Summary
铁 （Fe） 生物利用度的 Caco-2 细胞生物测定代表了一种经济高效且用途广泛的方法，用于评估食品、食品、补充剂、膳食甚至饮食方案的铁生物利用度。经过人体研究的彻底验证，它代表了铁生物利用度研究的最新技术。
Abstract
了解铁的生物利用度对于评估食品中铁的营养质量至关重要。Fe生物利用度的 体内 测量受到成本、通量和食品Fe同位素标记固有的警告的限制。因此，迫切需要一种高通量和成本效益高的方法。Caco-2细胞生物测定法就是为了满足这一需求而开发的。用于Fe生物利用度的Caco-2细胞生物测定利用模拟的胃和肠道消化以及称为Caco-2的人肠上皮细胞系的培养。在Caco-2细胞中，Fe摄取刺激铁蛋白的细胞内形成，铁蛋白是一种易于通过酶联免疫吸附测定（ELISA）测量的铁储存蛋白。铁蛋白形成与铁摄取成比例;因此，通过测量Caco-2细胞铁蛋白的产生，可以评估肠道从模拟食物消化物到肠细胞中的Fe摄取。
通过这种方法，该模型复制了确定食品铁生物利用度的关键初始步骤。自1998年成立以来，该模型方法已与已知影响人类铁生物利用度的因素进行了严格的比较。此外，它已被应用于平行研究，三项人类功效研究评估了铁生物强化作物。在所有情况下，生物测定都正确预测了因子、作物和整体饮食中铁生物利用度的相对量。本文提供了Caco-2细胞培养与 体外 消化过程和细胞铁蛋白ELISA相结合的详细方法，以进行Caco-2细胞生物测定以获得Fe生物利用度。
Introduction
为了充分了解Caco-2细胞生物测定对Fe生物利用度的研究需求和益处，必须首先了解该模型出现之前的方法。测量体内食物或膳食中的Fe生物利用度是一项具有挑战性的任务，特别是当需要在膳食或饮食中评估食物组合时。在过去50年中，同位素标记一直是测量Fe生物利用度的最常见方法1。同位素标记用于单餐和多餐研究，对于长期研究是不切实际的。铁的稳定同位素如57铁和58铁是最常用的;然而，已经利用全身计数2对59Fe等放射性同位素进行了研究。对于植物性食品，同位素标记是通过外在或内在标记完成的。对于外在标记，将已知量的同位素添加到食物或膳食中。然后将食物混合，并在食用前将15-30分钟的平衡期纳入方案中。水培培养 - 将同位素添加到营养液中，以便在植物生长和发育时将其纳入植物中 - 是植物食品内在标记所必需的。下面讨论每种方法的优缺点。
外在同位素标记
在1970年代早期至中期，通过食品中Fe的外在标记来研究人类Fe的吸收，其中将已知量的同位素添加到食物或膳食中已知量的Fe中，混合，并在测量前平衡15-30分钟。已经使用了不同数量的外征同位素，范围从本征铁的1%到100%，但最常见的是在7%-30%的范围内3。外在标记基于外在Fe同位素与食物或膳食的固有Fe完全平衡的假设。然后测量外征同位素吸收，并计算外征同位素的每个原子以表示给定数量的固有Fe原子。该计算基于相对摩尔量。1983年，该技术的多项验证研究在一篇综述论文4中进行了总结。通过同时比较外征同位素标签的吸收百分比与固有同位素标记的吸收百分比来验证该技术。因此，外禀吸收与内在吸收的比率接近1表明每个Fe池被平等地吸收。当时，接近1的比率也被认为代表外在同位素与食物或膳食的内在Fe的平衡。外在与内在铁吸收的比率范围为平均值0.40至1.62，在63项比较中，平均值（±SD）比率为1.08±0.14。值得注意的是，在本综述总结的所有研究中，没有一项直接测试了外在标签与内在Fe的平衡。总之，该综述的作者得出以下结论：
“在某些实验条件下，外在标签技术已被证明对几种食物有效。但是，这种方法还不能被认为是在所有类型的食物中得到证明的。外在标签法不适用于监测含有不溶性铁形式的饮食中的铁吸收。该技术的有效性依赖于一个基本假设，即外在标签与所有内源性非血红素食物铁完全交换。目前尚不清楚不同形式的非血红素铁是如何完全被外在标签标记的。鉴于研究表明，铁抑制剂对外在标签的影响可能与食物中某些形式的非血红素铁不同，这一点很重要。对可能损害完全同位素交换的食物因子的研究很少。因此，解释来自外在标签研究的生物利用度数据需要考虑可能存在于食物或饮食中的交换抑制剂。
