBP-oppføringene. **Signifikant høyere (p < 0,05) score for jernbiotilgjengelighet enn de andre YBP-genotypene. Dette tallet ble endret fra32. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Jernbiotilgjengelighet uttrykt som Caco-2-celleferritindannelse (nanogram ferritin per milligram celleprotein) av bønnesorter og deres tilsvarende bønnebaserte spaghettis. (A) Tre hvite bønnesorter og deres tilsvarende bønnebaserte spaghettis; (B) fire fargede bønnevarianter og deres tilsvarende bønnebaserte spaghettis. Verdier er middelet (± standardavvik) for seks målinger fra hver variant. Den blå bindestrekslinjen indikerer jernbiotilgjengeligheten til en ikke-forsterket durumhvetepastakontroll ekstrudert, kokt og behandlet på samme måte som bønnebasert spaghettis. *Signifikant (p ≤ 0,05) høyere Caco-2-celleferritindannelse enn hele bønner etter tilberedning. **Signifikant (p ≤ 0,05) lavere Caco-2 celleferritindannelse enn hele bønner etter tilberedning. Dette tallet ble endret fra33. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Siden starten har det blitt publisert mange studier som beskriver denne metoden for Caco-2-cellebioassay. De grunnleggende forholdene har vært relativt uendret siden den første publiseringen i 199818. I løpet av de siste 20 årene har imidlertid mange tekniske detaljer blitt raffinert og standardisert for å gi enestående konsistens i responsen til bioassay. Forsiktig og presis overholdelse av cellekulturen og in vitro fordøyelsesforhold er nøkkelen til konsistent og sensitiv respons av bioassay.
Fra vår erfaring med å trene mange individer i bruken av denne metoden, er den vanligste kampen den riktige kulturen til Caco-2-cellene. Konsekvent kultur av sunne monolag er nøkkelen til sunne og responsive Caco-2-cellemonolag. Hvis celleproteinnivåene ikke er svært konsistente fra brønn til brønn og ikke innenfor området for celleprotein oppført i protokollen, bør utprøveren revurdere cellekulturbetingelsene for avvik fra protokollen. Alternativt kan forurensning av mikroorganismer på lavt nivå eksistere, cellekulturinkubatoren fungerer kanskje ikke som den skal, eller cellekulturmediet kan ikke formuleres riktig.
In vitro fordøyelsesprosessen er en annen kilde til potensielle problemer. Fjerning av forurensende Fe fra fordøyelsesenzymer er kritisk. Til tross for produsentens krav, er det forsvarlig å periodisk sjekke Fe-konsentrasjonen av enzymer og sørge for at Fe-fjerningsprosessen (se protokoll) er effektiv. Hvis Fe-forurensning er tilstede i fordøyelsesenzymer, vil baseline fordøye kvalitetskontroll gi celleferritinverdier som overstiger det anbefalte området.
En erfaren og utdannet etterforsker skal kunne analysere 20 eksperimentelle prøver, pluss kvalitetskontrollene, i en enkelt kjøring av bioassay. Dermed er det behov for omtrent 12 seksbrønnsplater for hvert løp av bioassay. Høyere antall prøver per bioassay anbefales ikke, da tidspunktet for pH-titrering under fordøyelsesprosessen kan være for lang, noe som fører til potensiell inkonsekvens mellom fordøyelsestider.
Ulempene med denne modellen er relativt få. Det krever etterforskere som er dyktige i cellekultur og i stand til presis oppmerksomhet på detaljer og protokoll. Laboratorieplass må være ren for kilder til Fe-forurensning, og reagenser og andre materialer bør overvåkes rutinemessig for Fe-forurensning. Dermed bør brukeren ha evne eller tilgang til instrumentering for måling av Fe-konsentrasjon. Denne modellen er bare et relativt eller semi-kvantitativt mål. Men med riktig bruk av referansekontroller kan modellen gi noen kvantitative estimater av Fe-absorpsjon. Faktisk har en konverteringsligning av absorpsjonsforhold for kontroll versus testmateriale blitt generert19.
Bioassay fungerer i henhold til følgende prinsipp: Caco-2-celler produserer mer ferritinprotein som respons på økning i cellulære Fe-konsentrasjoner. Derfor er Fe-biotilgjengeligheten proporsjonal med økningen i Caco-2-celleferritinproduksjon. Denne økningen uttrykkes som et forhold mellom celleferritin og totalt Caco-2-celleprotein (nanogram ferritin per milligram totalt celleprotein) etter eksponering for en fordøyd prøve19. Ferritinmålinger gjøres ved hjelp av et ELISA-sett (se materialtabellen) testet for respons i dette bioassayet. Totale celleproteinkonsentrasjoner kvantifiseres ved hjelp av et proteinanalysesett. Som nevnt tidligere, under forholdene som brukes til denne metoden, varierer typiske Caco-2-celleproteinnivåer i en seksbrønnsplate fra 2,0 mg til 2,6 mg celleprotein per brønn. Verdier utenfor dette området indikerer usunne cellekulturer, mulig overvekst av celler eller dårlig cellesåteknikk. Innenfor en gitt kjøring av bioassay, bør verdiene bare variere opp til 0,2 mg per brønn. Videre, under såtetthetene og kulturforholdene som brukes i denne metoden, er det betydelig børstegrenseenzymaktivitet 13 dager etter såing, noe som indikerer modning av de fleste, om ikke alle, av cellemonolaget28,29,30. Overvåk cellemonolag gjennom de siste 13 dagene før bruk for forurensning eller stress, for eksempel vakuoldannelse eller hull i monolagsdannelse. Hvis slike forhold er tydelige, bør cellene ikke anses som gyldige for bruk i bioassay.
For å overvåke responsen til Caco-2-bioassayet, bør hvert eksperiment kjøres med flere kvalitetskontroller, inkludert en blank fordøyelse, som bare inneholder fysiologisk balansert saltvann og gastrointestinale enzymer. Disse kontrollene sikrer at det ikke er Fe-forurensning i bioassayet. Ferritinverdier av Caco-2-celler utsatt for blank fordøyelse varierer vanligvis fra 1 ng til 6 ng ferritin / mg celleprotein. Baseline ferritin i dette området indikerer også at cellene har relativt lav Fe-status og dermed bør utvise maksimal følsomhet for tilgjengelig Fe.
For de første 15 års bruk inkluderte ytterligere kvalitetskontroller 1) en blank fordøyelse med FeCl 3 (66 μM) og 2) en blank fordøyelse av FeCl 3 (66 μM) pluss tilsetning av1,3 mM askorbinsyre. Ferritinverdier for FeCl 3-fordøyelsen var vanligvis i området 30-50 ng ferritin / mg celleprotein, og FeCl 3-fordøyelsen med askorbinsyre var i området 250-400 ng ferritin / mg celleprotein. I de senere år forblir det blanke fordøyelsen en kvalitetskontroll; Vi har imidlertid gått over til å bruke en matprøve med og uten askorbinsyre i forholdet 20:1, askorbat:Fe. Matprøven som ble brukt var et hvitt bønnemel som inneholder ca. 65 μg Fe/g prøve. Disse kvalitetskontrollene gir et smalere og mer konsistent responsområde, og gir 20-30 ng ferritin / mg celleprotein for hvitt bønnemel og 70-150 ng ferritin / mg celleprotein for hvitt bønnemel pluss askorbat. Det skal bemerkes at det nye verdiområdet er fra det refererte settet i materialtabellen, som har en tendens til å være litt lavere enn det nå nedlagte Ramco ELISA-settet. Fra og med publiseringen av dette manuskriptet er det bare samlet inn 2-3 måneder med data med det refererte settet.
Det er viktig å gjenkjenne resultatene og cellekulturforholdene som indikerer en ugyldig eller suboptimal kjøring av bioassay. For det første, som angitt i metodene, hvis de tomme fordøyelsesbetingelsene gir celleferritinkonsentrasjoner høyere enn det foreslåtte området, kan dette være en indikasjon på Fe-forurensning av cellekulturmediet, fordøyelsesenzymer eller dialysemembranen. Akseptable Fe-konsentrasjoner for cellekulturmediet og fordøyelsesenzymene er <20 μg Fe / ml. Verdier utenfor området for de andre kvalitetskontrollene, spesielt hvis de er på den lave siden, indikerer også at gyldigheten av resultatene er tvilsom.