自1983年以来，仅发表了两项研究，评估了Fe3，5的外在标记的准确性。在这两项研究中，将外在同位素标签的平衡直接与食品的内在铁进行比较，在这些研究中，食品是主食作物。测试了白豆、红豆和黑豆品种，以及扁豆和玉米。使用已建立的体外消化技术以及Fe溶解度和沉淀的测量，两项研究都表明，外在同位素标记并不能始终如一地导致完全平衡，有证据表明，对于某些豆类品种，根据外在同位素的数量和种皮颜色3，不平衡可能非常高。尽管1983年的综述论文得出了结论，但豆类的外在标签研究仍在继续6，7，8，9，10，11，12。这些研究均未包括测试外在标签与内在Fe的平衡性。
内在标签
用于评估铁生物利用度的植物食品的内在标记消除了外在标记中平衡的准确性问题。然而，由于水培培养需要温室空间，这种方法不能产生大量材料。水培培养是劳动密集型的，需要大量昂贵的稳定同位素，并且经常导致植物生长在产量和种子铁浓度方面不同。由于成本原因，内在标记仅适用于旨在了解铁摄取机制或影响食品中铁摄取的因素的小规模研究。生产 1-2 公斤主食作物的成本约为 20，000-30，000 美元，具体取决于同位素和水培方法13，14。
鉴于与同位素标记相关的挑战，研究人员寻求开发 体外 方法。早期的方法利用模拟的胃和肠道食物，结合Fe溶解度或Fe透析性的测量作为生物利用度的估计15。这些研究很快发现，Fe透析性并不是生物利用度的一致衡量标准，因为Fe是可溶的，与化合物紧密结合，因此不可交换，导致生物利用度被高估。为了解决这些问题，进化了利用人类肠道细胞系的方法，从而增加了活组分并能够测量Fe摄取16。人类肠道细胞Caco-2细胞起源于人类结肠癌，并已广泛用于营养吸收研究。该细胞系很有用，因为在培养中，细胞分化成肠细胞，其功能类似于小肠的刷状边界细胞。研究表明，Caco-2细胞表现出适当的转运蛋白和对影响Fe摄取的因素的反应17，18。
最初的研究利用放射性同位素测量Caco-2细胞中的Fe摄取，经过改进以基于Caco-2细胞铁蛋白形成来测量Fe摄取。Caco-2 细胞铁蛋白测量提高了样品通量，并消除了放射性同位素处理和外在铁与固有铁19，20 的平衡问题。通过铁蛋白形成测量铁的摄取使研究人员能够研究广泛的食物，包括复杂的膳食21。因此，模拟（体外）消化与Caco-2细胞Fe摄取相结合，为食物中的Fe摄取提供了更好的生理评估。需要注意的是，该模型主要决定了Fe生物利用度的相对差异。像许多有用的细胞系一样，Caco-2细胞也显示出反应性的变化，但在食物之间铁摄取方面保持一致的相对差异。适当的技术和对细节的仔细关注可以改善Caco-2细胞中一致的细胞铁蛋白形成反应。
体外消化/Caco-2细胞模型也称为Caco-2细胞生物测定。通过与人类和动物研究的直接比较，该测定已得到彻底验证22。除了将生物测定与人类功效试验直接平行比较外，该模型还被证明在铁摄取方面表现出与人类相似的定性反应18，19，23。因此，作为一种体外方法，Caco-2细胞生物测定作为评估食品中铁营养的筛选工具具有很高的可信度。它已广泛应用于众多食品和食品21，24，25，26，27，28。
自 1998 年成立以来，Caco-2 细胞生物测定法已经推动了铁营养领域的发展，因为它有助于确定影响肠道铁摄取的因素。通过这样做，该模型已经制定并完善了研究目标，以实现更明确和成本更低的人体研究。人们也可以争辩说，使用该模型否定了进行某些人体试验的必要性。
总之，可以使用Caco-2细胞生物测定法测量食物或膳食中Fe的相对输送。无论测试膳食中的Fe含量如何，生物测定都定义了进入肠细胞的相对Fe量 - 吸收过程的第一步。这是定义铁生物利用度的最重要步骤，因为大多数情况下的目标是测量以改善或至少监测食品中铁的营养质量。鉴于铁状态受吸收调节，因此缺铁个体的铁摄取上调以满足营养需求，该模型的标准条件设计为细胞对铁的摄取最大。通过这种方式，生物测定提供了食物输送铁潜力的真实测量。