Oppsummert er denne modellen svært følsom for biotilgjengelig Fe, da cellekulturforholdene er utformet for å skape celler med lav Fe-status; dermed er deres mekanismer for Fe-opptak sterkt oppregulert. Det er en robust modell som er i stand til høy gjennomstrømning. Enhver mat eller diett som kan mates til mennesker, kan vurderes i denne modellen, og derfor har bioassay et bredt spekter av applikasjoner. Planteoppdrettere kan bruke denne modellen til å måle Fe-biotilgjengelighet i stiftfôr, identifisere egenskaper og kromosomale regioner som påvirker Fe-biotilgjengeligheten. Matforskere kan bruke modellen til å bestemme optimale formuleringer og evaluere effekten av behandlingen for å sikre tilstrekkelig Fe-biotilgjengelighet. Ernæringseksperter kan bruke modellen til å evaluere og overvåke diett Fe biotilgjengelighet fra individuelle matvarer, matkombinasjoner og til og med diettplaner. Det har blitt grundig validert til menneskelige forsøk, riktig forutsi retningen og omfanget av effekter i hver applikasjon. Ved å kombinere simulert fordøyelse med tarmepitelcelle Fe-opptak, representerer denne modellen det kritiske første trinnet i Fe-absorpsjonsprosessen og er derfor i stand til å forutsi levering eller biotilgjengelighet av Fe fra matvarer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatteren er dypt takknemlig for den tekniske innsatsen til Yongpei Chang og Mary Bodis. Den ekstremt vellykkede anvendelsen av denne modellen innen ernæring er et direkte resultat av deres kompetanse og oppmerksomhet på detaljer. Utviklingen av denne modellen ble finansiert helt av USAs Department of Agriculture, Agricultural Research Service.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
- Fairweather-Tait, S. J., Dainty, J. Use of stable isotopes to assess the bioavailability of trace elements: a review. Food Additives Contaminants. 19 (10), 939-947 (2002).
- Hadley, K. B., Johnson, L. K., Hunt, J. R. Iron absorption by healthy women is not associated with either serum or urinary prohepcidin. American Journal of Clinical Nutrition. 84 (1), 150-155 (2006).
- Glahn, R. P., Cheng, Z., Giri, S. Extrinsic labeling of staple food crops with isotopic iron does not consistently result in full equilibration: revisiting the methodology. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 63 (43), 9621-9628 (2015).
- Consaul, J. R., Lee, K. Extrinsic tagging in iron bioavailability research: a critical review. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 31 (4), 684-689 (1983).
- Jin, F., Cheng, Z., Rutzke, M. A., Welch, R. M., Glahn, R. P. Extrinsic labeling method may not accurately measure Fe absorption from cooked pinto beans (Phaseolus vulgaris): comparison of extrinsic and intrinsic labeling of beans. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56 (16), 6881-6885 (2008).
- Junqueira-Franco, M. V. M., et al. Iron absorption from beans with different contents of iron, evaluated by stable isotopes. Clinical Nutrition ESPEN. 25, 121-125 (2018).
- Petry, N., Egli, I., Zeder, C., Walczyk, T., Hurrell, R. Polyphenols and phytic acid contribute to the low iron bioavailability from common beans in young women. Journal of Nutrition. 140 (11), 1977-1982 (2010).
- Petry, N., et al. Stable iron isotope studies in Rwandese women indicate that the common bean has limited potential as a vehicle for iron biofortification. Journal of Nutrition. 142 (3), 492-497 (2012).
- Petry, N., Egli, I., Campion, B., Nielsen, E., Hurrell, R. Genetic reduction of phytate in common bean (Phaseolus vulgaris L.) seeds increases iron absorption in young women. Journal of Nutrition. 143 (8), 1219-1224 (2013).
- Petry, N., et al. Phytic acid concentration influences iron bioavailability from biofortified beans in Rwandese women with low iron status. Journal of Nutrition. 144 (11), 1681-1687 (2014).
- Petry, N., Boy, E., Wirth, J. P., Hurrell, R. F. Review: The potential of the common bean (Phaseolus vulgaris) as a vehicle for iron biofortification. Nutrients. 7 (2), 1144-1173 (2015).
- Petry, N., et al. In Rwandese women with low iron status, iron absorption from low-phytic acid beans and biofortified beans is comparable, but low-phytic acid beans cause adverse gastrointestinal symptoms. Journal of Nutrition. 146 (5), 970-975 (2016).
- Donangelo, C. M., et al. Iron and zinc absorption from two bean (Phaseolus vulgaris L.) genotypes in young women. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (17), 5137-5143 (2003).
- Dellavalle, D. M., Glahn, R. P., Shaff, J. E., O'Brien, K. O. Iron absorption from an intrinsically labeled lentil meal is low but upregulated in women with poor iron status. Journal of Nutrition. 145 (10), 2253-2257 (2015).
- Miller, D. D., Schricker, B. R., Rasmussen, R. R., Van Campen, D. An in vitro method for estimation of iron availability from meals. American Journal of Clinical Nutrition. 34 (10), 2248-2256 (1981).