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Protocol
注意：作为读者的方便参考点，以下方法描述了在生物测定运行中从20个实验样品中测量Fe生物利用度所需的特定培养条件和材料，以及所需的质量控制。由于生物测定中的各种细胞培养和 体外 消化步骤需要时间，因此不建议增加超过此容量的样品数量。
1. 选择样品量
- 对于固体或液体食品，确定可被视为代表待测样品的食物量。
- 在测试豆类品种的铁生物利用度时，使用100-150克豆籽并将该量处理成均匀的样品。
- 对于强化果汁、奶制品和运动饮料等液体样品，请确保在取样前充分混合食物。
注意：上面提到的豆类种子材料的数量对于解释这种主要作物种子之间的固有差异至关重要。
2. 样品的制备
- 在加工前，用蒸馏去离子水冲洗掉任何食物样品上的土壤和灰尘。
- 根据实验目标处理适量的样品，例如通过蒸煮方法和研磨。
注意：对于烹饪和加工，使用不是潜在污染铁源的炊具和设备至关重要。不锈钢设备不污染;然而，石磨机、铸铁炊具和任何含有铁的非不锈钢设备等设备都会添加大量的铁污染物。标准的不锈钢咖啡研磨机通常足以研磨。 - 冻干并研磨成均匀的粉末。
注意：一旦均质化，研究表明，对于被测量的每种食物，三次独立的分析重复就足够了。- 如果样品均匀性难以实现，请修改产品的配方或加工。如果无法做到这一点，请在非同质性不严重的情况下添加复制。
- 对于大多数均质固体食品，每次重复使用0.5 g冻干样品。如有必要，每次重复最多使用1.0 g样品，但检查超过0.5 g是否会产生响应程度的益处。
注意：高于0.5克固体食物的量可能会堵塞透析膜（见下文）。 - 使用 1-2 mL 液体样品。
注意：液体样品通常不需要冻干。
3. Caco-2细胞培养
- 库存文化
- 从认证供应商处购买Caco-2电池。
- 使用补充有25mM HEPES（pH 7.2），10%（v / v）胎牛血清（FBS）和1%抗生素 - 抗真菌溶液的Dulbecco改良鹰培养基（DMEM）在具有5%CO2 空气气氛（恒定湿度）的培养箱中培养来自库存小瓶的细胞。
- 一旦有足够的细胞可用，通常在培养7-10天后，将细胞接种在非胶原蛋白包被的烧瓶中，密度为30，000个细胞/ cm2。
- 根据接种多孔板所需的可用细胞数量选择烧瓶尺寸。
注意：通常，T225（225 cm 2）烧瓶最适合每次生物测定使用11个多孔（6孔;9.66cm2 /孔）板（10个板用于样品比较，1个板用于质量控制）的实验。 - 在烧瓶中培养细胞7天，每隔一天更换培养基，并在第 7天用于接种多孔板。
注意：建议从细胞从原液培养物开始并随后用于一系列实验时使用不超过10-15代的传代范围。应限制细胞培养传代，因为广泛的传代会导致细胞系的适应性变化，从而导致模型响应的可变性。
- 多孔板上的细胞培养
- 在 50，000 个细胞/cm 2 的密度接种 Caco-2 细胞，放入 6 孔胶原蛋白包被的板中。
注意：此步骤通常在星期三完成时效果最佳。以下步骤将清楚地说明为什么一周中的这一天是最佳的。 - 使用补充有25mM HEPES（pH 7.2），10%（v / v）FBS和1%抗生素 - 抗真菌溶液的DMEM在具有5%CO2 空气气氛（恒定湿度）的培养箱中在37°C下培养细胞12天。
注意：培养细胞单层超过12天会导致细胞过度生长。先前的研究已经清楚地表明，在这些条件下，在接种后12天，细胞单层成熟，很好地附着在板上，并且在反应的一致性方面最佳29，30，31。细胞生长时间更长，例如长达19-21天，会导致细胞过度生长，并且培养基中的营养物质迅速耗尽，导致不健康的单层。 - 在 12 天内，至少每 2 天按照一致的每日时间表更换培养基。
- 在播种后第12 天， 用 2 mL 最低必需培养基 （MEM [pH 7]） 替换培养基，并补充有 10 mM PIPE（哌嗪-N，N'-双-[2-乙磺酸]）、1% 抗生素-抗真菌溶液、氢化可的松 （4 mg/L）、胰岛素 （5 mg/L）、硒 （5 μg/L）、三碘甲状腺原氨酸 （34 μg/L） 和表皮生长因子 （20 μg/L）。
注意：如果在星期三开始播种，那么第 12 天将是星期一。 - 第二天（即第 13 天），取出 MEM 并用 1 mL MEM （pH 7） 替换。
注意：此步骤将在星期二进行。这是生物测定开始的日子;因此，13天的时间表产生了一致的每周时间表的优势，允许生物测定在同一工作日一致地进行。
- 在 50，000 个细胞/cm 2 的密度接种 Caco-2 细胞，放入 6 孔胶原蛋白包被的板中。
4. 体外 消化
- 插入环的准备
- 使用装有酸洗透析膜的硅胶O形圈创建灭菌插入环（图1A）。
注意：提前1天（即星期一，第12天）准备插入物，并将18MΩ水储存在4°C的18MΩ水中，直到准备使用。 - 在生物测定当天（星期二，第13天），从冰箱中取出插入物，沥干水分，然后用0.5M HCl代替水。 使用前将其在室温下放置在层流罩中至少1小时。
注意：此步骤应在从培养板中取出MEM之前完成。膜的酸洗用于去除可能的污染铁，并对插入环和膜进行灭菌。 - 从插入物中排出0.5M HCl，并用无菌18 MΩ水冲洗。在室温下储存在层流罩中的无菌 18 MΩ 水中，直到准备使用。
- 用Caco-2细胞将一个环插入6孔板的每个孔中，从而创建一个双室系统。将带有插入物的板放回培养箱。
注意：此步骤应在将新鲜的 1.0 mL MEM 添加到每个孔后立即完成（参见步骤 3.2.5）。
- 使用装有酸洗透析膜的硅胶O形圈创建灭菌插入环（图1A）。
- 胃蛋白酶溶液的制备
- 在实验当天，通过将0.145g胃蛋白酶溶解在50mL的0.1M HCl中来制备胃蛋白酶溶液。 在室温下在平台摇床上轻轻摇动溶液30分钟。
- 胰酶-胆汁溶液的制备
- 在实验的同一天，通过将 2.1 g NaHCO 3 溶解在 250 mL 的 18 MΩ 水中来制备 0.1 M NaHCO3。
- 将 0.35 g 胰酶和 2.1 g 胆汁提取物混合在 175 mL 的 0.1 M NaHCO3 中。
- 一旦胰酶和胆汁提取物溶解，加入87.5g弱阳离子交换树脂（参见 材料表），并在室温下振荡30分钟混合。
- 将浆液倒入大柱中并收集洗脱液。
- 用另外 70 mL 的 0.1 M NaHCO3 洗脱色谱柱，将此体积收集到胰酶胆汁溶液中。
注意：树脂的目的是去除胰酶胆汁提取物中常见的污染物Fe。
- 启动 体外 消化。
- 在无菌 50 mL 离心管（聚丙烯）中称出样品，然后加入 pH 2 的 10 mL 生理盐水，其中含有 140 mM NaCl 和 5 mM KCl。
- 通过将0.5mL制备的猪胃蛋白酶溶液加入样品中来启动胃消化过程，并在37°C下以低，温和的设置在摇床上孵育1小时。
- 在此期间之后，通过用1.0M NaHCO3将pH调节至5.5-6.0来启动每个样品的肠道消化过程。
- 向每个样品管中加入 2.5 mL 胰酶-胆汁溶液，并用 1.0 M NaHCO3 将 pH 值调节至 6.9-7.0。
- 调节pH值后，使用140mM NaCl，5mM KCl（pH 6.7）溶液平衡每个管中的体积，以15g的目标值测量管的重量。
注意：对于某些食物，可能需要将总体积增加到 16 克或 17 克，具体取决于食物的缓冲能力。 - 将每个肠消化物的1.5mL转移到含有Caco-2细胞的6孔培养板的相应孔的上室（即，包含带有透析膜的插入环）（图1B）。
- 更换板盖并在37°C（5%CO2 空气气氛）下在摇床上以6次振荡/分钟的速度孵育2小时。
- 取出带有消化物的插入环，并向每个孔中额外添加 1 mL MEM （pH 7）。