- Glahn, R. P., Wien, E. M., Van Campen, D. R., Miller, D. D. Caco-2 cell iron uptake from meat and casein digests parallels in vivo studies: use of a novel in vitro method for rapid estimation of iron bioavailability. Journal of Nutrition. 126 (1), 332-339 (1996).
- Martini, L. A., Tchack, L., Wood, R. J. Iron treatment downregulates DMT1 and IREG1 mRNA expression in Caco-2 cells. Journal of Nutrition. 132 (4), 693-696 (2002).
- Glahn, R. P., Wortley, G. M., South, P. K., Miller, D. D. Inhibition of iron uptake by phytic acid, tannic acid, and ZnCl2: studies using an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 50 (2), 390-395 (2002).
- Glahn, R. P., Lee, O. A., Yeung, A., Goldman, M. I., Miller, D. D. Caco-2 cell ferritin formation predicts nonradiolabeled food iron availability in an in vitro digestion/Caco-2 cell culture model. Journal of Nutrition. 128 (9), 1555-1561 (1998).
- Yun, S., Habicht, J. P., Miller, D. D., Glahn, R. P. An in vitro digestion/Caco-2 cell culture system accurately predicts the effects of ascorbic acid and polyphenolic compounds on iron bioavailability in humans. Journal of Nutrition. 134 (10), 2717-2721 (2004).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Homogenization, lyophilization or acid-extraction of meat products improves iron uptake from cereal-meat product combinations in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. British Journal of Nutrition. 101 (6), 816-821 (2009).
- Tako, E., Bar, H., Glahn, R. P. The combined application of the Caco-2 cell bioassay coupled with in vivo (Gallus gallus) feeding trial represents an effective approach to predicting Fe bioavailability in humans. Nutrients. 8 (11), 732-757 (2016).
- Engle-Stone, R., Yeung, A., Welch, R., Glahn, R. Meat and ascorbic acid can promote Fe availability from Fe-phytate but not from Fe-tannic acid complexes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53 (26), 10276-10284 (2005).
- Tako, E., Blair, M. W., Glahn, R. P. Biofortified red mottled beans (Phaseolus vulgaris L.) in a maize and bean diet provide more bioavailable iron than standard red mottled beans: studies in poultry (Gallus gallus) and an in vitro digestion/Caco-2 model. Nutrition Journal. 10, 113 (2011).
- Pachón, H., Stoltzfus, R. J., Glahn, R. P. Chicken thigh, chicken liver, and iron-fortified wheat flour increase iron uptake in an in vitro digestion/Caco-2 cell model. Nutrition Research. 28 (12), 851-858 (2008).
- Beasley, J. T., et al. Metabolic engineering of bread wheat improves grain iron concentration and bioavailability. Plant Biotechnology Journal. 17 (8), 1514-1526 (2019).
- Zhu, L., Glahn, R. P., Nelson, D., Miller, D. D. Comparing soluble ferric pyrophosphate to common iron salts and chelates as sources of bioavailable iron in a Caco-2 cell culture model. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57 (11), 5014-5019 (2009).
- Wortley, G., Leusner, S., Good, C., Gugger, E., Glahn, R. Iron availability of a fortified processed wheat cereal: a comparison of fourteen iron forms using an in vitro digestion/human colonic adenocarcinoma (Caco-2) cell model. British Journal of Nutrition. 93 (1), 65-71 (2005).
- Jumarie, C., Malo, C. Alkaline phosphatase and peptidase activities in Caco-2 cells: differential response to triiodothyronine. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Animal. 30 (11), 753-760 (1994).
- Engle, M. J., Goetz, G. S., Alpers, D. H. Caco-2 cells express a combination of colonocyte and enterocyte phenotypes. Journal of Cellular Physiology. 174 (3), 362-369 (1998).
- Ferruzza, S., Rossi, C., Sambuy, Y., Scarino, M. L. Serum-reduced and serum-free media for differentiation of Caco-2 cells. Alternatives to Animal Experimentation. 30 (2), 159-168 (2013).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Tako, E., Glahn, R. P. The fast cooking and enhanced iron bioavailability properties of the Manteca yellow bean (Phaseolus vulgaris L). Nutrients. 10 (11), 1609 (2018).
- Wiesinger, J. A., Cichy, K. A., Hooper, S. D., Hart, J. J., Glahn, R. P. Processing white or yellow dry beans (Phaseolus vulgaris L.) into a heat treated flour enhances the iron bioavailability of bean-based pastas. Journal of Functional Foods. 71, 104018 (2020).