- 将细胞培养板放回培养箱（37°C;5%CO2 空气气氛）中再放置22小时。
- 22小时后，除去细胞培养基并向细胞单层中加入2.0mL的18MΩ水。
注意：水会渗透裂解细胞。 - 将整个细胞裂解物收获到标准聚丙烯微量离心管或类似管中，用于后续的细胞蛋白和细胞铁蛋白分析。
5. Caco-2细胞铁蛋白和细胞蛋白的测定
- 使用步骤4.4.10中的细胞裂解物。用于测量细胞铁蛋白和蛋白质。
- 要测量Caco-2细胞的铁蛋白含量，请按照试剂盒的说明（参见 材料表）进行操作，除了将小鼠抗铁蛋白抗体 - 辣根过氧化物酶（HRP）偶联物的孵育时间从30分钟增加到2小时。
- 要测量细胞蛋白，请按照细胞蛋白试剂盒中提供的说明进行操作（参见 材料表）。
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Representative Results
主要粮食作物中铁生物利用度的鉴定和测量
开发该模型的主要原因之一是确定影响主食作物中铁生物利用度的因素，并为植物育种者提供工具，使他们能够识别和开发具有增强铁生物利用度的品种。普通豆（菜豆）已成为全球铁生物强化作物的目标;因此，该模型已被广泛用于评估各种豆类市场类别和豆类育种计划中Fe的营养质量。例如，黄豆是美国的新兴市场类别。在东非等地区，它们非常受欢迎，众所周知是快速烹饪，被许多人认为“易于消化”。最近对Caco-2细胞生物测定的研究表明，相对于其他颜色类别，某些品种的黄豆具有较高的铁生物利用度（图2）。在这项研究中，与白色和红色斑驳颜色类别的参考对照相比，Manteca品种被确定为具有较高的铁生物利用度。此外，连续两个收获年的结果是一致的。这种比较在其他模型中根本不可行，特别是在 体内 模型中，因为动物和人体试验的成本高，通量低得多。
评估食品加工对铁生物利用度的影响
Caco-2细胞生物测定也可用于评估食品加工对Fe生物利用度的影响。例如， 图3 中的结果来自对多种颜色等级的豆类和豆类面食的分析。结果表明，将豆类加工成面粉如何提高白色（斯诺登、阿尔皮纳和武士）和黄色（加那利）豆品种的铁生物利用度。对于蔓越莓（Etna），红肾（Red Hawk）和黑色（Zenith）品种，面粉制剂中的Fe生物利用度降低。相关分析表明，将豆子加工成面粉会破坏豆子的子叶细胞壁，从而使细胞内铁易于吸收。白豆和黄豆面食的铁摄取量增加，因为这些品种的种皮不含抑制铁生物利用度的多酚化合物。相比之下，蔓越莓、红肾和黑豆的种皮含有高水平的抑制性多酚，从而降低了铁的吸收。这些结果清楚地表明，该模型在揭示可能影响Fe营养质量的因素方面是有用的，否则这些因素将无法被发现。
图 1：Caco-2 细胞铁摄取的插入环设置。 （A）Caco-2细胞和带有透析膜的插入环的图像。（B）在多孔板的单孔内体外消化与Caco-2细胞Fe摄取的整个过程图。请点击此处查看此图的大图。
图 2：不同黄豆组中未浸泡和煮熟的全种子基因型的铁生物利用度评分。 （A） 2015年实地季节;（二）2016年田间季节。值是每个基因型（n = 6）的两个现场重复的三次重复测量的平均值（标准偏差）。基因型按烹饪类别在 x 轴上分类，从烹饪速度最快的基因型到烹饪速度最慢的条目排列。*铁生物利用度评分明显低于（p < 0.05）优于其他YBP条目。**铁生物利用度评分明显高于其他YBP基因型（p < 0.05）。这个数字是从32修改而来的。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：表示为豆类品种及其相应豆类意大利面的 Caco-2 细胞铁蛋白形成（每毫克细胞蛋白的铁蛋白纳克）的铁生物利用度。 （一）三种白豆品种及其相应的豆类意大利面条;（二）四种彩色豆类品种及其相应的豆类意大利面条。值是每个品种的六个测量值的平均值（±标准差）。蓝色连字符线表示非强化硬质小麦面食的铁生物利用度，对照以与豆基意大利面相同的方式挤压、烹饪和加工。*烹饪后Caco-2细胞铁蛋白形成明显（p ≤ 0.05）比全豆高。**烹饪后Caco-2细胞铁蛋白形成显著（p ≤ 0.05）比全豆低。这个数字是从33修改而来的。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
自成立以来，已经发表了许多研究来描述这种用于Caco-2细胞生物测定的方法。自1998年首次出版以来，基本条件基本保持不变18.然而，在过去的20年中，许多技术细节已经得到完善和标准化，以在生物测定的反应中产生前所未有的一致性。仔细和精确地坚持细胞培养和 体外 消化条件是生物测定一致和灵敏反应的关键。
根据我们培训许多人使用这种方法的经验，最常见的斗争是Caco-2细胞的正确培养。健康单层的一致培养是健康和反应迅速的Caco-2细胞单层的关键。如果细胞蛋白水平在孔与孔之间不高度一致，并且不在方案中列出的细胞蛋白范围内，则研究者应重新检查细胞培养条件是否偏离方案。或者，可能存在低水平的微生物污染，细胞培养箱可能无法正常运行，或者细胞培养基可能未正确配制。
体外消化过程是潜在问题的另一个来源。从消化酶中去除污染物铁至关重要。尽管制造商声称，谨慎的做法是定期检查酶的铁浓度，并确保铁去除过程（见方案）有效。如果消化酶中存在铁污染，则基线消化质量控制将产生超过推荐范围的细胞铁蛋白值。
经验丰富且训练有素的研究人员应该能够在一次生物测定中分析20个实验样品以及质量控制。因此，每次生物测定运行大约需要12个六孔板。不建议每次生物测定使用更多的样品，因为在消化过程中进行pH滴定的时间可能太长，导致样品消化时间之间可能存在不一致。
这种模式的缺点相对较少。它需要研究人员在细胞培养方面具有很高的技能，并且能够精确关注细节和方案。实验室空间必须没有铁污染源，试剂和其他材料应定期监测铁污染。因此，用户应该有能力或使用仪器来测量铁浓度。该模型只是一个相对或半定量的度量。然而，通过正确使用参考对照，该模型可以提供一些Fe吸收的定量估计。实际上，已经生成了对照与测试材料的吸收比转换方程19。
生物测定根据以下原理工作：Caco-2细胞产生更多的铁蛋白，以响应细胞Fe浓度的增加。因此，Fe的生物利用度与Caco-2细胞铁蛋白产量的增加成正比。这种增加表示为暴露于消化样品后细胞铁蛋白与总Caco-2细胞蛋白（每毫克总细胞蛋白的纳克铁蛋白）的比率19。铁蛋白测量是使用ELISA试剂盒（参见材料表）进行的，该试剂盒在该生物测定中测试了反应。使用蛋白质检测试剂盒定量总细胞蛋白浓度。如前所述，在用于该方法的条件下，六孔板中的典型Caco-2细胞蛋白水平范围为每孔2.0mg至2.6mg细胞蛋白。超出此范围的值表示不健康的细胞培养、可能的细胞过度生长或不良的细胞接种技术。在给定的生物测定运行中，值应仅变化至每孔0.2mg。此外，在该方法中使用的接种密度和培养条件下，在接种后13天存在大量的刷状边界酶活性，表明大多数（如果不是全部）细胞单层28，29，30的成熟。使用前 13 天内监测细胞单层的污染或应力，例如液泡形成或单层形成的间隙。如果这些条件很明显，则不应认为细胞可用于生物测定。
为了监测Caco-2生物测定的反应性，每个实验都应使用几种质量控制进行，包括空白消化物，仅包含生理平衡的盐水和胃肠道酶。这些控制确保生物测定中没有铁污染。暴露于空白消化物的Caco-2细胞的铁蛋白值通常在1ng至6ng的铁蛋白/mg细胞蛋白范围内。该范围内的基线铁蛋白也表明细胞处于相对较低的Fe状态，因此应该表现出对可用Fe的最大灵敏度。
在最初的 15 年使用中，其他质量控制包括 1） 含有FeCl 3 （66 μM） 的空白消化物和 2） 含有 FeCl 3 （66 μM） 的空白消化物加上添加1.3 mM 抗坏血酸。FeCl3 消化物的铁蛋白值通常在 30-50 ng 的铁蛋白/mg 细胞蛋白范围内，而含抗坏血酸的 FeCl3 消化物的铁蛋白在 250-400 ng 的铁蛋白/mg 细胞蛋白范围内。近年来，空白摘要仍然是一种质量控制;然而，我们已经改用含有和不含抗坏血酸的食品样品，比例为20：1，抗坏血酸：Fe。使用的食品样品是白豆粉，含有约65微克铁/克样品。这些质控品提供了更窄、更一致的响应范围，白豆粉产生 20-30 ng 的铁蛋白/mg 细胞蛋白，白豆粉加抗坏血酸产生 70-150 ng 的铁蛋白/mg 细胞蛋白。应该注意的是，新的值范围来自 材料表中引用的试剂盒，该试剂盒往往略低于现已停产的Ramco ELISA试剂盒。截至本手稿出版时，仅使用参考工具包获得了 2-3 个月的数据。
重要的是要识别表明生物测定无效或次优运行的结果和细胞培养条件。首先，如方法中所述，如果空白消化条件产生的细胞铁蛋白浓度高于建议的范围，这可能表明细胞培养基、消化酶或透析膜的铁污染。细胞培养基和消化酶的可接受铁浓度为 <20 μg Fe/mL。超出其他质量控制范围的值，特别是如果它们偏低，也表明结果的有效性值得怀疑。
总之，该模型对生物可利用的Fe高度敏感，因为细胞培养条件旨在创建低Fe状态的细胞;因此，它们的Fe摄取机制是高度上调的。它是一个能够实现高吞吐量的强大模型。任何可以喂给人类的食物或饮食都可以在该模型中进行评估，因此，生物测定具有广泛的应用。植物育种者可以使用该模型来测量主食中的铁生物利用度，识别影响铁生物利用度的特征和染色体区域。食品科学家可以应用该模型来确定最佳配方并评估加工效果，以确保足够的铁生物利用度。营养学家可以使用该模型来评估和监测来自单个食物、食物组合甚至饮食计划的膳食铁生物利用度。它已经过人体试验的全面验证，可以正确预测每个应用中的影响方向和程度。因此，通过将模拟消化与肠上皮细胞Fe摄取相结合，该模型代表了Fe吸收过程中关键的第一步，因此能够预测食物中Fe的递送或生物利用度。
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Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
作者对张永培和玛丽·博迪斯的技术努力深表感谢。该模型在营养领域的成功应用是他们专业知识和对细节的关注的直接结果。该模型的开发完全由美国农业部农业研究服务局资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M HCl | Fisher Scientific | A508-4 Hydrochloric Acid TraceMetal Grade | |
| 18 megaohm water | Also known as distilled, deionized water | ||
| 3,3′,5-Triiodo-L-thyronine sodium salt | Sigma Aldrich Co | T6397 | |
| 6-well plates | Costar | 3506 | Use for bioassay experiments |
| ascorbic acid | Sigma Aldrich Co | A0278 | |
| bile extract | Sigma Aldrich Co | B8631 | |
| Caco-2 cells | American Type Culture Collection | HTB-37 | HTB-37 is a common variety. |
| Cell culture flasks T225 | Falcon | 353138 | |
| Cell culture flasks T25 | Corning | 430639 | |
| Cell culture flasks T75 | Corning | 430641U | |
| Chelex-100 | Bio-Rad Laboratories Inc | 142832 | Known as the weak cation exchange resin in the protocol |
| collagen | Corning | 354236 | |
| dialysis membrane | Spectrum Laboratories | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO | Spectra/Por 7 Pretreated RC Dialysis Tubing 15,000 MWCO |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Gibco | 12100046 | DMEM |
| epidermal growth factor | Sigma Aldrich Co | E4127-5X.1MG | |
| Ferritin ELISA Assay Kit | Eagle Biosciences | FRR31-K01 | |
| fetal bovine serum | R&D Systems | S12450 | Optima |
| HEPES | Sigma Aldrich Co | H3375 | |
| Hydrocortisone-Water Soluble | Sigma Aldrich Co | H0396 | |
| insert ring | Corning Costar | not sold | Transwell, for 6 well plate, without membrane |
| insulin | Sigma Aldrich Co | I2643 | |
| KCl | Sigma Aldrich Co | P9333 | |
| large column | VWR International | KT420400-1530 | |
| Minimum Essential Medium | Gibco | 41500034 | MEM |
| NaCl | Fisher Scientific | S271 | |
| pancreatin | Sigma Aldrich Co | P1750 | |
| PIPES disodium salt | Sigma Aldrich Co | Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid) disodium salt P3768 | |
| porcine pepsin | Sigma Aldrich Co | P6887 or (P7012-25G Sigma | |
| protein assay kit | Bio-Rad Laboratories Inc | Bio-Rad DC protein assay kit 500-0116 | Measurement of Caco-2 cell protein |
| silicone o rings | Web Seal, Inc Rochester NY | 2-215S500 | |
| sodium bicarbonate | Fisher Scientific | S233 | |
| Sodium selenite | Sigma Aldrich Co | S5261 | |
| ZellShield | Minerva Biolabs | 13-0050 | Use at 1% as antibiotic/antimycotic ordered through Thomas Scientific |
References
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